WO1999055361A1

WO1999055361A1 - Inhibiteurs de neovascularisation

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Publication number: WO1999055361A1
Application number: PCT/JP1999/001834
Authority: WO
Inventors: Toshikazu Nakamura
Original assignee: Toshikazu Nakamura
Priority date: 1998-04-28
Filing date: 1999-04-06
Publication date: 1999-11-04
Also published as: CA2327382C; JP4094814B2; ATE408415T1; EP1074264A1; US20090023658A1; DE69939586D1; DK1074264T3; EP1074264A4; CA2327382A1; ES2313777T3; EP1074264B1

Description

明細書

血管新生抑制剤技術分野

本発明は、血管新生抑制剤に関する。より詳細には、 Hepa tocy te growt h fac t o r (以下、単に H G F とち称する。）の α鎖の特定領域を含む蛋白質を有効成分とする血管新生抑制剤に関する。

本発明の血管新生抑制剤は、その血管新生抑制作用に基づいて、血管異常増殖に起因する種々の疾患、例えばリウマチ性関節炎，糖尿病性網膜症，未熟児網膜症，老人黄班部変性，創傷治癒時の過剰瘢痕形成等の予防又は治療剤として有用である。背景技術

血管新生とは、何らかの刺激に応じて、主に細静脈の血管内皮細胞が反応して新しい血管網を形成する現象である。この現象は、生体の正常な状況下においては、組織の代謝を維持し、生体の機能的恒常性を保持するために不可欠であり、一般に損傷の治癒過程、胎児における肺の発育、黄体形成の進展形成等で観察される。

その一方、従来から異常な血管新生が炎症性疾患を含む種々の疾患に関係していることが知られている。例えば、増殖性糖尿病、尋常性乾癬、リウマチ性関節炎、糖尿病性網膜症、老人黄班部変性，創傷治癒時の過剰瘢痕形成等の疾患及び固形腫瘍の転移や再発は、血管、特に末梢毛細血管の異常増殖に起因することが報告されている ( Polverini PJ. , Crit Rev Oral Biol Med. , 1995, 6 (3), pp.230-247, Review ： Forkman J. , ature Med. , 19 95， 1(1), pp.27-31) 。

このため、これらの疾患に対する予防又は治療剤として、血管新生阻害作用を有する物質を有効成分とする種々の血管新生抑制剤が開発されている。

本発明は、新規な血管新生抑制因子を提供することを目的とするものである。さらに、本発明は上述するように血管の異常増殖に起因して生じる種々の疾患の予防及び治療に役立つ血管新生抑制剤を提供することを目的とするものである。図面の簡単な説明

図 1 において、 Aは H G Fのエラスターゼ処理物を逆相高速液体カラムクロマトグラフィー（逆相 H P L C ) ( C 4 ) にかけて得られたクロマトグラムであり、 B は逆相 H P L C の各ピーク画分を電気泳動（還元条件、非還元条件）に付した結果を示す図である。

図 2 は、 H G Fの α鎖及び；3鎖の構造、並びにエラスターゼ処理により切り出される本発明の H G Fの PyrGlu ³²〜Val 領域（ H G F Z N K 4 ) の構造を模式的に示す図である。

図 3 において、 A及び Bは、それぞれラット肝臓の原形質膜に対する ¹²⁵ I - H G F及び ¹²⁵ I - H G F / N K 4 の用量依存的な結合を示す図である。なお、図 A及び B 中の挿入図は、上記ラッ卜肝臓の原形質膜に対する ¹²⁵ 1 -H G F及び ¹²⁵ I — H G F Z N K 4 の結合をそれぞれスキャッチヤードプロットで示した図である。 Cは、 ¹²⁵ I - H G F存在下で、ラット肝臓原形質膜に対する非標識 H G F又は非標識 H G F / N K 4 の結合を調べた結果を示す図である（実施例 2参照）。

図 4 は、 H G F及び H G F _ N K 4 のマイトゲン活性の有無（ A ) 、並びに H G Fのマイトゲン活性に対する H G F Z N K 4のアンタゴニス卜作用を示す図である ( B ) 。マイトゲン活性はラット初代培養肝細胞の D N A合成を測定することによって調べた。具体的には、図 Aは、 H G F または H G Fノ N K 4の存在下での肝細胞の D N A合成を示し、図 Bは 6 0 p Mの H G F又は 1 . 5 n Mの表皮成長因子（ E G F ) の存在下における肝細胞の D N A合成に対する H G F Z N K 4 の影響を見た図である（実施例 3参照）。

図 5 は、 b F G F、 H G F若しくは V E G Fの存在下又は非存在下（None) における H G F / N K 4 によるヒト肺微小血管内皮細胞の増殖抑制作用を調べた結果を示す図である（実施例 7参照）。

図 6 は、 b F G F、 H G F若しくは V E G Fの存在下又は非存在下（None) における H G F Z N K 4 によるヒト皮膚微小血管内皮細胞の増殖抑制作用を調べた結果を示す図である（実施例 7参照）。

図 7 は、 H G F Z N K 4 (図中、 N K 4 として表示）及び抗 H G F抗体（図中、 a - H G F A b として表示）のヒト毛細血管内皮細胞の増殖に対する影響を 5 %ゥシ胎児血清（ F B S ) 、 5 % F B S + b F G F、 5 % F B S + V E G F または 5 % F B S + H G Fの存在下で調べた結果を示す図である（実施例 9 A参照）。

図 8 は、 H G F Z N K 4 (図中、 N K 4 として表示）及び抗 H G F抗体（図中、 a - H G F A b として表示）のヒト毛細血管内皮細胞の遊走に対する影響を 1 %ゥシ胎児血清（ F B S ) 、 l % F B S + b F G F、 1 % F B S + V E G F または 1 % F B S + H G Fの存在下で調べた結果を示す図である（実施例 9 B参照）。図 9 は、 H G F Z N K 4 による鶏胚漿尿膜の血管新生抑制作用を実体顕微鏡による観察により調べた結果を示す、図面にかわる写真である。

図 1 0 は、 H G F Z N K 4 による腫瘍血管新生抑制作用を免疫組織化学法によって調べた結果を示す、図面にかわる写真である。

図 1 1 は、 H G Fノ N K 4が Lewis肺癌細胞の成長を抑制する作用を有することを示す図面である。 Aは移植癌の体積を経時的に追跡した図であり、 Bは移植癌の 2 8 日目の重量を示す図である。

図 1 2 中、 Aは H G F / N K 4が Lewis肺癌細胞の転移を抑制する作用を有することを示す図面である（参考例 1 参照）。 B は肺に転移した癌組織を示す図面に代わる写真であり、生理食塩水を注入したコントロール群は明らかに複数の肺転移巣があるのに対して、 H G F / N K 4投与群は肺転移巣がほとんどないことを示す。

図 1 3 は、 H G F / N K 4が J y g乳癌細胞の成長 ( A ) 及び転移（ B ) を抑制する作用を有することを示す図面である。 Aは移植癌の体積を経時的に追跡した図であり、 Bは転移巣の数を示す図である。発明の開示本発明者らは、上記目的に基づいて新規な血管新生抑制因子を求めて日夜研究を重ねていたところ、 Hepatocy te growth factor ( H G F ) の α鎖の特定領域を含む蛋白質に血管の新生を有意に抑制する作用があることを見いだして本発明を開発するに至った。

