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WO1999060112A1 - Antibodies and utilization thereof - Google Patents

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Publication number
WO1999060112A1
WO1999060112A1 PCT/JP1999/002650 JP9902650W WO9960112A1 WO 1999060112 A1 WO1999060112 A1 WO 1999060112A1 JP 9902650 W JP9902650 W JP 9902650W WO 9960112 A1 WO9960112 A1 WO 9960112A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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ligand
antibody
boc
arg
peptide
Prior art date
Application number
PCT/JP1999/002650
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hirokazu Matsumoto
Chieko Kitada
Shuji Hinuma
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries, Ltd. filed Critical Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority to CA2328416A priority Critical patent/CA2328416C/en
Priority to AU37331/99A priority patent/AU3733199A/en
Priority to EP99919662A priority patent/EP1081222B1/en
Priority to DE69942580T priority patent/DE69942580D1/de
Priority to US09/700,643 priority patent/US7067268B1/en
Priority to AT99919662T priority patent/ATE474044T1/de
Publication of WO1999060112A1 publication Critical patent/WO1999060112A1/ja
Priority to US11/004,336 priority patent/US7598351B2/en

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Definitions

  • the present invention relates to a novel monoclonal antibody having binding specificity for a 19P2 ligand or a derivative thereof. More specifically, the development of a method for quantifying 19P2 ligand or its derivative based on the antibody reaction to the thigh, and the development of a diagnosis or prevention of diseases involving 19P2 ligand or its derivative by utilizing the neutralizing activity.
  • 19P2 ligand is a novel peptide found as a ligand for the orphan G protein-coupled receptor Yuichi (19P2). It is most abundant in the brain (particularly the hypothalamus), and its receptor, 19P2, It is considered to be one of the new hypothalamic hormones (pituitary hormones) because it is most frequently found in the pituitary gland.
  • the 19P2 ligand is composed of (1) 19P2-L31 (a peptide consisting of 31 amino acids) consisting of 31 residues,
  • a 19P2 ligand consisting of 31 amino acids is called a 19P2 ligand (1-31) or 19? 2-31, and a 19P2 ligand consisting of 20 amino acids is called a 19P2 ligand (12-31) , Or 19P2-L20. ]
  • amino acid sequences of human, rat and rat 19P2 ligands (12-31) are shown below.
  • An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody that can specifically and quantitatively determine 19 P 2 ligand or a derivative thereof with high sensitivity, and a method for detecting and quantifying 19 P 2 ligand or a derivative thereof using the antibody.
  • the present inventors have conducted extensive research to solve the above problems, and as a result, produced a plurality of monoclonal antibodies that specifically recognize different portions of the 19P2 ligand or its derivative, and by using these antibodies, We have developed a highly sensitive and sensitive method for detecting and quantifying 19 P 2 ligand or its derivative. As a result of further research, the present invention was completed.
  • the present invention relates to an antibody (preferably, a monoclonal antibody) specifically against a C-terminal partial peptide of a 19P2 ligand or a derivative thereof, and a specific peptide at the central portion of the 19P2 ligand or a derivative thereof.
  • Antibodies preferably monoclonal antibodies
  • hybridoma cells producing the monoclonal antibodies methods for producing the antibodies and hybridoma cells, and 19P2 ligands and their induction by competition or sandwich methods using the antibodies
  • the present invention relates to an immunoassay method for a conductor and the like.
  • the present inventors have a [Cys 17] 19P2 ligand (17- 31) and [Cys 2 5] 19P2 ligand (12- 25) as an immunogen, the monoclonal antibody was more prepared, by combining these An immunoassay method capable of detecting a 19P2 ligand or a derivative thereof with high sensitivity and specificity has been developed. That is, a complex of thyroglobulin (BTG) with [Cys 17 ] 19 P 2 ligand (17-31) and [Cys 25 ] 19P2 ligand (12-25) was used as a source to form a 19 P 2 ligand (1 31) Monoclonal antibody recognizing the C-terminal and intermediate regions of or its derivatives, for example?
  • BCG thyroglobulin
  • a method for quantifying 19 P2 ligand or a derivative thereof in a test solution comprising using the antibody according to (1) and the monoclonal antibody according to (4), and
  • the monoclonal antibody described in (11) above is a monoclonal antibody represented by P2L_1Ta or P2L-3Ta,
  • one of the antibody to the 19P2 ligand and the antibody to the labeled 19P2 ligand insolubilized on the carrier is a monoclonal antibody designated as P2L-1Ca or P2L-2Ca, The other?
