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WO1998011253A2 - Procede et trousse de diagnostic et/ou de quantification par hybridation de type sandwich de sequences d'acides nucleiques sur support solide - Google Patents

Procede et trousse de diagnostic et/ou de quantification par hybridation de type sandwich de sequences d'acides nucleiques sur support solide Download PDF

Info

Publication number
WO1998011253A2
WO1998011253A2 PCT/BE1997/000102 BE9700102W WO9811253A2 WO 1998011253 A2 WO1998011253 A2 WO 1998011253A2 BE 9700102 W BE9700102 W BE 9700102W WO 9811253 A2 WO9811253 A2 WO 9811253A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleotide sequence
target
sequence
standard
bases
Prior art date
Application number
PCT/BE1997/000102
Other languages
English (en)
Other versions
WO1998011253A3 (fr
Inventor
José REMACLE
Isabelle Alexandre
Nathalie Zammatteo
Isabelle Ernest
Original Assignee
Remacle Jose
Isabelle Alexandre
Nathalie Zammatteo
Isabelle Ernest
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from BE9600755A external-priority patent/BE1010608A3/fr
Priority claimed from BE9700244A external-priority patent/BE1011052A3/fr
Application filed by Remacle Jose, Isabelle Alexandre, Nathalie Zammatteo, Isabelle Ernest filed Critical Remacle Jose
Priority to EP97939883A priority Critical patent/EP0929696A2/fr
Publication of WO1998011253A2 publication Critical patent/WO1998011253A2/fr
Publication of WO1998011253A3 publication Critical patent/WO1998011253A3/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a method and a kit comprising reagents for the detection and / or quantification by sandwich-type hybridization of nucleic acid sequences on a solid support.
  • the labeled nucleotide sequence will be immobilized if the target or standard nucleotide sequence is present and immobilized on a trapping nucleotide sequence.
  • the target or standard nucleotide sequence is then sandwiched between the nucleotide sequence trapper and the nucleotide sequence marked, by a double recognition, which increases the specificity, reduces the background noise, and allows a quantification of the nucleotide sequences. This is only possible if the hybridization is carried out quantitatively and reproducibly. This is all the more true as the yield from this hybridization is high.
  • nucleic acids coming from "biological agents”, pathogenic or not, such as viruses, fungi, bacteria, mycoplasmas, animal and plant cells or tissues often amplified by a step of amplification, such as PCR (Polymerase Chain Reaction (US Patent 4965188), LCR (Landegren et al., 1988, Science, 241, 1077-1080), NASBA (Kievits et al. 1991, J. Virol. Methods 35 . 273-286), the CPR (Cycling Probe Reaction (WO Patent 95/14106) or the ICR.
  • the detection of the amplified sequences requires carrying out a specific sensitive detection which is easily adapted to a large number of samples.
  • a first solution consists in using beads, as described in patent application EP-0205532, in which Sephacryl beads of 5 to 50 ⁇ m are activated by diazotasion of aromatic souls.
  • multi-well plates already serve as the basis for many tests, in particular ELISA and numerous reading devices in photometry, fluorescence, luminescence already exist for reading these plates.
  • This fixation can be obtained by simple adsorption (non-covalent reaction), and makes it possible to measure amplicons present in solution (Dahlem et al. 1987, Mol. Cell. Probes 1.
  • Kellér et al. describe a sandwich hybridization method using as trapper sequence a fragment of 3300 base pairs used for the detection of a target sequence of 190 base pairs which is also complementary to another labeled sequence, the single strand trapper sequence being fixed by an NH2 function covalently to a solid support.
  • Polsky-Cinky et al. describe a method in which the trapper sequence comprises 4800 base pairs of which 800 base pairs are complementary to the target sequence of 1600 base pairs to be detected. As it appears in FIG. 1 of this document, the target sequence is complementary in the hybridization of another labeled nucleotide sequence.
  • Japanese patent application JP-8089300 describes a trapper sequence having a length less than 30,000 base pairs and comprising at least 10 repeating units of 100 base pairs capable of hybridizing in series in the same orientation with target sequences to be detected and increases the sensitivity of traditional methods.
  • Patent application EP-0079139 describes a single-strand trapper sequence of 1200 to 1500 base pairs hybridizing with target sequences of 600 to 700 base pairs, detected by sandwich hybridization by means of a labeled and complementary sequence d 'another portion of the target sequence.
  • the trapping nucleotide sequence When the trapping nucleotide sequence is very short, there is a poor overlap of the target sequence and a folding of the target sequence onto itself or a rehybridization of target sequences between them. In addition, the low percentage of hybridization of the target sequence on the trapper sequence decreases the sensitivity.
  • Patent application EP-0205532 describes a trapper sequence of 341 base pairs fixed so covalent on microbeads, this trapper sequence being capable of reacting with a target sequence to obtain an overlap of the trapper sequence on the target sequence of 175 base pairs, the target sequence reacting with a marked sequence of 201 base pairs by sandwich hybridization .
  • this document does not describe an optimal recovery of the single-stranded trapper sequence by the target sequence.
  • a free portion of 166 base pairs at the level of which replays of the single-stranded trapper sequence on itself or the pairing with other sequences present in the sample. are likely to decrease the percentage of target sequence hybridizing on the trapper sequence, and the sensitivity of detection and / or quantification.
  • amplicons 1) quantitative (often complex) extraction of the nucleic acid from the biological sample; 2) quantitative amplification of the sequence studied; and 3) quantitative measurement of the number of amplified sequences (called amplicons).
  • the amplification step in particular by the Polymerase Chain Reaction (PCR) (US Pat. No. 4,965,188), poses great difficulties with regard to the control of quantification and detection.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the first step is to mismatch the double strands of DNA, often very long (and possibly stabilized by various proteins or molecules), and to raise the temperature so that the two strands are separated.
  • the second step is the pairing
  • Patent application WO96 / 09407 describes an amplification method comprising the use of an internal standard having a specific part different from the target nucleotide sequence to be quantified by 17 animated acids. In this case, the target and standard sequences of the same length are quantified by fixing them to biotins reacting on a streptavidin fixed on a solid support.
  • Patent application WO93 / 10257 describes a method for quantifying a DNA fragment by adding an internal standard different from the target DNA fragment to be quantified by less than 10% in sequence and / or in size.
  • the standard nucleotide sequence differs from the target DNA fragment by a specific sequence comprising a deletion, mutation or addition at a site of 1 to 5 nucleotides allowing the incorporation of a restriction or cut site achievable by an enzyme or any other way.
  • the quantification is carried out by specific recognition of the target DNA fragment or of the standard nucleotide sequence by different specific primers. The use of different primers hybridizing with the fragments in different sites will generate labeled fragments of different sizes and sequences, which can be separated by electrophoresis.
  • This process is based on a double check of the specificity of identification.
  • methods and devices based on selective identification of the standard sequence in one step do not guarantee a sufficient specificity and sensitivity, which may result in the presence of false positives or false negatives when quantifying a target nucleotide sequence.
  • the present invention aims to provide a new method and a kit allowing detection and / or quantification of nucleic acid sequence which would not have the drawbacks of the cited state of the art.
  • a particular object of the present invention is to provide a process EDS and a kit for an optimal hybridization of nucleic acid sequences, in particular a high percentage of hybridization of the trapper sequence from a target sequence or standard, low risk of folding back these sequences or of the trapper sequence onto itself and a low risk of reappearance of these sequences by complementary sequences present in the sample.
  • Another object of the present invention is to provide a detection and / or quantification method and kit having improved specificity and sensitivity compared to the methods and devices of the prior art, in particular for the detection and / or the quantification of any type of nucleic acids present in a biological sample and possibly obtained after genetic amplification
  • An additional aim of the present invention is to obtain a method and a kit for detection and / or quantification of said target nucleic acid sequence which allow the amplification of a sequence. internal or external standard regardless of the number of cycles of genetic amplification.
  • the present invention relates to a method for detecting and / or quantifying a nucleotide sequence called "target " "present in a biological sample, characterized in that it comprises a type of contacting "sandwich” of said target nucleotide sequence 2 with a nucleotide sequence called “trapper” 5 fixed on an insoluble solid support 3, said trapping nucleotide sequence being complementary to part 7 of the target nucleotide sequence, contacting type " sandwich “also being carried out with one or more other nucleotide sequence (s) (6, 11) of which at least one (6) is marked, the said nucleotide sequence (s) (6 , 11) (of which at least one (6) is marked) being complementary (s) to another part 8 of the target nucleotide sequence 2 (another part than that 7 hybridized by the nucleotide sequence "trapper”5); in that the trapping nucleotide sequence 5 is covalently attached by one of its ends to the solid support 3; in
  • the parts 13 of the target nucleotide sequence 2 do not hybridize with the trapping nucleotide sequence 5 and with the nucleotide sequence (s) (6) , 11) (of which at least one (6) is marked), is less than 60 bases, preferably less than 40 bases, or even zero.
  • nucleotide sequence (s) (6, 11) (of which at least one (6) is marked) will take the name of nucleotide sequences "helper" 11 when the said sequence (s) do not are not marked, and nucleotide sequences "labeled” 6 when c * c ⁇ -they are likely to be recognized directly or indirectly by a system for detecting and / or quantifying, preferably selected from the group consisting of fluorescence, chemolummescence, electroluminescence, staining, detection by radioactive labeling, bioluminescence, electrochemistry, light reflection, an optical process or a mixture of them.
  • nucleotide sequences "helper” 11 are used to stabilize the "sandwich” and obtain the most complete possible coverage of the target nucleotide sequence 2 on the marked nucleotide sequence 6 and on the trapper nucleotide sequence 5, which increases the sensitivity and the specificity of the process according to the invention.
  • the sandwich hybridization is preferably carried out in two stages, that is to say that the first stage consists in the hybridization of the target nucleotide sequence 2 to the nucleotide sequence trapper 5 and that the second step is the hybridization of the target nucleotide sequence 2 with one or more nucleotide sequences (6, 11) of which at least one (6) is marked.
  • the two stages are preferably separated by a washing stage.
  • the sequences are chosen so that the conditions (temperature, salt concentration, reaction time) are compatible for the two hybridizations, which makes it possible to carry out the hybridization in a single step.
  • the target and standard nucleotide sequences to be detected and / or quantified consist of any type of nucleic acid, DNA or RNA.
  • the trapped, "helper”, labeled and standard nucleotide sequences used according to the present invention consist of DNA so as to avoid any destruction of these sequences by RNase possibly present in the biological sample. .
  • the target 2 and standard 1 nucleotide sequences are the result of a prior amplification by a genetic amplification method, preferably chosen from the group consisting of PCR, LCR, CPR, NASBA or ICR.
  • the 5 'terminal part 9 of the target nucleotide sequence 2 can be left uncovered by the labeled sequence (s) (s) 6 and the nucleotide sequence (s) "helper” 11, and is then covered by a complementary "primer” nucleotide sequence 12 (also called “primer”), used for amplification of the sequence target nucleotide 2.
  • this "primer" 12 nucleotide sequence can be considered to be a "helper" type sequence.
  • the invention also relates to a method for quantifying a target nucleotide sequence 2 present in a biological sample, which comprises the following steps:
  • - a sandwich type contact of the target 2 and standard 1 nucleotide sequences with a trapping nucleotide sequence 5, preferably as described above, the trapping nucleotide sequence 5 being complementary to the common part of the target nucleotide sequence and the standard nucleotide sequence, the sandwich type contact also taking place with one or more sequences nucleotides (6, 11) of which at least one (6) is labeled and complementary to the specific part B of the target nucleotide sequence 2 or to the specific part B of the standard nucleotide sequence 1, - said method also comprising a quantification of the ratio between the specific labeling of the target nucleotide sequence 2 and the specific labeling of the standard nucleotide sequence 1.
  • the term “content in close GC / AT bases” is understood to mean that the ratio of GC / AT bases of the standard is less than 20% of the ratio of GC / AT bases of the target nucleotide sequence.
  • the contacting of the "sandwich" type as advantageously described, whether or not previously described, is advantageously combined with a device for quantification by a standard internal or external nucleotide sequence.
  • the specific parts B of the standard and target nucleotide sequences preferably correspond to part 8 of the target or standard nucleotide sequences.
  • the common part A preferably corresponds to the part 7 of this target or standard nucleotide sequence hybridizing with the trapper nucleotide sequence 5.
  • the specific part B of the standard nucleotide sequence 1 is different from the specific part B of the target nucleotide sequence by 5 to 500 nucleotides, preferably by 20 to 40 nucleotides.
  • the internal standard nucleotide sequence 1 comprises on either side of the specific sequence B and common A common parts 15 to parts 15 of the target nucleotide sequence 2, and which can serve in whole or in part as sequences complementary to primer sequences 12 for genetic amplification.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the use of internal standard nucleotide sequences amplified jointly with the target nucleotide sequence 2 or external standards amplified in parallel with the target nucleotide sequences 2.
  • the method according to the invention comprises a high number of cycles of genetic amplification, preferably by PCR or LCR, preferably greater than 30.
  • the internal standard is added in quantity variable to the starting sample and the ratio obtained between the specific labeling of the target nucleotide sequence 2 and the specific labeling of the standard nucleotide sequence 1 is plotted as a function of known quantities added to the starting sample, allowing to determine on the line thus obtained, for a ratio equal to 1, what is the quantity of target nucleotide sequence 2 present in the sample.
  • the standard nucleotide sequence is added in an identical amount to a sample having undergone various dilutions, and the ratio between the specific labeling of the target nucleotide sequence and the specific labeling of the nucleotide sequence standard is plotted as a function of the dilutions of the sample, and the line obtained allows: to determine, for a ratio equal to 1, what is the quantity of target nucleotide sequence 2 present in the sample. Quantification can also be carried out by comparison of the ratio obtained with a single determined quantity of standard added to a single quantity of sample and a calibration line.
  • the present invention also relates to the detection and / or quantification kit comprising the reagents for carrying out the methods described above.
  • the kit for detection and / or quantification by hybridization of the “sandwich” type of a nucleotide sequence - target 2 comprises a trapping nucleotide sequence 5 fixed on a solid insoluble support 3 and complementary to part 7 of the target nucleotide sequence 2 and one or more other nucleotide sequence (s) (6, 11) (of which at least one (6) is marked), the said nucleotide sequence (s) (6, 11) being complementary (s) ) of another part 8 of the target nucleotide sequence 2.
  • said trapping nucleotide sequence 5 is covalently attached by one of its ends to the solid support 3 and has a length of between 50 and 500 bases, preferably between 100 and 300 bases, more particularly between 120 and 250 bases, and part 10 of the trapper nucleotide sequence 5 which does not hybridize with part 7 of the naked sequence target key 2 is less than 40 bases, preferably less than 20 oases, or even zero.
  • the nucleotide sequence labeled has a length sufficient to specifically recognize the target or standard nucleotide sequence to be detected and / or quantified, this specificity depending on the type of target or standard nucleotide sequence to be detected and / or quantified, and can be characterized by recognition by hybridization a specific complementary portion of at least 10 bases, preferably more than 20 bases, of the target or standard nucleotide sequence.
  • the kit according to the invention will also include the reagents necessary for the specific identification of the marked sequence, for detection and / or quantification by a * method preferably chosen from the group consisting of fluorescence, chemolummescence, electroluminescence , staining, detection by radioactive labeling, bioluminescence, electrochemistry, light reflection, an optical process or a mixture of them.
  • a * method preferably chosen from the group consisting of fluorescence, chemolummescence, electroluminescence , staining, detection by radioactive labeling, bioluminescence, electrochemistry, light reflection, an optical process or a mixture of them.
  • the trapper nucleotide sequence 5 is covalently attached to the insoluble solid support 3 and is preferably produced via a 5 ′ phosphate of the trapper nucleotide sequence 5 on one or more amino functions of the solid support 3 insoluble by reaction with ide fuel.
  • the insoluble solid support 3 is preferably chosen from the group consisting of tubes, filters, beads, possibly magnetic, multi-well plates, a plate or a mixture of them.
  • the invention also relates to a detection and / or quantification kit which comprises a standard internal or external nucleotide sequence 1 as described below and all the elements necessary for extraction, amplification, detection and / or quantification according to the methods described above.
  • FIG. 1 represents a schematic example of sandwich hybridization according to the invention.
  • FIG. 2 represents a concentration DNA target curve of CMV obtained after sandwich hybridization and detection in bioluminescence.
  • FIG. 3 represents a DNA sensitivity curve for Chlamydia trachomatis measured after amplification by PCR, sandwich hybridization and detected in colorimetry by the streptavidin-peroxidase conjugate.
  • FIG. 4 represents a diagram illustrating the nucleotide structure of a standard competitive standard, compared to that of a target DNA to be measured during an amplification by PCR.
  • FIG. 5 represents a diagram of a competitive standard (A) for the measurement of CMV viral DNA and its comparison with the target DNA (B).
  • FIG. 6 represents a diagram of a competitive standard (A) for the measurement of the RNA of the HIV virus and its comparison with the target RNA (3).
  • the numbering corresponds to the sequence nucleotide of viral RNA ("Los Alamos de
  • FIG. 7 is a schematic description of the principle of the quantification of a target DNA by using a competitive standard according to the invention and their respective measurement by specific probes after capture on a common immobilized sequence.
  • FIG. 8 represents a curve of the concentration of CMV target DNA and of the corresponding standard by sandwich hybridization and measured spectrophotometrically.
  • Figure 9 shows a target DNA concentration curve of CMV and corresponding standard after PCR amplification and hybridization sandwich using a probe common trapper and a specific biotinylated probe to the target DNA or standard.
  • FIG. 10 represents the measurements of the target DNA of CMV and of the internal standard after an amplification by 40 cycles of PCR when 1000 copies of standard have been added to increasing amounts of target DNA and measured after PCR by sandwich hybridization as defined in Figure 7.
  • FIG. 11 represents the calibration line of a target DNA of CMV by the use of an internal standard according to the invention.
  • the abscissa represents the ratios of the target signals and the standard obtained in FIG. 10.
  • FIG. 12 represents the quantification of a target CMV DNA as a function of the number of cycles of the PCR thanks to the use of a competitive standard according to the invention.