H G F は、そもそも本発明者によって 1 9 8 4年に肝実質細胞の新規増殖因子として見いだされたポリベプチ卜である ( Nakamura T.， et al. , Biochem Biophys Res Co謹 n, , 1984, 122, pp. 1450- 1459 ) 。本発明者のその後の研究によって、 H G F は分子量約 6 9 k D a の α鎖と約 3 4 k D a の鎖からなるヘテロダイマーであり、しかもその構造は、 α鎖に N末端ヘアピンドメインと 4つのクリングルドメインを有し、また /3鎖にセリンプロテァーゼ様ドメインを有するユニークなドメイン構造であること力わ力、つた ( Nakamura T. , et al. , Nature 1989， 3 42, pp.440-443) 。 H G F の発見当初は肝再生因子の本体として肝細胞に特異性の高い増殖因子であると考えられていたが、リコンビナント H G Fが使用できるようになつた 1 9 8 9 年以降の研究により、等がいう H G F は肝細胞以外にも多くの上皮細胞に対して強力なマイトゲンとして働くこと力明らカヽになった ( Nakamura T. , Prince ss Takamatsu Symp. , 1994, 24, pp. 195 -213. Review) ₀ また、更なる研究によって H G F はかかる細胞増殖制御に加えて、細胞運動（cell motility) を促進するモートゲン ( motogen) としての機能 ( T. Nakamura, Prog, growth Factor Res. , 3, pp. 67-85, 1991 ) や、多くの癌細胞の増殖を抑制する tumor suppressor作用などの新しい生物活性を有すること力ゎカヽつた（ Higashio K, et al.， Bioche m Biophys Res Com匪. ， 1990, July 16, 170(1), pp.397 -404) 。

さらに 1 9 9 1 年には、 H G Fの高親和性で機能的なレセプターが、プロトオンコジーン産物（ c — m e t 産物： c — M e t ) であることが明らカヽとなり（Bottaro D P, et al. , Science, 1991, Feb.， 15， 251 (4995 ), pp.802 - 80 4： Naldini L, et al. , Oncogene. 1991 Apr, 6(4), pp.501- 504)。本発明者は、 α鎖内の N末端ヘアピンならびに第 1 、第 2 クリングノレドメインが該 c — M e t H G F レセプターに結合する最小ドメインであることを見いだした ( Ma t sumoto K, et al. , Biochem Biophys Res Commun .， 1991 Dec. , 16， 181(2), pp. 691- 699) 。

本発明者はかかる H G F に関する一連の研究成果をさらに追究すべく研究を行っていたところ、本発明に先だち鎖内の N末端ヘアピンならびに第 1 から第 4 の 4 つのクリングルドメインを有するポリペプチドが、上記 c - M e t / H G F レセプターを介する H G Fの作用に対してアンタゴニスト活性を有していることを新たに見いだし、かかるポリペプチドが H G Fの血管新生作用を有意に抑制する作用を有することを確認した。

本発明は、このような年余にわたる H G F の研究を基礎として上記新規な知見に基づいてなされたものであるすなわち、本発明は下記 1 〜 5 に掲げる血管新生抑制剤である。

1 . 以下の（ a ) 又は（ b ) に記載されるポリペプチドを有効成分として含有する血管新生抑制剤。

( a ) Hepatocyte growth factorの PyrGlu ³²〜 Val ⁴⁷⁸ からなるアミノ酸配列を有するポリべプチド、 ( b ) ( a ) のアミノ酸配列において、 1 若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつ c — M e t / H G F レセプタ一を介する H G F の作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリべプチド。

2. 上記ポリペプチドが、少なくとも一つのヘアビンドメイン及び 4つのクリングルドメインを有するものである 1 記載の血管新生抑制剤。

3 . 上記ポリべプチド、力 Hepatocyte growth factorをェラスタ一ゼで消化して得られるものである 1 又は 2 記載の血管新生抑制剤。

4 . 配列番号 1 記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する血管新生抑制剤。

5 . 配列番号 2 記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する血管新生抑制剤。

また本発明は、下記 6 〜 1 0 に掲げる、医学的若しくは薬理学的に有用な医薬品である。

6 . 上記 1 記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する、血管異常増殖に起因する疾患の予防又は治療剤。

7 . 血管異常増殖に起因する疾患が、リウマチ性関節炎、乾癬、オスラー -ウエノく一 ( Os i e r - Webbe r ) 症候群、心筋の脈管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節症、眼の脈管形成性疾患、血管線維腫、良性腫瘍及び創傷肉芽形成よりなる群から選択されるいずれかである上記 6 記載の予防又は治療剤。

8 . 1 記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する、内皮細胞の過度な刺激によって生じる疾患の予防又は治療剤。

9 . 内皮細胞の過度な刺激によって生じる疾患が、腸管癒着、クローン病、ァテローム硬化症、強皮症及び過剰瘢痕形成よりなる群から選択されるいずれかである

8 記載の予防又は治療剤。

0 . 請求項 1 記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する受胎調節剤。

更にまた本発明は、下記 1 1 〜 1 3 に掲げる、医学的しくは薬理学的に有用な処置方法である。

1 . 下記（ a )又は（ b )に記載されるポリペプチド：

( a ) Hepatocyte growth factor ( H G F ) の PyrGlu 3²〜 Val ⁴⁷⁸からなるアミノ酸配列を有するポリべプチド、

( b ) ( a ) のアミノ酸配列において、 1 若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつ c — M e t Z H G F レセプターを介する H G Fの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリべプチド

及び薬学的に許容される担体を含む血管新生抑制剤を被験者に投与することからなる、血管新生抑制方法。 2 . 下記（ a )又は（ b )に記載されるポリペプチド：

( b ) ( a ) のアミノ酸配列において、 1 若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつ c — M e t / H G F レセプターを介する H G Fの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリべプチド

及び薬学的に許容される担体を含む血管新生抑制剤を血管異常増殖に起因する疾患の予防または治療をうける被験者に投与することからなる、該疾患の予防または治療方法。

3 . 上記疾患が、リウマチ性関節炎、乾癬、オスラー -ウェバー（Osier- Webber) 症候群、心筋の脈管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節症、眼の脈管形成性疾患、血管線維腫、良性腫瘍、創傷肉芽形成、腸管癒着、クローン病、ァテローム硬化症、強皮症及び過剰瘢痕形成よりなる群から選択されるいずれかである上記 12 記載の予防又は治療方法。

また、本発明は血管新生抑制剤の製造のための、下記 a )又は（ b )に記載されるポリぺプチドの使用に関する

( b ) ( a ) のアミノ酸配列において、 1 若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつ c 一 M e t / H G F レセプタ一を介する H G Fの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリべプチド。なお、本明細書において、アミノ酸、ペプチド、塩基配列その他に関する略号による表示は、基本的には I U P A C及び I U P A C — I U B による命名法又はその規定、及び「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（平成 9年 3月、特許庁調整課審査基準室）に従うものとする。