  • one of the antibodies against the 19P2 ligand insolubilized on the carrier and the antibodies against the 19P2 ligand identified is a monoclonal antibody denoted by P2L-1Ca; Is a monoclonal antibody represented by P2L_2Ca, P2L_ITa or P2L-3Ta, and a peptide having 19P2 ligand or a derivative thereof having the amino acid sequence represented by its own sequence number: 1, SEQ ID NO: The peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5; the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; Quantification method,
  • One of the antibody to the 19 ⁇ 2 ligand insolubilized on the carrier and the labeled antibody to the 19 ⁇ 2 ligand is a monoclonal antibody denoted by P2L-2Ca, and the other is P2L_lCa, P2L—ITa or P A monoclonal antibody represented by 2L-3Ta, wherein the 19P2 ligand or a derivative thereof has a peptide having the amino acid sequence represented by its own sequence number: 1, and has an amino acid sequence represented by: SEQ ID NO: 2 A peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3; a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; and / or a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the 19P2 ligand in the present invention there are a 19P2 ligand (1-31) composed of 31 amino acids and a 19P2 ligand (12-31) composed of 20 amino acids.
  • the 19 P 2 ligand (12-31) having a different amino acid sequence is used as the 19 P 2 ligand derivative in the present invention.
  • the N-terminal amino acid of the 19 P 2 ligand is 16 to 17 Deletion of residual difficulty, deletion of one amino acid at C-terminal, substitution of L-glycine with D-alanine, conversion of C amide to carboxylic acid, L-glycine and L at C-terminal —With arginine , Obtained by adding the L one cysteine, such as those having Asechiru group at the N-end is used.
  • a peptide represented by SEQ ID NO: 4 lacking the first to 16th amino acid sequences from the amino acid sequence of 19 P2-L31, ( ⁇ a peptide represented by SEQ ID NO: 4) * Peptide represented by SEQ ID NO: 6 with an acetyl group added to 3 ⁇ 4, 3 19 ⁇ 2-—The 29th glycine in the amino acid sequence of L31 was converted to D-alanine.
  • P 2 ligands or derivatives thereof can be prepared from (a) mammals such as humans, monkeys, rats, and mice by their own methods, and (b) peptide / synthesizers, etc. Use itself can also be chemically synthesized by the method of peptide synthesis.
  • the partial peptide on the C-terminal side of the 19P2 ligand or a derivative thereof in the present invention is a peptide having an amino acid sequence at positions 18 to 31 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7. Peptidoca with cysteine added to the N end.
  • the antibody preferably, a monoclonal antibody specifically reacting with the C-terminal partial peptide of the 19P2 ligand or its derivative in the present invention
  • an antibody that recognizes the 19 ⁇ 2 ligand or its derivative is used.
  • antibodies (i) and (ii) those which are mouse IgG and those whose subclass is ⁇ are preferably used.
  • An antibody that specifically recognizes (12-31) is more preferable, and furthermore, H-Ser-Arg-Thr-His-Arg-His-Ser-Met-Glu-lie-Arg- Thr-Pro-Asp-Ile- Asn- Pro- Ala- Trp- Tyr- Ala-Ser- Arg - human 19 having the amino acid sequence represented by Gly-Ile-Arg-Pro- Val-D-Ala-Arg-Phe-NH 2
  • An antibody that specifically recognizes the P 2 ligand (12-31) is preferable, and furthermore, a human 19 P 2 ligand (1-30) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 and represented by SEQ ID NO: 8
  • An antibody which has the amino acid sequence of the amino acid sequence and recognizes 19P2 ligand (1-31) -Gly-Ala-0H is preferred.
  • a typical example of the above-mentioned antibody (i) is a monoclonal antibody indicated by P2L-1Ca, and a typical example of the above-mentioned antibody (ii) is indicated by P2L-2Ca.
  • Monochrome antibodies are monochrome antibodies.
  • a partial peptide having an amino acid sequence represented by its own sequence number: 7 is used as the monoclonal antibody specific to the central partial peptide of the 19P2 ligand or a derivative thereof according to the present invention. It does not recognize, but recognizes a partial peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and uses a monoclonal antibody or the like that specifically reacts with a 19P2 ligand or a derivative thereof.
  • a ⁇ 2 ⁇ ⁇ 19 ⁇ 2 ligand (1-31) having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • An antibody that specifically recognizes ligand (12-31) is preferable, and recognizes a peptide having an amino acid sequence lacking the first to 16th amino acid sequences from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
  • those that are mouse IgG, and those whose antibody subclass is ⁇ are preferably used, specifically, P2L—lTa, P2L—2Ta, and P 2 L—3.
