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WO1998017693A1 - Composition contenant du chitosan - Google Patents

Composition contenant du chitosan Download PDF

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Publication number
WO1998017693A1
WO1998017693A1 PCT/FR1997/001897 FR9701897W WO9817693A1 WO 1998017693 A1 WO1998017693 A1 WO 1998017693A1 FR 9701897 W FR9701897 W FR 9701897W WO 9817693 A1 WO9817693 A1 WO 9817693A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
composition according
kda
chitosan
integer
Prior art date
Application number
PCT/FR1997/001897
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English (en)
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WO1998017693B1 (fr
Inventor
Hanno Kolbe
Original Assignee
Transgene S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Application filed by Transgene S.A. filed Critical Transgene S.A.
Priority to EP97912239A priority Critical patent/EP0934342B1/fr
Priority to DK97912239T priority patent/DK0934342T3/da
Priority to AT97912239T priority patent/ATE211489T1/de
Priority to AU49505/97A priority patent/AU725723B2/en
Priority to DE69709891T priority patent/DE69709891T2/de
Priority to JP10519049A priority patent/JP2001502736A/ja
Priority to CA002268804A priority patent/CA2268804A1/fr
Publication of WO1998017693A1 publication Critical patent/WO1998017693A1/fr
Publication of WO1998017693B1 publication Critical patent/WO1998017693B1/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to chitosan compounds comprising from 5 to 300 repeats of glucosamine units and a pharmaceutical composition comprising such compounds. More particularly, the present invention relates to a process for preparing chitosan according to the invention and its use for the transfer of a nucleic acid into a host cell.
  • the most practiced approach consists in using a viral vector to introduce the therapeutic nucleic acid into the cells to be treated and, in particular retroviral and adenoviral.
  • viruses have developed sophisticated mechanisms to cross cell membranes, escape degradation at the level of lysosomes and make their genome penetrate into the nuclei in order to ensure the expression of the therapeutic gene.
  • the viral approach has its limitations, in particular a limited cloning capacity, a potential production of viral particles competent for replication capable of dissemination in the host organism and the environment, a risk of insertional mutagenesis in the case of vectors. retrovirals and an induction of immune and inflammatory responses in the host which hamper repeat therapy in the case of adenoviral vectors.
  • cationic polymers such as dendrimers (WO 95/24221), polyethylene imine (WO 96/02655) and polylysine (WO 95/33061) could exhibit hemolytic activity after intravenous administration.
  • chitosan a natural polysaccharide formed by the linear repetition of glucosamine residues.
  • chitosan a natural polysaccharide formed by the linear repetition of glucosamine residues.
  • chitosan obtained by deacylation of chitin. Generally, they have a long chain of glucosamine units and have a high average molecular weight of up to 2000 kDa.
  • the preparations of lower molecular mass available at present have approximately 70 kDa and contain on average 430 glucosamine residues (a glucosamine unit with a molecular mass of 161 Da).
  • Fragments of chitosan of low molecular mass less than 5 kDa, between 5 and 10 kDa and greater than 10 kDa, have now been generated by acid hydrolysis, and have shown their properties particularly advantageous for gene transfer.
  • the chitosan fragments of the present invention are large enough to form with the therapeutic nucleic acid a complex of adequate stability to allow its transport in the host cell but also its release in vivo.
  • the process used makes it possible to reduce the pigments which contaminate the preparations of the prior art and to improve the solubility in water.
  • composition comprising a compound of general formula [X] n in which n represents an integer from 5 to 300 and X has the following formula (I):
  • a first subject of the invention relates to a composition
  • a composition comprising a compound comprising a linear repeat of 5 to 300 glucosamine residues of formula (I) as defined above.
  • This compound according to the invention is advantageously used for its transfecting power for the transfer of a gene or a vector of interest into a host cell.
  • n represents an integer from 5 to 150, preferably from 5 to 75 and, most preferably, n is between 5 and 50.
  • a compound which can be used according to the invention can be chemically nodified by addition, deletion and / or substitution of radicals or chemical groups so as to improve its stability, its half-life, the complexation with nucleic acid and / or its transfecting power.
  • the modification may relate to part (partial modification) or all (complete modification) of the glucosamine residues and to one or more radical (s) of each of the glucosamine residues.
  • a compound which can be used according to the invention is modified by N-, C- and / or O-alkylation, -acylation, -aminoalkylation and / or - polyoxyethylenation (see for example Dunn et al., 1993, J.
  • the particularly preferred compounds are poly-N-dodecyl-polyglucosamine in which the NH2 radical of formula (I) is replaced by NH- (CH2) 11-CH3 and mono-C ⁇ -octadecyl-polyglucosamine in which the OH radical of the compound according to the invention after chain is replaced by O- (CH2) 17-CH3.
  • the compound which can be used according to the invention is a chitosanium salt, in particular a sulphate, a phosphate and, more preferably, a chloride.
  • the compounds which can be used according to the invention can be obtained in different ways. They can, for example, be synthesized chemically from the glucosamine monomer by polymerization or from a high molecular weight preparation by gentle enzymatic hydrolysis. However, it is particularly preferred to use an acid hydrolysis process for the prior art chitosan preparations followed by differential diafiltration, as described below.
  • the present invention also relates to certain of the compounds of formula (I) as such, in particular the compound of formula [X] n in which n represents an integer from 5 to 300 and X has the following formula (1):
  • the present invention also relates to a substantially pure preparation of chitosan. It is in particular obtained by any conventional purification technique and in particular, by extraction of pigments and other residual contaminants. This purification step can be carried out on commercial chitosan preparations to generate a substantially pure preparation of high molecular weight or not which can be used to complex a nucleic acid.
  • the present invention relates more particularly to a composition comprising at least one compound or preparation according to the invention and a therapeutically active substance. It is preferably a negatively charged substance and, in particular, a nucleic acid.
  • nucleic acid is meant both a deoxyribonucleic acid (DNA) and a sense or antisense ribonucleic acid (RNA).
  • the nucleic acid can be homologous or heterologous to the host cell. They can be natural, hybrid or synthetic sequences derived from genomic DNA, cDNA, mRNA, APvNr, tRNA, viral RNA, of any origin (prokaryote, eukaryote, virus , parasite, plant ). They can be obtained by conventional molecular biology techniques (cloning, PCR for Polymerase Chain Reaction in English, etc.) or by chemical synthesis.
  • the nucleic acid used in the context of the present invention is a vector for the expression of a gene of therapeutic interest.
  • the expression vector is advantageously in the form of a plasmid, but it is also possible to use a viral vector (derived from a retrovirus, adenovirus, poxvirus, herpes virus, virus associated with adenovirus ).
  • a viral vector derived from a retrovirus, adenovirus, poxvirus, herpes virus, virus associated with adenovirus .
  • the choice of plasmids which can be used in the present invention is vast. It is possible to use a plasmid / vector of the prior art or to construct it by genetic manipulation techniques (Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY).
  • the plasmid used in the present invention may also include additional elements improving its maintenance, its stability in the host cell or even its integration into the chromosomes of the host. Generally, such elements are known to those skilled in the art.
  • the gene of therapeutic interest in use in the present invention can code for a ribozyme, an antisense RNA or even an mRNA which will then be translated into a polypeptide.
  • a polypeptide It may be a mature polypeptide, a precursor and in particular a precursor intended to be secreted and comprising a signal peptide, of a native, truncated, chimeric polypeptide originating from the fusion of sequences of various origins or d 'a mutated polypeptide having improved and / or modified biological properties.
  • polypeptides to which consideration can be given there may be mentioned more particularly:
  • cytokines or lymphokines interferons ⁇ , ⁇ and ⁇ , interleukins and in particular LL-2, ⁇ LL-6, riL-10 OR IL-12, tumor necrosis factors (TNF), colony stimulating factors (GM-CSF , C-CSF, M-CSF ...);
  • cellular or nuclear receptors receptors recognized by pathogenic organisms (viruses, bacteria, or parasites) and, preferably, by the HIV virus (Human Immunodeficiency Virus) or their ligands;
  • proteins capable of complementing deficient cellular activity in particular in the context of a genetic disease (factor Vu, factor VIII, factor IX, dystrophin or minidystrophin, insulin, CFTR protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), growth hormones (hGH);
  • enzyme inhibitors ⁇ l-antitrypsin, antithrombin III, viral protease inhibitors, etc.
  • polypeptides with anti-tumor effect capable of at least partially inhibiting the initiation or progression of tumors or cancers
  • anti-sense RNA antibodies, inhibitors acting at the level of cell division or transduction signals, expression of tumor suppressor genes, e.g. p53 or Rb, polypeptides or peptides stimulating the immune system
  • polypeptides capable of inhibiting a viral, bacterial or parasitic infection and / or its development antigenic polypeptides having immunogenic properties, antigenic epitopes, antibodies, trans-dominant variants capable of inhibiting the action of a native protein by competition ...;
  • toxins thymidine kinase from herpes simplex virus 1 (TK-HSV-1), ricin, cholera toxin, diphtheria ”). or immunotoxins; and
  • the therapeutic gene is placed under the control of the elements necessary for its expression in the host cell.
  • “necessary elements” is meant all of the elements allowing its transcription into RNA and the translation of an mRNA into a polypeptide.
  • the promoter is of particular importance. It can be derived from any gene (eukaryotic, viral, natural promoter of the gene of interest in question ...) or can be hybrid. Furthermore, it can be constitutive or regulable. Alternatively, it can be modified so as to improve the promoter activity, to suppress a region inhibiting transcription, to modify its mode of regulation, to introduce a restriction site ...
  • Mention may be made, by way of examples, of viral promoters CMV (Cytomegalovirus), of the TK gene of the HSV-1 virus, early of the SV40 virus (Simian Virus 40), early adenoviral (El A) or late (MLP for Major Late Promoter) or the eukaryotic promoters of the PGK genes (Phospho Glycerate kinase) murine or human, D l-antitrypsin (liver-specific), immunoglobulins (lymphocyte-specific).
  • CMV Cytomegalovirus
  • nucleic acid can also comprise additional elements such as intronic sequence, signal sequence, nuclear localization sequence, transcription terminator sequence, site of initiation of translation of IRES type or the like.
  • vector may contain several genes of interest placed under the control of independent or common regulatory elements.
  • the respective proportions of the compound according to the invention and of the nucleic acid are preferably determined so that the charge ratio of said nucleic acid to said compound (R DNA / compound) is between 1/10 and 10/1 and, preferably between 1/1 and 1/5.
  • a composition according to the invention can be used as it is or in combination with other compounds and, in particular an adjuvant capable of improving its transfecting power.
  • the adjuvants preferably used in the composition according to the invention are the cationic amphiphilic compounds and / or the neutral or zwitterionic lipids.
  • a mono, di or tri alkylated or acylated compound bearing from 1 to 4 positive charges is preferred, such as a cationic lipid.
  • DOGS 5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide
  • DC-Chol 3 ⁇ [N- (N ', N'- dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol
  • DOSPA (2,3-droleylocyl- N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] N, N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate)
  • phosphatidyl ethanolamine As it is a neutral or zwitterionic lipid, mention may be made of phosphatidyl ethanolamine, phosphatidylcholine, phosphocholine, sphyngomyelin, ceramide and cerebroside or their derivatives. Preferably, it is dioleyl phosphatidyl ethanolamine (DOPE).
  • DOPE dioleyl phosphatidyl ethanolamine
  • a composition according to the invention is more particularly characterized in that the lipid-to-DNA charge ratio is between 25/1 and 1/1 and preferably 5/1 and
  • composition according to the invention it is also possible to combine with the composition according to the invention other substances to further improve the transfection efficiency or the stability of the complexes.