また、本発明において、アミノ酸番号やアミノ酸の位置は、プレブ口 H G Fのアミノ酸配列を基準として表記する ( Nakamura T. , et al. , Nature 1989, 342, pp.440-44 3) 。本発明で、 PyrGluとは、修飾アミノ酸であるピログノレ夕メート（ pyroglutamate) を意味し、 PyrGlu³²とはプレブ口 H G Fのァミノ酸配列を基準として N末端から 3 2 番目のアミノ酸残基が、ピログルタメートになっていることを示す。本発明の血管新生抑制剤は、 H G F の α鎖に起因するものであって血管新生抑制作用を有するポリべプチドを有効成分として含有するものである。

ここで「 H G Fの鎖に起因する」とは、 H G Fのな鎖の全領域又はその断片を連続的もしくは非連続的に有するという意味で用いられる。

血管新生抑制作用とは、血管の新生作用を抑制する作用であればその機序の別を問うものではないが、好適には H G Fが有する血管新生作用を抑制する作用を意味する o

かかる作用を有するポリペプチドとしては、 H G Fのレセプターである c — M e t Z H G F レセプターに親和性を有し、該レセプターへの H G Fの結合を競合的に阻害する作用を有するものを挙げることができる。好適には、 c 一 M e t / H G F レセプターに結合して、 c — M e t Z H G F レセプタ一を介する H G Fの作用に対してアン夕ゴニスト活性を有するポリペプチドである。

c — M e t Z H G F レセプターを介する H G Fの作用としては、 c 一 M e t / H G F レセプターのチロシンリン酸ィ匕作用ヽモ一卜ゲン活性 ( raotogenic activity) ヽマイトゲン活性 ( raitogenic activity) 及びモノレフォゲン活性（ morphogenic activity) を挙げることができる (実験医学， Vol.11， No.9 ( 1993 )参照）。

従って、本発明で用いられるポリペプチドとしては、これらの作用のいずれかを抑制 · 阻害するもの、具体的には H G F誘導による c — M e t / H G F レセプターのチロシンリン酸化を抑制，阻害する作用、 H G Fが有するモートゲン活性を抑制 · 阻害する作用、 H G Fが有するマイトゲン活性を抑制 · 阻害する作用、または H G F が有するモルフォゲン活性を抑制 · 阻害する作用のいずれか少なくとも 1 種を有するものが挙げられる。好ましくは、上記すベての作用を有するポリペプチドを挙げることができる。

このようなポリペプチドとしては、好適には H G Fの ?7 111^{3 2}〜 3 ⁷⁸からなるアミノ酸配列を有するポリべプチド、具体的には配列番号 1 で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを挙げることができる。尚、配列番号 1 中、「Xaa」とは「PyrGlu」を意味する。

当該ポリペプチドは、基本的には H G Fをエラスターゼ処理することによって得られ、 H G Fの α鎖の N末端領域の 4 4 7 アミノ酸から構成される。このため、当該ポリペプチドは、 H G Fの α鎖と同様に Ν末端アミノ酸として修飾アミノ酸残基：ピログルタメートを有し、一つの Ν末端ヘアピンドメインと 4つのクリングルドメインを有している。なお、本発明において当該ポリべプチドを H G F Z N K 4 とも称する。後述する実施例で示すように、当該ポリペプチドは、 c — M e t / H G F レセプターに H G F と競合的に結合するアンタゴニスト活性をもち、 H G Fが誘導する c 一 M e t Z H G F レセプターの自動チロシンリン酸化を抑制 · 阻害する作用を有している。また当該ポリペプチドは、それ自身はマイトゲン活性、モートゲン活性及びモルフォゲン活性を殆ど有しておらず、 H G Fが有するマィトゲン活性、モ一トゲン活性及びモルフォゲン活性を阻害する性質を有している。

しかしながら、前述するように本発明の血管新生抑制剤の有効成分として用いられるポリペプチドは、 H G F の α鎖に起因するものであって、 H G Fが有する血管新生作用を抑制する作用を有するものであれば、上記配列番号 1 で示される特定のポリペプチドに限定されることはない。

かかるポリペプチドとしては、具体的には.、 H G Fの PyrGlu³² ~ Va 1⁴⁷⁸からなるアミノ酸配列において、その一部若しくは数個乃至は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリべプチドであって、かつ c 一 M e t Z H G F レセプターを介する H G Fの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリべプチドを挙げることができる。より好適には前述する H G F Z N K 4 と同じか若しくは同程度の生理活性（チロシンリン酸化抑制作用、モートゲン活性抑制作用、マイトゲン活性抑制作用、モルフォゲン活性抑制作用）を有するポリペプチドを挙げることができる。

ここでアミノ酸の「欠失、置換若しくは付加」の程度およびそれらの位置等は、改変されたポリペプチドが上記生理活性を有するものであれば特に制限されない。例えば、上記 H G F Z N K 4 の N末端及び Z又は C末端において 1 若しくは複数（又は数個）のアミノ酸が欠失又は付加したポリペプチド、 H G F N K 4 の中央領域において 1 若しくは複数（又は数個）のアミノ酸が欠失又は付加したポリべプチドを挙げることができるが、 H G F / N K 4の特徴的な構造である少なくとも一つのヘアピンドメイン及び 4つのクリングルドメインが実質上保持されるような改変であることが望ましい。

ゆえに改変ペプチドとして、好適にはヘアビンドメイン及び 4つのクリングルドメイン以外の領域において 1 若しくは複数（又は数個）のアミノ酸が置換、欠失又は付加したポリペプチドを例示することができる。かかるポリペプチドとして、具体的には、 H G F Z N K 4 のポリペプチドのうちアミノ酸番号 1 6 2 ~ 1 6 6 (配列番号 1 において、アミノ酸番号 1 3 1 〜 1 3 5 ) の 5つのアミノ酸が欠失したポリペプチド（ H G F Z N K 4 (del 5)) 、具体的には配列番号 2 に示すアミノ酸配列を有するポリべプチドを挙げることができる。

本発明で用いられる H G F Z N K 4又は H G F / N K 4 (del5)は、それぞれ配列番号 1 又は 2 に示すァミノ酸配列又は既に公知の H G Fの遺伝子配列等に基づいて、慣用のぺプチド合成に準じて化学的に製造するか又は遺伝子工学的に製造することができる。

好適には H G Fを酵素的に分解することによって得ることができる。

H G Fの酵素分解は、例えばエラスターゼ等の酵素を用いて H G Fを消化することにより行うことができる。次いで、高速液体クロマトグラフィーや S D S — P A G E等の慣用の蛋白精製法を用いて酵素消化物を精製し、所定の分子量を有するポリべプチドを単離することにより、 H G F Z N K 4 を取得することができる。ここで分子量としては、 S D S — P A G Eの還元条件下で約 6 5 〜 6 9 k D、好ましくは約 6 7 k Dを挙げることができまた S D S — P A G Eの非還元条件下で約 4 8 〜 5 2 k D、好ましくは約 5 0 k Dの分子量を挙げることができる o なお、酵素分解に用いられる H G F は、その取得の由来及び調製法等によつて特に制限されるものではない。