  • Ta or P 2 L—marked with 4 Ta Such as monoclonal antibodies are used.
  • these monoclonal antibodies it is preferred, particularly P2L-1 T a.
  • the antigen used to prepare the antibody of the present invention includes, for example, any of 19P2 ligand or a derivative thereof, and a synthetic peptide having one or more antigen determinants identical to the 19P2 ligand. (Hereinafter, these may be simply referred to as 19 P 2 ligand).
  • 19P2 ligand or a derivative thereof those described above and the like are used.
  • These 19P2 ligands or derivatives thereof can be prepared from (a), for example, fibers or cells of mammals such as humans, monkeys, rats, mice, etc., using the method of itself or a method analogous thereto, (B) It can also be synthesized chemically by a peptide synthesis method known per se using a peptide synthesizer or the like.
  • C The 19P2 ligand or a derivative thereof can also be isolated by culturing a transformant containing DNA encoding the same.
  • the fibers or cells are homogenized. After extraction, the extract is extracted with an acid or alcohol, etc., and the extract is subjected to chromatography such as salting out, dialysis, gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. Purification can be performed by combining the above.
  • examples of the synthetic peptide include a peptide having the same structure as that of a 19P2 ligand antigen purified from nature, and a 19P2 ligand (1-31).
  • a peptide comprising one or more amino acid sequences identical to the amino acid sequence at any position consisting of three or more, preferably six or more amino acids in the amino acid sequence of Abbreviated as synthetic peptide).
  • the DNA encoding the ligand or the derivative thereof may be obtained by a known cloning method.
  • the cloning method includes: (1) a DNA encoding the peptide from a cDNA library by a hybridization method using a DNA probe or a DNA primer designed based on the amino acid sequence of the peptide; Or (2) a method for obtaining a transformant containing DNA encoding the peptide by PCR using a DNA primer designed based on the amino acid sequence of the peptide. And the like.
  • the peptide as the peptide can be produced by (1) a method for synthesizing the peptide itself, or (2) by cleaving the peptide containing the peptide of the present invention with an appropriate peptidase. it can.
  • any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the peptide with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group, the target peptide can be Stated.
  • Examples of the condensation method and elimination of the protecting group include the following (the method described in ⁇ D).
  • the peptide can be purified by a combination of ordinary purification methods, for example, leaching, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like.
  • the peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by the method of the above, and conversely, when it is obtained as a salt, it can be converted to the free form by the method of the above.
  • a commercially available resin for peptide synthesis suitable for amide formation can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzylalcohol resin, 4-methylpenthydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethyl resin.
  • Rylphenylacetamide methyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl 2-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl-Fmoc aminoethyl) phenoxy resin, etc. Can be mentioned.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target peptide according to various known condensation methods.
  • the peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are used to obtain the desired peptide.
  • a partially protected peptide can be taken out using a chlorotrityl resin, an oxime resin, a 4-hydroxybenzoic acid-based resin, or the like, and the protecting group can be further removed by a conventional method to obtain a desired peptide.
  • the protected amino acids described above various activating reagents that can be used for peptide synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • the carbodiimides include DCC, ⁇ , N′-diisopropylpropylcalirepositimide, ⁇ -ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolylyl) carbodiimide, and the like.
  • the protected amino acids may be added directly to the resin along with racemization inhibitors (e.g., H0Bt, HOOBt, etc.) or may be pre-protected as acetic anhydride or HOBt ester or HOOBt ester.
  • the solvent used for activation of the protected amino acid or condensation with the resin can be selected from solvents known to be usable for peptide condensation reactions.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone
  • halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform
  • alcohols such as trifluoroethanol.
  • Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide; tertiary amines such as pyridine; ethers such as dioxane and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; A mixture of 3 ⁇ 4 ⁇ and the like is used.
  • the reaction ⁇ is selected from the range known to be usable for the peptide bond formation reaction, and is usually selected from the range of about ⁇ 20 ° C. to about 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in about 1.5 to about 4 times excess.
  • the condensation power is sufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protective group.
  • the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole so as not to affect the subsequent reaction.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting amino acid include Z, Boc, tertiary-pentoxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CutZ, Br-Z, and adamantyl.
  • Examples include carbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, and Fmoc.
  • the hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower (C ⁇ 6 ) alkanoyl groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, benzyloxycarbonyl group, ethoxy group and the like. And groups derived from carbonic acid such as a xycarponyl group.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydrovinyl group, and a short-butyl group.
  • Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl 2 -BzK 2 -nitrobenzyl, Br-Z, and Yuichi Sharybutyl.
  • imidazole protecting group for histidine examples include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, Bom, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like.
  • the activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, the corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) , Cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H0B, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalileimide, ester with H0BO], etc.
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol
  • Cyanomethyl alcohol paranitrophenol
  • H0B N-hydroxysuccinimide
  • N-hydroxyphthalileimide N-hydroxyphthalileimide
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include, for example, bonding in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd carbon, or anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, or trifluoromethanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd black or Pd carbon
  • anhydrous hydrogen fluoride methanesulfonic acid, or trifluoromethanesulfonic acid.
  • Acid treatment with trifluoroacetic acid or a mixture thereof salt treatment with diisopropylethyleramine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc .; and reduction with sodium in liquid ammonia.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is carried out at 120 ° C. to 40 ° C.
  • Protection and protection of functional groups that should not be involved in the reaction of the raw materials, and elimination of the protection, Activation of the functional group involved in the reaction can be selected from the group or the means of M ⁇ Ci.
  • Another method for obtaining the amide form of the peptide is as follows: first, after amidating the ⁇ -force lipoxyl group of the amino acid peptide, extending the amino acid peptide chain to a desired chain length, A) a peptide having only the protecting group of the amino group removed and a peptide (or amino acid) having only the protecting group of the carboxyl group of C prepared, and these peptides are mixed in a mixed solvent as described above. To condense. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the 19 P 2 ligand antigen Since the 19 P 2 ligand antigen is very weak, it can be directly exempt from insolubilized antigen. Further, a complex obtained by binding or adsorbing the 19 ⁇ 2 ligand antigen to a suitable carrier may be immunized.
  • the mixing ratio of the carrier and the carrier (carrier 1) to the 19P2 ligand antigen (butene) should be such that if the antibody can be efficiently produced with respect to the 19 ⁇ 2 ligand bound or adsorbed to the carrier. Any substance may be bound or adsorbed at any ratio, and a natural or synthetic polymer carrier commonly used for production of an antibody against the octane antigen is usually used in a weight ratio of 0 to 1 for hapten.
  • Natural polymer carriers include, for example, serum albumin of mammals such as horseshoe, egrets, humans, and thyroglobulin of mammals such as horseshoe, egrets, etc. Hemoglobin, keyhole limpet, and mocyanin are used.
  • polymer carrier to be synthesized for example, polymers such as polyamino acids, polystyrenes, polyacryls, polyvinyls, and polypropylenes, and various latexes such as copolymers can be used.
  • Various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • An example For example, crosslink tyrosine, histidine, and tributofan
  • dialdehyde compounds such as glutaraldebit that crosslink amino groups
  • diisocyanate compounds such as toluene 1,2,4-diisocyanate
  • dimaleimides such as N, N'-o-phenylenedimaleimide that crosslink thiol groups
  • a compound, a maleimide active ester compound having an amino group and a thiol group, and a carbodiimide compound for crosslinking an amino group and a carbonyl group are conveniently used.
  • a thiol group is introduced by reacting an active ester reagent (for example, SPDP) having a dithiopyridyl group on one amino group, and then introducing the thiol group. After the maleimide group is introduced into the amino group by a maleimide-active ester reagent, the two can be reacted.
  • an active ester reagent for example, SPDP
  • the 19 P2 ligand is administered to fiifii animals by autologous administration, such as by intranasal ax, intravenous ax, or subcutaneous injection, at the site where T antibody production is possible, either by itself or with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant—incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of the warm-blooded animal include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens. Mouse and rats are preferably used for preparing monoclonal antibodies.
  • the 19P2 ligand thigh When preparing monoclonal antibodies, select an animal immunized with the 19P2 ligand thigh, for example, an individual with an antibody titer from a mouse, and remove the spleen or lymph node from the spleen or lymph node 2 to 5 days after the final immunization. By collecting the antibody and producing the antibody contained therein, the cells can be fused with bone cells to prepare an anti-19P2 ligand monoclonal antibody-producing hybridoma. The measurement of the anti-19P2 ligand antibody titer in the serum is carried out, for example, by reacting the labeled 19P2 ligand described below with the supernatant, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. You.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Köhler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion agent include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • Bone fall Examples of cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and the like, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen) cells used and the number of osseous cells is usually 1: 1 to 20: 1 gram, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) is 10 to 80% PEG.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding the mixture in step (1) and incubating at usually 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C, usually for 1 to 10 minutes.