  • a competitive CMV sequence standard as described in FIG. 5 was used and added in constant quantity to the sample having undergone 4 different dilutions.
  • FIG. 13 represents a competitive RT-PCR carried out on a target RNA of HIV and a standard RNA (FIG. 6) and a detection in bioluminescence after sandwich hybridization.
  • the graph represents for each RT-PCR the ratio between the detection obtained using " a target specific probe and that of the standard.
  • the results show a competition between the amplification of the target added in constant quantity (10 8 copies) compared to the standard added in decreasing quantity ranging from 10 10 (1), 10 8 (2) to 10 6 (3) copies.
  • the trapper nucleotide sequence 5 preferably a DNA sequence, is covalently attached to multiwell plates 3. This covalent attachment is obtained by the binding of a phosphate located at the 5 'terminal position of the trapper sequence on an amine located on the support in the presence of carbodii ide, as described by Rasmussen et al. (1991, Anal.
  • the attached trapper 5 nucleotide sequences can hybridize a target DNA 2, which will then be sandwich sandwich with a labeled nucleotide sequence 6.
  • An advantage of sandwich hybridization is a very low background noise which makes it possible to carry out a massive analysis of clinical samples with a minimum of DNA purification.
  • the quantity of trapping nucleotide sequences fixed on the multiwells can reach 1.2 pmoles for small oligonucleotides, but as regards the larger nucleotide sequences, the quantity fixed is less important (of the order of 300 fmoles for nucleotide sequences about 500 bases).
  • the quantity of " trapped nucleotide sequences fixed is sufficient not to be limiting in the hybridization process of the invention.
  • the fixing of the trapping nucleotide sequence on microbeads also makes it possible to increase the number of trapping nucleotide sequences in the reaction solution by using a larger quantity of beads.
  • the trapper nucleotide sequences according to the invention chosen are complementary over their entire length to the target nucleotide sequence to be detected. This advantageously allows easy production of these trapping nucleotide sequences by PCR from target nucleotide sequences cloned into plasmids and can thus be used for a reproducible industrial production of these trapping nucleotide sequences.
  • trappers can be used, part of the nucleotide sequence of which comprises one or more parts of sequences which are not complementary to the sequence of the ciole.
  • the inventors have tested sequences trapping nucleotides having a 20 or 40 base sequence not complementary to the target nucleotide sequence and located in the 5 'terminal position used for attachment to the multiwells. These sequences serve as "spacers" between the trapper sequence proper and the solid support. In this experiment, the sequence carrying a 20 base spacer is more efficient than the 40 and 60 base spacers for hybridizing small target sequences.
  • Another property of the method and of the kit of the invention is the advantageous use of trapping nucleotide sequences having a minimum size of 50 bases if possible 100 and at best 150 or more bases. This observation is unexpected based on the following considerations.
  • the stability of the hybrids in the case where the ionic strength is constant and the size sufficient (beyond 50 cells), only depends on the composition (% G + C i and not on the size of the hybrids
  • the importance of the size to favor or not the hybridization depends on the speed of the hybridization and not on their stability. Indeed, in solution, the size of the nucleic acid strands influences the rate of re-pairing. This is proportional to the square root of the length (Wetmur, JG and Davidson, N. 1968, J. Mol. Biol.
  • the speed is proportional at the square root of the shortest strand, be it DNA (Wetmur, JG 1971, Biopolymers 10, 601) or RNA (Hutton, JR and Wetmur, JG 1973, J. Mol. Biol. 77, 495).
  • the other factor which influences the speed of hybridization is the respective concentration of the target nucleotide sequences and the trapping nucleotide sequences.
  • the situation in this case is complex because two reactions are possible: on the one hand the target nucleotide sequences to be measured being usually double strands in the starting solution, they will be able to reassociate with each other and on the other hand they will be able to hybridize on the trapper nucleotide sequence. These are therefore two competitive reactions, one taking place in solution (reassociation of the double strands of the target nucleotide sequence) and the other on a solid support (hybridization on the trapping nucleotide sequence).
  • k2 kinetic constant of DNA reassociation
  • k] _ kinetic constant of hybridization with the nucleotide sequence
  • Cf concentration of the nucleotide sequence which hybridizes on DNA.
  • the trapper is made up of a single strand because a single phosphorylated primer in the 5 'terminal position is used during its construction by PCR. This phosphate is the only one able to react on the amino support.
  • the plate is washed in the presence of 0.4 N NaOH (cf. example 1) in order to remove the second strand. So we end up with a single strand fixed on the support. This strand being complementary to only one of the two strands of target DNA, it will fix this strand. After washing, this hybrid strand can be easily dehybnded for example by heating or with 0.4 N NaOH. A single strand of DNA is thus obtained in the solution.
  • This technique can be used on a large scale, for example by using beads on which the trapping nucleotide sequences are fixed.
  • This single strand preparation can have multiple applications as reagents using a chemically labeled strand for example.
  • Detection of unlabeled target sequences is carried out by using their hybridization on trapping nucleotide sequences fixed on an insoluble support using one or more nucleotide sequences of which at least one is labeled (detection nucleotide sequences) which can hybridize on the part of the target nucleotide sequence not recognized by the trapper nucleotide sequence.
  • This sequence can be chemically labeled and detected according to the various methods known to those skilled in the art. It is possible to obtain a fixation of at least 80% of the detection nucleotide sequence relative to the sequence target nucleotide hybridized to the trapper nucleotide sequence.
  • the target nucleotide sequence dissociated in single strand is found in the solution in the presence of its strand of complementary target nucleotide sequence but also of the detection nucleotide sequence (and possibly primers) and on the support of the trapping nucleotide sequence.
  • the target nucleotide sequence can either react first with the detection nucleotide sequence before binding to the trapper, or it can bind to the trapper before fixing the detection nucleotide sequence. In both cases, the use of large nucleotide sequences will promote the reaction speed as well as the stability of the hybrids formed.
  • the target nucleotide sequence has a part of its unpaired sequence which can then be recognized by a complementary target nucleotide sequence which will be able to move the intermediate hybrid and redo a target nucleotide sequence double strand.
  • the target nucleotide sequence will be hybridized and completely covered by the trapping nucleotide sequence and by the detection nucleotide sequence without having any (or too little) free sequence, the pairing (annealmg) of another strand of the sequence complementary target nucleotide can no longer take place and the sandwich hybrid will be stable.
  • the target nucleotide sequence even after sandwich hybridization keeps a free sequence, this can always serve as a pairing site for the other strand of the complementary target nucleotide sequence, which will destabilize the hybrid and may even dissociate according to the experimental conditions (temperature, salts, etc.), because once the pairing has started, the propagation of the formation of the double strand is very rapid and thermodynamically favorable.
  • Another characteristic of the sandwich hybridization method according to the invention is that not only the target sequence can be entirely covered by the trapping nucleotide sequence and the labeled nucleotide sequence, but that the trapping sequence can be entirely covered by the target sequence.
  • This therefore makes it possible " to use as marked nucleotide sequence large double-stranded nucleotide sequences produced for example easily by PCR amplification in the presence of dUTP-biotin. Indeed, once one of these biotinylated strands paired with the target nucleotide sequence , it will be completely covered and can no longer be redeployed by its complementary strand, which is not the case in this work reported by Keller et al. (1989, Anal. Bioch. 177, 27-32).
  • the trapper nucleotide sequences by using a primer carrying a phosphate in 5 'terminal which will allow the covalent fixing of only one of these strands on the amino microplates and on the other hand of the sequences labeled nucleotides.
  • the labeled sequences are small, 20-30 or 40 bases, they will be chemically synthesized and will be single-stranded. ndes, they can be produced by amplification. Exceeding the target nucleotide sequence outside the hybridized part on the sensor and the detection nucleotide sequence by its 5 'terminal end resulted in a reduction in the hybridization yield if this uncovered part became important.
  • a target nucleotide sequence of 20 bases is fixed on a trapping nucleotide sequence of 20 bases which is complementary to it with a yield which can be 25 times greater compared to a sequence which has the same 20 nucleotides but which additionally has 20 additional nucleotides on the 3 'terminal side.
  • a yield which can be 25 times greater compared to a sequence which has the same 20 nucleotides but which additionally has 20 additional nucleotides on the 3 'terminal side.
  • the invention relates to the construction of one or more sequences of oligonucleotides (DNA or RNA) having specific specificities, as described below, and their use as standards for the measurement of target sequence (s). DNA or RNA by sandwich hybridization using oligonucleotide probes labeled according to the method described above or not. The construction represented in FIG.
  • Standard 1 is compatible with possible prior amplification and quantitative detection of a DNA sequence (or RNA) of which part A of the sequence is identical to the target DNA and part B, at least (the smallest possible) is different.
  • these two parts will be flanked by two sequences 3 identical to those of the target DNA or RNA which serve as matrix for the attachment of oligonucleotide primers
  • the length of the standard will be the same or very close to that of the target DNA or RNA. Care will also be taken to introduce into the specific part B an AT and GC base content close to or identical to that of the target DNA or RNA.
  • An example of a standard used for the quantification of a DNA fragment of the CMV virus is given in FIG. 5, and an example of an RNA standard for the quantification of a RNA sequence of the HIV virus is shown in FIG. 6.
  • Such a standard also allows use as an external standard or as an internal standard for PCR amplification.
  • their similarity and partial identity allows an amplification rate very close to or identical to that of the target DNA or RNA.
  • They have matrix sequences 3 for primers 4 identical, therefore which will carry out their fixation (annealing) in the same proportions.
  • Their identical length, their sequence identity over a large distance and the similarity of the non-common part in length and in number of GC bases / number of AT bases ratio means that reading by DNA polymerase will be carried out with the same efficiency.
  • it also has a particular property.
  • slowing down and stopping the amplification of the standard sequence results in the same slowing down for the target sequence and vice versa.
  • This slowdown in efficiency at the end of the amplification process can be due to several reasons: the decrease in the number of primers, the number of free nucleotides, the decrease in DNA polymerase activity or the too rapid rehybridization of the amplify with each other rather than with the primers during the step of fixing the primers (annealing). All these reasons are equivalent for the 2 sequences and will therefore have the same influence on their amplification.
  • the inventors have observed that by sandwich hybridization of the invention, the limiting factor is the binding of amplicons 1 and 2 to the immobilized trapper sequence 5. Since this is present on a surface, the reaction speed is much slower due to the slower diffusion of the reagents when approaching a rigid surface and with steric hindrances. Experimentally, we observe that less than 50% of amplicons 1 and 2 are fixed on the trapper sequences 5. However, even if this percentage of fixation is low, we observe that it is the same for standard 1 and for standard target 2. This property is explained by the fact that the 2 sequences are the same size and that they are fixed on a trapper 5 sequence of the same type.
  • this sandwich hybridization also allows quantification of these two amplicons with the same efficiency by operating as follows: the preparation containing the 2 amplicons is diluted adequately and is added to 2 or a double series of wells
  • the fixation of the two amplicons on the trapper DNA will be identical in the two tuos since they will be present at the same concentration.
  • the trapper since the trapper is common to the two amplicons and they have an identical size, their fixing will be carried out with the same yield, that is to say that the proportion of the 2 fixed amplicons will be identical to that present in the preparation. after PCR.
  • the sandwich hybridization can be carried out either in two stages or in one stage, by carrying out the fixation on the trapper sequence then by adding the specific marked sequence or by adding together the specific marked sequence to the amplicons during the immobilization on the trapper sequences. .
  • results indicate the possibility of quantitatively detecting between 30 and a million copies of these target sequences by using a thousand copies of standard sequences at the start.
  • This property constitutes an important practical advantage because the biological samples can contain very variable quantities of target nucleotide sequences to be measured and in this case, a linear assay of more than 4 orders of magnitude makes it possible to greatly reduce, if not totally, the number of dilutions to be made in order to be in the zone of quantification.
  • RNA for example messenger RNAs or viral RNAs.
  • a standard must be used which consists of an RNA chain having the same specificities as the DNA standard explained above.
  • the amplification and measurement approach requires a preliminary step which is the transformation of RNA into a DNA chain by an enzyme having reverse transc ⁇ ptase activity.
  • the rest of the operations and the quantification are identical to that explained above.
  • An example of a standard used for the quantification of the RNA of the HIV virus is given in FIG. 6 and the quantification of HIV presented in Example 11 and in FIG. 13.
  • oligonucleotides as external standards is less advantageous than their use as internal standards and it requires special controls and conditions. It must be certain that the efficiency of the amplification is identical for the sample and for the tube containing the external standard; it is also necessary to work in the linear amplification zone in order to keep a proportionality between the number of amplicons obtained and the quantity of sequences present in the sample and the standard at the start. It will also be necessary to carry out the tests in several copies in order to minimize the variations observed from tube to tube during amplification.
  • the sample containing the target DNA or RNA is processed in parallel with tubes containing increasing concentrations of external standard. All the amplification and detection conditions are identical and made with the same solutions in order to minimize processing variations. The results are compared with the calibration curve obtained with the standards. In the invention, a series of dilutions of the target sample are preferred in order to obtain values corresponding to the area covered by the standards.
  • a more adequate method but which requires more tests consists in diluting the sample (for example 4 dilutions of 10 in 10) and adding to it a constant amount of internal standard.
  • the sample for example 4 dilutions of 10 in 10.
  • the internal standard is normally added to the initial sample. It may possibly, for practical reasons, be added after extraction if it is quantitative. This is the case where the nucleic acids are extracted from a sample and then made 4 dilutions before adding a constant amount of internal standards before quantifying as in Example 10 and Figure 12. This procedure requires only one sample extraction.
  • Example 1 Influence of the length of the trapper for a simple hybridization of a target DNA of HPV-18
  • Hybridization was carried out from these amplicons labeled at the 5 'terminal end via the T4 polynucleotide kinase in the presence of [ ⁇ ATP-at 32 P].
  • Two types of trappers were used, corresponding to 180 and 360 bases complementary to the amplicon sequence.
  • the hybridizations were carried out in the presence of increasing concentrations of target amplicons at 45 ° C. for 2 hours in a solution consisting of SSC 2x concentrated, ⁇ e Denhart 5x concentrated, Denatured salmon sperm DNA at 0.1 mg / ml.
  • the experiment was carried out for hybridization of amplicons of 435 base pairs corresponding to a CMV sequence at position 171075 of the genome (strain AD169, reference GENBANK X17403).
  • MIE5 antisense: 5 'CAGCACCATCCTCCTCTTCCTCTGG as described by Demmler et al. (J. Infect. Dis., 158, pp;
  • the trapper 50, 100, 150 and 250 bases were produced by
  • Hybridization was performed at 60 ° C for
  • the experiment was carried out for the hybridization of amplicons of 586 base pairs corresponding to a sequence of HPV-18 located at position 6193 to 6779 of the viral DNA. This sequence was amplified by the primers described in Example 2.
  • Three types of trappers were used, corresponding to a sequence of 25, 180 and 360 bases complementary to the amplicon sequence.
  • the various trappers recognized the part of the amplicons located on the 3 'terminal side.
  • the probes included either 360 bases for hybridization on the 180-base trapper, or 180 bases for hybridization on the 360-base trapper, or 21 bases for hybridization on the 25-base trapper. They were labeled with 32 P by phosphorylation in the 5 ′ terminal position by T4 kmase in the presence of [ 32 P] ATP. They corresponded to the 5 'terminal end of the target sequence.
  • the 21 base probes were single strand, while the 180 and 360 base probes were double strand.
  • the sandwich sandwiches have been optimized with regard to temperature, salt concentration and concentration of amplicons.
  • the hybridization carried out at 45 ° C.
  • Hybridization on the 180 and 360 base trappers was carried out in a single step and under the following conditions: the amplicons were added respectively at a rate of 2.5 fmoles in the presence of 15 fmoles of labeled probe. Hybridization took place for 20 hours of a 2x SSC solution concentrated at 45 ° C.
  • the quantity of labeled hybridized probe is 0.54 fmoles for the 180 base trapper and 0.69 fmoles for the 360 base trapper.
  • the difference in probe fixation was due to a higher efficiency of hybridization of the target sequence on the large trapper (cf. example 2).
  • the DNA extracted from Mycobacterium tuberculosis was amplified by its sequence Mt 308 using the following primers: T2MT3 '(primer 5' -3 '): GTCGACACGCCTCTGCACGGAAGTCCTT DMT3' (antisense primer 5 '-3'): GCTCGACTTCTGGTCACGACGTCC
  • the trapper was obtained using the T2MT3 probe 'phosphorylated in position 5' and an antisense primer SMT5 ': GGGCATCCGCGAGTTGAAGACCTGAAGTGG.
  • the sandwich hybridization was performed in a j outant each well 54 fmoles DNA amplified target by PCR in the presence of 50 ng of 40 base probe and 25 ng for the 135 base sequence. Hybridization was carried out for 2 hours at 60 ° C.
  • the reading is done for an hour. After subtracting the white, a value of 1.5 million RLU (Relative Light Unit) for the 40 base probe and 2.7 million RLU for the 135 base probe are obtained.
  • RLU Relative Light Unit
  • the 135 base probe was double stranded and lowered. Despite these two unfavorable conditions, the signal obtained is almost twice as high, which clearly indicates the importance of making a large detection probe which covers the entire target sequence.
  • the amplicons originating from the CMV DNA were obtained from a PCR carried out with the primers MIE4 and MIME5 described in example 2. They make it possible to obtain amplicons of 435 base pairs.
  • the amplicons were used to produce the sandwich hybridization curve described below. This was carried out on multi-well plates on which were fixed trappers complementary to this target sequence and a biotinylated probe of 185 bases also produced by PCR. The size of the trapper was 257 bases. They were produced from a PCR using primers MIE4 described in Example 3 and MEI- ⁇ ⁇ or.t the sequence was GTACAGGGGACTCTGGGGGTGAC
  • the trapper once produced is purified on spin column G25.