例えば、ヒトを含む哺乳動物の肝臓などの組織、血小板や白血球などの血液細胞又は血漿や血清などから抽出、精製することによって得ることができるし（FEBS， 224, 3 12, ( 1987) ； Proc. Acad. Sci. USA, 86, 5844, ( 1989 ) ) ヽまた H G F を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物から分離、精製することによって得ることができる。また、遺伝子工学的手法により H G F をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞 (例えば、動物細胞）に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換え H G Fを得ることもできる（例えば、 Nature, 342, 440, 1989 ；特開平 5 — 1 1 1 3 8 3 号公報；特開平 3 — 2 5 5 0 9 6 号公報； Biochem. Biophys. Res. Com瞧リ 163， 967， 1989等）。 H G Fをコードする遺伝子としては、通常ヒトを含む哺乳動物に由来する H G F遺伝子、好ましくはヒ卜に由来する H G F遺伝子、より好ましくはヒトに由来する組換え H G F遺伝子（特開平 5 — 1 1 1 3 8 3 号公報）を用いることができる。

また H G F / N K 4 (del5)のように、 H G F / N K 4 のアミノ酸配列に基づいて改変されてなるいわゆる改変体は、ぺプチド合成法により化学的に調製してもよく、また H G Fの遺伝子に基づいて遺伝子工学的改変法で調製することもできる。

遺伝子工学的改変法としては、例えばサイトスぺシフイツク ' ミュータゲネシス L Methods in Enzymology, 1 54: 350, pp.367-382 ( 1987 ) ；同 100: 468 ( 1983 ) ； Nu cleic Acids Res.， 12: 9441 ( 1984) ；続生化学実験講座 1 「遺伝子研究法 II」、日本生化学会編， pl 05 ( 1986)〕等の遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法等の化学合成手段〔 J. Am. Chem. Soc.， 8 9： 4801 ( 1967) ；同 91: 3350 ( 1969 ) ； Science, 150： 1 78 ( 1968) ； Tetrahedron Lett. , 22: 1859 ( 1981 ) ；同 2 4: 245 ( 1983)〕及びそれらの組合せ方法等が例示できる本発明の血管新生抑制剤は、その投与剤形を特に制限するものではなく、例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤又はシロップ剤等の経口剤；軟膏、クリーム、貼付剤、坐剤等の外用剤；点眼剤、眼軟膏等の眼用剤；注射剤、点滴などの種々の製剤形態をとり得る。これらの投与剤は、この分野で通常知られた慣用的な製剤方法により製剤化される。

錠剤の形態に成形するに際しては、担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ゲイ酸等の賦形剤、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カノレポキシメチノレセノレロース、セラック . メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム . カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第 4 級アンモニゥム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ゲイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。更に錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、フイノレムコーティング錠、二重錠多層錠等とすることができる。

丸剤の形態に成形するに際しては、担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、力ォリン、タルクなどの賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン等の結合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤等を使用できる。

カプセル剤は常法に従い、上記べプチドを上記で例示した各種の担体と混合して硬化ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。

坐剤の形態に成形するに際しては、担体として例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等が使用できる。

注射剤は常法に従って調製することができ、例えば上記ポリペプチドを適切な溶媒に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することによって調製することができる。なお、注射液は血液と等張であるのが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤として例えば滅菌水、ェチルアルコーノレ、マクロゴール、プロピレングリコーノレ、エトキシ化イソステアリノレアノレコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソノレビタン脂肪酸ェステル類等を使用できる。なお、この場合等張性の溶液を調製するに十分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。

軟膏剤を調製する場合は、上記べプチドに通常使用される基剤、安定化剤、潤滑剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては流動ノ、⁰ラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、パラフィン等が挙げられる。保存剤としてはパラォキシ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸ェチル、パラォキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。

貼付剤を製造する場合には、通常の支持体に前記軟膏ペースト、クリーム、ゲル等を常法により塗布すればよい。支持体としては綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフイノレムあるいは発泡体シートが適当である。

更に上記各製剤には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等の薬学的に許容される添加剤や他の医薬品を含有させてもよい。

製剤化に際しては、安定化剤を配合することが好ましい。安定化剤としては例えば、アルブミン、グロブリンゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール等を挙げることができる。

また、注射剤等の液剤とする場合は、凍結保存するかまたは予め凍結乾燥品として調製することが好ましい。凍結乾燥品は、用時に注射用蒸留水等により再溶解して使用される。 P T/JP9 /0183

23 本発明の製剤中に含有されるべきポリべプチドの量としては、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常製剤中 0 . 0 0 0 2 〜 0 . 2 ( w/ v % ) 程度、好ましくは 0 . 0 0 1 〜 0 . 1 ( wZ v % ) 程度とするのがよい。

上記医薬製剤の投与方法は特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾患の程度等に応じて適宜決定される。例えば、注射剤は単独であるいはブドウ糖、ァミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。

本発明の血管新生抑制剤の 1 日当りの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概に決定できないが、本発明のポリペプチド（ H G F N K 4 またはその改変体）として通常成人 1 日当り約 0 . 0 1 〜 l O O m g とすればよく、これを 1 回又は数回に分けて投与するのが好ましい。

本発明の血管新生抑制剤は、血管異常増殖に起因する疾患の予防又は治療に広く適用することができる。かかる疾患としては、特に制限はないが、具体的には、例えばリウマチ性関節炎、乾癬、オスラー -ウェバー（Osier -Webber) 症候群、心筋の脈管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節症、眼の脈管形成性疾患（例えば、糖尿病性網膜症，未熟児網膜症，老人黄班部変性，角膜移植拒絶，血管新生緑内障，水晶体後線維増殖症又はルぺォ一シス等）、血管線維腫、良性腫瘍（例えば、血管種，聴神経腫，神経線維種，トラコーマ，化膿性肉芽腫等）、白血病を含む造血器腫瘍、固形腫瘍、腫瘍転移、創傷肉芽形成等を挙げることができる。

本発明の血管新生抑制剤は、また内皮細胞の過度若しくは異常な刺激によって生じる疾患の予防又は治療に広く適用することができる。かかる疾患としては、特に制限はないが、具体的には、例えば腸管癒着、クローン病、ァテローム硬化症、強皮症、例えばケロイド等の過剰瘢痕形成等を挙げることができる。

本発明の血管新生抑制剤は、さらに胚着床に必要な血管新生を妨げることに基づく受胎調節剤として有用であり、また病的な結果としてネコのひっかき疾患（ca t s c ra tch d i sea s e ) や潰瘍といった脈管形成を伴う疾患の予防剤又は治療剤として有用である。発明を実施するための最良の形態以下、本発明の説明のために実施例を記載するが、当該実施例はなんら本発明の技術的範囲を制限するものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。実施例 1 H G F Z N K 4の単離精製

ヒト H G F c D N Aで形質転換した C H O細胞を培養して、該培養物からヒト遺伝子組換え H G Fを精製単離した ( Nature 342, pp.440-443 ( 1989 ) ； Biochem. Biophy s. Res. Commun.172, pp.321 -327 ( 1990 )) 。次いで該組換え H G F ( 9 0 0 m g ) を 0. 2 M トリスノ塩酸緩衝液 ( p H 8. 8 ) 中で 3 7 °C、 2 0分間、脾臓エラスターゼ（Sigma社製）（酵素：基質 = 1 ： 1 0 0 ) で消化し、該消化物を逆相高速液体クロマトグラフィー（ H P L C ： β Bondapack C4カラム使用、日本ウォーターズ社製）に付して、 0 . 0 5 % トリフルォロ酢酸を含有するァセトニトリルのグラジェントによって溶出し、精製した。図 1 Aに示すように、 H P L Cにより 3つのピークが得られた。