  • a solid phase in which 19 P 2 ligand or 19 P 2 ligand-related synthetic peptide is adsorbed directly or together with a carrier For example, add the hybridoma culture supernatant to a microplate and add anti-immunoglobulin antibody labeled with radioactive substances or enzymes (if the cell used for cell fusion is a mouse, anti-mouse immunoglobulin antibody is used) )
  • a method for detecting anti-19P2 ligand monoclonal antibody bound to a solid phase by adding protein A, and adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, Add 19P2 ligand labeled with proteins or enzymes, and detect anti-19P2 ligand monoclonal antibody bound to solid phase.
  • Screening and breeding of anti-19P2 ligand monoclonal antibodies are usually performed by adding HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) and adding 10-20% fetal bovine serum to animal cell culture medium (eg, RPMI 1640). ).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • 10-20% fetal bovine serum to animal cell culture medium (eg, RPMI 1640).
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the anti-19P2 ligand antibody titer in the antiserum described above.
  • Separation and purification of anti-19P2 ligand monoclonal antibody can be performed by the same method as that for ordinary polyclonal antibody separation and purification of immunoglobulin (eg, salting out method, alcohol method, isoelectric point method, electrophoresis, ion exchange) Using an antibody (eg, DEAE), fiber removal, gel filtration, antigen-bound solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G to collect only the antibody Specific purification method to be obtained].
  • an antibody eg, DEAE
  • fiber removal eg, gel filtration, antigen-bound solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G to collect only the antibody Specific purification method to be obtained.
  • a hybridoma that produces an anti-19P2 ligand antibody that reacts with a partial region of 19P2 ligand and an anti-19P2 that reacts with 19P2 ligand but does not react with a partial region thereof.
  • Screening of a hybridoma that produces a ligand monoclonal antibody can be performed, for example, by measuring the binding between a peptide corresponding to a partial region of the hybridoma and an antibody generated by the hybridoma.
  • the monoclonal antibody labeled P2L-3Ta which specifically reacts with the partial peptide at the central part, has a partial peptide at the C-terminal side and central part of 19P2 ligand, respectively. Since it can be specifically recognized, it can be used for quantification of 19P2 ligand in a test wave, particularly for quantification by a sandwich immunoassay.
  • An antibody against the 19P2 ligand or derivative thereof of the present invention is allowed to react competitively with the test solution-identified 19P2 ligand or derivative thereof, and the labeled 19P2 ligand or derivative thereof bound to the antibody is reacted.
  • a method for quantifying 19 P 2 ligand or a derivative thereof in a test solution comprising measuring the ratio of
  • a method for quantifying 19 P 2 ligand or its induction in a test wave comprising: an antibody against a 19 2 ligand or a derivative thereof insolubilized on a carrier;
  • One of the antibodies to the derivative is an antibody characterized by specifically reacting with 19 ⁇ 2 ligand or a partial peptide at the C-terminal side of the derivative, and the other is the amino acid represented by its own sequence number: 11.
  • a quantification method that is an antibody that recognizes an intermediate portion of a 19 ⁇ 2 ligand such as a partial peptide having a sequence (ie, 19P2 ligand (12-24)) or a derivative thereof.
  • an antibody characterized by specifically reacting with a partial peptide at the C-terminal side of 19 ⁇ 2 ligand or a derivative thereof is designated as P 2L-1 Ca or P 2L—2Ca.
  • a partial peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 (ie, , 19P2 ligand (12-24)) and other antibodies that recognize an intermediate portion of a 19P2 ligand or a derivative thereof are P2L_1Ta or? Monoclonal antibody labeled as 2 L—3 Ta.
  • One of the antibody to the 19 ⁇ 2 ligand insolubilized on the body and the antibody to the identified 19P2 ligand or a derivative thereof is a monoclonal antibody designated as P2L-1Ca, and the other is P2L-1 Monoclonal antibody designated as Ta or P 2 L-3T a, wherein the 19 P 2 ligand has a sequence number of 1, a sequence number of 2, a sequence number of 3, a sequence number of 5, or a sequence.
  • One of the antibody against the 19P2 ligand insolubilized on the body and the antibody against the recognized 19P2 ligand or a derivative thereof is a monoclonal antibody denoted by P2L-2Ca, and the other is P2L.
  • -It is a monoclonal antibody that is labeled with 2L-3T a, and is a 19P2 ligand.
  • a quantification method that is a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 is suitable, etc.