  • the total hybridization volume per well is 110 ⁇ l, containing:
  • hybridization buffer SSC 4 4x, Denhart lOx, salmon sperm DNA 200 ⁇ g / ml denatured 10 minutes at
  • Hybridization lasts 2 hours at 70 ° C. After hybridization, the wells are washed twice with 200 ⁇ l of 0.1 x SSC then with 200 ⁇ l of 100 mM maleate buffer, 150 mM NaCl, 0.3% Tween pH 7.5 for 15 minutes.
  • the kinase activity is revealed in 20 mM Tris buffer pH 7.75 containing 60 ⁇ M DTT, 100 ⁇ M EDTA, 5 mM MgCl 2 , 8 ⁇ M Luciferine, 6 mU luciferase per 20 mM KCl well, 1 mM Phosphoenolpyruvate and ADP 3.2 ⁇ M.
  • the light emission is followed for one hour with a luminometer (Lum oskan, Labsystem, Finland) and the results are expressed in RLU. mm.
  • Example 6 Differential hybridization of a small and a
  • the marked initial probes are large and are cut into two pieces which must be able to be detected and measured.
  • the problem is therefore to be able to measure by hybridization a small probe in the presence of its mother sequence which is larger.
  • the inventors have chosen in this example a mother sequence (OL1) biotinylated with 40 bases which have the following sequence: 5 'CCGCGACTATCCCTCTGTCCTCAGTAATTGTGGCTGAGAA 3'
  • This sequence corresponds to a specific sequence of the CMV genome located on the "Major Immediate Early Gene” (Akrigg et al., Virus Res. 2, p. 107).
  • the inventors wanted to detect a biotinylated probe (OL2) corresponding to the first 20 bases of this probe in the presence of the mother sequence (OL1).
  • the trapper consisted of an oligonucleotide of 20 bases complementary to the OL2 probe and terminated by a phosphate group at 5 '. This trapper was attached to the amino-wells by covalent reaction.
  • the wells were washed with 0.1 x concentrated SSC solution at 45 ° C. After four washes, the wells are incubated with the streptavidin-kinase conjugate and its fixation is estimated by measuring the kinase activity in bioluminescence. Under these conditions, the wells having the large fragment (OLA) showed an RLU x mm of 9 while the small fragments showed a RLU x mm of 210.
  • OLA large fragment
  • the target DNA to be measured consists of a double brm oligonucleotide of 314 base pairs corresponding to position 171193 of the CMV genome (strain 10169, reference GENBANK X17403).
  • the internal standard consists of a double brm oligonucleotide of 314 base pairs whose nucleotide sequence is identical to that of the target DNA to be measured except for the 40 nucleotides ranging from 3217 to 3256 which constitute a random sequence but whose Dourcenta ⁇ e in GC is similar to that of DNA target.
  • the composition of these nucleotides is presented in FIG. 5.
  • These nucleotides are first heated at 100 ° C. for 10 mm and then incubated in increasing concentration in wells to which have been attached sensor probes of the invention and corresponding to a portion. of the common sequence and supplied by Lambdatech (Namur-Belgium).
  • the 0.06 ml hybridization solution per well contains a 2 times concentrated SSC solution, 5 times concentrated Denhardt, 100 ⁇ g / ml of denatured salmon sperm DNA and 50 ng of biotinylated probe of 40 single brm nucleotides corresponding either to the sequence complementary to the target DNA, or to that of the standard DNA presented in FIG. 7.
  • To these 60 ⁇ l are added 40 ⁇ l of target or standard DNA. Hybridization takes place at
  • the wells are washed 1 time with 0.2 ml of SSC solution 0.1 times, then once with 0.2 ml of maleate buffer pH 7.5 containing 0.15 M NaCl and 0.3% Tween and finally with Maleate buffer pH 7.5 0.15 M NaCl and containing 1% milk powder.
  • a streptavidme-peroxidase conjugate is added in 0.1 ml at a 1/1000 dilution as recommended by the supplier (BIOSOURCE - Fleurus - Belgium) then washed 3 times with 0.2 ml of 0.1 M Maleate buffer pH 7.5 containing 0.15 M NaCl and 0.3% Tween then 1 time with a 500 mM glycine solution pH, 1 containing 100 mM KC1 and 2 lM MgCl.
  • the peroxidase activity is measured by the oxidation of TMB in the presence of K2 ⁇ 2 in a 1.1 ml of tarcor. 0.2 M acetate citrate pH 7.5 After 10 mm of reaction, 0.22 ml of a 1.2 M solution of H2SO4 is added to each well and the optical density is measured at 450 mM.
  • the results of the example are shown in Figure 8.
  • Example 8 Measurement of the Quantity of CMV Target DNA by Using an External Sample by Sandwich Hybridization After Amplification by
  • tubes are prepared containing increasing concentrations of external standard as defined in FIG. 5. All the tubes have undergone a PCR of 40 cycles using primers corresponding to the sequence
  • the PCR starts with 1 passage 3 mm at 94 ° C and continues with 40 cycles defined as follows: Each PCR cycle included a denaturation temperature at 94 ° C for 30 sec, a period of pairing of primers at 65 ° C for 30 sec and 30 sec polymerization at 72 ° C. PCR solution from
  • 0.1 ml included 100 pmol of each of the 2 primers, 200 mM of the various dNTPs and 2.5 U of Taq DNA polymerase in a 10 mM TRIS-HCl buffer pH 8.4 with 1.5 mM MgCl 2 and KCl
  • the PCR tubes pass 10 mm at 72 ° C.
  • Each point represents the average of 3 measurements. There is a correlation between the number of starting copies and the signal obtained. In addition, the curves obtained for the target and the standard are very close, which makes it possible to use the curve of the standard as a reference for determining the number of copies of the target DNA CMV in the starting sample.
  • Example 9 Measurement of the Quantity of CMV Target DNA Using an Internal Standard for Sandwich Hybridization After Amplification by PCR
  • a standardization curve is established in the following manner. Increasing amounts of ur were added to each of the tubes. plasmid containing part of the CMV virus genome and a constant amount of standard internal is equivalent to 1000 copies.
  • the CMV target DNA quantities were 30, 100, 300, 1,000, 3,000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000, and 1 million copies.
  • the composition of the internal standard is given in FIG. 5.
  • Each tube was subjected to amplification by 40 cycles of PCR under the conditions presented in example 15 using the primers corresponding to the sequence 3191-3217 and 3504-3481 of CMV gene ( Figure 5). After amplification, 314 base pair amplicons corresponding to the CMV target and to the standard are therefore obtained. From each of the PCR solutions, 0.04 ml are taken and incubated in 2 wells containing an identical trapper for the common sequences " of the 2 amplicons. In one of the wells, is added the biotinylated 40 base probe specific for the CMV target and in the other, the 40-base biotinylated probe specific for the standard.
  • a streptavidme-peroxidase conjugate is added to each tube and the peroxidase activity measured as in Example 7 by measuring the optical density (OD) corresponding to the absorbance of the peroxidase reaction product (figure 10).
  • OD optical density
  • the ratio between the OD corresponding to the detection of target amplicons and that corresponding to the detection of standard amplicons is determined and plotted as a function of the number of copies of CMV present at the start of the experiment.
  • the results are presented in FIG. 11 on a logarithmic scale in order to cover all the concentrations.
  • Each of the points represents the average of 3 experiences. There is very good linearity with a regression coefficient of 0.97 for the straight line, which means the possibility of determining the quantity of target CMV in a sample of starting from 30 to 1 million copies.
  • Example 9 This experiment was carried out essentially according to Example 9 and the diagram in FIG. 7, that is to say using at the start a sample containing 100,000 copies of CMV DNA diluted 10-fold and 10 times to which we added 1,000 copies of the standard.
  • Each of these tubes was subjected to a PCR as in Example 5 except that certain tubes were stopped after 25, 30, 35, or 40 cycles of PCR.
  • the amplicons were used for sandwich hybridization on the same trapper but with either a biotinylated probe specific for the target CMV or the standard.
  • the revelation was made in bioluminescence using a streptavidme-k ase conjugate and measurement of the light emitted by luciferase.
  • the target RNA to be measured consists of a 267 base single brm nucleic acid corresponding to the nucleotide sequence ranging from 4235 to 4481 of the AIDS virus (HIV) polymerase (Pol) gene (numbering of HIV virus (HIV) polymerase (Pol) gene (numbering of HIV virus (HIV) polymerase (Pol) gene (numbering of HIV virus (HIV) polymerase (Pol) gene (numbering of HIV virus (HIV) polymerase (Pol) gene (numbering of HIV virus (HIV) polymerase (Pol) gene (numbering of HIV virus (HIV) polymerase (Pol) gene (numbering of HIV virus (HIV) polymerase (Pol) gene (numbering of HIV virus (HIV) polymerase (Pol) gene (numbering of HIV virus (HIV) polymerase (Pol) gene (numbering of HIV virus (HIV) polymerase (Pol) gene (numbering of HIV virus (HIV) polymerase (Pol)
  • HIV-LAI Los Alamos HIV data bank ACK02013).
  • the standard consists of a single brm RNA nucleic acid whose nucleotide composition is identical to that of the target RNA to be measured with the exception of 38 nucleotides ranging from position 4367 to 4404, constituting a random sequence whose percentage in GC is similar to that of target RNA.
  • the composition of these RNAs is presented in FIG. 8.
  • the RNA standard is prepared by transcription m vi tro from a plasmid having in 5 'the promoter of an RNA polymerase and in 3' of a poly A sequence After purification and quantification of the latter, an increasing number of copies of RNA standard is placed in each tube in the presence of a fixed quantity of target RNA.
  • Each tube is subjected to a first reverse transcription step (AMV-RT, Avian Myeloblastosis Virus) for the synthesis of the first brm DNA (primer 4481-4501) and in a second step to the synthesis of the second strand of cDNA as well as the amplification of DNA (Tfl DNA polymerase Thermus flavius; System Access RT-PCR Pro ega) (primers 4235-4256; 4481-4501).
  • a reaction buffer optimized for the two stages simplifies the procedure and reduces the risk of contamination.
  • the amplification procedure comprises in a first step the transcription mverse at 48 ° C for 60 mm, followed by a step of mactivation of the AMV-RT and denaturation of RNA / cDNA hybrids at 94 ° C for 2 mm. Then, the synthesis of the second br of cDNA and the PCR are carried out by an amplification of 40 cycles each comprising a denaturation at 94 ° C. for 30 sec, a pairing of the primers at 50 ° C. for 30 sec and a step of extension. at 72 ° C for 30 sec.
  • the RT-PCR reaction takes place in 50 ⁇ l of solution comprising in final concentration 1 ⁇ M of each of the 2 primers, 0.2 mM of dNTPs, reaction buffer AMV / Tfl, 1 mM MgS0, 0.1 u / ⁇ l AMV -RT and 0.1 u / ⁇ l Tfl DNA polymerase.
  • the sandwich hybridization is carried out on the trapper probe common to the two amplicons fixed on the multiwells.
  • the presence of target and standard amplicons was demonstrated using a biotinylated 38 base probe specific for each of the 2 sequences.
  • the revelation is made in bioluminescence using a streptavidme-k ase conjugate and measurement of the light emitted by luciferase (cf. example 11).

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection et/ou de quantification d'une séquence nucléotidique cible (2) présente dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de type 'sandwich' de la séquence nucléotidique cible (2) avec une séquence nucléotidique monobrin trappeur (5) fixée sur un support solide insoluble (3) et complémentaire d'une partie (7) de ladite séquence nucléotidique cible (2) et avec une ou plusieurs séquences (6, 11) nucléotidiques dont au moins une est marquée (6), la ou lesdites séquences nucléotidiques (6, 11) étant complémentaires d'une autre partie (8) de la séquence nucléotidique cible (2); en ce que la séquence nucléotidique trappeur (5) est fixée de manière covalente par l'une de ses extrémités sur le support solide (3), comporte une longueur comprise entre 50 et 500 bases; et en ce que la partie (10) de la séquence nucléotidique trappeur (5) qui ne s'hybride pas avec la partie (7) de la séquence nucléotidique cible (2) est inférieure à 60 bases. La présente invention concerne également la trousse de détection et/ou de quantification pour la mise en oeuvre de ce procédé et l'utilisation d'une séquence nucléotidique standard de quantification.

Description

PROCEDE ET TROUSSE DE DIAGNOSTIC ET/OU DE QUANTIFICATION PAR HYBRIDATION DE TYPE SANDWICH DE SEQUENCES D'ACIDES NUCLEIQUES SUR SUPPORT SOLIDE
Ob-iet de l'invention
La présente invention concerne un procédé et une trousse comprenant des réactifs pour la détection et/ou la quantification par hybridation de type sandwich de séquences d'acides nucléiques sur un support solide.
Arrière-plan technologique à la base de l'invention
Il est connu de fixer de l'ADN de manière covalente sur un support et de l'utiliser comme séquence nucléotidique capteur pour fixer une séquence nucléotidique cible ou standard (destinée à la quantification de la séquence cible) et pouvoir la détecter directement, si elle est fixée à une molécule chimique détectable. Dans le cas où la séquence nucléotidique cible ou standard à identifier n'est pas marquée, on peut réaliser une hybridation de type
"sandwich" en utilisant une séquence nucléotidique marquée.
La séquence nucléotidique marquée sera immobilisée si la séquence nucléotidique cible ou standard est présente et immobilisée sur une séquence nucléotidique trappeur. La séquence nucléotidique cible ou standard est alors prise en sandwich entre la séquence nucléotidique trappeur et la séquence nucléotidique marquée, par une double reconnaissance, ce qui augmente la spécificité, réduit le bruit de fond, et permet une quantification des séquences nucléotidiques. Cela n'est possible que si l'hybridation est réalisée de manière quantitative et reproductible. Ceci est d'autant plus vrai que le rendement de cette hybridation est grand.
L'intérêt d'une telle hybridation quantitative est la mesure d'acides nucléiques provenant "d'agents biologiques" pathogènes ou non comme les virus, champignons, bactéries, mycoplasmes, cellules ou tissus animaux et végétaux, souvent amplifiés par une étape d'amplification, telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction (US Patent 4965188), la LCR (Landegren et al., 1988, Science, 241, 1077-1080), le NASBA (Kievits et al. 1991, J. Virol. Methods 35. 273-286), la CPR (Cycling Probe Reaction (WO Patent 95/14106) ou l'ICR.
Cependant, la détection des séquences amplifiées (appelées ci-après a plicons) nécessite de réaliser une détection spécifique sensible et facilement adaptée à un grand nombre d'échantillons.
Une première solution consiste à utiliser des billes, tel que décrit dans la demande de brevet EP- 0205532, où des billes de Sephacryl de 5 à 50 μm sont activées par diazotasion d' ammes aromatiques. D'autre part, les plaques multipuits servent déjà de base pour beaucoup de tests, notamment les ELISA et de nomoreux appareils de lecture en photométrie, fluorescence, luminescence existent déjà pour la lecture de ces plaques. Cependant, il faut pouvoir immobiliser les séquences nucléotidiques cibles ou standards sur ces plaques af n de pouvoir les détecter et/ou les quantifier Cette fixation peut s'obtenir par simple adsorption (réaction non covalente) , et permet de mesurer des amplicons présents en solution (Dahlem et al. 1987, Mol. Cell. Probes 1. 159-168; Cross et al. 1992, The Lancet 340. 870-873; Allibert et al., EP 486661). Cependant ces méthodes souffrent d'une absence de contrôle du processus d' adsorption (qui nécessite' de travailler avec de très grands fragments, souvent des plasmides entiers, et entraîne l'utilisation de trappeurs doubles brins qui peuvent se réassocier) et de la difficulté d'optimaliser la taille et la séquence nucléotidique trappeur du fait des aléats liés à 1 ' adsorption.
Dans différents documents de l'état de la technique, on a cherché à optimaliser la longueur d'une séquence simple brin pouvant servir de trappeur pour une séquence cible et caractériser la longueur de la séquence cible nécessaire pour être détectée dans les meilleures conditions .
Dans le document "J. of Clin. Microbiol" (Vol. 28, juin 1990, pp. 1469-1472), Inouye et Hondo et al. décrivent un procédé d'hybridation directe sur des séquences fixées sur des microplaques de segments d'ADN de différentes longueurs. Cette hybridation s'effectue sur des segments trappeurs d'ADN adsorbés de manière non covalente sur ces microplaques. Des trappeurs de longueurs différentes sont adsorbés et hybrides avec une séquence biotmylée de 642 paires de base. On observe avec les différentes séquences la même courbe d'hybridation, mais une efficience d'hybridation croissante en fonction de la taille des fragments. Sur base de cette expérimentation, les auteurs ont conclu qu'il est préférable que la séquence cible à identifier présente une longueur de plus de 300 paires de base. Comme l' adsorption de 1 "ADN sur le plastique se fait sur de très grandes longueurs et se fait en plusieurs endroits, ceci rend impossible la connaissance des longueurs disponibles pour obtenir une hybridation efficace.
Dans le document "Analytical Biochem. " (No. 177, pp. 27-32 (1989)), Kellèr et al. décrivent un procédé d'hybridation de type sandwich utilisant comme séquence trappeur un fragment de 3300 paires de base servant à la détection d'une séquence cible de 190 paires de base qui est également complémentaire d'une autre séquence marquée, la séquence trappeur simple brin étant fixée par une fonction NH2 de manière covalente à un support solide.
Comme il apparaît à la figure 2 de ce document, il n'existe qu'un recouvrement très partiel de la séquence trappeur et de la séquence marquée par la séquence cible.
Dans la publication "Clin. Chem. " (No. 31, pp. 1438-1443 (1985)), Polsky-Cinky et al. décrivent un procédé dans lequel la séquence trappeur comporte 4800 paires de base dont 800 paires de base sont complémentaires de la séquence cible de 1600 paires de base à détecter. Comme il apparaît dans la figure 1 de ce document, la séquence cible est complémentaire dans l'hybridation d'une autre séquence nucléotidique marquée. La demande de brevet japonais JP-8089300 décrit une séquence trappeur présentant une longueur inférieure à 30000 paires de base et comportant au moins 10 unité répétitives de 100 paires de base susceptibles de s ' hybrider en série selon la même orientation avec des séquences cibles à détecter et augmente la sensibilité des méthodes traditionnelles. La demande de brevet EP-0079139 décrit une séquence trappeur simple brin de 1200 à 1500 paires de base s'hybπdant avec des séquences cibles de 600 à 700 paires de base, détectées par une hybridation sandwich au moyen d'une séquence marquée et complémentaire d'une autre portion de la séquence cible.