次いで、これらの各ピーク画分を S A S — P A G Eにかけて、タンパク染色を行った（図 1 B ) 。それにより、第一のピークが非還元条件下で 5 0 k D、還元条件下で 6 7 k Dの分子量を有するポリべプチドのフラグメントであり、第二のピークが 6 9 k Dの α鎖及び 3 4 / 3 2 k Dの /S鎖からなる未消化のヘテロダイマー H G Fに相当し、第三のピークが非還元条件下で 3 3 / 3 1 k D , 及び還元条件下で 3 4 / 3 2 k D分子量を有するフラグメントであることがわかった。

なお上記において、 — /— k D とは、アミノ酸配列は同一であるが、付加している糖鎖の違いに基づいて、分子量の異なる蛋白質が存在することを示す。

このことは、 H G Fをエラスターゼ処理することによつて、 α鎖の大部分を有するが α鎖全体よりもわずかに小さいフラグメント（第一ピーク）と、鎖の C末端側の一部と完全な /3鎖とからなるフラグメント（第三ピーク）との 2つに消化されることが分かった。

精製フラグメントについてァミノ酸配列を分析するために、まず各溶出画分から溶媒を蒸発して、残渣を 0. 0 5 % C H A P S ( Sigma社製）及び 1 M N a C l を含む 0. 1 M リン酸緩衝液（ p H 7. 3 ) に溶解した。アミノ酸分析は、自動プロテインシークェンサ一モデル 492 ( Applied Biosystem Inc.社製：）を用いて行った ₀ まず第一ピークのフラグメン卜の N末端ァミノ酸分析を行ったが、うまくいなかったため、 H G Fの N末端と同様に該フラグメントの N末端はピログルタメ一トになつている可能性が示唆された。そこで、該フラグメントをピログルタメ一トアミノぺプチダ一ゼで処理して N末端アミノ酸分析を行ったところ、その配列は一文字表記で R K R R N T I H E Fであり、鎖の 2 〜 1 1 番目の N末端アミノ酸配列と一致した。このことから、該フラグメントの N末端アミノ酸はピログルタメ一卜に修飾されたグルタミンであり、 N末端領域の構造は未消化の H G F と同じであることが判明した。

次に、当該フラグメントの C末端を分析するために、エラスターゼ消化によって生じた他のフラグメント（第三ピーク）について、それが有する部分 α鎖の N末端をアミノ酸分析した。その結果、該部分 α鎖の Ν末端領域のアミノ酸配列は H G Fの A s n ⁴⁷⁹— A l a ⁴⁸⁸に相当することがわかった。これから、第一ピークフラグメントの C末端は V a 1 ⁴⁷⁸であることが判明した。

以上の結果から、 H G Fをエラスタ一ゼ処理することによって、 2つのフラグメントに消化され、その一つは H G Fのヘアビンドメインと 4つのクリングルドメインを有する PyrGlu³²〜 V a 1 ⁴⁷⁸の領域からなるフラグメント（ H G F Z N K 4 ) であり、他の一つは α鎖の一部 ( A s n ⁴⁷⁹から始まる 1 6 アミノ酸）と鎖とからなるフラグメントであることが明ら力、になった（図 2 ) 。実施例 2 — H G F Z N K 4 の細胞表面レセプターとの結合性

実施例 1 で調製した H G F / N K 4 について、細胞表面レセプターとの結合性を調べた。また比較実験として、 H G Fを用いて同様に細胞表面レセプターとの結合性を調べた。なお、 H G F / N K 4及び H G F はクロラミン一 T法によって放射性標識し（ ¹²⁵ I - H G F / N K 4 . ¹²⁵ I 一 H G F ) 、また細胞表面レセプター標品としてラット肝臓から調製した原形質膜を用いた。

スキャッチヤード分析により、 H G F及び H G F Z N K 4 はいずれも 8 0 p Mまで、濃度依存的に細胞表面レセプターと結合することがわかり（図 3 A及び B ) 、 H G F レセプターの K d及び数はそれぞれ 6 4 . 5 p M及び 5 4 7 8部位 Z n gであり、また H G F Z N K 4 レセプタ一の K d及び数はそれぞれ 4 8 6 p M及び 6 4 2 7 部位 gであった。

次いで H G F Z N K 4 が H G Fに対する競合的なアンタゴニス卜であるか否かを調べるために、肝臓の原形質膜（ 5 0 /z g ) を ¹²⁵ 1 — H G F単独（ 6 0 p M) 、または ¹²⁵ 1 — H G F に種々の濃度の非標識 H G F若しくは非標識 H G F / N K 4 を加えて、それらの存在下でインキュべ一シヨンを行った。 ¹²⁵ I — H G Fの膜結合は、非標識 H G Fの添加によって完全に阻害され、非標識 H G F による 5 0 %阻害濃度は 6 0 才であった。非標識 H G F / N K 4 もまた同様に ¹²⁵1 — H G Fの膜結合を阻害し H G F Z N K 4 による 5 0 %阻害濃度は 6 0 0 p Mであり、 6 0 n Mで完全に ¹²⁵ I — H G Fの膜結合を阻害した (図 3 C ) 。

このことから、 H G F Z N K 4 は、 c - M e t / H G F レセプターに対して、 H G F より 8 〜 1 0倍低いものの親和性を有しており、 H G Fのアンタゴニストであることが示唆された。実施例 3 - H G F Z N K 4のマイトゲン活性及び H G F のマイトゲン活性に対する阻害作用

ラット初代培養肝細胞の D N A合成を測定することにより、 H G F / N K 4のマイトゲン活性を調べた。また、比較対象実験として、同様に H G Fのマイトゲン活性を測定した ( Nature 342, 440-443 ( 1989) ； Biochem. Bioph ys. Res. Commun.181, 691 - 699 ( 1991 )) ₀

結果を図 4 Aに示す。該図から分かるように、 H G F は用量依存的に肝細胞の D N A合成を促進するのに対して、 H G F / N K 4 には Ι Ο Ο η Μという高濃度でも D N A合成を促進する効果はみられなかった。

一方、 H G Fを含有する培養液中に H G F Z N K 4 を入れ、 H G F と H G F Z N K 4 を共存させた場合、 H G F / N K 4 は用量依存的に H G F によって促進される D N A合成を抑制し、 6 0 n Mでほぼ完全に阻害した（図 4 B ) 。それに対して、 H G F / N K 4 は表皮成長因子 ( E G F ) によって促進される D N A合成に対しては阻害作用を示さなかった（図 4 B ) 。

これらのことから、 H G F / N K 4 は、それ自身マイトゲン活性を有しないが、 H G Fのマイトゲン活性を特異的に阻害する作用を有していることがわかる。実施例 4 — H G F Z N K 4のモートゲン活性及び H G F のモートゲン活性に対する阻害作用

腎尿細管由来の正常上皮細胞である M D C K細胞を用いて H G F Z ^T K A のモ一トゲン活性を調べた。

M D C K細胞は、 H G Fを含まないコントロール培地中では隙間なくコロニーを形成したが、 H G F ( 2 2 p M ) を培地に添加すると M D C K細胞の運動性を亢進し該細胞を分散させた。それに対して H G F Z N K 4 は細胞を全く分散させず、細胞と細胞の接触性はよく維持されていた。また、 M D C K細胞を H G F及び H G F / N K 4の共存下で培養したところ、 H G F Z N K 4 は H G Fによって誘導される細胞分散を阻害した。