  • the present invention also relates to the use of a composition according to the invention, for preparing a medicament for curative, preventive or vaccine purposes intended for the transfer of nucleic acid into a host cell in vivo, ex vivo or in vitro.
  • a composition according to the invention can be used in various types of host cells, for example a microorganism, yeast, insect, plant cell but it is preferably a mammalian cell and, in particular d 'a human cell.
  • Said cell can be a primary or tumor cell of hematopoietic origin (totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte, macrophage ”), hepatic, renal, of the central nervous system, fibroblast, epithelial and in particular a pulmonary epithelial cell, or muscle (myocyte, myoblast, cardiomyocyte, satellite cell ).
  • totipotent stem cell leukocyte, lymphocyte, monocyte, macrophage
  • hepatic renal
  • fibroblast epithelial and in particular a pulmonary epithelial cell
  • muscle myocyte, myoblast, cardiomyocyte, satellite cell
  • a composition according to the invention can be administered systemically or by aerosol.
  • One can more particularly consider the gastric, subcutaneous, intracardiac, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, intratumoral, intrapulmonary, intranasal or intratracheal route.
  • the administration can take place in single dose or repeated one or more times after a certain interval of interval.
  • the appropriate route of administration and dosage vary according to different parameters, for example the individual or the disease to be treated or the gene (s) to be transferred.
  • the formulation may also include a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a composition according to the invention is in particular intended for the preventive or curative treatment of genetic diseases (hemophilia, cystic fibrosis, Duchenne and Becker myopathy, etc.), cancers and viral diseases (AIDS, papilloma infections, herpes virus. ..).
  • the present invention also relates to a process for preparing a compound which can be used according to the invention from a preparation of high molecular weight chitosan by acid hydrolysis, precipitation with ethanol and extraction of the pigments in the presence of an organic solvent. .
  • High molecular weight chitosan preparations are commercially available (e.g. Fluka, references 22741, 22742 and 22743). In the context of the present invention, it is preferred to use a preparation with an average molecular weight of around 70 kDa which corresponds to the lowest molecular weight available on the market (Fluka reference 22741). Acid hydrolysis is carried out in the presence of hydrochloric acid at a molarity of approximately 4 M at a temperature of approximately 100 ° C and for approximately 4 hours. Of course, a person skilled in the art is able to adapt the experimental hydrolysis conditions according to the starting preparation. After coarse filtration to remove the insolubles and cooling, the hydrolyzate is precipitated with ethanol at a final concentration of approximately 50% when cold. The precipitated material is harvested by centrifugation or any conventional means. It is preferable to carry out several washes in 50% ethanol before taking it up in water or an appropriate buffer.
  • the dissolved material is subjected to extraction in the presence of solvent.
  • Any polar solvent which is immiscible with water can be used and, in particular, C 4 to C 8 alcohols and esters thereof.
  • a preferred solvent in the context of the invention is butanol-2.
  • This step which has the advantage of considerably reducing the pigments contained in the starting preparation, preferably comprises a first extraction with a third of volume of butanol-2 then a second extraction carried out on the aqueous phase with a third of volume of a butanol-2 / hexane mixture (50/50).
  • the method according to the invention comprises an additional step aimed at separating the compounds of the invention according to their size.
  • fractionation methods permeation gel, membrane filtration, etc.
  • differential diafiltration using membranes with increasing cutoff threshold.
  • the compound of the invention having an average molecular mass of less than 5 kDa is obtained in the filtrate resulting from a first diafiltration through a membrane having a cut-off threshold of 5 kDa.
  • the concentrate is then recovered and subjected to a second diafiltration through a membrane having a cutoff threshold of 10 kDa in order to obtain in the filtrate the compound having an average molecular weight of 5 to 10 kDa and, in the concentrate, the compound of the invention having an average molecular weight greater than 10 kDa and less than the starting chitosan.
  • a second diafiltration through a membrane having a cutoff threshold of 10 kDa in order to obtain in the filtrate the compound having an average molecular weight of 5 to 10 kDa and, in the concentrate, the compound of the invention having an average molecular weight greater than 10 kDa and less than the starting chitosan.
  • the skilled person is able to adapt the technique according to the desired average molecular weight. It is also possible to carry out one or more additional diafiltration (s) on the last concentrate generated. For example, the passage of the latter through a membrane having a cutoff threshold of 15 kDa will make it possible to harvest the
  • Figure 1 illustrates a cytotoxicity graph on L132 cells obtained with the polymers pcTG12 NI, pcTG12 N2, pcTG12 N3, dextran and polylysine.
  • Figure 2 illustrates a cytotoxicity graph on CCRF-CEM cells obtained with the polymers pcTG12 NI, pcTG12 N2, pcTG12 N3, dextran and polylysine.
  • Figure 3 illustrates the hemolytic activity tested on rat red blood cells of the polymers pcTG12 NI, pcTG12 N2, pcTG12 N3, dextran and polylysine after 1 hour of contact.
  • FIG. 4 illustrates the hemolytic activity tested on rat red blood cells of the polymers pcTG12 NI, pcTG12 N2, pcTG12 N3, dextran and polylysine after 5 hours of contact.
  • Figure 5 illustrates the expression of luciferase in A549 cells transfected with the plasmid pTG1 1033 complexed with DC Chol / DOPE (control) or DC Chol / DOPE / chitosan at a concentration of 10, 30 and 60%.
  • Figure 6 illustrates the expression of luciferase in primary myoblasts transfected with the plasmid pTG11033 complexed with DC Chol / DOPE (control) or DC Chol / DOPE / chitosan at a concentration of 10, 30 and 60%.
  • EXAMPLE 1 preparation of chitosan fragments.
  • the commercial preparations of chitosan of varied molecular mass can be used and the most suitable for the implementation of the present invention are those of low molecular mass (for example the preparation Fluka under the reference 22741 whose molecular mass average is around 70 kDa).
  • the acid hydrolysis is carried out in a 1 liter Schott DURAN bottle with a magnetic stirrer. After weighing, 25 g of chitosan (lot 340315/1 295) are placed in the presence of 625 ml of hydrochloric acid (HC1) 4 M (HC1 of analytical quality such as R.P Normatur, Prolabo 20 252.290, min 36%).
  • HC1 hydrochloric acid
  • the reaction mixture After exchanging the gas phase for 5 min with nitrogen (to avoid any oxidation) and closing the bottle, the reaction mixture is placed under regular magnetic stirring (500 rpm) in a water bath. oil kept at 100 ° C. After equilibration of the temperature (15 min under the aforementioned experimental conditions), the reaction is allowed to continue for 4 hours at 100 ° C. It is observed that this treatment is accompanied by a change in coloration of the solution which appears light brown.
  • the hydrolysis conditions are suitable for the preparation of starting chitosan. If it has a high molecular weight (Fluka, 750 or 2000 kDa), the hydrolysis will be more stringent (increase in the concentration of HC1 or the reaction time).
  • the reaction mixture is immediately filtered (pore filter of about 0.6 mm) in order to remove the insoluble impurities and aggregates.
  • the filtrate is transferred to a 2 liter Schott DURAN bottle and cooled for about 1 hour in ice before being precipitated by adding 625 ml of absolute ethanol (of analytical quality, for example sds, reference 013A0516) and kept overnight at 2-4 ° C.
  • the precipitated material is collected by centrifugation (10,000 g, 2-4 ° C, 10 min) and subjected to two washes in an ethanol / water mixture (50/50).
  • the pellets are taken up in 20 to 60 ml of demineralized water on a Milli Q cartridge (Milli Q water), frozen at -80 ° C. while waiting to be lyophilized.
  • a Milli Q cartridge Milli Q water
  • 12 to 16 g of chitosan fragments are obtained in the form of hydrochloride salts.
  • the pigments are then extracted from the preparation of chitosan x nHCl in the following manner. 14.9 g of the above lyophilized preparation are dissolved in 300 ml of Milli Q water and then treated with 100 ml of butanol-2 (analytical quality). The mixture is then vigorously stirred and left at room temperature in a separating funnel until the phases have separated.
  • the upper phase of brownish coloration is eliminated and the aqueous phase is subjected to a new extraction in the presence of 100 ml of a butanol-2 / hexane mixture (50/50).
  • the lower phase is recovered, the aqueous medium of which is evaporated by rotation under vacuum.
  • the dried material is finally dissolved in 50 to 100 ml of Milli Q water and subjected to two consecutive diafiltration stages using membranes of increasing cut-off threshold in order to purify chitosan fragments of corresponding molecular mass.
  • the solution is first filtered through a 5 kDa cut-off membrane (for example YM-5, Amicon). This last operation is repeated three times, supplementing with Milli Q water to the initial volume and the filtrates thus obtained are combined and frozen pending lyophilization.
  • a dry, white preparation of chitosan chloride is obtained with a molecular mass of less than 5 kDa (designated pcTG12 NI).
  • the concentrate is in turn subjected to a second diafiltration on a cut-off membrane of 10 kDa (for example YM-10, Amicon). After 3 washes with the initial volume, the filtrates are combined, frozen and lyophilized to give a dry white preparation of chitosan chloride with a molecular mass of between 5 and 10 kDa (designated pcTG12 N2).
  • the concentrate is recovered, which is also frozen and lyophilized, from which a slightly yellowish dry preparation of chitosan chloride with a molecular mass greater than 10 kDa is obtained (designated pcTG12 N3).
  • the preparations thus generated can be characterized by conventional analytical methods, for example by assaying free amino groups (Curotto and Aros, 1993, Analytical Biochemistry 21 1, 240-241).
  • the length of the polymers was also determined by laser desorption mass spectrometry and a distribution is observed in the Gausse curve.
  • the polymers of the pcTGl2 NI preparation ( ⁇ 5 kDa) are formed by a repetition of 5 to 35 glucosamine residues, the maximum being around 10.
  • the polymers of the pcTG12 N2 preparation (5-10 kDa) have a repetition of 10 to 50 monomers, the maximum being between 30 and 35.
  • the capacity of the above polymeric preparations to complex the reporter plasmid pCHUON is evaluated. It comprises the promoter / enhancer block of the SV40 virus directing the expression of the LacZ gene coding for the ⁇ -galactosidase of Escherichia coli provided in N-terminal with a nuclear localization signal originating from SV40.
  • 500 ng of plasmid DNA are placed in the presence of increasing amounts of each of the pcTG12 N preparations according to a DNA / chitosan mass ratio varying from 1 / 0.5 to 1/4 (the precise DNA / chitosan ratios are: 1/0 , 5, 1/1, 1 / 1.5, 1/2, 1/3 and 1/4) in a total volume of 10 ⁇ l possibly supplemented with TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) pH 7.5.
  • the negative control consists of plasmid DNA simply taken up in TE.
  • the mixtures are analyzed on 0.9% agarose gel (TAExl migration buffer pH 7.8 and 2 hour migration at 50V) and revealed by ethidium bromide. Free plasmid DNA migrates in the form of several bands corresponding to the different topoisomers (circular DNA, supercoiled) while once complexed with chitosan, it no longer enters the gel and is visualized in the deposition pockets.
  • the cytotoxicity of the polymers pcTG12 NI, N2 and N3 was evaluated in vitro against human cell lines L132 (ATCC CCL5) originating from lungs.
  • human embryos and CCRF-CEM ATCC CCL1 19 from human lymphoblastoma. These lines were selected on the basis of their different behavior in cell culture, the first growing in an adherent manner (L132) and the second in suspension (CCRF-CEM).