Cependant, dans tous ces dispositifs d'hybridation basés sur une hybridation simple ou une hybridation sandwich, on observe un mauvais recouvrement de la séquence trappeur par la séquence cible, ainsi qu'un mauvais recouvrement de la séquence cible par la séquence trappeur et/ou la séquence marquée. Par conséquent, en utilisant de très longues séquences trappeurs pour la détection ou de très longues séquences cibles à détecter, on observe des reploiements des séquences sur elles-mêmes ou avec d'autres séquences "parasites" présentes dans l'échantillon (séquences complémentaires d'une séquence amplicon, etc . ) .
Dans le document "Nucleic Acid Research" (Vol. 21, No. 15, pp. 3469-3472 (1993)), Kosaka et al. décrivent des séquences trappeurs fixées par une liaison covalente sur des microplaques. Ces séquences trappeurs très courtes (de l'ordre de 17 paires de base) sont utilisées pour obtenir une hybridation de séquences cibles à identifier et à quantifier en présence de séquences similaires marquées. Comme il apparaît dans la figure 2 de ce document, malgré la faible longueur de la séquence trappeur, il n'existe pas de recouvrement optimal de cette séquence trappeur par la séquence cible à quantifier. Dans le document "Clin. Chem. " (No. 40/2, pp. 200-205 (1994)), Rasmussen et al. décrivent une séquence trappeur simple brin fixée par une liaison covalente à des microplaques. Cette séquence trappeur très courte (25 nucléotides) est utilisée pour obtenir l'hybridation de séquences cibles de 350 à 500 paires de base . Dans la demande de brevet WO94/06933, on décrit un procédé d'hybridation sandwich au moyen d'une séquence trappeur fixée sur' microplaques par hybridation sandwich d'une séquence cible s ' hybridant avec une séquence marquée. Cependant, dans les exemples d'exécution, les séquences trappeurs sont d'une vingtaine de nucléotides utilisées pour l'hybridation de séquences cibles de 400 à 600 paires de base. Lorsque la séquence nucléotidique trappeur est très courte, on observe un mauvais recouvrement de la séquence cible et un reploiement de la séquence cible sur elle-même ou une réhybridation de séquences cibles entre elles. De plus, le faible pourcentage d'hybridation de la séquence cible sur la séquence trappeur diminue la sensibilité.
Dans le document "Journ. of Clin. Microbiol . " (Vol. 33, pp. 752-754 (1995)), Shaw et al. décrivent un procédé utilisant une séquence trappeur simple brin de 188 paires de base adsorbée sur des microplaques, cette séquence trappeur biotinylée permettant d'hybrider une séquence biotinylée cible de 245 paires de base. Cette technique d'hybridation non basée sur la reconnaissance de type sandwich présente un mauvais recouvrement de la séquence trappeur par la séquence cible, et dans tous les cas, un mauvais recouvrement de la séquence cible sur au moins une soixantaine de paires de base. Par conséquent, cette portion de 60 paires de base suffit pour obtenir des reploiements de la séquence cible, voire de la séquence trappeur, sur elle-même, dont les structures secondaires sont susceptibles de perturber l'hybridation entre la séquence trappeur et la séquence cible, ce qui diminue la sensibilité du test.
Dans le document "Journ. of Chem. Microbiol." (Vol. 9, pp. 638-641 (1991)), Keller et al. décrivent une séquence trappeur simple brin fixée (de manière aléatoire par l'usage de diammo hexane) par une liaison covalente sur des microplaques, cette séquence trappeur simple brin présentant une longueur de 126 paires de base, dont au moins une portion est susceptible de s'hybrider avec une séquence cible de 191 paires de base. Le document mentionne que la séquence simple brin n'est complémentaire que d'une partie de la séquence cible de 191 paires de base, mais n'est pas susceptible d'obtenir un recouvrement complet, en particulier des séquences pπmers de part et d'autre de cette séquence cible de manière à éviter toute homologie de recouvrement entre les pπmers et la séquence simple brin. On observe donc aux deux extrémités de la séquence cible plus de 30 paires de base qui ne sont pas recouvertes par la séquence trappeur, la reconnaissance de l'hybridation étant détectée par le marquage de la séquence cible par de la biotme fixée et peut être reconnue par le conjugué streptavidme peroxydase permettant sa détection par coloπmétπe . On obtient un mauvais recouvrement de la séquence cible à quantifier et un reploiement de la séquence cible et de l'extrémité de la séquence trappeur fixée sur le support solide. De plus, la fixation du trappeur au puits se fait de manière aléatoire et la portion de la séquence du trappeur accessible à la séquence cible n'est pas connue.
La demande de brevet EP-0205532 décrit une séquence trappeur de 341 paires de base fixée de manière covalente sur des microbilles, cette séquence trappeur étant susceptible de réagir avec une séquence cible pour obtenir un recouvrement de la séquence trappeur sur la séquence cible de 175 paires de base, la séquence cible réagissant avec une séquence marquée de 201 paires de base par hybridation sandwich. Cependant, ce document ne décrit pas un recouvrement optimal de la séquence trappeur simple brin par la séquence cible. On observe, au niveau de la séquence trappeur simple brin, une portion libre de 166 paires de base au niveau de laquelle des reploiements de la séquence trappeur simple brin sur elle-même ou 1 ' appariement avec d'autres séquences présentes dans l'échantillon sont susceptibles de diminuer le pourcentage de séquence cible s ' hybridant sur la séquence trappeur, et la sensibilité de la détection et/ou de la quantification.
Les méthodes d'amplification génétique (PCR, LCR, NASBA) à des fins de diagnostic et de dosage d'acides nucléiques présentent également des problèmes au niveau d'une quantification optimale desdits acides nucléiques. En effet, dans une étape de quantification, il faut réaliser une détection et une quantification dans chacune des 3 étapes du dosage à savoir :
1) l'extraction quantitative (souvent complexe) de l'acide nucléique de l'échantillon biologique; 2) l'amplification quantitative de la séquence étudiée; et 3) la mesure quantitative du nombre de séquences amplifiées (appelées amplicons) .
Ces méthodes d'extraction se sont améliorées ces dernières années et le rendement de ces extractions est très souvent supérieur à 90 %, et permet de considérer cette étape comme non limitante dans l'ensemble du processus de quantification de l'acide nucléique. L'étape d'amplification, notamment par la Polymerase Chain Reaction (PCR) (brevet US-4965188) , pose de grosses difficultés pour ce qui est du contrôle de la quantification et de la détection. Dans l'amplification, la première étape consiste à désapparier les doubles brins d'ADN, souvent de très grande longueur (et éventuellement stabilisés par des protéines ou molécules diverses) , et à faire monter la température pour que les deux brins soient séparés. La deuxième étape est 1 ' appaπement
(annealmg) des oligonucléotides amorces. Ceux-ci sont en très large excès par rapport à l'ADN à amplifier et l'on peut trouver des co'nditions dans lesquelles cette reconnaissance est optimale. Ensuite vient l'élongation de l'ADN à partir des amorces par l'ADN polymerase, qui doit se faire dans des conditions optimales (pH, température, sels, dNTP, ...) pour rencontrer les sites de fixation Amorces-ADN. Même dans les conditions optimalisées, on constate que le rendement (ou taux) d'amplification, c'est- à-dire la proportion moyenne des molécules qui se dupliquent au cours d'un cycle ne dépasse pas 90% et peut être même très inférieure à cette valeur (J. Peccoud, 1993,
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De plus, on trouve une variabilité d'un échantillon à l'autre, d'un même échantillon en fonction de la dilution et même d'un tube à l'autre pour un même échantillon (J. Peccoud, 1993, Med/sci, 12, 1378-1385) .
La méthode d'amplification par Ligase Chain Reaction (LCR) (Landegren et al., 1988, Science, 241. 1077- 1080) et par NASBA présentent les mêmes difficultés de l'estimation du taux d'amplification et donc de la quantification des séquences cibles à mesurer. Il existe plusieurs moyens d'obtenir une quantification de la séquence nucléotidique cible. Comme l'amplification dépend de très nombreux facteurs et que des variations sont observées, on doit utiliser comme référence un standard qui soit le plus proche possible de la séquence cible et si possible qui est amplifié dans le même tube. Un standard interne (c'est-à-dire placé dans le même tube de PCR et amplifié en même temps que la séquence cible) est préféré à la comparaison avec un standard externe qui serait amplifié parallèlement au test. L'utilisation d'un standard externe n'est possible que dans le cas où la méthodologie d'amplification est standardisée et reproductible .
Il existe cependant une contrainte qui est celle de la détection quantitative et distincte des 2 amplicons. Pour que l'efficience de l'amplification soit la même, il faut que les 2 séquences soient les plus semblables possible, tout en gardant la possibilité de pouvoir les différentier lors de leur mesure. De plus, si pendant toute une série de cycles, l'efficience est maintenue constante, on constate en fin d'amplification un ralentissement de cette efficience qui fini par devenir nulle. On obtient un effet plateau pour lequel le nombre d' amplicons n'augmente plus avec le nombre de cycles. Ce ralentissement apparaît à des endroits différents de la PCR en fonction du nombre de copies présentes au départ. Ceci complique l'utilisation du standard interne qui continue à être amplifié lorsque la cible est déjà arrivée au plateau. Si la différence de concentration entre les 2 séquences est trop grande, l'une des 2 arrivera au plateau alors que l'autre ne sera pas encore en concentrations suffisantes pour être mesurée. Ces contraintes conduisent souvent les auteurs à se limiter à des concentrations en standard interne très proches de celles des séquences cibles et à travailler dans la zone d'amplification logarithmique de la PCR, c'est-à-dire avec un nombre d' amplicons réduit. La demande de brevet WO96/09407 décrit un procédé d'amplification comprenant l'utilisation d'un standard interne présentant une partie spécifique différente de la séquence nucléotidique cible à quantifier par 17 acides animés. Dans ce cas, les séquence cible et standard de même longueur sont quantifiées en les fixant à des biotines réagissant sur une streptavidine fixée sur un support solide.
La demandé de brevet WO93/10257 décrit un procédé de quantification d'un fragment d'ADN par l'addition d'un standard interne différent du fragment d'ADN cible à quantifier par moins de 10% en séquence et/ou en taille. La séquence nucléotidique standard diffère du fragment d'ADN cible par une séquence spécifique comportant une délétion, mutation ou addition en un site de 1 à 5 nucléotides permettant l'incorporation d'un site de restriction ou de coupure réalisable par une enzyme ou tout autre moyen. La quantification s'effectue par une reconnaissance spécifique du fragment d'ADN cible ou de la séquence nucléotidique standard par des amorces spécifiques différentes. L'utilisation d'amorces différentes s ' hybridant avec les fragments dans des sites différents va générer des fragments marqués de tailles et de séquences différentes, qui pourront être séparés par électrophorèse . Ce procédé est basé sur une double vérification de la spécificité d'identification. Cependant, de tels procédés et dispositifs basés sur 1 ' identification sélective de la séquence standard en une étape, ne garantissent pas une spécificité et une sensibilité suffisantes, ce qui peut occasionner la présence de faux positifs ou de faux négatifs lors d'une quantification d'une séquence nucléotidique cible.
Buts de l'invention
La présente invention vise à fournir un nouveau procédé et une trousse permettant une détection et/ou une quantification de séquence d'acides nucléiques qui ne présenteraient pas les inconvénients de l'état de la technique cité.
Un but particulier de la présente invention vise à fournir un proc'édé et une trousse permettant une hybridation optimale des séquences d'acides nucléiques, en particulier un haut pourcentage d'hybridation de la séquence trappeur par une séquence cible ou standard, un faible risque de reploiement de ces séquences ou de la séquence trappeur sur elle-même et un faible risque de ré- appaπement de ces séquences par des séquences complémentaires présentes dans l'échantillon.
Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé et une trousse de détection et/ou de quantification présentant une spécificité et une sensibilité améliorées par rapport aux procédés et aux dispositifs de l'état de la technique, en particulier pour la détection et/ou la quantification de tout type d'acides nucléiques présents dans un échantillon biologique et obtenus éventuellement après une amplification génétique
Un but additionnel de la présente invention vise à obtenir un procédé et une trousse de détection et/ou de quantification de ladite séquence d'acides nucléiques cible qu permettent l'amplif cation d'une séquence standard interne ou externe quel que soit le nombre de cycles d'amplification génétique.
Eléments caractéristiσueg de l'invention La présente invention est relative à un procédé de détection et/ou de quantification d'une séquence nucléotidique dénommée "cible"" présente dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend une mise en contact de type "sandwich" de ladite séquence nucléotidique cible 2 avec une séquence nucléotidique dénommée "trappeur" 5 fixée sur un support solide insoluble 3, ladite séquence nucléotidique trappeur étant complémentaire d'une partie 7 de la séquence nucléotidique cible, la mise en contact de type "sandwich" s 'effectuant également avec une ou plusieurs autre (s) séquence (s) nucléotidique (s) (6, 11) dont au moins une (6) est marquée, la ou lesdites séquence (s) nucléotidique (s) (6,11) (dont au moins une (6) est marquée) étant complémentaire (s) d'une autre partie 8 de la séquence nucléotidique cible 2 (une autre partie que celle 7 hybridée par la séquence nucléotidique "trappeur" 5) ; en ce que la séquence nucléotidique trappeur 5 est fixée de manière covalente par une de ses extrémités au support solide 3; en ce que la séquence nucléotidique trappeur 5 comporte une longueur comprise entre 50 et 500 bases, de préférence entre 100 et 300 bases, plus particulièrement entre 120 et 250 bases; et en ce qu'une partie 10 de la séquence nucléotidique trappeur 5 ne s'hybridant pas avec la partie 7 de la séquence nucléotidique cible 2 est inférieure à 60 bases, de préférence inférieure à 40 bases ou inférieure à 20 bases, voire nulle. Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, les parties 13 de la séquence nucléotidique cible 2 ne s'hybridant pas avec la séquence nucléotidique trappeur 5 et avec la ou le (s) séquence (s) nucléotidique (s) (6, 11) (dont au moins une (6) est marquée) , est inférieure à 60 bases, de préférence inférieure à 40 bases, voire nulle .
Dans la suite de la description, la ou les séquence (s) nucléotidique (s) (6, 11) (dont au moins une (6) est marquée) prendront la dénomination de séquences nucléotidiques "helper" 11 lorsque la ou lesdites séquences ne sont pas marquées, et de séquences nucléotidiques "marquées" 6 lorsque c*elles-cι sont susceptibles d'être reconnues directement ou indirectement par un système de détection et/ou de quantification, de préférence choisi parmi le groupe constitué par la fluorescence, la chemolummescence, 1 ' électroluminescence, la coloration, la détection par marquage radioactif, la bioluminescence, 1 ' électrochimie, la réflexion de la lumière, un procédé optique ou un mélange d'entre eux.
Les séquences nucléotidiques "helper" 11 sont utilisées pour stabiliser le "sandwich" et obtenir un recouvrement le plus complet possible de la séquence nucléotidique cible 2 sur la séquence nucléotidique marquée 6 et sur la séquence nucléotidique trappeur 5, ce qui augmente la sensibilité et la spécificité du procédé selon 1 ' invention.
Dans le procédé de détection et/ou de quantification, l'hybridation sandwich se réalise de préférence en deux étapes, c'est-à-dire que la première étape consiste en l'hybridation de la séquence nucléotidique cible 2 sur la séquence nucléotidique trappeur 5 et que la seconde étape est l'hybridation de la séquence nucléotidique cible 2 par une ou plusieurs séquences nucléotidiques (6, 11) dont au moins une (6) est marquée. Les deux étapes sont de préférence séparées par une étape de lavage. Dans le mode d'utilisation préféré, les séquences sont choisies de manière à ce que les conditions (température, concentration en sels, temps de réaction) soient compatibles pour les deux hybridations, ce qui permet de réaliser l'hybridation en une seule étape. Selon l'invention, les séquences nucléotidiques cible et standard à détecter et/ou quantifier sont constituées de tout type d'acide nucléique, ADN ou ARN. De préférence, les séquences nucléotidiques trappeur, "helper", marquée (s) et standard (s) utilisées selon la présente invention sont constituées d'ADN de manière à éviter toute destruction de ces séquences par des RNase éventuellement présentes dans l'échantillon biologique .
Avantageusement, les séquences nucléotidiques cible 2 et standard 1 sont le résultat d'une amplification préalable par un procédé d'amplification génétique, de préférence choisi parmi le groupe constitué par la PCR, la LCR, la CPR, la NASBA ou l'ICR.
Selon l'invention, dans le cas où la séquence nucléotidique cible 2 est un amplicon résultant d'une amplification génétique, la partie 9 terminale 5' de la séquence nucléotidique cible 2 peut être laissée non recouverte par la ou les séquence (s) marquée (s) 6 et la ou les séquence (s) nucléotidique (s) "helper" 11, et est alors recouverte par une séquence nucléotidique "primer" 12 (dénommée également "amorce") complémentaire, utilisée pour 1 ' amplificacion de la séquence nucléotidique cible 2. Selon l'invention, on peut considérer cette séquence nucléotidique "primer" 12 comme étant une séquence de type "helper". Il est donc possible d'obtenir également un recouvrement optimal, voire total, de la séquence nucléotidique cible 2 par la séquence nucléotidique trappeur 5, la ou les séquence (s) nucléotidique (s) 6 marquée (s), et éventuellement la ou les séquences nucléotidiques "helper" 11 et le primer 12.