これらのことから、 H G F / N K 4 は、それ自身モートゲン活性を有しないが、 H G Fのモートゲン活性を阻害する作用を有していることがわかる。実施例 5 一 H G F Z N K 4 のモルフォゲン活性及び H G Fのモルフォゲン活性に対する阻害作用

H G F / N K 4が、 H G Fの有するモルフォゲン活性を阻害するか否かを調べるために、腎尿細管由来の正常上皮細胞である M D C K細胞を H G F及び Z又は H G F / N K 4 の存在下、コラーゲンゲル中で生育させた。

M D C K細胞は、 H G Fを含まないコントロール培地中では球状の細胞塊を形成したが、 H G F ( 5 5 p M ) を培地に添加すると枝分かれした管腔構造が誘導されたそれに対して H G F / N K 4 ( 5 5 n M ) を添加しても管腔構造は誘導されなかった。また、 M D C K細胞を H G F及び H G F Z N K 4 の共存下で培養すると、細胞は細胞塊の状態を維持し、管腔構造は誘導されなかった。

これらのことから、 H G F / N K 4 は、それ自身モルフォゲン活性を有しないが、 H G Fのモルフォゲン活性を阻害する作用を有していることがわかる。実施例 6 - H G F Z N K 4 の、 H G Fが誘導する _c — M e t チロシンリン酸化の阻害作用

肺癌細胞 A 5 4 9 は、 c 一 M e t Z H G F レセプターを発現しており、 H G F刺激によって c 一 M e t のチロシンリン酸化が亢進することが知られている。そこで、 H G F Z N K 4 が該 H G Fの c — M e t に対するチロシンリン酸化作用を阻害するかどうかを調べた。

具体的には、 A 5 4 9 細胞を H G F及びノ又は H G F Z N K 4 で刺激して、細胞を可溶化させて、抗 c 一 M e t 抗体で免疫沈降させ、ウェスタンブロッテイングを行つて、抗ホスホチロシン抗体で c 一 M e t のチロシンリン酸化を観察した。

その結果、 H G F ( 1 1 0 p M ) による刺激によって c 一 M e t のチロシンリン酸化が誘導されたのに対して H G F / N K 4 ( 1 1 0 n M ) による刺激では殆どリン酸化されなかった。また、 H G F Z N K 4 は、 H G F誘導による c — M e t のチロシンリン酸化を用量依存的に阻害した。

これらのことから、 H G F Z N K 4 は、 H G Fが誘導する c — M e t ノ H G F レセプターのチロシンリン酸化を抑制することが分かる。また、この阻害作用に基づいて H G F Z N K 4 は H G Fの生物学上の活性に対してァンタゴニストとして作用すると考えられた。

実施例 7 — H G F Z N K 4 の血管内皮細胞の増殖抑制作里

血管内皮細胞として、ヒト肺微小血管内皮細胞（ H M V E C - L ： Clone tics社）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞 ( H M V E C - D ： Clonetics社 ) を用いて、 H G F / N K 4 の内皮細胞に対する増殖抑制作用をみた。

具体的には、 Passage- 5 〜 8 の対数増殖期のヒト肺微小血管内皮細胞またはヒト皮膚微小血管内皮細胞の細胞浮遊液を作成し、ゼラチンコートした 2 4 ゥエルのプレ一トディッシュに 1 ゥエルあたり 8 0 0 0 個の細胞を播きこんだ。 2 4 時間後、新しい培養液（ E G M (Eagle G enera 1 Medium)と D M E M (Dulbecco s Modified Eagle Medium)とを 1 ： 1 で混合し、それに 5 % となるように血清を混合したもの）に交換し、 3 ng/ml b F G F (bas ic Fibroblast Growth Factor)^ lOng/ml H G Fヽ lOng /ml V E G F (Vascular Endothelial Growth Factor)および何も添加しないもの（ 5 %血清含有溶液、図中 None で示す）の 4 つの群を設定し、それに 0 〜 4 5 0 n M範囲の各濃度の 110 ? / 1^ 1： 4 を添加して 3 7 °(：、 5 % C 02で培養した。 7 2時間後、トリプシンで細胞を剥がし Coulter counterで細胞数を計測した。

ヒト肺微小血管内皮細胞についての結果を図 5 に、ヒト皮膚微小血管内皮細胞についての結果を図 6 に示す。図から分かるように、 H G F Z N K 4 は 3 ng/ml b F G F、 10ng/ml H G F、 lOng/ml V E G F及び 5 %血清の刺激により促進された血管内皮細胞の増殖を、濃度依存的に顕著に抑制した。このことから、 H G F Z N K 4 は、 H G F刺激で促進される血管内皮細胞の増殖のみならず、 b F G Fや V E G Fなどの他の血管内皮増殖促進因子による増殖に対しても、抑制的に作用することが示唆された。実施例 9 - ヒト毛細血管内皮細胞に対する抗 H G F抗体及び H G F / N K 4の作用

A . 増殖に対する影響

抗 H G F抗体及び H G F Z N K 4 のヒト毛細血管内皮細胞の増殖に対する影響を調べた。

[方法]

培養したヒト皮膚毛細血管内皮細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ P B S ) にて洗浄後、トリプシン一 E D T A ( 0.05%トリプシン及び 0.02!¾E D T Aを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ P B S ) ) を用いて剥がした。得られた内皮細胞を 5 % ゥシ胎児血清（ F B S ) を含む E B M— 2 培地（ Clone tics社製）にて懸濁後、ゼラチンコートした 2 4 ゥエルプレートに 5 x 1 0 ³細胞ノ c m ²となるように播き、 2 4 時間培養した。

培養物を、 5 % F B S含有 E B M - 2 培地をベースとする下記 1 0 種類の培地に応じて 1 0群に分けて、培地をそれぞれ下記培地で交換した。なお、下記 - HGF Abは抗 H G F ゥサギポリクローナル抗体を示す。

1 . 5¾ FBS

2 . 5% FBS+ 3ng/ml bFGF

3 . 5% FBS+ 3ng/inl bFGF+ 300nM HGF/NK4

4 . 5¾ FBS+ 3ng/ml bFGF+ 10 ^ g/ml a -HGF Ab 5 . 5¾ FBS+ lOng/ml VEGF

6 . 5% FBS+ lOng/ml VEGF+ 300nM HGF/NK4

7 . 5¾ FBS+ 10ng/ml VEGF+ n g/ml -HGF Ab

8 . 5¾ FBS+ 3ng/ml HGF

9 . 5% FBS+ 3ng/ml HGF + 300nM HGF/NK4

10. 5¾ FBS+ 3ng/ml HGF + 10 ^ g/ml a -HGF Ab これらの培地を 3 7 °C、 5 % (： 0 ²の条件下で 7 2 時間培養し、次いでトリプシンで細胞を剥がし、 Coulter co unterで細胞数を計測した。

[結果 ]