  • CCRF-CEM cells are cultured in a 96-well microtiter plate with a "v" -shaped bottom (Costar) at the rate of 1x104 cells per well and cultured at 37 ° C. in a CO 2 5% atmosphere in RPMI 1640 medium (Gibco BRL) containing 10% fetal calf serum (FCS) (Gibco BRL).
  • RPMI 1640 medium Gibco BRL
  • FCS fetal calf serum
  • the cells are centrifuged at 1000 g for 10 min and the cell pellet is taken up in the same medium in the presence of the polymers to be tested (dissolution of an adequate quantity of each of the polymers in RPMI medium 1640-10% FCS of so as to obtain a final concentration of 0.1 ⁇ g / ml to 1 mg / ml then sterilizing filtration on 0.2 ⁇ m filters (Acrodisk)).
  • Medium containing dextran of molecular mass 72 kDa (Sigma) is used at concentrations identical to those used for the molecules pcTG12 as a negative control and polylysine of molecular mass 30-70 kDa (Sigma) as a positive control .
  • the control cells are cultivated under the same conditions but in the absence of polymers.
  • the L132 cells are cultured in a 96-well microtiter plate (Costar) at the rate of 1 ⁇ 10 4 cells per well and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere in El 99 medium (Gibco BRL, reference 22340 -012) containing 5% FCS. After 24 hours, the culture supernatant is replaced by fresh El 99-5% FCS medium in which appropriate concentrations of each of the polymers of the invention or of the controls have been dissolved as indicated above.
  • El 99 medium Gibco BRL, reference 22340 -012
  • the viability of the L132 and CCRF-CEM cells is determined after 67 hours of exposure to the various polymers by the MTT test according to the technique described in Sgouras and Ducan (1990, J. of Materials Science: Materials in Medicine 1, 61-68) . After an incubation period of 5 hours, the cell supernatant is removed (possibly after centrifugation at low speed in the case of lines in suspension) and replaced by 100 ⁇ l of optical grade DMSO (Sigma) and the absorbance is determined at 550 nm at each culture well (Titerteck plate reader). Low absorbance is a sign of significant mortality. The viability is expressed as a percentage relative to the absorbance read for the cells cultured in the absence of polymers.
  • Figures 1 and 2 show the results obtained for L132 and CCRF-CEM cells respectively and show that the 3 polymers according to the invention (chitosan fragments with molecular mass ⁇ 5, 5-10 and> 10 kDa) have little effect on viability cell and this at doses as high as 0.5 mg / ml, just like dextran (non-recognized toxicity). At 1 mg / ml, a reduction in viability is observed by a factor of around 20%. The IC50, ie 50% of viable cells, corresponds to a concentration of approximately 2 mg / ml. On the other hand, polylysine exerts a cytotoxic effect at doses 100 times lower (IC50 reached at a concentration of 10 ⁇ g / ml).
  • the pcTG12 NI, N2 and N3 polymers are diluted to concentrations ranging from 1 to 10 ng / ml in PBS buffer, placed in the presence of a fresh suspension of rat red blood cells (2% weight / volume) and incubated at 37 ° C for 1 and 5 hours.
  • the mixture is centrifuged at 1500 g for 10 min at room temperature and the amount of hemoglobin present in the supernatant is evaluated by spectophotometric assay at 550 nm. The same is done with the dextran and polylysine witnesses.
  • the results are expressed as a percentage of lysis relative to a control treated with Triton X-100 (Sigma) which corresponds to 100% lysis.
  • the red cells of rats are incubated for 1 or 5 hours in the presence of 10 ⁇ g / ml of pcTG12 NI, N2, N3, dextran or polylysine then suspended overnight in a reconstituted glutaraldehyde solution (0.25% vol / vol) in PBS (Oxoide).
  • the cells are centrifuged at low speed (1200 g 1 min at room temperature; MSE Microcentour centrifuge) and, after removal of the supernatant, taken up in 1% osmium tetroxide (weight / vol) in PBS. After 1 hour at room temperature, centrifugation is carried out under the same conditions as above and the cells are treated with 50% ethanol diluted in PBS for 30 min.
  • the plasmid pTG11033 (1 mg / ml) is used to evaluate the transfection efficiency of the compounds of the invention. It includes the reporter gene read which codes for luciferase placed under the control of the CMV promoter and the gene for resistance to kanamycin. However, any other plasmid can also be used.
  • DC-Chol is obtained by chemical synthesis on a scale of 20 g according to the process described by Gao et al. (1991, BBRC 179, 280-285).
  • the colipid DOPE is commercially available (Sigma, reference P5078).
  • the stock solutions of the pcTG12N chitosan preparations are stored at 10 mg / ml in chloroform.
  • the DC-Chol / DOPE mixture is obtained by mixing the two compounds in a weight ratio of 1/1 and a stock solution is established in chloroform at a rate of 10 mg / ml.
  • the transfections are carried out in 96-well plates in which 2x104 A 549 cells (ATCC CCL185) derived from human lung carcinoma are cultured in Eagle medium modified by Dulbecco (DMEM) containing 10% FCS. After 24 hours of culture at 37 ° C. in a CO2 atmosphere (5%), the cells are placed in the presence of DNA / DC Chol / DOPE complexes in the absence or in the presence of the pcTG12 NI polymers. The complexes are prepared in Nunc polypropylene tubes and in a laminar flow hood in order to preserve the sterility of the preparations.
  • DMEM Dulbecco
  • the lipids are first mixed with the polymer by injection of DC-Chol / DOPE either in water (control 0% chitosan) or in water containing chitosan (10, 30 or 60 %) using a Hamilton syringe and keeping the whole under slow agitation. It is indicated that the percentages of chitosan are calculated relative to the charge provided by the cationic lipid DC-Chol.
  • the DNA is then added to the lipid / polymer mixture.
  • DC Chol / DOPE / DNA 40.5 ⁇ l (540.5 ⁇ g) of the preceding lipid solution are added to 500 Dl of water of which 455 ⁇ l (or 455 ⁇ g) are placed in the presence of 30 ⁇ g of pTGl 1033 dissolved in a volume of 145 ⁇ l of water,
  • DC Chol / DOPE / 10% Chitosan / DNA 40.5 ⁇ l (540.5 ⁇ g) of the preceding lipid solution are added to 498 ⁇ l of water and 2 ⁇ l (20 ⁇ g) of chitosan of which 455 ⁇ l are placed in the presence 30 ⁇ g of pTGl 1033 dissolved in a volume of 145 ⁇ l of water,
  • DC Chol / DOPE / 30% Chitosan / DNA 40.5 ⁇ l (540.5 ⁇ g) of the preceding lipid solution are added to 494 ⁇ l of water and 6 ⁇ l (60 ⁇ g) of chitosan of which 455 ⁇ l are placed in the presence 30 ⁇ g of pTGl 1033 dissolved in a volume of 145 ⁇ l of water,
  • DC Chol / DOPE / 60% Chitosan / DNA 40.5 ⁇ l (540.5 ⁇ g) of the preceding lipid solution are added to 488 ⁇ l of water and 12 ⁇ l (120 ⁇ g) of chitosan of which 455 ⁇ l are placed in the presence 30 ⁇ g of pTGl 1033 dissolved in a volume of 145 ⁇ l of water.
  • the culture is continued for 48 hours, the medium eliminated and after having been washed with 100 ⁇ l of PBS buffer, the cells are lysed with 50 ⁇ l of lysis buffer (Promega) and frozen at -80 ° C. until measurement of 1 luciferase activity.
  • the luciferase activity is revealed on 20 ⁇ l (or 2/5 of the sample) by measuring the emission of photons using a luminometer (LB96P, Berthold). The results are expressed in RLU / min sample. As an indication, the protein concentration of the sample measured is 24 to 32 ⁇ g.
  • Myoblasts are obtained from biopsies performed on the quadriceps muscles of male dogs. The samples are fragmented into segments of approximately 1 mm 3 and cultured in Petri dishes (Falcon) covered with 1% human plasma gelatin. The culture is carried out in Ham FI 4 medium (Gibco BRL) supplemented with growth factors [Glutamine 2 mM (BioMérieux), FGF 10 ng / ml (Peprotech-TEBU), EGF 10 ng / ml (Sigma), insulin 10 ⁇ g / ml (Sigma)], gentamicin 40 ⁇ g / ml (Scherring Plow) and calf serum at a concentration of 10%.
  • growth factors [Glutamine 2 mM (BioMérieux), FGF 10 ng / ml (Peprotech-TEBU), EGF 10 ng / ml (Sigma), insulin 10 ⁇ g / ml (Sigma)], gentamicin 40 ⁇ g
  • the cells are distributed in 96-well plates at a rate of 5 ⁇ 10 3 cells per well and cultured under standard conditions for 24 hours before being transfected in serum-free medium with variable amounts of DNA.
  • plasmid (2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.063, 0.032 or 0.016 ⁇ g) complexed with DC Chol / DOPE alone (for comparison) or with the DC Chol / DOPE / Chitosan mixture at a chitosan concentration of 10, 30 or 60%
  • the preparation pcTG12N1 is used and the percentages of chitosan are expressed relative to the charge provided by DC-Chol.
  • the various complexes are prepared in Ham F 14 medium supplemented with gentamicin and glutamine according to conventional methods or as indicated in the previous example. Once the culture medium has been aspirated, the cells are transfected with 225 ⁇ l of each sample to be tested. Four hours after transfection, the cells are replaced in the presence of serum by adding 25 ⁇ l of FCS to each well.
  • the luciferase activity is determined 48 hours post-transfection after washing the cells in phosphate buffer and lysis (Promega buffer) The measurement is carried out using a Microlumat LB96P luminometer (Berthold) The results reported in Figure 6 show that the best transfection rates are obtained with complexes incorporating chitosan, the luciferase activity being 4 to 9 times higher than when the transfection implements DNA complexed with DC Chol / DOPE alone.
  • the beneficial transfection effect of chitosan has been observed in a lung adenocarcinoma cell line and, at an even higher level, in a primary myoblast line.
  • the chitosan pcTG12 NI, N2 and N3 preparations are labeled with iodine using the Bolton / Hunter reagent (Amersham Life Science; IM5861) (Bolton and Hunter, 1973, Biochem J. 133, 529-539).
  • the preparations are adjusted to 10 mg / ml in borate buffer (for 1 1: 3.094 g of boric acid, 3.728 g of potassium chloride, pH 6.5) and 500 ⁇ l placed in the presence of triethylamine (193 ⁇ l for pcTG12 NI and 163 ⁇ l for pcTG12 N2 and N3) allowing the deprotonation of the groups -NH 3 + to -NH 2 .
  • Each polymer thus activated is added to 0.5 mCi of Bolton / Hunter reagent (100 ⁇ l) previously dried and the reaction is allowed to continue for 15 min on ice.
  • the labeling efficiency is determined on an aliquot of 5 ⁇ l by electrophoresis on chromatographic paper (Whatman, ref. 3001 845) and in barbital buffer pH 8.6 (Sigma, ref. B6632). Na 125 I is used as a control (Amersham, ref. IMS30). The migration of the preparations marked with respect to the control makes it possible to quantify the proportion of free and bound 125 I (see thesis by Ruth Duncan 1979, Keele University). The percentage of free I is estimated to be less than 1%. The rest of the preparation is subjected to dialysis against a solution of 1% HCl (v / v) in water (Sigma D7884 dialysis tubes) until no radioactivity can be detected in the dialysate.
  • 200 ⁇ l of the marked preparation (5 ⁇ 104 cpm) is administered intravenously to Wistar rats (3 rats per preparation).
  • the animals are sacrificed 5 min or 60 min after the injection and the radioactivity in the urine and faeces and a selection of organs after digestion in NaOH IN soda containing 0.1% Triton X-100 (v / v).