L'invention concerne également un procédé de quantification d'une séquence nucléotidique cible 2 présente dans un échantillon biologique, qui comprend les étapes suivantes :
- une préparation d'une quantité connue d'une séquence nucléotidique standard 1 possédant au moins une partie A commune à la séquence nucléotidique cible 2 et une partie spécifique B dont la séquence est différente et possède un contenu en bases GC/AT proche, de préférence identique, à la séquence d'une partie spécifique B de la séquence nucléotidique cible 2, - une extraction éventuelle de la séquence nucléotidique cible 2 à quantifier de l'échantillon biologique,
- une amplification éventuelle de la séquence nucléotidique cible 2, et
- une mise en contact de type "sandwich" des séquences nucléotidiques cible 2 et standard 1 avec une séquence nucléotidique trappeur 5, de préférence telle que décrite ci -dessus, la séquence nucléotidique trappeur 5 étant complémentaire de la partie commune de la séquence nucléotidique cible et de la séquence nucléotidique standard, la mise en contact de type "sandwich" s 'effectuant également avec une ou plusieurs séquences nucléotidiques (6, 11) dont au moins une (6) est marquée et complémentaire de la partie spécifique B de la séquence nucléotidique cible 2 ou de la partie spécifique B de la séquence nucléotidique standard 1, - ledit procédé comprenant également une quantification du rapport entre le marquage spécifique de la séquence nucléotidique cible 2 et le marquage spécifique de la séquence nucléotidique standard 1.
On entend par "contenu en bases GC/AT proche", que le rapport en bases GC/AT du standard soit différent de moins de 20% du rapport en bases GC/AT de la séquence nucléotidique cible.
Par conséquent, dans le procédé de quantification selon l'invention, on combine avantageusement la mise en contact de type "sandwich" telle que décrite précédemment ou non avec un dispositif de quantification par une séquence nucléotidique standard interne ou externe .
Les parties spécifiques B des séquences nucléotidiques standard et cible correspondent de préférence à la partie 8 des séquences nucléotidiques cible ou standard. La partie commune A correspond de préférence à la partie 7 de cette séquence nucléotidique cible ou standard s'hybridant avec la séquence nucléotidique trappeur 5.
Selon l'invention, la partie spécifique B de la séquence nucléotidique standard 1 est différente de la partie spécifique B de la séquence nucléotidique cible par 5 à 500 nucléotides, de préférence par 20 à 40 nucléotides. Avantageusement, la séquence nucléotidique standard interne 1 comporte de part et d'autre de la séquence spécifique B et commune A des parties 15 communes à des parties 15 de la séquence nucléotidique cible 2, et pouvant servir en totalité ou en partie de séquences complémentaires à des séquences amorces 12 pour une amplification génétique. Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour l'utilisation de séquences nucléotidiques standards internes amplifiées conjointement avec la séquence nucléotidique cible 2 ou de standards externes amplifiés en parallèle avec les séquences nucléotidiques cible 2.
Avantageusement, le procédé selon l'invention comporte un nombre élevé de cycles d'amplification génétique, de préférence par PCR ou LCR, de préférence supérieur à 30. Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, le standard interne est ajouté en quantité variable à l'échantillon de départ et le rapport obtenu entre le marquage spécifique de la séquence nucléotidique cible 2 et le marquage spécifique de la séquence nucléotidique standard 1 est porté en graphique en fonction de quantités connues ajoutées à l'échantillon de départ, permettant de déterminer sur la droite ainsi obtenue, pour un rapport égal à 1, quelle est la quantité de séquence nucléotidique cible 2 présente dans l'échantillon. Selon une autre forme d'exécution préférée de la présente invention, la séquence nucléotidique standard est ajoutée en quantité identique à un échantillon ayant subi diverses dilutions, et le rapport entre le marquage spécifique de la séquence nucléotidique cible et le marquage spécifique de la séquence nucléotidique standard est porté en graphique en fonction des dilutions de l'échantillon, et la droite obtenue permet: de déterminer, pour un rapport égal à 1, quelle est la quantité de séquence nucléotidique cible 2 présente dans l'échantillon. La quantification peut également être réalisée par comparaison du rapport obtenu avec une seule quantité déterminée de standard ajouté à une seule quantité d'échantillon et d'une droite d'étalonnage.
La présente invention concerne également la trousse de détection et/ou de quantification comprenant les réactifs pour la réalisation des procédés décrits ci- dessus.
La trousse de détection et/ou de quantification par hybridation de type "sandwich" d'une séquence nucléotidique - cible 2 comprend une séquence nucléotidique trappeur 5 fixée sur un support solide 3 insoluble et complémentaire d'une partie 7 de la séquence nucléotidique cible 2 et une ou plusieurs autres séquence (s) nucléotidique (s) (6, 11) (dont au moins une (6) est marquée), la ou lesdites séquence (s) nucléotidique (s) (6, 11) étant complémentaire (s) d'une autre partie 8 de la séquence nucléotidique cible 2. Dans la trousse de détection et/ou de quantification selon l'invention, ladite séquence nucléotidique trappeur 5 est fixée de manière covalente par l'une de ses extrémités sur le support solide 3 et comporte une longueur comprise entre 50 et 500 bases, de préférence entre 100 et 300 bases, plus particulièrement entre 120 et 250 bases, et la partie 10 de la séquence nucléotidique trappeur 5 qui ne s 'hybride pas avec la partie 7 de la séquence nucléotidique cible 2 est inférieure à 40 bases, de préférence inférieure à 20 oases, voire nulle.
Il est bien entendu que dans le procédé et la trousse selon l'invention, la séquence nucléotidique marquée présente une longueur suffisante pour reconnaître de manière spécifique la séquence nucléotidique cible ou standard à détecter et/ou quantifier, cette spécificité dépendant du type de séquence nucléotidique cible ou standard à détecter et/ou quantifier, et peut être caractérisée par une reconnaissance par hybridation d'une portion spécifique complémentaire d'au moins 10 bases, de préférence de plus de 20 bases, de la séquence nucléotidique cible ou standard. La trousse selon l'invention comprendra également les réactifs nécessaires pour l'identification spécifique de la séquence marquée, pour la détection et/ou la quantification par un* procédé choisi de préférence parmi le groupe constitué par la fluorescence, la chemolummescence, 1 ' électroluminescence, la coloration, la détection par marquage radioactif, la bioluminescence, 1 ' électrochimie, la réflexion de la lumière, un procédé optique ou un mélange d'entre eux.
La séquence nucléotidique trappeur 5 est fixée de manière covalente sur le support solide insoluble 3 et se réalise de préférence par l'intermédiaire d'un phosphate 5 ' terminal de la séquence nucléotidique trappeur 5 sur une ou plusieurs fonctions aminés du support solide 3 insoluble par réaction avec du carbodu ide . Le support solide insoluble 3 est choisi de préférence parmi le groupe constitué par des tubes, des filtres, des billes, éventuellement magnétiques, des plaques multipuits, une plaque ou un mélange d'entre eux.
L'invention concerne également une trousse de détection et/ou de quantification qui comporte une séquence nucléotidique standard 1 interne ou externe telle que décrite ci-dessous et tous les éléments nécessaires pour l'extraction, l'amplification, la détection et/ou la quantification selon les procédés décrits ci-dessus.
La présente invention sera décrite plus en détails dans les exemples ci -dessous en référence aux figures annexées.
Brève description des figures
La figure 1 représente un exemple schématique d'hybridation sandwich selon l'invention. La figure 2 représente une courbe de concentration d'ADN cible de CMV obtenue après hybridation en sandwich et détection en bioluminescence. La figure 3 représente une courbe de sensibilité d'ADN de Chlamydia trachomatis mesurée après amplification par PCR, hybridation sandwich et détectée en colorimétπe par le conjugué streptavidine-peroxydase . La figure 4 représente un schéma illustrant la structure nucléotidique d'un standard compétitif type, comparé à celle d'un ADN cible à mesurer lors d'une amplification par PCR. La figure 5 représente un schéma d'un standard compétitif (A) pour la mesure de l'ADN viral de CMV et sa comparaison avec l'ADN cible (B) . La numérotation correspond à la séquence nucléotidique "immédiate early gène" (Demmler et al., 1988, J. Infectious Diseases, 158. 1177- 1184) . La figure 6 représente un schéma d'un standard compétitif (A) pour la mesure de l 'ARN du virus HIV et sa comparaison avec l'ARN cible (3) . La numérotation correspond à la séquence nucléotidique de l'ARN viral ("Los Alamos de
HIV", Meyers et al. (1992)).
La figure 7 est une description schématique du principe de la quantification d'un ADN cible par utilisation d'un standard compétitif selon l'invention et leur mesure respective par des sondes spécifiques après capture sur une séquence commune immobilisée.
La figure 8 représente une courbe de la concentration en ADN cible de CMV et du standard correspondant par hybridation sandwich et mesuré en spectrophotométπe .
La figure 9 représente* une courbe de concentration en ADN cible de CMV et en standard correspondant après amplification par PCR et hybridation sandwich en utilisant une sonde trappeur commune et une sonde biotinylée spécifique de l'ADN cible ou du standard.
La figure 10 représente les mesures de l'ADN cible de CMV et du standard interne après une amplification par 40 cycles de PCR lorsque 1000 copies de standard ont été ajoutées à des quantités croissantes d'ADN cibles et mesurées après PCR par hybridation sandwich comme défini à la figure 7.
La figure 11 représente la droite d'étalonnage d'un ADN cible de CMV par l'utilisation d'un standard interne selon l'invention. L'abscisse représente les rapports des signaux de cible et du standard obtenus à la figure 10.
La figure 12 représente la quantification d'un ADN cible de CMV en fonction du nombre de cvcles de la PCR grâce à l'utilisation d'un standard compétitif selon l'invention. Un standard compétitif de la séquence de CMV tel que décrit à la figure 5 a été utilisé et ajouté en quantité constante à l'échantillon ayant subi 4 dilutions différentes. La figure 13 représente une RT-PCR compétitive réalisée sur un ARN cible de HIV et un ARN standard (figure 6) et une détection en bioluminescence après hybridation sandwich.
Le graphique représente pour chaque RT-PCR le rapport entre la détection obtenue en utilisant "une sonde spécifique du cible et celle du standard. Les résultats montrent une compétition entre l'amplification du cible ajouté en quantité constante (108 copies) par rapport au standard ajouté en quantité décroissante allant de 1010 (1) , 108 (2) à 106 (3) copies.
Description d'une forme d'exécution préférée de l'invention
La séquence nucléotidique trappeur 5, de préférence une séquence d'ADN, est fixée de manière covalente sur des plaques de multipuits 3. Cette fixation covalente est obtenue par la liaison d'un phosphate situé en position 5' terminale de la séquence du trappeur sur une aminé située sur le support en présence de carbodii ide, telle que décrite par Rasmussen et al. (1991, Anal.
Biochem. 198, 138-142) . Les séquences nucléotidiques trappeur 5 fixées peuvent hybrider un ADN cible 2, qui sera ensuite hybride en sandwich par une séquence nucléotidique marquée 6.
Un avantage de l'hybridation en sandwich est un bruit de fond très faible qui permet de réaliser une analyse massive d'échantillons cliniques avec un minimum de purification de l'ADN.
La quantité de séquences nucléotidiques trappeurs fixées sur les multipuits peut atteindre 1,2 pmoles pour des petits oligonucléotides, mais en ce qui concerne les séquences nucléotidiques plus grandes, la quantité fixée est moins importante (de l'ordre de 300 fmoles pour des séquences nucléotidiques de 500 bases environ) . La quantité de" séquences nucléotidiques trappeurs fixées est suffisante pour ne pas être limitante dans le procédé d'hybridation de l'invention.
La fixation de la séquence nucléotidique trappeur sur des microbilles permet également d'augmenter le nombre de séquences nucléotidiques trappeurs dans la solution de réaction en utilisant une quantité de billes plus importante.
Les séquences nucléotidiques trappeurs selon 1 ' invention choisies sont complémentaires sur toute leur longueur de la séquence nucléotidique cible à détecter. Ceci permet avantageusement une production aisée de ces séquences nucléotidiques trappeurs par PCR à partir de séquences nucléotidiques cibles clonées dans des plasmides et peuvent ainsi servir à une production industrielle reproductible de ces séquences nucléotidiques trappeurs.
On peut cependant utiliser des trappeurs dont une partie de la séquence nucléotidique comprend une ou des parties de séquences non complémentaires αe la séquence du ciole Les Inventeurs ont testé des séquences nucléotidiques trappeurs possédant une séquence de 20 ou 40 bases non complémentaire de la séquence nucléotidique cible et située en position 5' terminale servant à la fixation sur les multipuits. Ces séquences servent de "spacers" entre la séquence trappeur proprement dite et le support solide. Dans cette expérience, la séquence portant un "spacer" de 20 bases est plus efficace que les spacers de 40 et 60 bases pour hybrider de petites séquences cibles. Ce résultat est probablement dû aux possibilités supplémentaires de repliement de ces séquences nucléotidiques trappeurs sur elles-mêmes, ce qui diminue, voire inhibe, l'hybridation des séquences nucléotidiques cibles. Ces repliements ont pu être visualisés par l'utilisation des programmes de prédiction des structures secondaires Olιgo4 et DNA-fold et ils peuvent effectivement impliquer des portions parfois assez longues de la séquence trappeur.
Ces repliements sont à éviter au maximum, car ils diminuent l'efficacité de l'hybridation, surtout lorsqu'ils impliquent des portions non complémentaires à la séquence cible qui ne peut donc pas les déplacer.
Une autre propriété du procédé et de la trousse de l'invention est l'utilisation avantageuse de séquences nucléotidiques trappeur ayant une taille minimale de 50 bases si possible 100 et au mieux 150 ou plus de bases. Cette observation est inattendue sur la base de considérations suivantes.
La stabilité des hybrides, dans le cas où la force ionique est constante et la taille suffisante (au delà de 50 cases) , ne dépend plus que de la composition (% G + C i et non de la taille des hybrides L'importance de la taille pour favoriser ou non l'hybridation dépend de la vitesse de l'hybridation et non de leur stabilité. Effectivement, en solution, la taille des brins d'acides nucléiques influence la vitesse de réappariement . Celle-ci est proportionnelle à la racine carrée de la longueur (Wetmur, J.G. and Davidson, N. 1968, J. Mol. Biol. 3, 584) et dans le cas où les 2 brins sont de taille différente, la vitesse est proportionnelle à la racine carrée du brin le plus court que ce soit un ADN (Wetmur, J.G. 1971, Biopolymers 10, 601) ou un ARN (Hutton, J.R. and Wetmur, J.G. 1973, J. Mol. Biol. 77, 495).
L'autre facteur qui influence la vitesse de l'hybridation est la concentration respective des séquences nucléotidiques cibles et des séquences nucléotidiques trappeurs. La situation dans ce cas est complexe car deux réactions sont possibles : d'une part les séquences nucléotidiques cibles à mesurer étant habituellement double brins dans la solution de départ, elles vont pouvoir se réassocier entre elles et d'autre part elles vont pouvoir s'hybrider sur la séquence nucléotidique trappeur. Il s'agit donc de deux réactions compétitives, l'une se passant en solution (la réassociation des doubles brins de la séquence nucléotidique cible) et l'autre sur un support solide (l'hybridation sur la séquence nucléotidique trappeur) .
On peut considérer tout d'abord la situation où la quantité de séquence nucléotidique trappeur est en excès par rapport à la quantité de séquence nucléotidique cible. On détecte des concentrations de séquence nucléotidique cible de l'ordre de la fmole (de 0,1 à 50 fmoles) alors que la quantité de séquence nucléotidique trappeur peut atteindre 300 fmoles. Si les 2 réactions compétitives se passaient en solution, la formule cinétique qui exprime la diminution de la concentration en séquence nucléotidique cible simple brin (ADN) en solution (Cs) en fonction du temps est de :
Figure imgf000029_0001
dans laquelle : k2 : constante cinétique de réassociation de l'ADN k]_ : constante cinétique d'hybridation avec la séquence nucléotidique Cf : concentration de la séquence nucléotidique qui s ' hybride sur 1 ' ADN .
Comme la réaction s'effectue sur support solide insoluble, il faut tenir compte de la vitesse de diffusion (J) de la séquence nucléotidique cible simple brin vers la surface solide sur laquelle est fixée la séquence nucléotidique trappeur, soit :
Figure imgf000029_0002
La situation devient très complexe et ne peut être appréhendée dans son ensemble. Anderson et Young (1985) ont essayé de mesurer l'influence de la taille de la séquence nucléotidique cible double brin sur l'hybridation sur filtre en présence d'un excès de séquence nucléotidique fixée et ils concluent "The différence m dependence on molecular weight of the two types of filter hybridization is not understood" .
En ce qui concerne l'influence de la taille de la séquence nucléotidique trappeur sur support solide en plastique, les études n'ont pas encore été réalisées et il n'est pas possible d'obtenir une formulation mathématique permettant de prévoir les résultats obtenus avec le procédé de l'invention.
Si on examine cependant les conditions particulières du milieu réactionnel, on constate que la quantité de séquence nucléotidique trappeur (par exemple 300 fmoles) est largement en excès par rapport à la quantité de séquence nucléotidique cible (par exemple 10 fmoles) . Si on considère que cet excès permet de compenser les limitations dues à la diffusion, on se retrouve dans une situation proche de la réaction en solution où la vitesse d'hybridation devrait être proportionnelle à la racine carrée de la longueur des séquences.
En choisissant une séquence nucléotidique trappeur de 360 bases au lieu de 180 bases, on a observé le déplacement d'un rendement de 30% à 50% soit une augmentation de 1,67 fois. Même en se basant sur un effet de taille en solution c'est-à-dire à une vitesse dépendant de la racine carrée de la longueur, on aurait dû s'attendre à une augmentation maximale de 1,4 fois. En outre, un rendement de 50% n'a jamais été décrit à ce our dans la littérature scientifique.