結果を図 7 に示す。図から分かるように、 300nM H G F / N K 4 は、 3ng/ml b F G F、 10ng/ml V E G F、 3 ng/ml H G Fの刺激で促進された血管内皮細胞の増殖を顕著に抑制した。一方、 10 g/mlの抗 H G F ゥサギポリクローナル抗体は、 H G F刺激による血管内皮細胞の増殖を特異的に抑制したが、 b F G Fや V E G F刺激による血管内皮細胞の増殖は抑制しなかった。このことから、 H G F Z N K 4が H G Fアンタゴニスト作用に加えて、更に別の異なる新規な作用によって血管内皮細胞の増殖を抑制することが示唆された。 B . 細胞遊走に対する影響

抗 H G F抗体及び H G F / N K 4 のヒト毛細血管内皮細胞の遊走に対する影響を調べた。

[方法]

細胞遊走に対する影響は改良したボイデンチャンバー法 ( Yoshida A, et al,； Growth Factors.1996 ; 13 ( 1 - 2 ) : 5 7-64) を用いて調べた。具体的には、 1 3. 4 t/ _g / m l のフイブロネクチンでコーティングしたポアサイズ 5 μ mのポリカーボネートフイノレターを用いてボイデンチャンバ一法を行った。

まずヒト皮膚毛細血管内皮細胞を、血清を含まない E B M— 2 培地にて 1 2 時間培養した後、 1 %ゥシ胎児血清を含む E B M — 2 で懸濁し、上記フィルターに 1 2 x 1 0 ⁴細胞 cm²となるように播いた。

該培養物を 1 0 群に分け、各培養物のフィルタ一カツプ外液に下記のように b F G F、 H G F、 V E G F または H G F Z N K 4 、抗 H G F ゥサギポリクローナル抗体 ( a -HGF Ab) が含まれるように、各溶液を添加した。

1 . 無添加（ 1% FBS含有 ΕΒΙί- 2培地）

3 . 3ng/ml bFGF+ 300nM HGF/NK4

4 . 3ng/ml bFGF+ 10 g/ml a -HGF Ab

5 . lOng/ral VEGF

6 . lOng/ml VEGF+ 300nM HGF/NK4

7 . lOng/ml VEGF + 10 g/ml a -HGF Ab

8 . 3ng/ml HGF

9 . 3ng/ml HGF + 300nM HGF/NK4

10. 3ng/ml HGF + 10^ g/ml a -HGF Ab

これらを 5 時間培養し、顕微鏡下（ X 2 0 0 ) で各フィルターの下面に遊走した細胞数（ 1 視野内）を計測した。なお精度向上を図るため、細胞数の計測は、 5 視野をランダムに選択して各視野において行った。

[結果 ]

結果を図 8 に示す。図から分かるように、 300nli H G F / Ν Κ 4 は、 3ng/ml b F G F、 10ng/ml V E G F、 3 ng/ml H G Fの刺激で促進された血管内皮細胞の遊走を顕著に抑制した。一方、 10^ g/ralの抗 H G F ゥサギポリクローナル抗体は、 H G F刺激による血管内皮細胞の遊走を特異的に抑制したが、 b F G Fや V E G F刺激による血管内皮細胞の遊走は抑制しなかった。このことから . H G F Z N K 4が H G Fアンタゴニスト作用に加えて、更に別の異なる新規な作用によって血管内皮細胞の遊走を抑制することが示唆された。実施例 1 0 - H G F / N K 4 の鶏胚漿尿膜（ C A M ) の血管新生抑制作用

鶏受精卵を 4 日間培養し、気室上部と鶏卵側部の 2 力所の卵殻に穴をあけ、側部の穴から 3 m 1 卵白を吸引しテープでシールした。気室上部の卵殻と卵殻膜を除去した、胚漿尿膜（ C A M ) 上にシリコンリングの中心をあわせるように置き、シリコンリング内に H G F / N K 4 または牛血清アルブミン（コントロール）を含むメチルセルロースディスクを置いた。 3 7。Cで 2 日間培養した後、 C A M上の血管網を実体顕微鏡下で観察した。結果を表 1 に示す。

新生血管の進入度

HG F/NK4 +

：3ン卜ロール + + + なおディスク中への新生血管の進入度は次の基準に基づいて評価した

一：新生血管の進入が認められない

+ ·· 1 〜 2程度の新生血管の進入が認められる + + ： 3〜 4程度の新生血管の進入が認められる + + + ： 5以上のの新生血管の進入が認められるまた、実体顕微鏡で観察した結果を図面に代わる写真 (図 9 ) として提出する。

これらからわかるように、コント口一ノレのディスクでは、新生血管の進入を著しく認めたのに対して、 H G F ノ N K 4 のディスクでは新生血管の進入が殆どなかったこのことから、 H G F / N K 4 に血管新生抑制作用があることが認められた。実施例 1 1 — H G F / N K 4 による腫瘍血管新生の抑制作用

6 〜 8 週齢のヌ一ドマゥス（ 8 八 8 じ n u / n u ) 背部皮下に 5 X 1 0 ⁶個の G B - d 1 ヒト胆のう癌細胞を移植した。 7 日後、 H G F Z N K 4 またはコント口ールとして生理食塩水を含む浸透圧ポンプ（Alzet社製）を背部皮下に埋め、 1 3 日間 H G F Z N K 4 または生理食塩水を持続的に移植癌近傍に注入した。癌移植 4 週間後、癌を摘出し、固定後通常の組織切片を作成した。腫瘍内の血管新生を調べるため、微小血管を抗 von f illeb rand factor抗体（ Dako社）を用いた免疫組織化学法により染色した。結果を表 2 に示す。表 2 von Willebrand factor陽性度

HG F/NK 4 +

コント口ール + + + + なお腫瘍内の血管新生度は次の基準に基づいて評価した

― von Willebrand ： factor陽性を示す微小血管が認められない + ： 1 / 4 程度の微小血管が von Willebrand factor陽性を示す

+ + ： 1 / 2 程度の微小血管が von Willebrand factor陽性を示す

+ + + ： 3 / 4 程度の微小血管が von Willebrand factor陽性を示す

+ + + + ： 3 / 4 以上の微 /Jヽ血管カヽ' von Willebrand

： factor陽性を示す

また、顕微鏡で観察した結果を図面に代わる写真（図 1 0 ) として提示する。

これらの結果からわかるように、生理食塩水を注入したコント口一ノレの移植癌組織内には von Willebrand fac tor陽性の微小血管が多数形成され、腫瘍組織内での癌細胞のアポトーシスは認められなかった。これに対して、 H G F / N K 4 を注入した移植癌組織では腫瘍血管新生は著しく抑制され、癌中心部では癌細胞のアポトーシスが広範囲に認められた。このことから、 H G F Z N K 4 は in vivoで腫瘍血管新生を抑制することが判明した。参考例 H G F Z N K 4 による癌の成長 · 転移抑制効果（ 1 )

6 〜 8 週齢のヌードマウス（ B A L B Zc nu/ nu) 背部皮下に 5 x l 0 ⁶個の Lewis肺癌細胞を移植した。 5 日後、 H G F Z N K 4又は生理食塩水（コントロール）を含む浸透圧ポンプ（Alzet社製）を背部皮下に埋め、 2週間 H G F / N K 4又は生理食塩水を持続的に移植癌近傍に注入した。癌移植後 2 8 日後に移植癌の重量及び肺転移を調べた。癌の体積は（短径） ² x (長径） ² x 0. 5 で算出した。