  • Counting is carried out using a gamma counter (LKB Wallac) for 10 min per sample. The amount of radioactivity in each organ relative to the total radioactivity is determined.
  • results presented in the tables below are expressed as a percentage of the dose recovered per organ ( ⁇ the standard bypass) and show a recovery of 32% (5 min) and 16% (60 min) of the doses injected for the NI preparation. and 36% (5 min) and 47% (60 min) for the N3 preparation.
  • I mg of calf thymus DNA is complexed with increasing amounts of the pcTG12 NI, N2 and N3 preparations according to a charge ratio (polymers / DNA) of 1: 1 to 1: 0.01.
  • the complexes thus formed are placed in the presence of deoxyribonuclease
  • DNAase II DNAase II
  • chitosan DNAase II
  • the state of the DNA is estimated on agarose gel.
  • Degradation is significantly reduced (compared to an uncomplexed DNA control) when the DNA is complexed with chitosan according to a high charge ratio.

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Abstract

La présente invention a pour objet un composé chitosan présentant de 5 à 300 résidus glucosamine, une préparation substantiellement pure de chitosan, une composition en comprenant ainsi que l'utilisation thérapeutique de cette dernière pour le transfert d'une substance thérapeutiquement active dans une cellule hôte. La présente invention concerne également un procédé pour préparer un tel composé ou une telle préparation.

Description

COMPOSITION CONTENANT DU CHITOSAN
La présente invention a pour objet des composés de chitosan comprenant de 5 à 300 répétitions d'unités glucosamines et une composition pharmaceutique comprenant de tels composés. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de préparation de chitosan selon l'invention et son utilisation pour le transfert d'un acide nucléique dans une cellule hôte.
Le transfert de gènes dans une cellule donnée est à la base même de la thérapie génique. Cette nouvelle technologie dont le champ d'application est vaste, permet d'envisager le traitement de maladies graves pour lesquelles les alternatives thérapeutiques classiques sont peu efficaces voire inexistantes et concerne aussi bien les maladies génétiques (hémophilie, mucoviscidose, myopathie ...) qu'acquises (cancer, syndrome d'immunodéficience acquise SIDA...).
L'approche la plus pratiquée consiste à utiliser un vecteur viral pour introduire l'acide nucléique thérapeutique dans les cellules à traiter et, en particulier rétroviral et adénoviral. En effet, les virus ont développé des mécanismes sophistiqués pour traverser les membranes cellulaires, échapper à la dégradation au niveau des lysosomes et faire pénétrer leur génome dans les noyaux afin d'assurer l'expression du gène thérapeutique. Cependant, l'approche virale a ses limitations, notamment une capacité de clonage restreinte, une production potentielle de particules virales compétentes pour la replication susceptibles de dissémination dans l'organisme hôte et l'environnement, un risque de mutagénèse insertionnelle dans le cas des vecteurs rétroviraux et une induction de réponses immunitaires et inflammatoires chez l'hôte qui entravent les répétitions de traitement dans le cas des vecteurs adénoviraux. Ces inconvénients importants pour un usage humain justifient la recherche de systèmes alternatifs de transfert d'acides nucléiques. A cet égard, de nombreux composés amphiphiles et cationiques ont déjà été décrits dans la litérature (voir par exemple Behr et al. 1994, Bioconj Chem 5, 382-389).
Dans cette optique, il peut également être avantageux d'avoir recours à des polymères
(répétition d'unités monomèriques). Cependant, les polymères protéiques sont à éviter du fait de leur nature potentiellement immunogène. Les polymères neutres tels que les dextrans, polyvinylpyrrolidone (PVP) et polyéthylèneglycol (PEG) ont l'avantage d'être peu toxiques in vivo mais, du fait de l'absence de charges positives, ne complexent pas les acides nucléiques de façon satisfaisante. Enfin, les polymères cationiques, tels que les dendrimères (WO 95/24221), le polyéthylène imine (WO 96/02655) et la polylysine (WO 95/33061) pourraient présenter une activité hémolytique après administration intraveineuse.
Un autre polymère cationique est constitué par le chitosan, un polysaccharide naturel formé par la répétition linéaire de résidus de glucosamine. Il existe d'ores et déjà des préparations commerciales de chitosan obtenues par déacylation de la chitine. D'une manière générale, elles comportent une longue chaîne d'unités de glucosamine et présentent une masse moléculaire moyenne élevée pouvant atteindre 2000 kDa. A titre indicatif, les préparations de plus faible masse moléculaire disponibles à l'heure actuelle ont environ 70 kDa et comportent en moyenne 430 résidus glucosamine (une unité glucosamine à une masse moléculaire de 161 Da).
Quelques documents de l'art antérieur reportent l'usage du chitosan pour le transfert de substances médicamenteuses et de polypeptides (Berscht et al., 1994, Biomaterials 15, 593-600 ; Chandry et Sharma, 1990, Biomater. Artif Cells Artif Organs 18, 1-24 et Illum et al., 1994, Pharm. Res. 11, 1 186-1 189) et plus récemment d'acides nucléiques (Murata et al., 1996, Carbohydrate Polymers 29, 69-74). Ce dernier document décrit la mise en oeuvre de chitosan dont les résidus aminés sont quaternisés par triméthylation et conjugué à du galactose pour cibler plus particulièrement les cellules hépatiques. Ce document ne mentionne pas la possibilité de lier l'ADN sans quaternisation préalable.
En outre, les préparations de l'état de la technique présentent certains inconvénients qui compromettent leur utilisation pour le transfert de gènes, notamment chez l'homme. En particulier, elles contiennent des pigments et d'autres contaminants qui même en faible quantité peuvent être nocifs. De plus, leur solubilité dans l'eau ou les tampons de conditionnement acceptables d'un point de vue pharmaceutique est médiocre et nécessite l'ajout d'au moins 0, 1 % d'acide acétique et la solution obtenue reste visqueuse. Enfin, il est fort probable que la complexation de ces longues chaînes de polycations (en moyenne 430 unités pour les préparations de plus faible masse moléculaire) avec une longue chaîne de polyanions (acide nucléique) favorise les liaisons interchaînes et donc la formation de complexes de grande taille susceptibles de précipiter en solution. La présente invention apporte une solution avantageuse à ces différents problèmes.
On a maintenant généré par hydrolyse acide, des fragments de chitosan de faible masse moléculaire : inférieure à 5 kDa, comprise entre 5 et 10 kDa et supérieure à 10 kDa, et montré leurs propriétés particulièrement avantageuses pour le transfert de gènes. Les fragments de chitosan de la présente invention ont une taille suffisante pour former avec l'acide nucléique thérapeutique un complexe d'une stabilité adéquate pour permettre son transport dans la cellule hôte mais également sa libération in vivo. En outre, le procédé mis en oeuvre permet de réduire les pigments qui contaminent les préparations de l'art antérieur et d'améliorer la solubilité dans l'eau.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet une composition comprenant un composé de formule générale [X]n dans laquelle n représente un nombre entier de 5 à 300 et X a la formule (I) suivante :
Figure imgf000005_0001
et une substance thérapeutiquement active.
Un premier objet de l'invention concerne une composition comprenant un composé comprenant une répétition linéaire de 5 à 300 résidus glucosamines de formule (I) telle que définie ci-dessus. Ce composé selon l'invention est avantageusement utilisé pour son pouvoir transfectant pour le transfert d'un gène ou d'un vecteur d'intérêt dans une cellule hôte. On préfère tout particulièrement le cas où deux résidus de glucosamine sont liés de la manière suivante :
Figure imgf000006_0001
De manière avantageuse, dans la formule générale [X]n, n représente un nombre entier de 5 à 150, de manière préférée, de 5 à 75 et, de manière tout à fait préférée, n est compris entre 5 et 50.
Les composés particulièrement préférés dans le cadre de la présente invention sont les suivants :
(i) un composé présentant une masse moléculaire moyenne inférieure à 5 kDa, (ii) un composé présentant une masse moléculaire moyenne comprise entre 5 et
10 kDa, et (iii) un composé présentant une masse moléculaire moyenne supérieure à 10 kDa et inférieure à 50 kDa.
Bien entendu, un composé utilisable selon l'invention peut être nodifié chimiquement par addition, délétion et/ou substitution de radicaux ou groupements chimiques de manière à améliorer sa stabilité, sa demi-vie, la complexation avec l'acide nucléique et/ou son pouvoir transfectant. La modification peut porter, sur une partie (modification partielle) ou l'ensemble (modification complète) des résidus glucosamines et sur un ou plusieurs radical(aux) de chacun des résidus glucosamines. Selon un mode de réalisation avantageux, un composé utilisable selon l'invention est modifié par N-, C- et/ou O-alkylation, -acylation, -amino-alkylation et/ou - polyoxyéthylénation (voir par exemple Dunn et al., 1993, J. Applied Polymer Science 50, 353-365 ; Boullanger et al., 1995, Carbohydr. Res. 278, 91-101 ; Muzzarelli et al., 1983, J. Memb. Science 16, 295-308). A cet égard, les composés particulièrement préférés sont la poly-N-dodecyl-polyglucosamine dans lequel le radical NH2 de la formule (I) est remplacé par NH-(CH2)11-CH3 et la mono-Cα-octadecyl- polyglucosamine dans lequel le radical OH du composé selon l'invention en bout de chaîne est remplacé par O-(CH2)17-CH3. Mais il est également possible de greffer un résidu alkyl de type hexyl à octadécyl ou un résidu alkyl mono non saturé de type oléoyl.
De manière particulièrement avantageuse, le composé utilisable selon l'invention est un sel de chitosanium, notamment un sulphate, un phosphate et, plus préférentiellement, un chlorure.
Les composés utilisables selon l'invention peuvent être obtenus de différentes manières. Ils peuvent par exemple être synthétisés chimiquement à partir du monomère de glucosamine par polymérisation ou à partir d'une préparation de haute masse moléculaire par hydrolyse enzymatique ménagée. Mais on préfère tout particulièrement mettre en oeuvre un procédé d'hydrolyse acide des préparations de chitosan de l'état de la technique suivi d'une diafiltration différentielle, tel que décrit ci- après.
La présente invention concerne également certains des composés de la formule (I) en tant que tel, notamment le composé de formule [X]n dans laquelle n représente un nombre entier de 5 à 300 et X a la formule (1) suivante :
Figure imgf000007_0001
caractérisé en ce que tout ou partie des résidus X composant ledit composé est modifié par N-, C- et/ou O-alkylation, alcylation, -amino-alkylation et/ou polyoxyéthylénation ; et le composé de formule [X]n dans laquelle n représente un nombre entier de 5 à 300 et X a la formule (1) suivante :
Figure imgf000008_0001
caractérisé en ce qu'il est présent sous forme de sel et plus particulièrement, de chlorure, de sulfate ou de phosphate ; ces composés préférés correspondant aux utilisations décrites précédemment.
La présente invention concerne également une préparation substantiellement pure de chitosan. Elle est en particulier obtenue par toute technique de purification classique et notamment, par extraction des pigments et autres contaminants résiduels. Cette étape de purification peut être réalisée sur les préparations commerciales de chitosan pour générer une préparation substantiellement pure de masse moléculaire élevée ou non qui peut être utilisée pour complexer un acide nucléique.