En comparant les rendements de l'hybridation en fonction de petites séquences nucléotidiques trappeurs allant de 50, 100, 150 et 250 bases, on constate (en prenant l'hybridation sur la séquence nucléotidique trappeur de 50 bases comme référence) , une augmentation de rendement de 4 , 6 et 17 fois alors que les racines carrées de ces séquences sont dans un rapport respectif de 1,4, 1,7 et 2,2 fois. On constate donc un effet inattendu de la longueur de ces séquences nucléotidiques trappeurs sur l'augmentation du rendement de 1 ' hycπdation. Une application particulière de ces hauts rendements d'hybridation de l'ADN cible sur support insoluble est son utilisation pour purifier un des deux brins de cet ADN cible. En effet le trappeur est constitué d'un seul brin car on utilise lors de sa construction par PCR une seule amorce phosphorylée en position 5' terminale. Ce phosphate est le seul à pouvoir réagir sur le support aminé. Après fixation, on lave la plaque en présence de NaOH 0,4 N (cfr. exemple 1) afin d'enlever le deuxième brin. On se retrouve donc avec un seul brin fixé sur le support. Ce brin étant complémentaire d'un seul des deux brins d'ADN cible, il va fixer ce brin. Après lavage, ce brin hybride peut être déhybndé facilement par exemple par chauffage ou par du NaOH 0,4 N. On obtient ainsi dans la solution un brin unique d'ADN. Cette technique peut être utilisée sur une grande échelle par exemple en utilisant des billes sur lesquelles sont fixées les séquences nucléotidiques trappeurs. Cette préparation de brin simple peut avoir de multiples applications comme réactifs en utilisant un brin marqué chimiquement par exemple.
La détection de séquences cibles non marquées est réalisée en utilisant leur hybridation sur des séquences nucléotidiques trappeurs fixées sur un support insoluble en utilisant une ou plusieurs séquences nucléotidiques dont au moins une est marquée (séquences nucléotidiques de détection) qui peuvent s'hybrider sur la partie de la séquence nucléotidique cible non reconnue par la séquence nucléotidique trappeur. Cette séquence peut être marquée chimiquement et détectée suivant les diverses méthodes connues de l'homme de l'art. Il est possible d'obtenir une fixation de 80% au moins de la séquence nucléotidique de détection par rapport à la séquence nucléotidique cible hybridée sur la séquence nucléotidique trappeur.
En examinant l'influence de la longueur de cette séquence nucléotidique marquée sur l'efficacité de l'hybridation sandwich, on constate l'importance d'utiliser une séquence nucléotidique marquée qui recouvre le plus possible la séquence nucléotidique cible. Les meilleurs rendements sont obtenus lorsque la séquence nucléotidique cible est recouverte entièrement d'une part par la séquence nucléotidique trappeur et d'autre part par la séquence nucléotidique de détection (figure 1) .
Dans le cas de la détection d' amplicons obtenus par PCR, on peut laisser du côté 5' terminal de la séquence nucléotidique cible une séquence non recouverte par la séquence nucléotidique de détection mais qui pourra être reconnue par les amorces toujours présentes dans la solution de la PCR. De cette manière l'ensemble de la séquence nucléotidique cible est recouvert lors de l'hybridation et il n'y a pas d'interférence entre les amorces et la séquence nucléotidique pendant l'hybridation.
L'efficacité accrue obtenue par cette procédure peut probablement s'expliquer de la manière suivante. Lorsque l'on réalise l'hybridation en une seule étape, la séquence nucléotidique cible dissociée en simple brin se retrouve dans la solution en présence de son brin de séquence nucléotidique cible complémentaire mais aussi de la séquence nucléotidique de détection (et éventuellement des amorces) et sur le support de la séquence nucléotidique trappeur. La séquence nucléotidique cible peut soit d'abord réagir avec la séquence nucléotidique de détection avant de venir se fixer sur le trappeur, soit se fixer sur le trappeur avant de fixer la séquence nucléotidique de détection. Dans les 2 cas, l'utilisation de grandes séquences nucléotidiques va favoriser la vitesse de réaction ainsi que la stabilité des hybrides formés. Cependant dans cet état intermédiaire, où seule la séquence nucléotidique est hybridée, la séquence nucléotidique cible possède une partie de sa séquence non appariée qui peut alors être reconnue par une séquence nucléotidique cible complémentaire qui pourra redéplacer l'hybride intermédiaire et refaire une séquence nucléotidique cible double brin. Par contre lorsque la séquence nucléotidique cible sera hybridée et recouverte complètement par la séquence nucléotidique trappeur et par la séquence nucléotidique de détection sans avoir aucun (ou trop peu) de séquence libre, l' appariement (annealmg) d'un autre brin de la séquence nucléotidique cible complémentaire ne pourra plus avoir lieu et l'hybride sandwich sera stable. Dans le cas où la séquence nucléotidique cible même après hybridation sandwich garde une séquence libre, celle-ci pourra toujours servir de site d' appariement pour l'autre brin de la séquence nucléotidique cible complémentaire, ce qui déstabilisera l'hybride et pourra même le dissocier en fonction des conditions expérimentales (température, sels, ...), car une fois 1 ' appariement commencé, la propagation de la formation du double brin est très rapide et thermodynamiquement favorable .
Cette optimalisation des divers paramètres et composés intervenant dans cette hybridation sandwich permet de réaliser cette hybridation sandwich à la fois avec une séquence nucléotidique marquée présente dans la solution et une séquence nucléotidique trappeur fixée sur un support insoluble en même temps alors que si ce n'est pas le cas, il faut d'abord réaliser une hybridation en solution avant de faire la capture sur une séquence nucléotidique immobilisée comme décrit par Ghost et al. (EP. 557456) ou par un système plus complexe d'hybridation sandwich en solution puis capture par un récepteur fixé sur un support solide (Miller, US : 5,374,524).
Une autre caractéristique du procédé d'hybridation sandwich selon l'invention est que non seulement la séquence cible peut être entièrement recouverte par la séquence nucléotidique trappeur et la séquence nucléotidique marquée, mais que la séquence trappeur peut être entièrement recouverte par la séquence cible. Ceci permet "donc d'utiliser comme séquence nucléotidique marquée des grandes séquences nucléotidiques doubles brins produites par exemple facilement par une amplification en PCR en présence de dUTP-biotine . En effet une fois l'un de ces brins biotinylés appariés avec la séquence nucléotidique cible, il sera totalement recouvert et ne pourra plus être redéplacé par son brin complémentaire, ce qui n'est pas le cas dans ces travaux rapportés par Keller et al. (1989, Anal. Bioch. 177, 27- 32) . Cette invention permet donc une production facile en très grande quantité d'une part des séquences nucléotidiques trappeur en utilisant une amorce portant un phosphate en 5' terminal qui permettra la fixation covalente d'un seul de ces brins sur les microplaques aminées et d'autre part des séquences nucléotidiques marquées. Si les séquences marquées sont petites, de 20-30 ou 40 bases, elles seront synthétisées chimiquement et seront simples brins. Si elles sont plus grandes, on peut les produire par amplification. Le dépassement de la séquence nucléotidique cible en dehors de la partie hybridée sur le capteur et la séquence nucléotidique de détection par son extrémité 5' terminale entraînait une diminution du rendement d'hybridation si cette partie non recouverte devenait importante. C'est aussi le cas si la partie 3' terminale n'est pas recouverte. En choisissant des conditions de réaction optimales, une séquence nucléotidique cible de 20 bases se fixe sur une séquence nucléotidique trappeur de 20 bases qui lui est complémentaire avec un rendement qui peut être 25 fois supérieur par rapport à une séquence qui possède les mêmes 20 nucléotides mais qui a en outre 20 autres nucléotides supplémentaires du côté 3' terminal. On voit donc une différence d'efficacité de 25 fois entre ces 2 séquences du fait de la présence d'un morceau de la séquence non hybridée du côté 3'. L'explication d'un tel effet est sans doute due à un effet d'encombrement stérique de cette séquence libre située près du support. Cet effet inattendu peut être utilisé afin de pouvoir mesurer des petites séquences de nucléotides en présence de séquences plus grandes c'est le cas dans des méthodes d' amplifications comme la CPR où le produit de la réaction a mesurer est une petite séquence provenant d'une séquence nucléotidique de départ plus grande. L'invention concerne la construction d'une ou de plusieurs séquences d ' oligonucléotides (ADN ou ARN) ayant des spécificités particulières, telles que décrites ci-dessous, et leur utilisation comme standards pour la mesure de séquence (s) cible (s) d'ADN ou d 'ARN par hybridation sandwich à l'aide de sondes oligonucléotidiques marquées selon le procédé décrit ci -dessus ou non. La construction représentée à la figure 4 de cette séquence "standard" 1 a été conçue de manière à ce que, en cas d'une éventuelle amplification préalable, l'efficience de l'amplification soit identique ou très proche de celle de la séquence cible 2 à quantifier et que les amplicons du standard et du cible puissent être quantifiés avec une efficience égale ou très proche.
Le standard 1 selon 1 ' invention est compatible avec une éventuelle amplification préalable et une détection quantitative d'une séquence d'ADN (ou ARN) dont une partie A de la séquence est identique à l'ADN cible et une partie B, au moins (la plus petite possible) est différente. Dans le" cas d'une amplification par PCR, ces deux parties seront flanquées de deux séquences 3 identiques à celles de l'ADN ou l'ARN cible qui serviront de matrice pour la fixation d' oligonucléotides amorces
(primers) 4. La longueur du standard sera identique ou très proche de celle de l'ADN ou l'ARN cible. L'on veillera aussi à introduire dans la partie spécifique B un contenu en base AT et GC proche ou identique à celle de 1 'ADN ou l'ARN cible. Un exemple de standard utilisé pour la quantification d'un fragment d'ADN du virus CMV est donné dans la figure 5, et un exemple de standard à ARN pour la quantification d'une séquence d'ARN du virus HIV est montré à la figure 6.
Un tel standard permet également une utilisation comme standard externe ou comme standard interne pour l'amplification par PCR En effet, leur similitude et identité partielle permet un taux d'amplification très proche ou identique à celui de l'ADN ou l'ARN cible. Ils possèdent des séquences matrice 3 pour les amorces 4 identiques, donc qui réaliseront leur fixation (annealing) dans les mêmes proportions. Leur longueur identique, leur identité de séquence sur une grande distance et la similitude de la partie non commune en longueur et en rapport nombre de bases GC/nombre de bases AT fait que la lecture par l'ADN polymerase se réalisera avec la même efficience. Dans le cas d'une utilisation comme standard interne, il possède également une propriété particulière. En effet, pendant la phase d'amplification, le ralentissement et l'arrêt de l'amplification de la séquence standard entraîne le même ralentissement pour la séquence cible et réciproquement. Ce ralentissement de l'efficience à la fin du processus d'amplification peut être due à plusieurs raisons : la diminution du nombre d'amorces, du nombre de nucléotides libres, la baisse d'activité de la DNA polymerase ou la rehybridation trop rapide des amplicons entre eux plutôt qu'avec les amorces lors de l'étape de fixation des amorces (annealing) . Toutes ces raisons sont équivalentes pour les 2 séquences et auront donc la même influence sur leur amplification. Cette dernière propriété est intéressante, car lorsque un des deux amplicons (par exemple le standard) sera en forte concentration, il se réassociera en double brin de préférence à la fixation sur les amorces plus petites et donc moins stables. Cependant, comme il possède une grande séquence commune avec l'autre amplicon (par exemple la cible) , il reformera aussi des réassociations stables (hybrides) avec cet autre amplicon, ce qui inhibera de la même manière la fixation des amorces. Ainsi le design des standards compétitifs selon l'invention, permet une quantification indépendamment des cycles de la PCR. Un exemple est donné à la figure 15 montrant la possibilité de quantification après 25, 30, 35 et 40 cycles, moment où l'amplification de la PCR n'est plus exponentielle.
Conjointement à leur utilisation pour l'amplification, la présence sur ces standards d'une partie commune A et d'une partie spécifique B est avantageusement adaptée à leur mesure selon la méthode "hybridation sandwich" sur support insoluble de l'invention, et cela avec une spécificité identique ou très proche de celle de l'acide nucléique cible (voir figure 4).
Les inventeurs ont observé que par l'hybridation sandwich de l'invention, le facteur limitant est la fixation des amplicons 1 et 2 sur la séquence trappeur 5 immobilisée. Celle-ci étant présente sur une surface, la vitesse de réaction est beaucoup plus lente du fait de la diffusion plus lente des réactifs à l'approche d'une surface rigide et aux encombrements stériques. Expérimentalement, on observe que l'on fixe moins de 50 % des amplicons 1 et 2 sur les séquences trappeur 5. Cependant, même si ce pourcentage de fixation est faible, on observe qu'il est le même pour le standard 1 et pour la cible 2. Cette propriété s'explique par le fait que les 2 séquences ont la même taille et qu'elles se fixent sur une séquence trappeur 5 de même type. La fixation des séquences spécifiques 6 marquées ne semble pas poser de problème, car il s'agit d'une sonde simple brin, mise en excès de manière à obtenir une fixation quantitative. Expérimentalement, on peut obtenir 90 % de fixation de ces séquences 6 marquées sur les amplicons 1 et 2 trappes dans les puits. De plus, la longueur identique de ces séquences 6 et leur contenu plus ou moins comparable en GC et la concentration identique utilisée font que les 2 séquences spécifiques 6 complémentaires du standard 1 et du cible 2 se fixent avec la même efficience. Ainsi l'ensemble de 1 ' nycridation sandwich se réalise avec la même efficience pour les amplicons standards 1 et pour les cibles . Ceci est illustré expérimentalement à la figure 8.
On peut donc avantageusement utiliser ces standards comme standards externes puisque leur efficience d'amplification sera identique et leur mesure par hybridation sandwich également. Une expérience de ce type est montrée à la figure 9 dans laquelle des nombres de copies croissantes en CMV cible et standard ont été amplifiés par 40 cycles de PCR puis détectés par hybridation sandwich. On constate une évolution parallèle des deux courbes. On doit cependant souligner une certaine variabilité des résult'ats provenant essentiellement des variabilités de l'amplification d'un même échantillon au cours de la PCR comme explicité ci -dessus.
Dans le cas où le standard est utilisé comme standard interne (c'est-à-dire que après l'amplification par PCR, les tubes contiennent un mélange d' amplicons de standard et de cible) cette hybridation sandwich permet aussi une quantification de ces deux amplicons avec la même efficience en opérant de la manière suivante : la préparation contenant les 2 amplicons est diluée de manière adéquate et est ajoutée à 2 ou une double série de puits
(ou filtres ou tubes) dans lesquels se trouve un ADN trappeur correspondant à tout ou une partie de la séquence commune des 2 amplicons. Dans un (ou une série de) puits, on ajoute une séquence marquée spécifique du cible et dans l'autre (ou 2ème série de) puits, on ajoute la séquence marquée spécifique du standard (voir figure 7) . Pour une dilution donnée, la fixation des deux amplicons sur l'ADN trappeur sera identique dans les 2 tuoes puisqu'ils seront présents à la même concentration. De plus comme le trappeur est commun aux deux amplicons et qu'ils ont une taille identique, leur fixation se réalisera avec le même rendement, c'est-à-dire que la proportion des 2 amplicons fixés sera identique à celle présente dans la préparation après PCR. Leur concentration relative aux fonds des puits ne dépendra donc que de leur concentration respective dans l'échantillon. Si l'on ajoute les séquences spécifiques marquées en excès de telle manière que leur fixation sur les amplicons soit quantitative, on obtiendra un marquage qui sera directement proportionnel à la concentration des amplicons dans la préparation.
On peut réaliser l'hybridation sandwich soit en deux étapes ou en une étape, en réalisant la fixation sur la séquence trappeur puis en ajoutant la séquence marquée spécifique ou en ajoutant ensemble la séquence marquée spécifique aux amplicons lors de l'immobilisation sur les séquences trappeurs.
L'utilisation de standards selon l'invention permet donc d'obtenir non seulement une amplification identique (ou très proche) du standard et de l'ADN cible mais également leur capture et leur détection en proportion identique dans les tubes servant à la mesure des amplicons cibles et des standards. La mesure des séquences marquées doit se faire par la suite de manière quantitative de manière à garder la quantification à toutes les étapes. Un schéma reprenant les diverses étapes de la démarche de quantification à l'aide de standards internes est présenté à la figure 7.
A côté des propriétés particulières lors de l'amplification par PCR résultant du design du standard interne citées ci-dessus, à savoir une efficience identique à celle de la cible de l'échantillon bioloσ αue ou une indépendance par rapport aux nombres de cycles de PCR, la quantification par hybridation sandwich telle que proposée dans ce brevet et réalisée suivant un protocole représenté à la figure 7 apporte encore un avantage que l'on peut observer dans l'exemple 9 (dont les résultats sont présentés dans les figures 10 et 11) . Dans cette expérience, une quantité constante de standard interne soit mille copies ont été ajoutés à des quantités croissantes de cibles CMV allant de 30 à un million de copies. Après 40 cycles d'amplification par PCR, les 2 séquences ont été mesurées après hybridation sandwich par mesure en spectrophotométrie. La figure 10 représente les données pour les standards et l'es cibles. On observe aux faibles concentrations en cible une présence importante du standard qui diminue au fur et à mesure que la quantité de cibles devient importante. Lorsque la quantité de cibles est égale a celle du standard soit mille copies, les deux valeurs sont pratiquement identiques. Puisque l'une des propriétés de l'invention est de pouvoir garder les rapports constants entre le standard et la cible à chacune des étapes de la quantification, les rapports des signaux obtenus pour la mesure de la séquence nucléotidique cible et standard ont été portés en fonction de la quantité de séquences cibles mise au départ. On obtient effectivement une relation linéaire, ce qui confirme bien la pertinence des résultats l'invention. Une propriété inattendue fut d'observer cette linéarité sur une échelle aussi importante de séquences nucléotidiques cibles. En effet, les résultats indiquent la possibilité de détecter quantitativement entre 30 et un million de copies de ces séquences cibles en utilisant au départ mille copies de séquences standards. Cette propriété constitue un avantage pratique important car les échantillons biologiques peuvent contenir des quantités très variables de séquences nucléotidiques cibles à mesurer et dans ce cas, un dosage linéaire de plus de 4 ordes de grandeur permet de diminuer fortement, sinon totalement, le nombre de dilutions à réaliser pour se situer dans la zone de quantification.