  • a quantification method for the 19 P 2 ligand or a derivative thereof (hereinafter, abbreviated as 19 P 2 ligand) of the present invention The immunoassay will be described in more detail.
  • the antibody of the present invention can recognize 19 P 2 ligand, measurement of 19 P 2 ligand or detection by Sayaya staining or the like can be performed.
  • the antibody ⁇ may be used, or F (ab ') 2, Fab' or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measurement method using the antibody of the present invention is not particularly limited.
  • the amount of the antibody, the amount of the antibody or the antibody-thigh complex corresponding to the small amount (for example, the amount of 19P2 ligand) in the test solution can be measured chemically or Any measurement method may be used as long as it is detected by physical means and is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of i).
  • the method is suitably used such as a nephelometry, a competition method, an immunometric method, and a sandwich method.
  • Labeling agents used in assays using labeling substances include radioisotopes, enzymes, and fluorescent substances And luminescent materials.
  • Radioactive allotropic for example, 1 2 5 I, 1 3 1 I, 3 H, 1 4 C is, as the enzyme, large preferably stable and specific activity, e.g., / 3-galacto- fern Ichize, j3-Darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc .; fluorescent substances such as fluorescamine and fluorescein isothiocyanate; luminescent substances such as luminol, luminol derivatives, luciferin And lucigenin, respectively.
  • some antibodies may use a biotin-avidin system for binding the 19 P2 ligand to the labeling agent.
  • the insolubilization of the antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing a protein or an enzyme may be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, and synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass.
  • the test solution is allowed to react with the insolubilized anti-19P2 ligand antibody (primary reaction), and further reacted with the labeled anti-19P2 ligand antibody (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent on the carrier, the amount of 19 P 2 ligand in the test solution can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed at the same time or at different times.
  • the labeling agent and the method of melting can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the anti- 19 P 2 ligand antibody used for the primary reaction and the secondary reaction is the site capacity of the 19 P 2 ligand that binds to the antibody.
  • a different antibody is preferably used. That is, for example, when the antibody used in the primary reaction recognizes the partial peptide at the C-terminal side of 19P2 ligand, the antibody used in the secondary reaction is preferably other than the partial peptide at the C-terminal side (ie, , An N-terminal or an intermediate peptide).
  • the C-terminal portion of the 19 P 2 ligand used in the sandwich immunoassay of the present invention As a monoclonal antibody specific to anti-JiTT, a monoclonal antibody prepared using [Cys 17 ] human 19 P 2 ligand (17-31) as a contact can be used.
  • the present inventors have established eight hybridomas that produce such antibodies. Above all, antibodies produced by hybridoma P2L-11C are used in human and human immunoassays in a competitive enzyme-linked immunosorbent assay using a key protease-labeled 19P2 ligand (17-31).
  • a monoclonal antibody that specifically reacts with a partial peptide at the C-terminal side of 19 P 2 ligand suitable for the sandwich enzyme immunoassay of the present invention is not necessarily a 19 P 2 ligand (1-31). It does not need to have high affinity. As such an antibody, for example,? 2-1 and & are used conveniently.
  • [Cys 25 ] 19 P 2 ligand (12-25) is ⁇
  • the antibody prepared as described above is preferably used.
  • P 2 L— 1 Ta and P 2 L—3 Ta had good reactivity with 19 P 2 ligand (1-31).
  • P 2L-1 Ta provided an extremely sensitive sandwich measurement method.
  • P 2 L-1 Ta showed similar reactivity with 19 P 2 ligand (12-31). That is, in the present invention, as an antibody that recognizes a partial peptide in the middle part of the 19P2 ligand suitable for the sandwich method, the 19P2 ligand (12-2 Although several types of antibodies against 4) are provided, P 2 L-ITa is particularly preferably used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can also be used in a sandwich measurement system, for example, a competition method, an immunometric method, a nephrometry method, and the like.
  • a competition method after reacting the antibody in the test solution with the labeled ⁇ competitively with the antibody, the unreacted label (F) and the labeled ⁇ 3 ⁇ 40 (B) bound to the antibody are separated (BZF Separation), measure the amount of any of B and F, and quantify the amount of fc in the test solution.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • B / F separation is carried out using a polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • a second antibody is used.
  • the first antibody a soluble antibody is used, and an immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ in a test solution and immobilized i3 ⁇ 43 ⁇ 4 are subjected to a competitive reaction with a certain amount of a labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Then, a solid-phased antigen is added and unreacted labeled antibody is bound to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of labeling in either phase is measured to determine the amount of tang in the test solution.