La présente invention concerne plus particulièrement une composition comprenant au moins un composé ou une préparation selon l'invention et une substance thérapeutiquement active. Il s'agit préférentiellement d'une substance chargée négativement et, en particulier, d'un acide nucléique. Par acide nucléique, on entend aussi bien un acide désoxyribonucléique (ADN) qu'un acide ribonucléique (ARN) sens ou antisens. Par ailleurs, l'acide nucléique peut être homologue ou hétérologue à la cellule hôte. Il peut s'agir de séquences naturelles, hybrides ou synthétiques dérivées d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, d'APvNr, d'ARNt, d'ARN viral, d'une origine quelconque (procaryote, eucaryote, virus, parasite, plante ...). Elles peuvent être obtenues par les techniques conventionnelles de biologie moléculaire (clonage, PCR pour Polymerase Chain Reaction en anglais ...) ou par synthèse chimique.
Selon un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention est un vecteur pour l'expression d'un gène d'intérêt thérapeutique. Le vecteur d'expression est avantageusement sous forme de plasmide mais on peut également avoir recours à un vecteur viral (dérivé d'un rétrovirus, adénovirus, poxvirus, virus de l'herpès, virus associé à l'adénovirus ...). S'agissant du mode préféré, le choix des plasmides utilisables dans la présente invention est vaste. On peut employer un plasmide/vecteur de l'état de la technique ou le construire par les techniques de manipulations génétiques (Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY). Avantageusement, il possède les éléments génétiques lui permettant de se répliquer et de se maintenir dans un microorganisme et/ou une cellule hôte, comme par exemple au moins une origine de replication et un gène de sélection. Dans ce dernier cas, il peut s'agir d'un gène codant pour une auxotrophie ou conférant une résistance à un antibiotique (ampicilline, tétracycline, puromycine, G418, chloramphénicol ...). Bien entendu, le plasmide en usage dans la présente invention peut également comprendre des éléments supplémentaires améliorant son maintien, sa stabilité dans la cellule hôte ou encore son intégration dans les chromosomes de l'hôte. D'une manière générale, de tels éléments sont connus de l'homme de l'art.
Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, le gène d'intérêt thérapeutique en usage dans la présente invention peut coder pour un ribozyme, un ARN antisens ou encore un ARNm qui sera ensuite traduit en polypeptide. Il peut s'agir d'un polypeptide mature, d'un précurseur et notamment un précurseur destiné à être sécrété et comprenant un peptide signal, d'un polypeptide natif, tronqué, chimère provenant de la fusion de séquences d'origines diverses ou d'un polypeptide muté présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. Parmi les polypeptides auxquels on peut envisager d'avoir recours, on peut citer plus particulièrement :
" les cytokines ou lymphokines (interférons α, β et γ, interleukines et notamment LL-2, ΓLL-6, riL-lO OU l'IL-12, facteurs nécrosant des tumeurs (TNF), facteurs stimulateurs de colonies (GM-CSF, C-CSF, M-CSF ...) ;
" les récepteurs cellulaires ou nucléaires (récepteurs reconnus par des organismes pathogènes (virus, bactéries, ou parasites) et, de préférence, par le virus VIH (Virus de l'Immunodéficience Humain) ou leurs ligands ;
" les protéines capables de complémenter une activité cellulaire déficiente notamment dans le cadre d'une maladie génétique (facteur Vu, facteur VIII, facteur IX, dystrophine ou minidystrophine, insuline, protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), hormones de croissance (hGH) ;
les enzymes (uréase, rénine, thrombine ...) ;
les inhibiteurs d'enzymes (αl-antitrypsine, antithrombine III, inhibiteurs de protéases virales ...) ;
" les polypeptides à effet anti-tumoral capables d'inhiber au moins partiellement l'initiation ou la progression de tumeurs ou cancers (ARN anti-sens, anticorps, inhibiteurs agissant au niveau de la division cellulaire ou des signaux de transduction, produits d'expression des gènes suppresseurs de tumeurs, par exemple p53 ou Rb, polypeptides ou peptides stimulant le système immunitaire
...) ;
" les protéines du complexe majeur d'histocompatibilité des classes I ou II ou protéines régulatrices agissant sur l'expression des gènes correspondants ;
" les polypeptides capables d'inhiber une infection virale, bactérienne ou parasitaire et/ou son développement (polypeptides antigéniques ayant des propriétés immunogènes, épitopes antigéniques, anticorps, variants trans-dominants susceptibles d'inhiber l'action d'une protéine native par compétition ...) ;
" les toxines (thymidine kinase de virus simplex de l'herpès 1 (TK-HSV-1), ricine, toxine cholérique, diphtérique ...) ou immunotoxines ; et
" les marqueurs (β-galactosidase, luciférase ...).
Il est à signaler que cette liste n'est pas limitative et que d'autres gènes peuvent également être employés.
Avantageusement, le gène thérapeutique est placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans la cellule hôte. Par "éléments nécessaires" on entend l'ensemble des éléments permettant sa transcription en ARN et la traduction d'un ARNm en polypeptide. Parmi ceux-ci, le promoteur revêt une importance particulière. Il peut dériver d'un gène quelconque (eucaryote, viral, promoteur naturel du gène d'intérêt en question ...) ou peut être hybride. Par ailleurs, il peut être constitutif ou régulable. Alternativement, il peut être modifié de manière à améliorer l'activité promotrice, supprimer une région inhibitrice de la transcription, modifier son mode de régulation, introduire un site de restriction... On peut mentionner, à titre d'exemples, les promoteurs viraux CMV (Cytomegalovirus), du gène TK du virus HSV-1, précoce du virus SV40 (Simian Virus 40), adénoviral précoce (El A) ou tardif (MLP pour Major Late Promoter) ou encore les promoteurs eucaryotes des gènes PGK (Phospho Glycerate kinase) murin ou humain, D l-antitrypsine (foie-spécifique), immunoglobulines (lymphocyte-spécifique).
Bien entendu, l'acide nucléique peut en outre comprendre des éléments additionnels tels que séquence intronique, séquence signal, séquence de localisation nucléaire, séquence terminatrice de la transcription, site d'initiation de la traduction de type IRES ou autre... On indique également que le vecteur peut comporter plusieurs gènes d'intérêt placés sous le contrôle d'éléments de régulation indépendants ou communs.
Selon un mode de réalisation optimal, les proportions respectives du composé selon l'invention et de l'acide nucléique sont de préférence déterminées de sorte que le rapport en charge dudit acide nucléique audit composé (R ADN/composé) est compris entre 1/10 et 10/1 et, de manière préférée entre 1/1 et 1/5.
Une composition selon l'invention peut être utilisée telle qu'elle ou en association avec d'autres composés et, en particulier un adjuvant capable d'améliorer son pouvoir transfectant. Les adjuvants utilisés préférentiellement dans la composition selon l'invention sont les composés amphiphiles cationiques et/ou les lipides neutres ou zwitterioniques. Dans le premier cas, on préfère un composé mono, di ou tri alkylé ou acylé portant de 1 à 4 charges positives tel qu'un lipide cationique. A titre d'exemples, on peut citer le 5-carboxyspermylglycine dioctadécylamide (DOGS), le 3β [N-(N', N'- diméthylaminoéthane)-carbamoyl] cholestérol (DC-Chol), le (2,3-droléylocyl-N- [2(sperminecarboxamido) éthyl] N, N-diméthyl-1-propanaminium trifluoroacétate) (DOSPA), la spermine cholestérol et la spermidine cholestérol. S'agissant d'un lipide neutre ou zwitterionique, on peut mentionner les phosphatidyl éthanolamine, phosphatidylcholine, phosphocholine, sphyngomyéline, céramide et cérébroside ou leurs dérivés. De préférence, il s'agit de la dioléyl phosphatidyl éthanolamine (DOPE). Une composition selon l'invention est plus particulièrement caractérisée en ce que le rapport de charge lipide sur ADN est compris entre 25/1 et 1/1 et de préférence 5/1 et
2/1.
II est également possible de combiner à la composition selon l'invention d'autres substances pour améliorer encore l'efficacité transfectionnelle ou la stabilité des complexes.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une composition selon l'invention, pour préparer un médicament à but curatif, préventif ou vaccinal destiné au transfert d'acide nucléique dans une cellule hôte in vivo, ex vivo ou in vitro. Une composition selon l'invention peut être utilisée dans divers types de cellules hôtes, par exemple une cellule de microorganisme, de levure, d'insecte, de plante mais il s'agit de préférence d'une cellule de mammifère et, en particulier d'une cellule humaine. Ladite cellule peut être une cellule primaire ou tumorale d'une origine hematopoïétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte, macrophage ...), hépatique, rénale, du système nerveux central, fibroblaste, épithéliale et notamment une cellule épithéliale pulmonaire, ou musculaire (myocyte, myoblaste, cardiomyocyte, cellule satellite ...).
Une composition selon l'invention peut être administrée par voie systémique ou par aérosol. On peut envisager plus particulièrement la voie gastrique, sous-cutanée, intracardiaque, intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, intratumorale, intrapulmonaire, intranasale ou intratrachéale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de différents paramètres, par exemple de l'individu ou de la maladie à traiter ou encore du ou des gènes(s) à transférer. La formulation peut également inclure un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Une composition selon l'invention est en particulier destinée au traitement préventif ou curatif de maladies génétiques (hémophilie, mucoviscidose, myopathie de Duchenne et Becker ...), cancers et maladies virales (SIDA, infections à papillome, virus de l'herpès ...). Enfin, la présente invention concerne également un procédé pour préparer un composé utilisable selon l'invention à partir d'une préparation de chitosan de haute masse moléculaire par hydrolyse acide, précipitation à l'éthanol et extraction des pigments en présence d'un solvant organique.
Les préparations de chitosan de haute masse moléculaire sont accessibles commercialement (par exemple Fluka, références 22741, 22742 et 22743). Dans le cadre de la présente invention, on préfère mettre en oeuvre une préparation d'une masse moléculaire moyenne d'environ 70 kDa qui correspond à la plus faible masse moléculaire disponible sur le marché (Fluka référence 22741). L'hydrolyse acide est réalisée en présence d'acide chlorhydrique à une molarité d'environ 4 M à une température d'environ 100°C et pendant environ 4 heures. Bien entendu, l'homme du métier est capable d'adapter les conditions expérimentales d'hydrolyse selon la préparation de départ. Après filtration grossière pour éliminer les insolubles et refroidissement, l'hydrolysat est précipité par de l'éthanol à une concentration finale d'environ 50% à froid. Le matériel précipité est récolté par centrifugation ou tout moyen classique. Il est préférable de procéder à plusieurs lavages dans de l'éthanol 50% avant de le reprendre dans de l'eau ou un tampon approprié.
Le matériel dissous est soumis à une extraction en présence de solvant. Tout solvant polaire et non miscible à l'eau peut être utilisé et, notamment, des alcools C4 à C8 et des esters de ces derniers. Un solvant préféré dans le cadre de l'invention est le butanol-2. Cette étape qui présente l'avantage de réduire considérablement les pigments contenus dans la préparation de départ, comprend de préférence une première extraction par un tiers de volume de butanol-2 puis une seconde extraction réalisée sur la phase aqueuse par un tiers de volume d'un mélange butanol-2/héxane (50/50).
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé selon l'invention comprend une étape supplémentaire visant à séparer les composés de l'invention selon leur taille. Bien que différentes méthodes de fractionnement puissent être envisagées (gel perméation, filtration sur membrane ...), on préfère avoir recours à une diafiltration différentielle utilisant des membranes de seuil de coupure croissant. Le composé de l'invention ayant une masse moléculaire moyenne inférieure à 5 kDa est obtenu dans le filtrat résultant d'une première diafiltration à travers une membrane ayant un seuil de coupure de 5 kDa. Le concentré est alors récupéré et soumis à une seconde diafiltration à travers une membrane ayant un seuil de coupure de 10 kDa afin d'obtenir dans le filtrat le composé ayant une masse moléculaire moyenne de 5 à 10 kDa et, dans le concentré, le composé de l'invention ayant une masse moléculaire moyenne supérieure à 10 kDa et inférieure au chitosan de départ. Bien entendu, l'homme du métier est capable d'adapter la technique en fonction de la masse moléculaire moyenne désirée. Il est également possible de procéder à une ou plusieurs diafiltration(s) supplémentaire(s) sur le dernier concentré généré. Par exemple, le passage de ce dernier à travers une membrane ayant un seuil de coupure de 15 kDa permettra de récolter des composés selon l'invention ayant une masse moléculaire moyenne de 10 à 15 kDa.