La même démarche peut être réalisée lors de la mesure d'ARN par exemple des ARN messagers ou des ARN viraux. Dans ce cas, il faut utiliser un standard qui est constitué d'une chaîne d'ARN ayant les mêmes spécificités que le standard ADN explicité ci -dessus. La démarche de l'amplification et de la mesure requiert une étape préalable qui est la transformation de l'ARN en chaîne d'ADN par une enzyme ayant une activité de transcπptase inverse. La suite des opérations et la quantification est identique à celle explicitée ci -dessus. Un exemple de standard utilisé pour la quantification de l'ARN du virus HIV est donné à la figure 6 et la quantification de HIV présentée à l'exemple 11 et à la figure 13. L'emploi de ces standards permet donc la quantification d'une séquence d'ADN (ou ARN) cible dans un échantillon et convient donc très bien à des tests de diagnostic ou de mesures d'ADN ou d'ARN en recherche ou dans des tests de routine. L'utilisation d' oligonucléotides comme standards externes est moins intéressante que leur utilisation comme standards internes et elle exige des contrôles et des conditions particulières. Il faut être certain que l'efficience de l'ampli ication est identique pour l'échantillon et pour le tube contenant le standard externe; il faut aussi travailler dans la zone linéaire d'amplification afin de garder une proportionnalité entre le nombre d' amplicons obtenus et la quantité de séquences présentes dans l'échantillon et le standard au départ. Il faudra également réaliser les tests en plusieurs exemplaires afin de minimiser les variations observées de tubes à tubes lors de l'amplification. Par contre on conserve les avantages donnés par la composition particulière de ce standard très semblable à la séquence d'acide nucléique cible pour obtenir une amplification et une détection identique ou très proche de celle de l'acide nucléique cible, ce qui permet la quantification de cette dernière.
En pratique, l'échantillon contenant l'ADN ou l'ARN cible est traité parallèlement à des tubes contenant des concentrations croissantes de standard externe. Toutes les conditions d'amplification et de détection sont identiques et faites avec les mêmes solutions afin de minimiser les variations de traitement. Les résultats sont comparés à la courbe d'étalonnage obtenue avec les standards. Dans l'invention, on privilégie une série de dilutions de l'échantillon cible afin d'obtenir des valeurs correspondant à la zone couverte par les standards.
L'utilisation des standards internes permet non seulement de tenir compte de variations qui se produisent de tube à tube lors de la PCR, mais aussi de possibles inhibitions de la PCR qui peuvent se produire dans des échantillons biologiques. Celles-ci sont en général dues à une inhibition de l'activité de la polymerase par des contaminants présents dans la préparation. Dans le cas d'inhibition de l'amplification, celle-ci se produira sur les 2 séquences, cible et standard, présentes dans le même tube et la proportion des amplicons sera donc conservée malgré un rendement d'amplification plus faible. De plus cette inhibition de la PCR pourra être constatée et évaluée en comparant la mesure des amplicons du standard ajouté dans l'échantillon et celle du contrôle positif de la PCR. En cas d'inhibition, le signal du standard interne présent dans l'échantillon fortement dilué sera inférieur à celui du contrôle contenant le même nombre de copies du standard interne traité dans les conditions optimales de PCR.
En pratique on ajoute à l'échantillon contenant l'ADN ou l'ARN cible, une quantité connue de standard puis l'on traite la préparation pour l'amplification et la détection après hybridation sandwich. Un contrôle positif contenant le standard seul et un contrôle négatif sans ADN spécifique sont aussi réalisés pour chaque expérience. Le rapport du signal obtenu pour la mesure des amplicons cibles et pour les amplicons du standard est rapporté à une droite d'étalonnage (voir figure 11) qui permet de déterminer le nombre de copies d'ADN cible au départ.
Une méthode plus adéquate mais qui requiert plus de tests, consiste à diluer l'échantillon (par exemple 4 dilutions de 10 en 10) et d'y ajouter une quantité constante de standard interne. Pour certains échantillons biologiques, il est nécessaire d'extraire et même parfois de purifier les acides nucléiques avant l'amplification pour éviter une inactivation de la polymerase. Dans d'autres, le chauffage à 100 °C destiné à séparer les doubles brins d'ADN suffit. Le standard interne est normalement ajouté dans l'échantillon de départ. Il peut éventuellement, pour des raisons pratiques être ajouté après extraction si celle-ci est quantitative. C'est le cas où les acides nucléiques sont extraits d'un échantillon puis que l'en réalise 4 dilutions avant d'ajouter une quantité constante de standards internes avant de faire la quantification comme dans l'exemple 10 et la figure 12. Cette manière de procéder ne nécessite qu'une seule extraction de l'échantillon. Après amplification et détection après hybridation sandwich, les rapports entre les signaux des amplicons cibles et standards sont portés en fonction de la dilution du cible. Ces 4 points déterminent une droite qui permet de déterminer la valeur du rapport égale à 1 pour lequel, la quantité de cible équivaut à celle du standard. Cette manière de réaliser la quantification est optimale. Un exemple est explicité ci- dessous et présenté à la figure 12.
Exemple 1 ; Influence de la longueur du trappeur pour une hybridation simple d'un ADN cible de HPV-18
L'expérience a été réalisée sur des amplicons de 586 paires de base correspondant à une séquence de HPV- 18 située en position 6193 à 6779 de l'ADN viral. Cette séquence a été amplifiée par les amorces suivantes : 1 = 5' TTTTGGAAGATGGTGATATGG 3' 2 = 5' CATAACATCTGCAGTTAAAGT 3 '
L'hybridation a été réalisée à partir de ces amplicons marqués à l'extrémité 5' terminale par l'intermédiaire de la T4 polynucléotide kinase en présence de [γATP-au 32P] .
Deux types de trappeurs ont été utilisés, correspondant à 180 et 360 bases complémentaires de la séquence des amplicons. Les hybridations ont été réalisées en présence de concentrations croissantes d' amplicons de cible à 45 °C pendant 2C heures dans une solution constituée de SSC 2x concentré, αe Denhart 5x concentré, de DNA de sperme de saumon dénaturé à 0,1 mg/ml.
Des concentrations des amplicons allant de 0,13 à 13 fmoles ont été testées, et la quantité fixée a été mesurée en radioactivité. Rapporté en pourcentage d'ADN fixé, ceci représente 30% sur le trappeur de 180 bases et 50% sur le trappeur de 360 bases quelles que soient les concentrations en cible testées.
Le fait que ce pourcentage soit stable entre 0,13 et 13 fmoles indique également que la quantité de trappeur n'est pas limitante.
Exemple 2 ; E££≤£ àg Là longueur du tra pgUr &UE UQ£ hybridation simple d'un ADN cible de CMV
L'expérience a été réalisée pour une hybridation d' amplicons de 435 paires de base correspondant à une séquence de CMV en position 171075 du génome (souche AD169, référence GENBANK X17403) .
Cette séquence a été amplifiée par les amorces suivantes : MIE4 : sens : 5' CCAAGCGGCCTCTGATAACCAAG
MIE5 : antisens : 5' CAGCACCATCCTCCTCTTCCTCTGG comme décrit par Demmler et al. (J. Infect. Dis., 158, pp;
1177-1184 (1988)) et marquées au 32P en utilisant lors de l'amplification par PCR des dCTP marqués au 32P. Les trappeurs de 50, 100, 150 et 250 bases ont été produits par
PCR et correspondent à la partie 3 ' terminale des amplicons .
L'hybridation a été réalisée à 60 °C pendant
2 heures dans une solution de SSC 2x concentré et de Denhart 5x concentré en présence de 0,1 mg/ml d'ADN de sperme de saumon. Une quantité de 10 fmoles d' amplicons 32P a été ajoutée à chaque puits Après réaction, les puits ont été découplés et la radioactivité mesurée. Les résultats montrent que pour les trappeurs de 50, 100, 150 et 250 bases, on obtient respectivement 0,09; 0,035; 0,53 et 1,55 fmoles de séquence cible hybridée. On observe bien un effet spectaculaire de la longueur du trappeur sur l'hybridation.
Exemple 3 : Influence de la longueur du trappeur pour une hybridation en sandwich d'im ADN cible de HPV-18
L'expérience a été réalisée pour l'hybridation d'amplicons de 586 paires de base correspondant à une séquence de HPV-18 située en position 6193 à 6779 de l'ADN viral. Cette séquence a été amplifiée par les amorces décrites à l'exemple 2.
Trois types de trappeurs ont été utilisés, correspondant à une séquence de 25, 180 et 360 bases complémentaires de la séquence des amplicons.
Les divers trappeurs reconnaissaient la partie des amplicons situés du côté 3' terminale. Les sondes comprenaient soit 360 bases pour l'hybridation sur le trappeur de 180 bases, soit 180 bases pour l'hybridation sur le trappeur de 360 bases, soit 21 bases pour l'hybridation sur le trappeur de 25 bases. Elles ont été marquées au 32P par phosphorylation en position 5' terminale par la T4 kmase en présence de [32P]ATP. Elles correspondaient à l'extrémité 5' terminale de la séquence cible. Les sondes de 21 bases étaient simple brin, alors que les sondes de 180 et 360 bases étaient double brin. Les nyoridations en sandwich ont été optimalisées en ce qui concerne la température, la concentration en sels et la concentration en amplicons. En ce qui concerne le trappeur de 25 bases, l'hybridation réalisée à 45 °C en présence de 2,5 fmoles d'amplicons pendant 2 heures dans une solution de SSC 2x concentrée puis après lavage incubé pendant 2 heures avec 15 fmoles de sonde marquée au 32P. On obtient une fixation de 0,280 fmoles avec un coefficient de variation de 80%. L'hybridation sur les trappeurs de 180 et 360 bases s'est faite en une seule étape et dans les conditions suivantes : les amplicons ont été ajoutés respectivement à raison de 2,5 fmoles en présence de 15 fmoles de sonde marquée. L'hybridation s'est déroulée pendant 20 heures d'une solution SSC 2x concentrée à 45 °C. La quantité de sonde marquée hybridée est de 0,54 fmoles pour le trappeur de 180 bases et de 0,69 fmoles pour le trappeur de 360 bases. La différence de fixation de la sonde était due à un rendement plus élevé de l'hybridation de la séquence cible sur le grand trappeur (cf. exemple 2) .
En effet, si l'on rapporte la fixation de la sonde marquée par rapport à la quantité de séquence cible trappée, on obtient dans les deux cas un rapport de 0,8. Ceci signifie que 80% des séquences cibles hybridées sur la séquence capteur ont fixé les séquences marquées. On constate donc dans cet exemple qu'il est possible d'utiliser des sondes de détection marquées, même double brin, et d'obtenir un très bon rendement de leur hybridation (80%) . Le facteur limitant pour la formation du sandwich dans ces conditions est alors la longueur de la sonde capteur. Exemple 4 : Influence du recouvrement de la séquence nuçléctidigμg cible Eâr l'AON trappeur s£ l'ADN sonde pour le rendement de l'hybridation (exemple de Mycobacterium u grçulpsjg)
Dans cet exemple, l'ADN extrait de Mycobacterium tuberculosis a été amplifié par sa séquence Mt 308 en utilisant les amorces suivantes : T2MT3 ' (amorce 5 '-3') : GTCGACACGCCTCTGCACGGAAGTCCTT DMT3 ' (amorce antisens 5 ' -3 ' ) : GCTCGACTTCTGGTCACGACGTCCGTCGAA
Ces amorcés ont été utilisées par Thierry et al. (Mol. Cell. Probes, 6, p. 181 (1992)), et permettent l'amplification d'un fragment de 279 paires de base.
Le trappeur a été obtenu en utilisant la sonde T2MT3 ' phosphorylée en position 5' et une amorce antisens SMT5 ' : GGGCATCCGCGAGTTGAAGACCTGAAGTGG .
Ces deux amorces permettent la production d'amplicons de 144 paires de base, dont l'un des deux brins possède un phosphate en 5'. Celui-ci a servi à fixer le trappeur par un brin covalent sur l'aminé des multipuits comme expliqué a l'exemple 1.
Deux sondes marquées ont été réalisées, l'une de 135 paires de base obtenue par l'utilisation d'une amorce antisens GSMT5 ' portant une biotme :
TCATTGGCAACGTTTGCGCCCTGCCTTGGG et l'autre par l'amorce antisens DMT3 ' . L'autre sonde était simple brin et portait également une biotme : 5' CAGCCACCAAGTCGAGCACTTTGCGGCGGAACTACTCGGG-biotine 3'
L'hybridation sandwich a été réalisée en ajoutant dans chaque puits 54 fmoles d'ADN cible amplifié par PCR en présence de 50 ng de sonde de 40 bases et de 25 ng pour la séquence de 135 bases. L'hybridation a été effectuée pendant 2 heures à 60 °C .
Après lavage, le conjugué streptavid e- kinase a été ajouté et après 45 minutes d'incubation, l'activité de la kinase a été dosée en bioluminescence comme décrit dans la demande de brevet WO94/06933.
La lecture est faite pendant une heure . On obtient après soustraction du blanc une valeur de 1,5 million de RLU (Relative Light Unit) pour la sonde de 40 bases et de 2,7 millions de RLU pour la sonde de 135 bases.
Dans cet exemple, la sonde de 135 bases était double brin et mise en quantité plus faible. Malgré ces deux conditions défavorables, le signal obtenu est presque deux fois supérieur, ce qui indique bien l'importance de réaliser une grande sonde de détection qui recouvre l'entièreté de la séquence cible.
Exemple 5 : Courbe de concentrations en amplicons de CMV après hybridation sandwich
Les amplicons provenant de l'ADN de CMV ont été obtenus à partir d'une PCR réalisée avec les amorces MIE4 et MIME5 décrites dans l'exemple 2. Elles permettent d'obtenir des amplicons de 435 paires de bases. Les amplicons ont servi pour réaliser la courbe d'hybridation sandwich décrite ci-dessous. Celle-ci a été réalisée sur des plaques multipuits sur lesquelles étaient fixés des trappeurs complémentaires à cette séquence cible et une sonde biotinylée de 185 bases produite également par PCR. La taille du trappeur était de 257 bases Ils ont été produits à partir d'une PCR utilisant des amorces MIE4 décrites à l'exemple 3 et MEI-β αor.t la séquence était GTACAGGGGACTCTGGGGGTGAC
Le trappeur une fois produit est purifiée sur spin colonne G25.
La fixation covalente du trappeur sur le polystyrène se fait comme suit . chaque puits contenant
100 ng de trappeur dénaturé, MIEM 0.01 M pH 7,5, carbodumide 0,2 M. Ces puits sont incubés 5 heures à
50 °C. Après incubation, deux lavages avec, 200 μl de NaOH 0,2 N, un lavage à l'eau et un séchage sont réalisés. Pour l'hybridation, les puits sont dénaturés avec 200 μl de NaOH 0,2 N et rincés avec 200 μl de SSC 2x.
Le volume total d'hybridation par puits est de 110 μl, contenant :
- 50 μl de tampon d'hybridation : SSC 4 4x, Denhart lOx, ADN de sperme de saumon 200 μg/ml dénaturé 10 minutes à
100 °C ;
- 10 μl de sonde biotinylée à une concentration de
900 pg/10 μl dénaturée 10 minutes à 100 °C ;
- 50 μl d'ADN cible amplifié par PCR en utilisant deux amorces MIE4 et MIE5 décrites à l'exemple 3, non purifié et dénaturé 10 minutes à 100 °C. Les quantités testées vont de 3,5 attomoles à 3500 attomoles.
L'hybridation dure 2 heures à 70 °C. Après hybridation, les puits sont lavés deux fois avec 200 μl de SSC 0 , lx puis avec 200 μl de tampon maléate 100 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,3% pH 7,5 durant 15 minutes .
Après rinçage avec 200 μl de tampon maléate
100 mM pH ~~ , 5 contenant NaCl 150 mM et du blocking reagent 1%, 100 μl de streptavidme-kinase sont ajoutés. Les puits sont rincés avec 400 μl de tampon maléate 100 mM pH 7,5 contenant NaCl 150 mM, Tween 0,3% pendant 10 minutes puis 3 fois 5 minutes avec 200 μl de tampon maléate 100 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,3% pH 7,5.
L'activité de la kinase est révélée dans du Tris buffer 20 mM pH 7,75 contenant du DTT 60 μM, EDTA 100 μM, MgCl2 5 mM, Luciferine 8 μM, luciferase 6 mU par puits KCl 20 mM, Phosphoenolpyruvate 1 mM et ADP 3,2 μM. L'émission de lumière est suivie pendant une heure avec un luminomètre (Lum oskan, Labsystem, Finlande) et les résultats sont exprimés en RLU. mm.
Exemple 6 : Hybridation différentielle d'un petit et d'un
Ipng ferilî d'APN ayant une partie de aâ séquence identique Lors de certaines amplifications comme la
CPR, les sondes de départ marquées sont grandes et sont coupées en deux morceaux qu'il faut pouvoir détecter et mesurer. Le problème est donc de pouvoir mesurer par hybridation une petite sonde en présence de sa séquence mère qui est plus grande. Les inventeurs ont choisi dans cet exemple une séquence mère (OL1) biotinylée de 40 bases qui ont la séquence suivante : 5 ' CCGCGACTATCCCTCTGTCCTCAGTAATTGTGGCTGAGAA 3 '
Cette séquence correspond à une séquence spécifique du génome de CMV située sur le "Major Immédiate Early Gène" (Akrigg et al., Virus Res . 2, p. 107) . Les inventeurs ont voulu détecter une sonde biotinylée (OL2) correspondant aux 20 premières bases de cette sonde en présence de la séquence mère (OL1) . Le trappeur était constitué d'un oligonucléotide de 20 bases complémentaires à la sonde OL2 et terminée par un groupement phosphate en 5 ' . Ce trappeur a été xé sur les muitipuits aminés par réaction covalente.
Dans l'expérience suivante, 100 fmoles de deux des séquences biotmylées OLl ou OL2 ont été incubés pendant 2 heures à 45 °C dans une solution de SSC 0 , 5x concentrée (soit 75 mM NaCl et 7,5 mM de nitrate de Na) .