  • nephelometry measures the amount of insoluble sediment resulting from an antibody reaction in a gel or in a solution. Even when the amount in the test solution is small and a small amount of sedimentation force cannot be obtained, a laser nephrometer using laser scattering is preferably used.
  • the antibody of the present invention can quantify 19 P2 ligand or its derivative with high sensitivity, it is possible to elucidate the physiological function of 19 P2 ligand and to evaluate the pathological condition involving 19 P2 ligand. Useful for diagnosis and the like.
  • Tr t Trityl
  • a 1 a Alanine
  • SEQ ID NOs used herein represent the amino acid sequences of the following peptides.
  • P2L-1C and P2L-1T among the hybridoma cells producing the anti-19-2 ligand antibody obtained in the Examples of the above were obtained from March 18, 1998 by the Ministry of International Trade and Industry (NIBH), respectively, with the accession number below n3 ⁇ 4.
  • Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Pro, Boc-Arg (Tos), Boc-Ile, Boc-Gly, Boc-Arg ( Tos), Boc-Gly, Boc-Ala, and Boc-Tyr (Br-Z) are sequentially condensed, and Boc-Ala and Boc-Tyr (Br-Z), which have been found to have sufficient condensation capacity in the dihydrin test, Recondensation completed the reaction.
  • Boc-Trp (CHO), Boc-Ala, Boc-Pro, Boc-Asn, Boc-Ile, Boc-Asp (OcHex), Boc-Pro, Boc-Trp (CHO) Thr (Bzl), Boc-Arg (Tos), Boc-II e> Boc- Glu (OcHex), Boc-Met, Boc- Ser (Bzl), Boc-His (Bom), Boc-Gln, Boc-His ( Bom), Boc-Ala, Boc-Arg (Tos) and Boc-Ser (Bzl) were similarly recondensed until a sufficient condensation was obtained by the ninhydrin test. After the entire sequence of amino acids was introduced, the resin was treated with 50% trifluoroacetic acid (TFA) / DCM to remove the Boc group on the resin, and the resin was dried to synthesize 1.8 g of a peptide resin.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Use solution B (50% acetonitrile water containing 0.1% TFA)
  • Use solution B (50% acetonitrile water containing 0.1% TFA)
  • the first Boc-Ala and the second Boc-lie in Experiment 1 were changed to Boc-Thr (Bzl) to proceed with the synthesis.
  • the amino acids with the entire sequence were introduced, and the resin was treated with 50% TFA / DCM. After removing the Boc group, the resin was dried to obtain a desired peptide resin.
  • This resin was treated and purified in the same manner as in Experimental Example 1, and Ser-Arg-Ala-His-Gin-His-Ser-Met-Glu-Thr-Arg-Thr-Pro-Asp-11 e-Asn- Pro-Al a-Trp-Tyr-Thr- G 1 y-Ar gG 1 y- 11 e-Ar -Pro-Va 1 -G 1 y-Ar g-Phe-NH 2 to obtain a white powder .
  • Boc-Trp (CHO), Boc-Ala, Boc-Pro, were similarly condensed with the resin condensed up to Boc-Tyr (Br-Z) in Experimental Example 2, and Boc-Pro-Ala-Trp ( CHO) -Tyr (Br-Z) -Al a-Gly-Arg (Tos) -Gly-Ile-Arg (Tos)-Pro-Val-Gly-Arg (Tos) -Phe-pMBHA-resin. This was subjected to hydrogen treatment and column purification in the same manner as in 2) of Experimental Example 1 to obtain 70 mg of a white powder.
  • Use solution B (50% acetonitrile water containing 0.1% TFA)
  • Boc-Asn, Boc-Ile, Boc-Asp (OcHex), Boc-Pro, Boc-Thr (Bzl) were similarly condensed with the resin condensed up to Boc-Pro in Experimental Example 4, and Boc-Thr ( Bz 1) -Pro-As (OcHex)-11 e-As nProA 1 a- Trp (CHO) -Tyr (Br-Z) -Ala-Gly-Arg (Tos) -Gly-Ile-Arg (Tos) -Pro-Val-Gly-Arg (Tos) -Phe-pMBHA-resin was obtained. This was subjected to hydrogen treatment and column purification in the same manner as in Test Example 4 to obtain 6 Omg of a white powder.
  • Use solution B (50% acetonitrile water containing 0.1% TFA)
  • Boc-Cys (MeBzl) was further condensed with the resin of Experimental Example 4, and this was similarly treated with hydrogen fluoride and purified by column to obtain 50 mg of a white powder.