La présente invention est plus particulièrement décrite en référence aux Figures suivantes :
La Figure 1 illustre un graphe de cytotoxicité sur cellules L132 obtenus avec les polymères pcTG12 NI, pcTG12 N2, pcTG12 N3, le dextran et la polylysine.
La Figure 2 illustre un graphe de cytotoxicité sur cellules CCRF-CEM obtenus avec les polymères pcTG12 NI, pcTG12 N2, pcTG12 N3, le dextran et la polylysine.
La Figure 3 illustre l'activité hémolytique testée sur des globules rouges de rat des polymères pcTG12 NI, pcTG12 N2, pcTG12 N3, du dextran et de la polylysine après 1 heure de contact.
La Figure 4 illustre l'activité hémolytique testée sur des globules rouges de rat des polymères pcTG12 NI, pcTG12 N2, pcTG12 N3, du dextran et de la polylysine après 5 heures de contact.
La Figure 5 illustre l'expression de la luciférase dans les cellules A549 transfectées avec le plasmide pTG1 1033 complexé à du DC Chol/DOPE (contrôle) ou du DC Chol/DOPE/chitosan à une concentration de 10, 30 et 60 %.
La Figure 6 illustre l'expression de la luciférase dans des myoblastes primaires transfectés avec le plasmide pTG11033 complexé à du DC Chol/DOPE (contrôle) ou du DC Chol/DOPE/chitosan à une concentration de 10, 30 et 60 %. EXEMPLES
EXEMPLE 1 : préparation des fragments de chitosan.
De manière générale, les préparations commerciales de chitosan de masse moléculaire variée peuvent être utilisées et les plus appropriées à la mise en oeuvre de la présente invention, sont celles de faible masse moléculaire (par exemple la préparation Fluka sous la référence 22741 dont la masse moléculaire moyenne est d'environ 70 kDa). L'hydrolyse acide est réalisée dans une bouteille Schott DURAN de contenance 1 litre munie d'un agitateur magnétique. Après pesée, 25 g de chitosan (lot 340315/1 295) sont mis en présence de 625 ml d'acide chlorhydrique (HC1) 4 M (HC1 de qualité analytique tel que R.P Normatur, Prolabo 20 252.290, min 36%). Après avoir procédé à l'échange de la phase gazeuse pendant 5 min avec de l'azote (pour éviter toute oxydation) et à la fermeture de la bouteille, le mélange réactionnel est placé sous agitation magnétique régulière (500 rpm) dans un bain d'huile maintenu à 100°C. Après équilibration de la température (15 min dans les conditions expérimentales précitées), on laisse la réaction se poursuivre pendant 4 heures à 100°C. On observe que ce traitement s'accompagne d'un changement de coloration de la solution qui apparaît brun clair. Bien entendu, les conditions d'hydrolyse sont adaptées à la préparation de chitosan de départ. Si celle-ci présente une masse moléculaire élevée (Fluka, 750 ou 2000 kDa), l'hydrolyse sera plus stringente (augmentation de la concentration en HC1 ou du temps de réaction).
Le mélange réactionnel est immédiatement filtré (filtre de pores d'environ 0,6 mm) afin d'éliminer les impuretés et aggrégats insolubles. Le filtrat est transvasé dans une bouteille Schott DURAN de 2 litres et refroidi pendant environ 1 heure dans de la glace avant d'être précipité par ajout de 625 ml d'éthanol absolu (de qualité analytique, par exemple sds, référence 013A0516) et conservé une nuit à 2-4°C. Le lendemain, le matériel précipité est récolté par centrifugation (10000 g, 2-4°C, 10 min) et soumis à deux lavages dans un mélange éthanol/eau (50/50). Les culots sont repris dans 20 à 60 ml d'eau déminéralisée sur cartouche Milli Q (eau Milli Q), congelés à -80°C en attendant d'être lyophilisés. On obtient habituellement 12 à 16 g de fragments de chitosan sous forme de sels d'hydrochlorure. On procède ensuite à l'extraction des pigments de la préparation de chitosan x nHCl de la façon suivante. 14,9 g de la préparation lyophilisée précédente sont dissous dans 300 ml d'eau Milli Q puis traités par 100 ml de butanol-2 (qualité analytique). Le mélange est alors agité vigoureusement et laissé à température ambiante dans une ampoule à décanter jusqu'à séparation des phases. La phase supérieure de coloration brunâtre est éliminée et la phase aqueuse est soumise à une nouvelle extraction en présence de 100 ml d'un mélange butanol-2/héxane (50/50). Comme précédemment, on récupère la phase inférieure dont on évapore le milieu aqueux par rotation sous vide.
Le matériel séché est finalement mis en solution dans 50 à 100 ml d'eau Milli Q et soumis à deux étapes de diafiltration consécutives mettant en oeuvre des membranes de seuil de coupure croissant afin de purifier des fragments de chitosan de masse moléculaire correspondante. La solution est tout d'abord filtrée à travers une membrane de seuil de coupure de 5 kDa (par exemple YM-5, Amicon). Cette dernière opération est répétée trois fois en complétant avec de l'eau Milli Q jusqu'au volume initial et les filtrats ainsi obtenus sont regroupés et congelés en attente d'une lyophilisation. On obtient une préparation sèche de couleur blanche de chlorure de chitosan d'une masse moléculaire inférieure à 5 kDa (désignés pcTG12 NI). Le concentré est quant à lui soumis à une seconde diafiltration sur membrane de seuil de coupure de 10 kDa (par exemple YM-10, Amicon). Après 3 lavages avec le volume initial, les filtrats sont regroupés, congelés et lyophilisés pour donner une préparation sèche de couleur blanche de chlorure de chitosan d'une masse moléculaire comprise entre 5 et 10 kDa (désignés pcTG12 N2). On récupère le concentré qui est également congelé et lyophilisé à partir duquel on obtient préparation sèche légèrement jaunâtre de chlorure de chitosan d'une masse moléculaire supérieure à 10 kDa (désignés pcTG12 N3).
Les préparations ainsi générées peuvent être caractérisées par les méthodes analytiques conventionnelles, par exemple par dosage des groupes aminés libres (Curotto et Aros, 1993, Analytical Biochemistry 21 1, 240-241). On a également déterminé la longueur des polymères par spectrométrie de masse desorption laser et on observe une distribution en courbe de Gausse. Les polymères de la préparation pcTGl2 NI (< 5 kDa) sont formés d'une répétition de 5 à 35 résidus glucosamines, le maximum se situant aux environs de 10. Les polymères de la préparation pcTG12 N2 (5-10 kDa) présentent une répétition de 10 à 50 monomères, le maximum étant compris entre 30 et 35. Pour ce qui est de la préparation pcTG12 N3, on observe un nombre de résidus glucosamines supérieur à 15.
EXEMPLE 2 : Complexation avec l'ADN et résultats sur gel
On évalue la capacité des préparations polymériques précédentes à complexer le plasmide reporter pCHUON. Il comporte le bloc promoteur/enhancer du virus SV40 dirigeant l'expression du gène LacZ codant pour la β-galactosidase d'Escherichia coli munie en N-terminal d'un signal de localisation nucléaire issu de SV40.
500 ng d'ADN plasmidique sont mis en présence de quantités croissantes de chacune des préparations pcTG12 N selon un rapport en masse ADN/chitosan variant de 1/0,5 à 1/4 (les rapports ADN/chitosan précis sont : 1/0,5, 1/1 , 1/1,5, 1/2, 1/3 et 1/4) dans un volume total de lOμl éventuellement complété par du TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) pH 7,5. Le témoin négatif est constitué par de l'ADN plasmidique repris simplement dans du TE. Les mélanges sont analysés sur gel d'agarose 0,9% (tampon de migration TAExl pH 7,8 et migration 2 heures à 50V) et révélés par le bromure d'éthidium. L'ADN plasmidique libre migre sous la forme de plusieurs bandes correspondant aux différents topoisomères (ADN circulaire, superenroulé) alors qu'une fois complexé au chitosan, il ne pénètre plus dans le gel et est visualisé dans les poches de dépôt.
Les résultats montrent que l'ADN plasmidique est entièrement complexé aux polymères pcTG12 NI et N2 à partir d'un rapport ADN/chitosan de 1/2 et 1/3 respectivement. La formation du complexe est plus rapide avec les polymères de masse moléculaire supérieure à 10 kDa pour lesquels l'absence d'ADN libre est observée dès l'équimolarité (R 1/1). Dans leur ensemble, ces résultats montrent la capacité des 3 préparations de l'invention à lier l'ADN plasmidique.
EXEMPLE 3 : Essais cytotoxiques
A. In vitro
La cytotoxicité des polymères pcTG12 NI, N2 et N3 a été évaluée in vitro à l'égard des lignées cellulaires humaines L132 (ATCC CCL5) issues de poumons embryonnaires humains et CCRF-CEM (ATCC CCL1 19) issues d'un lymphoblastome humain. Ces lignées ont été retenues sur la base de leur comportement différent en culture cellulaire, la première poussant de manière adhérente (L132) et la seconde en suspension (CCRF-CEM).
Les cellules CCRF-CEM sont mises en culture dans une plaque de microtitration à 96 puits ayant un fond en forme de "v" (Costar) à raison de 1x104 cellules par puits et cultivées à 37°C en atmosphère CO2 5% dans du milieu RPMI 1640 (Gibco BRL) contenant 10 % de sérum de veau foetal (FCS) (Gibco BRL). Après 24 heures, les cellules sont centrifugées à 1000g pendant 10 min et le culot cellulaire est repris dans le même milieu en présence des polymères à tester (dissolution d'une quantité adéquate de chacun des polymères dans du milieu RPMI 1640-10% FCS de manière à obtenir une concentration finale de 0, 1 μg/ml à 1 mg/ml puis filtration stérilisante sur filtres 0,2 μm (Acrodisk)). On utilise du milieu contenant du dextran de masse moléculaire 72 kDa (Sigma) à des concentrations identiques à celles utilisées pour les molécules pcTG12 à titre de témoin négatif et de la polylysine de masse moléculaire 30-70 kDa (Sigma) à titre de témoin positif. Les cellules contrôles sont cultivées dans les mêmes conditions mais en l'absence de polymères.
Les cellules L132 sont mises en culture dans une plaque de microtitration à 96 puits (Costar) à raison de lxl 04 cellules par puits et cultivées à 37°C en atmosphère CO2 5% dans du milieu El 99 (Gibco BRL, référence 22340-012) contenant 5% de FCS. Après 24 heures, le surnageant de culture est remplacé par du milieu frais El 99-5 % FCS dans lequel ont été dissous des concentrations appropriées de chacun des polymères de l'invention ou des témoins comme indiqué ci-dessus.