Après l'hybridation, les puits ont été lavés par une solution de SSC 0 , lx concentré à 45 °C . Après quatre lavages, les puits sont incubés avec le conjugué streptavidine-kinase et sa fixation est estimée par la mesure de l'activité kinase en bioluminescence. Dans ces conditions, les puits ayant le grand fragment (OLA) montraient une RLU x mm de 9 alors que les petits fragments montraient une RLU x mm de 210. La présence sur OLl d'une séquence de 20 nucléotides supplémentaires sur OLl situés du côté 5' par rapport à OL2 , c'est-à-dire du côté du plastique, déstabilise donc fortement l'hybridation de cette sonde sur le trappeur.
Exemple 7 : Mesure de la quantité d'ADN cible et de standard par hybridation sandwich et mesurés en spectrophntométπe
L'ADN cible à mesurer consiste en un oligonucléotide double brm de 314 paires de bases correspondant à la position 171193 du génome du CMV (souche 10169, référence GENBANK X17403) .
Le standard interne consiste en un oligonucléotide double brm de 314 paires de bases dont la séquence en nucléotides est identique à celle de l'ADN cible à mesurer excepté pour les 40 nucléotides allant de 3217 à 3256 qui constituent une séquence aléatoire mais dont le Dourcentaαe en GC est similaire à celui de l'ADN cible .
La composition de ces nucléotides est présentée à la figure 5. Ces nucléotides sont d'abord chauffés à 100 °C pendant 10 mm puis incubés en concentration croissante dans des puits auxquels ont été fixés des sondes capteurs de l'invention et correspondant à une partie de la séquence commune et fournis par Lambdatech (Namur-Belgium) . La solution d'hybridation de 0,06 ml par puit contient une solution SSC 2 fois concentrée, du Denhardt 5 fois concentré, 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé et 50 ng de sonde biotinylée de 40 nucléotides simple brm correspondant soit à la séquence complémentaire de l'ADN cible, soit à celle de l'ADN standard présentée à la figure 7. A ces 60 μl on ajoute 40 μl d'ADN cible ou standard. L'hybridation se déroule à
70 °C pendant 2 heures.
Après hybridation, les puits sont lavés 1 fois avec 0,2 ml de solution SSC 0,1 fois, puis une fois avec 0,2 ml de tampon maléate pH 7,5 contenant 0,15 M NaCl et du Tween 0,3 % et enfin avec du tampon Maléate pH 7,5 NaCl 0,15 M et contenant 1 % de poudre de lait.
Un conjugué streptavidme-peroxydase est ajouté dans 0,1 ml à une dilution 1/1000 comme recommandé par le fournisseur (BIOSOURCE - Fleurus - Belgique) puis lavés 3 fois avec 0,2 ml de tampon Maléate 0,1 M pH 7,5 contenant 0,15 M NaCl et 0,3 % de Tween puis 1 fois avec une solution de glycine 500 mM pH , 1 contenant du KC1 100 mM et MgCl2lM.
L'activité de la peroxydase est mesurée par l'oxydation du TMB en présence d'K2θ2 dans un 1,1 ml de tarcor. acétate-citrate 0,2 M pH 7,5 Après 10 mm de réaction, 0,22 ml d'une solution de H2SO4 1,2 M est ajouté à chaque puits et la densité optique est mesurée à 450 mM. Les résultats de l'exemple sont présentés à la figure 8.
Exemple 8 : Mesure de la quantité d'ADN cible de CMV par utilisation d'un s 3 »r externe par hybridation sandwich après amplification par
P££ De l'ADN du virus de CMV contenu dans un plasmide dont on connaissait le nombre de copies a été placé en concentrations croissantes dans les tubes pour la
PCR. Parallèlement, on prépare des tubes contenant des concentrations croissantes de standard externe tel que défini à la figure 5. Tous les tubes ont subi une PCR de 40 cycles en utilisant des amorces correspondant à la séquence
3191-3217 et 3504-3481 du gène de CMV (figure 5) . La PCR démarre par 1 passage 3 mm à 94 °C et se poursuit avec 40 cycles définis comme suit : Chaque cycle de PCR comprenait une température de dénaturation à 94 °C pendant 30 sec, une période d' appariement des amorces à 65 °C pendant 30 sec et une polymérisation de 30 sec à 72 °C . La solution de PCR de
0,1 ml comprenait 100 pmoles de chacun des 2 amorces, 200 mM des divers dNTP et 2,5 U de Taq DNA polymerase dans un tampon TRIS-HCl 10 mM pH 8,4 avec MgCl2 1,5 mM et KCl
50 mM, DMSO 2 %. A la fin des 40 cycles, les tubes PCR passent 10 mm à 72 °C .
Après amplification, 0,04 ml de la solution fut prélevée af n de réaliser 1 ' hyûr dation sandwich sur la sonde trappeur fixée sur les mult puits commune aux deux amplicons. La présence d'amplicons cible et d'amplicons standard fut mise en évidence grâce à une sonde de 40 bases biotinylée spécifique de chacune des 2 séquences (figure 5) . La réalisation s'est faite en utilisant un conjugué streptavidine-kinase et en mesurant l'activité de la kinase bioluminescence. Les conditions expérimentales pour l'hybridation et la révélation sont celles de l'exemple 7 mais en utilisant un conjugué streptavidine- kinase qui permet la production de lumière en présence de luciférase comme décrit dans la demande de brevet WO94/06933. Les résultats obtenus sont présentés à la figure 9. Chaque point représente la moyenne de 3 mesures. On remarque une corrélation entre le nombre de copies de départ et le signal obtenu. De plus, les courbes obtenues pour la cible et le standard sont très proches, ce qui permet d'utiliser la courbe du standard comme référence pour déterminer le nombre de copies du DNA cible CMV dans l'échantillon de départ.
Exemple 9 : Mesure de la quantité d'ADN cible de CMV par utilisation d'un standard interne p^r hybridation sandwich après amplification par PCR Afin de valider la méthode de mesure d'un ADN cible dans un échantillon en utilisant un standard interne et une amplification par PCR comme schématisée à la figure 7, on établit une courbe de standardisation de la manière suivante . Dans chacun des tubes ont été ajoutées des quantités croissantes d'ur. plasmide contenant une partie du génome du virus CMV et une quantité constante de standard interne soit équivalent à 1 000 copies. Les quantités d'ADN cible CMV correspondaient à 30, 100, 300, 1 000, 3 000, 10 000, 30 000, 100 000, 300 000, et 1 million de copies.
La composition du standard interne est donnée à la figure 5. Chaque tube a été soumis à une amplification par 40 cycles de PCR dans les conditions présentées à l'exemple 15 en utilisant les amorces correspondant à la séquence 3191-3217 et 3504-3481 du gène de CMV (figure 5) . Après amplification, on obtient donc des amplicons de 314 paires de bases correspondant au cible CMV et au standard. De chacune des solutions de PCR, 0,04 ml sont prélevés et incubés dans 2 puits contenant un trappeur identique pour les séquences communes" des 2 amplicons. Dans l'un des puits, est ajouté la sonde biotinylée de 40 bases spécifique du cible CMV et dans l'autre la sonde biotinylée de 40 bases spécifique du standard.
Après hybridation sandwich, un conjugué streptavidme-peroxydase est ajouté à chaque tube et l'activité de la peroxydase mesurée comme dans l'exemple 7 par la mesure de la densité optique (D.O.) correspondant à l'absorbance du produit de réaction de la peroxydase (figure 10) . Pour chaque PCR, le rapport entre la D.O. correspondant à la détection des amplicons cibles et celle correspondant à la détection des amplicons standards est déterminé et porté en fonction du nombre de copies de CMV présent au départ de l'expérience. Les résultats sont présentés à la figure 11 en échelle logarithmique afin de couvrir l'ensemble des concentrations. Chacun des points représente la moyenne de 3 expériences. On observe une très bonne linéarité avec un coefficient de régression de 0,97 pour la droite, ce qui signifie la possibilité de déterminer la quantité de CMV cible dans un échantillon de départ allant de 30 à 1 million de copies.
Exemple 10 ; Indépendance du nombre de cycles de PCR pour là mesure d'Un ADH cible de CMV par utilisation d'u standard interne et hybridation sandwich
Cette expérience a été réalisée essentiellement selon l'exemple 9 et le schéma de la figure 7, c'est-à-dire en utilisant au départ un échantillon contenant 100 000 copies d'ADN de CMV dilué de 10 en 10 fois et auquel nous avons ajouté 1 000 copies de standard. Chacun de ces tubes a été soumis à une PCR comme dans l'exemple 5 excepté que certains tubes ont été arrêtés après 25, 30, 35, ou 40 cycles de PCR. Après la PCR, les amplicons ont été utilisés pour une hybridation sandwich sur un même trappeur mais avec soit une sonde biotinylée spécifique du CMV cible ou du standard. La révélation s'est faite en bioluminescence en utilisant un conjugué streptavidme-k ase et mesure de la lumière émise par la luciférase.
Le rapport des signaux lumineux (RLU) émis par les puits utilisant la sonde du cible et ceux utilisant la sonde standard ont été portés en fonction de la dilution du cible de départ (figure 12) Pour une même PCR, on observe la linéarité des 4 points, ce qui signifie la détection possible dans ce cas du CMV cible entre 100 et 100 000 copies. Cette linéarité est retrouvée pour les 4 PCR comprenant 25-30-35 ou 40 cycles, ce qui signifie l'indépendance de cette quantification par rapport au nombre de cycles d'amplification de la PCR EXQpiple 1 : Megure de la quantité d'ARN cible et de standard par hybridation sandwich
L'ARN cible à mesurer consiste en un acide nucléique simple brm de 267 bases correspondant à la séquence nucléotidique allant de 4235 à 4481 du gène de la polymerase (Pol) du virus du Sida (HIV) (numérotation de
HIV-LAI : Los Alamos HIV data bank ACK02013) .
Le standard consiste en un acide nucléique simple brm ARN dont la composition en nucléotides est identique à celle de l'ARN cible à mesurer à l'exception de 38 nucléotides allant de la position 4367 à 4404, constituant une séquence aléatoire dont le pourcentage en GC est similaire à celui de l'ARN cible. La composition de ces ARN est présentée à la figure 8. Le standard ARN est préparé par transcription m vi tro à partir d'un plas ide possédant en 5 ' le promoteur d'une ARN polymerase et en 3' d'une séquence poly A. Après purification et quantification de ce dernier, un nombre de copies croissant de standard ARN est placé dans chaque tube en présence d'une quantité fixe d'ARN cible.
Chaque tube est soumis à une première étape de transcription inverse (AMV-RT, Avian Myeloblastosis Virus) pour la synthèse du premier brm ADN (amorce 4481- 4501) et dans une seconde étape à la synthèse du second brin d'ADNc ainsi que l'amplification de l'ADN (Tfl ADN polymerase Thermus flavius; System Access RT-PCR Pro ega) (amorces 4235-4256; 4481-4501). Un tampon de réaction optimalisé pour les deux étapes simplifie la procédure et réduit le risque de contamination. La procédure d'amplification comprend dans une première étape la transcription mverse à 48 °C penαant 60 mm, suivie d'une étape d' mactivation de l' AMV-RT et de la dénaturation des hybrides ARN/ADNc à 94 °C pendant 2 mm. Ensuite, la synthèse du second br d'ADNc et la PCR sont réalisées par une amplification de 40 cycles comprenant chacun une dénaturation à 94 °C pendant 30 sec, un appariement des amorces à 50 °C pendant 30 sec et une étape d'extension à 72 °C pendant 30 sec. La réaction de RT-PCR se déroule dans 50 μl de solution comprenant en concentration finale 1 μM de chacune des 2 amorces, 0,2 mM de dNTPs, tampon de réaction AMV/Tfl, 1 mM MgS0 , 0,1 u/μl AMV-RT et 0,1 u/μl Tfl ADN polymerase.
Après amplification, l'hybridation sandwich est réalisée sur la -sonde trappeur commune aux deux amplicons fixée sur les multipuits. La présence d'amplicons cibles et standards fut mise en évidence grâce à une sonde de 38 bases biotinylée et spécifique de chacune des 2 séquences . La révélation est faite en bioluminescence en utilisant un conjugué streptavidme-k ase et mesure de la lumière émise par la luciférase (cfr exemple 11) .
Les résultats d'une telle expérience dans laquelle 3 concentrations différentes de standards internes de 1010, 108, et 10^ copies ont été ajoutées à une concentration fixe de 108 copies d'ARN de HIV cible sont montrés à la figure 13.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection et/ou de quantification d'une séquence nucléotidique cible (2) présente dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend une mise en contact de type "sandwich" de la séquence nucléotidique cible (2) avec une séquence nucléotidique monobrin trappeur (5) fixée sur un support solide insoluble (3) et complémentaire d'une partie (7) de ladite séquence nucléotidique cible (2) et avec une ou plusieurs séquences (6, 11) nucléotidiques dont au moins une est marquée (6), la ou lesdites séquences nucléotidiques (6, 11) étant complémentaires d'une autre partie (8) de la séquence nucléotidique cible (2) ; en ce que la séquence nucléotidique trappeur (5) est fixée de manière covalente par l'une de ses extrémités sur le support solide (3), comporte un longueur comprise entre 50 et 500 bases; et en ce qu'une partie (10) de la séquence nucléotidique trappeur (5) qui ne s 'hybride pas avec la partie (7) de la séquence nucléotidique cible (2) est inférieure à 60 bases, de préférence inférieure à 40 bases, plus particulièrement inférieure à 20 bases.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisée en ce que la longueur de la séquence nucléotidique trappeur (5) est comprise entre 100 et 300 bases, de préférence entre 120 et 250 bases.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 , caractérisé en ce que le rendement d'hybridation de la séquence nucléotidique cible (2) sur la séquence nucléotidique trappeur (5) est supérieur à 40%.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'une partie fl3) de la séquence nucléotiαique cible ne s'hybridant pas avec la séquence nucléotidique trappeur (5) et avec la ou les séquences nucléotidiques marquées (6) ou non (11) est inférieure à 60 bases, de préférence inférieure à 40 bases.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support solide (3) est un support choisi parmi le groupe constitué par des tubes, des filtres, des billes, éventuellement magnétiques, des plaques de multipuits ou un mélange d'entre eux.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique cible (2) est un amplicon résultant d'une amplification " préalable par un procédé d'amplification génétique, de préférence choisi parmi le groupe constitué par la PCR, la LCR, la CPR, la NASBA ou l'ICR.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la partie terminale 5' (9) de la séquence cible (2) non recouverte par la ou les séquences nucléotidiques marquées (6) est recouverte par une séquence primer (12) utilisée pour son amplification.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, ' caractérisé en ce qu'il comporte également une mise en contact de type sandwich d'une séquence nucléotidique standard (1) dans les mêmes conditions que les séquences nucléotidiques cibles (2) à détecter et/ou quantifier et comporte une étape supplémentaire de quantification du rapport entre le marquage spécifique de la séquence nucléotidique cible (2) et le marquage spécifique de la séquence nucléotidique standard (1) .
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comporte également une étape d'une préparation d'une quantité connue d'une séquence nucléotidique standard (1) possédant au moins une partie commune (A) à la séquence nucléotidique cible (2) et une partie spécifique (B) dont la séquence est différente, et possède un contenu en bases GC/AT proche, de préférence identique, à la séquence d'une partie spécifique (B) de la séquence nucléotidique cible (2), une extraction éventuelle de la séquence nucléotidique cible (2) à quantifier de l'échantillon biologique et une mise en contact de type "sandwich" des séquences nucléotidiques cible (2) et standard (1) avec des séquences nucléotidiques trappeur (5) complémentaires de la partie commune (A) de ces deux séquences (1, 2) et avec des séquences nucléotidiques marquées (6) complémentaires soit de la partie spécifique (B) de la séquence nucléotidique cible (2), soit de la partie spécifique (B) de la séquence nucléotidique standard (1) , et une quantification entre le marquage spécifique de la séquence nucléotidique cible (2) et le marquage spécifique de la séquence nucléotidique standard (1) .
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'hybridation sandwich s'effectue en deux étapes.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fixation de la séquence nucléotidique trappeur (5) sur le support solide (3) s'effectue par un phosphate 5' termina sur une fonction aminé du support solide (3) par réaction avec du caroodumide .
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique cible (2) est un ADN.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique cible est un ARN.
14. Trousse de détection et/ou de quantification par hybridation de type "sandwich" d'une séquence nucléotidique cible (2) comprenant une séquence nucléotidique trappeur (5) fixée sur un support solide insoluble (3) et complémentaire d'une partie (7) de ladite séquence nucléotidique cible (2) et au moins une séquence nucléotidique marquée (6) complémentaire d'une autre partie
(8) de la séquence nucléotidique cible (2), caractérisée en ce que ladite séquence nucléotidique trappeur (5) est fixée de manière covalente par l'une de ses extrémités sur le support solide (3) et comporte une longueur comprise entre 50 et 500 bases et en ce que la partie (10) de la séquence nucléotidique trappeur (5) qui ne s ' hybride pas avec une partie (7) complémentaire de la séquence nucléotidique cible (2) est inférieure à 60 bases, de préférence inférieure à 40 bases, plus particulièrement inférieure à 20 bases.
15. Trousse selon la revendication 14, caractérisée en ce que la longueur de la séquence nucléotidique trappeur (5) est comprise entre 100 et 300 bases, de préférence entre 120 et 250 bases.
16. Trousse selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que le support solide (3) est un support solide insoluble choisi parmi le groupe constitué par des tubes, des filtres, des billes, éventuellement magnétiques, des plaques de multipuits ou un mélange d'entre eux.
17. Trousse selon l'une quelconque des revendicaticns 14 à 16, caractérisée en ce qu'elle comporte une séquence nucléotidique standard (1) .
18. Trousse selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique standard (1) possède au moins une partie commune (A) à la séquence nucléotidique cible (2) à quantifier et une partie spécifique (B) dont la séquence est différente et possède un contenu en base GC/AT proche, de préférence identique, à la partie spécifique (B) de la séquence nucléotidique cible (2) à quantifier.
19. Trousse selon l'une quelconque des revendications 14 à 18, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique trappeur (5) est fixée par un phosphate 5' terminal sur une fonetl'on amine du support solide (3) par réaction avec du carbodumide .
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