移植癌の体積を経時的に追跡した結果を図 1 1 Αに、図 1 1 Bに移植癌の 2 8 日目の重量を示す。図からわかるように、生理食塩水を注入したコントロールの移植癌は移植後 1 0 日以降急速に成長したが、 H G F Z N K 4 は癌の成長を用量依存的に強く抑制した。

また、 Lewis肺癌の肺転移に関しては、コントロールの生理食塩水注入群では多数の肺転移巣が観察されたのに対して、 H G F / N K 4 を注入した個体では肺転移は用量依存的に強く阻害された（図 1 2 A、 B ) 。

これらのことから、 H G F / N K 4 は、 in vivoで肺癌の成長及び転移を有意に抑制する作用を有していることカわ力、る。参考例 2 - H G F Z N K 4 による癌の成長 · 転移抑制効果（ 2 ) 6 〜 8週齢のヌードマウス（ B A L B / c nu/ nu) 背部皮下に 5 x 1 0 ⁶個の Jyg乳癌細胞を移植した。 5 日後、 H G F Z N K 4又は生理食塩水（コントロール）を含む浸透圧ポンプ（Alzet社製）を背部皮下に埋め、 2週間 H G F / N K 4又は生理食塩水を持続的に移植癌近傍に注入した。移植癌の体積を経時的に測定し、癌移植後 2 8 日目に肺表面の転移性腫瘍の数を計測した。

移植癌の体積を経時的に追跡した結果を図 1 3 Aに、図 1 3 Bに癌移植後 2 8 日目に肺表面の転移性腫瘍の数を示す。図からわかるように、生理食塩水を注入したコントロールの移植癌は移植後 1 0 日以降急速に成長したが、 H G F / N K 4 は癌の成長を抑制した。また、肺転移に関しては、コントロールの生理食塩水注入群では多数の肺転移巣が観察されたのに対して、 H G F Z N K 4 を注入した個体では肺転移の抑制が認められた。

これらのこと力、ら、 H G F Z N K 4 は、 in vivoで jyg 乳癌の成長及び転移を有意に抑制する作用を有していることがわかる。製剤例

生理食塩水 1 0 O m 1 中に実施例 1 で調製した H G F / N K 4 ( 1 m g ) 、マンニトール（ l g ) 及びポリソルベート 8 0 ( 1 0 m g ) を含有する溶液を無菌的に調製し、 1 m 1 ずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封して、本発明の血管新生抑制剤を凍結乾燥製剤として調製した。

製剤例 2

0. 0 2 M リン酸緩衝液（ 0. 1 5 M N a C l 及び 0. 0 1 %ポリソルベート 8 0含有、 p H 7 . 4 ) 1 0 0 m l 中に、実施例 1 で調製した H G F Z N K 4 1 m g及びヒト血清アルブミン 1 0 0 m gを含む水溶液を無菌的に配合して、 1 m 1 ずつバイアルに分注した。次いで、各バイアル中の液剤を凍結乾燥して密封して、本発明の血管新生抑制剤を凍結乾燥製剤として調製した。製剤例 3

注射用蒸留水 1 0 0 m 1 中に、実施例 1 で調製した H G F / N K 4 ( 1 m g ) 、ソノレビトール（ 2 g ) 、グリシン（ 2 g ) 及びポリソルベート 8 0 ( 1 0 m g ) を含む溶液を無菌的に調製し、 1 m 1 ずつバイアルに分注した後、凍結乾燥して密封して、本発明の血管新生抑制剤を凍結乾燥製剤として調製した。産業上の利用可能性本発明の血管新生抑制剤は、その血管新生抑制作用に基づいて、血管異常増殖に起因する種々の疾患、例えばリウマチ性関節炎，糖尿病性網膜症，未熟児網膜症，老人黄班部変性，創傷治癒時の過剰瘢痕形成等の予防又は治療剤として有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 下記の（ a ) 又は（ b ) に記載されるポリペプチドを有効成分として含有する血管新生抑制剤。

( b ) ( a ) のアミノ酸配列において、 1 若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつ c 一 M e t Z H G F レセプタ一を介する H G Fの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリべプチド

2 . 上記ポリペプチドが、少なくとも一つのヘアビンドメイン及び 4つのクリングルドメインを有するものである請求項 1 記載の血管新生抑制剤。

3 . 上記ポリぺプチド力 Hepatocyte growth factorをェラスターゼで消化して得られるものである請求項 1 記載の血管新生抑制剤。

6 . 請求項 1 記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する、血管異常増殖に起因する疾患の予防又は治療剤。

7 . 血管異常増殖に起因する疾患が、リウマチ性関節炎、乾癬、オスラー -ゥヱバー（ Os i er - Webber ) 症候群、心筋の脈管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節症、眼の脈管形成性疾患、血管線維腫、良性腫瘍及び創傷肉芽形成よりなる群から選択されるいずれかである請求項 6 記載の予防又は治療剤。

8 . 請求項 1 記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する、内皮細胞の過度な刺激によって生じる疾患の予防又は治療剤。

9 . 内皮細胞の過度な刺激によって生じる疾患が、腸管癒着、クローン病、ァテローム硬化症、強皮症及び過剰瘢痕形成よりなる群から選択されるいずれかである請求項 8 記載の予防又は治療剤。 0 . 請求項 1 記載のポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含有する受胎調節剤。 1 . 下記（ a )又は（ b )に記載されるポリペプチド：

( a ) Hepatocyte growth factor ( H G F ) の PyrGlu 3²〜 Val ⁴⁷⁸からなるァミノ酸配列を有するポリぺプチド、

( b ) ( a ) のアミノ酸配列において、 1 若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列カヽらなり、かつ c 一 M e t Z H G F レセプターを介する H G Fの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリべプチド

及び薬学的に許容される担体を含む血管新生抑制剤を被験者に投与することからなる、血管新生抑制方法。

1 2 . 下記（ a )又は（ b )に記載されるポリペプチド： ( a ) Hepatocyte growth factor ( H G F ) の PyrGlu 3²〜 Val ⁴⁷⁸からなるアミノ酸配列を有するポリべプチド、

( b ) ( a ) のアミノ酸配列において、 1 若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつ c 一 M e t Z H G F レセプターを介する H G Fの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリべプチド

及び薬学的に許容される担体を含む血管新生抑制剤を血管異常増殖に起因する疾患の予防または治療をうける被験者に投与することからなる、該疾患の予防または治療方法。 3 . 上記疾患が、リウマチ性関節炎、乾癬、オスラー -ウェバー（Osier- Webber) 症候群、心筋の脈管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節症、眼の脈管形成性疾患、血管線維腫、良性腫瘍、創傷肉芽形成、腸管癒着、クローン病、ァテローム硬化症、強皮症及び過剰瘢痕形成よりなる群から選択されるいずれかである請求項 1 2 記載の予防又は治療方法。 1 4 . 血管新生抑制剤の製造のための、下記（ a )又は ( b )に記載されるポリペプチドの使用：

( a ) Hepatocyte growth factor ( H G F ) の PyrGlu 3 2 Val ⁴⁷⁸からなるアミノ酸配列を有するポリべプチド、

) ( a ) のアミノ酸配列において、 1 若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつ c — M e t Z H G F レセプタ一を介する H G Fの作用に対してアンタゴニスト活性を有するポリべプチド。