La viabilité des cellules L132 et CCRF-CEM est déterminée après 67 heures d'exposition aux différents polymères par le test MTT selon la technique décrite dans Sgouras et Ducan (1990, J. of Materials Science: Materials in Médecine 1, 61-68). Après une période d'incubation de 5 heures, le surnageant cellulaire est éliminé (éventuellement après centrifugation à basse vitesse dans le cas des lignées en suspension) et remplacé par 100 μl de DMSO de grade optique (Sigma) et on détermine l'absorbance à 550 nm au niveau de chaque puits de culture (lecteur de plaque Titerteck). Une faible absorbance est signe d'une mortalité importante. La viabilité est exprimée en pourcentage par rapport à l'absorbance lue pour les cellules cultivées en absence de polymères.
Les Figures 1 et 2 présentent les résultats obtenus pour les cellules L132 et CCRF- CEM respectivement et montrent que les 3 polymères selon l'invention (fragments de chitosan de masse moléculaire <5, 5-10 et > 10 kDa) affectent peu la viabilité cellulaire et ceci à des doses aussi élevées que 0,5 mg/ml, tout comme le dextran (non toxicité reconnue). A 1 mg/ml, on observe une réduction de la viabilité d'un facteur environ 20%. L'IC50 soit 50 % de cellules viables correspond à une concentration d'environ 2 mg/ml. En revanche, la polylysine excerce un effet cytotoxique à des doses 100 fois inférieures (IC50 atteinte à une concentration de 10 μg/ml).
Dans leur ensemble, ces données confirment l'absence de cytotoxicité des préparations de chitosan de l'invention prérequise à leur utilisation pour le transfert de matériel génétique chez l'homme.
Des données récemment publiées (Carrino-Gomez et Ducan, 1996,Proc. lst International Symposium on Polymer Therapeutics : From the Laboratory to Clinical Practise. Janvier 10-12 1996, Londres) semblent indiquer une certaine cytotoxicité des préparations de chitosan de masse moléculaire élevée. Cet effet cytotoxique pourrait être dû à la masse moléculaire ou à un effet de charge. On indique également que le conjugué chitosan-galactose décrit par Murata et al. (1996, supra) présente une activité cytotoxique supérieure aux composés de la présente invention (50 % de cytotoxicité pour environ 200 μg/ml si l'on se reporte à la Figure 1).
B. In vivo
200 μg de chacune des préparations de chitosan de l'invention ont été administrés à des lapins par voie intraveineuse et on n'observe aucun effet toxique.
EXEMPLE 4 : Essais d'hématocompatibilité
A. Hémolyse de globules rouges Les polymères pcTG12 NI, N2 et N3 sont dilués à des concentrations allant de 1 à 10 ng/ml dans du tampon PBS, mis en présence d'une suspension fraîche de globules rouges de rat (2 % poids/volume) et incubés à 37°C pendant 1 et 5 heures. Le mélange est centrifugé à 1500g pendant 10 min à température ambiante et la quantité d'hémoglobine présente dans le surnageant est évaluée par dosage spectophotométrique à 550 nm. On procède de même avec les témoins dextran et polylysine. Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse par rapport à un contrôle traité par du Triton X-100 (Sigma) qui correspond à 100 % de lyse.
Les données obtenues après 1 et 5 heures de contact sont illustrées par les Figures 3 et 4. Les trois polymères de l'invention ne montrent pas d'activité membranaire jusqu'à 100 μg/ml (105 ng/ml) et au delà une activité lyrique inférieure à 10 % après 5 heures de contact. Dans les mêmes conditions, la polylysine à une concentration supérieure à 10 μg/ml affecte l'intégrité membranaire.
B. Etudes de microcopie électronique
Les hématies de rats sont incubées pendant 1 ou 5 heures en présence de 10 μg/ml de pcTG12 NI, N2, N3, dextran ou polylysine puis mises en suspension une nuit dans une solution de glutaraldéhyde (0,25 % vol/vol) reconstituée dans du PBS (Oxoide). Les cellules sont centrifugées à faible vitesse (1200g 1 min à température ambiante ; centrifugeuse MSE Microcentour) et, après élimination du surnageant, reprises dans du tétroxyde d'osmium 1 % (poids/vol) dans du PBS. Après 1 heure à température ambiante, on procède à une centrifugation dans les mêmes conditions que précédemment et les cellules sont traitées par de l'éthanol 50 % dilué dans du PBS pendant 30 min. Cette dernière opération est répétée avec de l'éthanol 60 %, 70 %, 80 % , 90 % et enfin de l'éthanol absolu. Le culot cellulaire est mis en suspension dans de l'héxamethyldisilazane (HMDS, Sigma) et, après évaporation du HMDS, les échantillons sont recouverts d'or (50 μA EMTECH Gold Coater). L'examen en microscopie électronique (Philips XL) montre que les polymères de l'invention ne perturbent pas la morphologie des hématies (morphologie comparable aux cellules traitées par du PBS seul ou du dextran) alors qu'un grand pourcentage des cellules incubées en présence de polylysine présente une morphologie altérée (en forme d'étoile). EXEMPLE 5 : Transfection des complexes chitosan/acide nucléique
Le plasmide pTG11033 (1 mg/ml) est utilisé pour évaluer l'efficacité transfectionnelle des composés de l'invention. Il comporte le gène reporter lue qui code pour la luciférase placé sous le contrôle du promoteur CMV et le gène de résistance à la kanamycine. Mais tout autre plasmide peut également être employé. Le DC-Chol est obtenu par synthèse chimique à une échelle de 20 g selon le procédé décrit par Gao et al. (1991, BBRC 179, 280-285). Le colipide DOPE est disponible commercialement (Sigma, référence P5078). Les solutions stock des préparations de chitosan pcTG12N sont conservées à 10 mg/ml dans du chloroforme. Le mélange DC-Chol/DOPE est obtenu par mélange des deux composés selon un rapport en poids de 1/1 et une solution stock est établie dans du chloroforme à raison de 10 mg/ml.
A. Transfection de cellules pulmonaires
Les transfections sont réalisées en plaques de 96 puits dans lesquels sont mises en culture 2x104 cellules A 549 (ATCC CCL185) dérivées de carcinome pulmonaire humain , dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de FCS. Après 24 heures de culture à 37°C en atmosphère CO2 (5 %), les cellules sont mises en présence de complexes ADN/DC Chol/DOPE en absence ou en présence des polymères pcTG12 NI . La préparation des complexes se fait dans des tubes Nunc en polypropylène et sous hotte à flux laminaire afin de préserver la stérilité des préparations. Brièvement, on procède tout d'abord au mélange des lipides au polymère par injection du DC-Chol/DOPE soit dans de l'eau (témoin 0 % de chitosan) ou dans de l'eau additionnée de chitosan (10, 30 ou 60 %) à l'aide d'une seringue Hamilton et en maintenant l'ensemble sous agitation lente. On indique que les pourcentages de chitosan sont calculés par rapport à la charge apportée par le lipide cationique DC- Chol. L'ADN est ensuite ajouté au mélange lipide/polymère.
Plus précisemment 2 mg de DC-Chol/DOPE (200 μl de solution stock) sont séchés et les lipides secs repris dans 150 μl d'éthanol jusqu'à dissolution complète (une sonication de 10 secondes peut améliorer la dissolution) et on génère les mélanges suivants : DC Chol/DOPE/ ADN : 40,5 μl (540,5 μg) de la solution lipidique précédente sont ajoutés à 500 Dl d'eau dont 455 μl (soit 455 μg) sont mis en présence de 30 μg de pTGl 1033 dissous dans un volume de 145 μl d'eau,
DC Chol/DOPE/10 % Chitosan/ ADN : 40,5 μl (540,5 μg) de la solution lipidique précédente sont ajoutés à 498 μl d'eau et 2 μl (20 μg) de chitosan dont 455 μl sont mis en présence de 30 μg de pTGl 1033 dissous dans un volume de 145 μl d'eau,
DC Chol/DOPE/30 % Chitosan/ADN : 40,5 μl (540,5 μg) de la solution lipidique précédente sont ajoutés à 494 μl d'eau et 6 μl (60 μg) de chitosan dont 455 μl sont mis en présence de 30 μg de pTGl 1033 dissous dans un volume de 145 μl d'eau,
DC Chol/DOPE/60 % Chitosan/ADN : 40,5 μl (540,5 μg) de la solution lipidique précédente sont ajoutés à 488 μl d'eau et 12 μl (120 μg) de chitosan dont 455 μl sont mis en présence de 30 μg de pTGl 1033 dissous dans un volume de 145 μl d'eau.
Après 24 heures à 4°C, on ajoute aux mélanges précédents 19 μl de NaCl 5 M afin d'ajuster la concentration à 0,9 % (154 mM). On prélève 86 μl de chacun des mélanges ainsi générés qui sont placés dans la ligne A d'une plaque de microtitration de 96 puits, complétés à 100 μl à l'aide du milieu DMEM et dilués au 1/2 en cascade dans du milieu DMEM. Le volume dans chaque puit est complété à 235 μl avec le milieu de culture et 225 μl prélevés et ajoutés aux cellules A549 en culture depuis 24 heures. 25 μl de FCS sont ajoutés 4 heures après le début de la transfection. La culture est poursuivie pendant 48 heures, le milieu éliminé et après avoir été lavées par 100 μl de tampon PBS, les cellules sont lysées par 50 μl de tampon de lyse (Promega) et congelées à -80°C jusqu'à mesure de l'activité luciférase. L'activité luciférase est révélée sur 20 μl (soit 2/5 de l'échantillon) par mesure de l'émission de photons à l'aide d'un luminomètre (LB96P, Berthold). Les résultats sont exprimés en RLU/mn échantillon. A titre indicatif, la concentration en protéine de l'échantillon mesuré est de 24 à 32 μg.
Comme montré dans la Figure 5, la présence de chitosan dans les complexes DC
Chol/DOPE/ADN s'avère avantageuse, le taux de transfection reflété par l'activité luciférase étant supérieur avec les complexes contenant du chitosan qu'avec les complexes qui en sont dépourvus. En effet, l'activité luciférase est significativement plus élevée d'un facteur environ 1,5 en présence de 10% de chitosan et d'un facteur 2 en présence de quantités plus importantes (30 et 60%)
B. Transfection de myoblastes primaires
Les myoblastes sont obtenus de biopsies pratiquées sur des muscles quadriceps de chiens mâles. Les prélèvements sont fragmentés en segments d'environ 1 mm3 et mis en culture dans des boîtes de Pétri (Falcon) recouvertes de gélatine plasmatique humaine 1 %. La culture est effectuée dans du milieu Ham FI 4 (Gibco BRL) additionné de facteurs de croissance [Glutamine 2 mM (BioMérieux), FGF 10 ng/ml (Peprotech-TEBU), EGF 10 ng/ml (Sigma), insuline 10 μg/ml (Sigma)], de gentamicine 40 μg/ml (Scherring Plough) et de sérum de veau à une concentration de 10 %. Dans ces conditions, on observe une croissance extensive des cellules mononuclées, principalement des myoblastes (confirmé par des études cytochimiques) Après élimination des fragments tissulaires, la couche de myoblastes est dissociée en présence de trypsine (0,25 %) ceci avant la fusion en fibres musculaires ou myotubes La culture est poursuivie pendant au plus 15 passages et les cellules congelées en azote liquide dans du milieu DMEM contenant 10 % de FCS et 8 % de DMSO
Pour les transfections, après décongélation, les cellules sont réparties dans des plaques de 96 puits à raison de 5x 103 cellules par puits et cultivées dans des conditions standards pendant 24 heures avant d'être transfectees en milieu sans sérum par des quantités variables d'ADN plasmidique (2, 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,063, 0,032 ou 0,016 μg) complexé au DC Chol/DOPE seul (à titre de comparaison) ou au mélange DC Chol/DOPE/Chitosan à une concentration en chitosan de 10, 30 ou 60 % Comme précédemment, on met en oeuvre la préparation pcTG12Nl et les pourcentages de chitosan sont exprimés par rapport à la charge apportée par le DC-Chol. Les différents complexes sont préparés dans du milieu Ham F 14 supplémenté en gentamicine et glutamine selon les méthodes conventionnelles ou comme indiqué à l'exemple précédent. Une fois le milieu de culture aspiré, les cellules sont transfectees par 225 μl de chaque échantillon à tester Quatre heures après la transfection, les cellules sont replacées en présence de sérum par ajout de 25 μl de FCS dans chaque puit. L'activité luciférase est déterminée 48 heures post-transfection après lavage des cellules dans du tampon phosphate et lyse (tampon Promega) La mesure est réalisée à l'aide d'un luminomètre Microlumat LB96P (Berthold) Les résultats reportés dans la Figure 6 montrent que les meilleurs taux de transfection sont obtenus avec les complexes incorporant du chitosan, l'activité luciférase étant 4 à 9 fois plus élevée que lorsque la transfection met en oeuvre l'ADN complexé au DC Chol/DOPE seul. En conclusion, l'effet transfectionnel bénéfique du chitosan a été observé dans une lignée cellulaire d'adénocarcinome de poumon et, à un niveau encore plus élevé, dans une lignée primaire de myoblastes
EXEMPLE 6 : Biodistribution des polymères pcTG12 NI. N2 et N3
Les préparations de chitosan pcTG12 NI, N2 et N3 sont marquées à l'iode à l'aide du réactif de Bolton / Hunter (Amersham Life Science ; IM5861) (Bolton et Hunter, 1973, Biochem J. 133, 529-539). Les préparations sont ajustées à 10 mg/ml dans du tampon borate (pour 1 1 : 3,094 g d'acide borique, 3,728 g de chlorure de potassium, pH 6,5) et 500 μl mis en présence de triéthylamine (193 μl pour pcTG12 NI et 163 μl pour pcTG12 N2 et N3) permettant la déprotonation des groupes -NH3+ en -NH2. Chaque polymère ainsi activé est ajouté à 0,5 mCi de réactif de Bolton / Hunter (100 μl) préalablement séché et on laisse la réaction se poursuivre pendant 15 min sur glace.
L'efficacité du marquage est déterminée sur une aliquote de 5 μl par électrophorèse sur papier chromatographique (Whatman, réf. 3001 845) et dans du tampon barbital pH8,6 (Sigma, réf. B6632). On utilise à titre de témoin du Na 125I (Amersham, réf. IMS30). La migration des préparations marquées par rapport au témoin permet de quantifier la proportion de 125I libre et lié (voir thèse de Ruth Duncan 1979, Keele University). Le pourcentage de I libre est estimé inférieur à 1 %. Le reste de la préparation est soumis à une dialyse contre une solution de HC1 1 % (v/v) dans de l'eau (tubes de dialyse Sigma D7884) jusqu'à ce que l'on ne puisse plus détecter de radioactivité dans le dialysat.
200 μl de la préparation marquée (5 x 104 cpm) est administrée par voie intraveineuse à des rats Wistar (3 rats par préparation). Les animaux sont sacrifiés 5 min ou 60 min après l'injection et on détermine la radioactivité dans les urines, les faeces et une sélection d'organes après digestion dans la soude NaOH IN contenant 0, 1 % de Triton X-100 (v/v). Le comptage est réalisé à l'aide d'un compteur gamma (LKB Wallac) pendant 10 min par échantillon. La quantité de radioactivité dans chaque organe par rapport à la radioactivité totale est déterminée.
Les résultats présentés dans les tableaux ci-après sont exprimés en pourcentage de la dose récupérée par organe (± la dérivation standard) et montrent une récupération de 32 % (5 min) et 16 % (60 min) des doses injectées pour la préparation NI et 36 % (5 min) et 47 % (60 min) pour la préparation N3.
Biodistribution de pcTG12 NI
Figure imgf000025_0001
Biodistribution de pcTG12 N3
Figure imgf000026_0001
EXEMPLE 7 : Etude de dégradation des complexes chitosan - ADN
I mg d'ADN de thymus de veau est complexé à des quantités croissantes des préparations pcTG12 NI, N2 et N3 selon un rapport de charges (polymères / ADN) de 1 :1 à 1:0,01. Les complexes ainsi formés sont mis en présence de désoxyribonucléase
II (DNAase II) selon le protocole standard et l'état de l'ADN est estimé sur gel d'agarose. La dégradation est notablement réduite (par rapport à un témoin ADN non complexé) lorsque l'ADN est complexé au chitosan selon un rapport de charges élevé.

Claims

Revendications
1. Composition comprenant au moins un composé de formule [X]n dans laquelle n représente un nombre entier de 5 à 300 et X a la formule (1) suivante :
Figure imgf000027_0001
et une substance thérapeutiquement active.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que n représente un nombre entier de 5 à 150.
3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que n représente un nombre entier de 5 à 75, et notamment, 5 à 50.
4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit composé présente une masse moléculaire moyenne inférieure à 5 kDa.
5. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit composé présente une masse moléculaire moyenne comprise entre 5 et 10 kDa.
6. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit composé présente une masse moléculaire moyenne supérieure à 10 kDa et inférieure à
50 kDa.
7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que tout ou partie des résidus X composant ledit composé est modifié par N-, C- et ou O- alkylation, alcylation, -amino-alkylation et/ou -polyoxyéthylénation.
8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit composé est sous la forme d'une poly-N-dodécyl-polyglucosamine ou d'une mono-Cα-octadecyl- polyglucosamine.
9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit composé est sous forme de sel et plus particulièrement, de chlorure, de sulfate ou de phosphate.
10. Composition selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ledit composé est substantiellement dépourvu de pigments et d'impuretés résiduelles.
11. Composition selon les revendication 1 à 10, caractérisée en ce que ladite substance thérapeutiquement active est un acide nucléique.
12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit acide nucléique est un vecteur pour l'expression d'un gène d'intérêt thérapeutique placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans une cellule hôte.
13. Composition selon la revendication 12, caractérisée en ce que le gène thérapeutique code pour un ribozyme, un ARN antisens ou encore un polypeptide sélectionné parmi une cytokine (interleukine-2, interleukine-12, interferon alpha, béta ou gamma, facteur nécrosant des tumeurs, facteur stimulateur de colonies, antigène du complexe majeur d'histocompatibilité ...), un récepteur de surface cellulaire ou nucléaire, un facteur de coagulation (FVII, FVIII, FIX ...), la protéine CFTR (pour Cystis Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), la dystrophine, l'insuline, une hormone de croissance, une enzyme (rénine, thrombine, uréase ...), un inhibiteur, un antigène viral, un épitope antigénique, un polypeptide supresseur de tumeur, un anticorps, une toxine (thymidine kinase du virus simplex-lde l'herpès, ricine, toxine diphtérique ...), un polypeptide ayant une activité antitumorale ou antivirale et un polypeptide marqueur.
14. Composition selon l'une des revendications 1 1 à 13, caractérisée en ce que le rapport en charge dudit acide nucléique audit composé est compris entre 10/1 et 1/10, et notamment, entre 1/1 et 1/5.
15. Composition selon l'une des revendications 10 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, au moins un adjuvant capable d'améliorer le pouvoir transfectant de ladite composition.
16. Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit adjuvant est un composé amphiphile cationique.
17. Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce que ledit composé amphiphilique cationique est un composé mono, di ou tri alkylé ou acylé portant de 1 à 4 charges positives.
18. Composition selon la revendication 17, caractérisée en ce que ledit composé est un lipide sélectionné parmi le 5-carboxyspermylglycine dioctadécylamide (DOGS), le 3β [N-(N, N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyl] cholestérol (DC-Chol), le (2,3- droléylocyl-N-[2(sperminecarboxamido) éthyl] N, N-diméthyl-1-propanaminium trifluoroacétate) (DOSPA), la spermine cholestérol et la spermidine cholestérol.
19. Composition selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisée en ce que ledit adjuvant est un lipide neutre ou zwitterionique.
20. Composition selon la revendication 19, caractérisée en ce que ledit lipide neutre ou zwitterionique est ou dérive d'une phosphatidyl éthanolamine, phosphatidylcholine, phosphocholine, sphyngomyéline, céramide ou cérébroside.
21. Composition selon la revendication 20, caractérisée en ce que ledit lipide neutre ou zwitterionique est la dioléyl phosphatidyl éthanolamine (DOPE).
22. Composition selon l'une des revendications 16 à 21, caractérisée en ce que le rapport de charge composé amphiphile cationique sur ADN est compris entre 25/1 et 1/1 et de préférence 5/1 et 2/1.
23. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 1 à 22, pour préparer un médicament à but curatif, préventif ou vaccinal destiné au transfert dudit acide nucléique dans une cellule hôte in vivo, ex vivo ou in vitro.
24. Utilisation selon la revendication 23, caractérisée en ce que ladite cellule hôte est une cellule de microorganisme, de levure, d'insecte, de plante, humaine, animale et, notamment, mammifère.
25. Utilisation selon la revendication 24, caractérisée en ce que ladite cellule hôte humaine est une cellule musculaire ou une cellule épithéliale pulmonaire.
26. Composé de formule [X]n dans laquelle n représente un nombre entier de 5 à 300 et X a la formule (1) suivante :
Figure imgf000030_0001
caractérisé en ce que tout ou partie des résidus X composant ledit composé est modifié par N-, C- et/ou O-alkylation, alcylation, -amino-alkylation et/ou polyoxyéthylénation.
27. Composé selon la revendication 26, sous la forme d'une poly-N-dodécyl- polyglucosamine ou d'une mono-Cα-octadecyl-polyglucosamine.
28. Composé de formule [X]n dans laquelle n représente un nombre entier de 5 à 300 et X a la formule (1) suivante :
Figure imgf000030_0002
caractérisé en ce qu'il est présent sous forme de sel et plus particulièrement, de chlorure, de sulfate ou de phosphate.
29. Composé selon les revendications 26 à 28, caractérisé en ce que n représente un nombre entier de 5 à 150.
30. Composé selon la revendication 29, caractérisé en ce que n représente un nombre entier de 5 à 75, et notamment, 5 à 50.
31. Composé selon l'une des revendications 26 à 30, caractérisé en ce qu'il présente une masse moléculaire moyenne inférieure à 5 kDa.
32. Composé selon l'une des revendications 26 à 30, caractérisé en ce qu'il présente une masse moléculaire moyenne comprise entre 5 et 10 kDa.
33. Composé selon l'une des revendications 26 à 30, caractérisé en ce qu'il présente une masse moléculaire moyenne supérieure à 10 kDa et inférieure à 50 kDa.
34. Une préparation substantiellement pure de chitosan dépourvue de pigments et impuretés résiduelles.
35. Procédé pour préparer un composé de formule [X]n dans laquelle n représente un nombre entier de 5 à 300 et X a la formule (1) suivante :
Figure imgf000031_0001
caractérisé en ce qu'on soumet une préparation de chitosan de haute masse moléculaire à une hydrolyse acide, une précipitation à l'éthanol et une étape d'extraction des pigments en présence d'un solvant.
36. Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que ledit solvant est du butanol-2.
37. Procédé selon la revendication 35 ou 36, caractérisé en ce qu'il comprend après l'étape d'extraction des pigments, une étape de diafiltration différentielle.
38. Procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce que ladite étape de diafiltration différentielle comprend une première diafiltration à travers une membrane ayant un seuil de coupure de 5 kDa et une seconde diafiltration à travers une membrane ayant un seuil de coupure de 10 kDa réalisée sur le concentré de ladite première diafiltration.
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