  • Use solution B (50% acetonitrile water containing 0.1% TFA)
  • Boc-Phe and Boc-Arg (Tos) were sequentially introduced into p-methyl BHA resin, and then Boc-Gly was introduced in place of Boc-D-Ala. Thereafter, the reaction was performed in the same manner as in Experimental Example 2, and Ser (Bzl) -Arg (Tos) -Thr (Bzl) -His (Bom) -Arg (Tos) -His (Bom) -Ser (Bzl) -Met-Glu ( OcHex) -I le-Arg (Tos)-Thr (Bz 1) -Pro-Asp (OcHex) -11 e-Asn-Pro-Ala-Trp (CHO) -Tyr (Br-Z) -Al a-Ser ( Bzl) -Arg (Tos) -Gly-11 e-Arg (Tos) -Pro-Va1-D-Ala-Arg (Tos) -Phe-pMBHA-resin
  • Use solution B (50% acetonitrile water containing 0.1% TFA)
  • Use solution B (50% acetonitrile water containing 0.1% TFA)
  • Boc-Phe-OCH 2 PAM resin (Applied Biosystems, manufactured by Perkin Elmer) 0.69 g (0.5 mm mole) of Boc amino acid was introduced sequentially according to the desired amino acid sequence in the same manner as in Experimental Example 9 , Treatment and purification to obtain a white powder.
  • Boc-Trp (CHO), Boc-Ala Boc-Pro, Boc-Asn Boc-Ile, Boc-Asp (OcHex), Boc-Pro , Boc-Thr (Bzl) condensed similarly, Boc-Thr (Bzl)-Pro-As (OcHex)-1 le-Asn- Pro- Al a-Tr (CHO) -Tyr (Br-Z) -Ala -Gly-Arg (Tos) -Gly-Ile-Arg (Tos) -Pro-Va 1 -Gly-Arg (Tos) -Phe-pMBHA-res in 1.14 g was obtained. This was subjected to hydrogen treatment and column purification in the same manner as in 2) of Experimental Example 1 to obtain 60 mg of a white powder.
  • the reaction was carried out at room temperature for 40 minutes. After the reaction, the mixture was fractionated on a Sephadex G-25 column, and 15 mg of BTG having a maleimide group introduced thereto and 1.6 mg of [Cys 7 ] 19 P 2 ligand (17-31) were mixed at 4 ° C. The reaction was performed for 2 days. After the reaction, dialysed against physiological saline at 4 ° C for 2 days did.
  • the plate is washed with phosphate-sparing saline (PBS, pH 7.4), and then 300 ⁇ l of PBS containing 25% Block Ace (made by Yukibrand Milk Co., Ltd.) is added to block excess binding sites in the wells. Noted and treated at 4 ° C for at least 24 hours.
  • PBS phosphate-sparing saline
  • mice showing a relatively high antibody titer final immunization was performed by intravenously inoculating 200 to 300 g of a mouse dissolved in 0.25 to 0.3 ml of sanitary water into a vein.
  • the spleen was excised from the mouse, ffig-filtered with a stainless mesh, filtered, and suspended in Igles 'Minimum' Essential Medium (MEM) to obtain a wisteria cell suspension.
  • MEM Igles 'Minimum' Essential Medium
  • MEM was added to the fused vesicles at a rate of 2 ml / min, and a total of 15 ml of MEM was added, followed by centrifugation at 600 rpm for 15 minutes to remove the supernatant.
  • CS3 were suspended at a rate of 2 x 10 "/ ml of P3U1 and seeded on a 24-well multi-dish (made of Limbrone earth) in 1 ml 1 ml each at 192 ml. After seeding, the cells were cultured at 37.
  • the cells were cultured in a 5% carbon dioxide incubator. 24 hours later HAT (Hypoxanthine 1 X 10
  • h ( ⁇ 31) n represents human 19P2-L31
  • M ⁇ 31) -OH represents human 19P2 ligand ( ⁇ 31) -OH
  • b ( ⁇ 31) n represents human 19P2-L31.
  • h ( ⁇ 31) ⁇ represents human 19P2-Ul, h 2 -31) ⁇ represents human 19P2-L20 and r ( ⁇ 31) ⁇ represents rat 19 ⁇ 2-L3I.
  • B 0.75 ⁇ (B / BJ, where B is the amount of HRP-labeled human 19 bound to the antibody in the presence of the antigen.
  • these hybridomas were subjected to cloning by the limiting dilution method.
  • BALB / C mouse thymocytes were used as a feeder cell at 5 ⁇ 10 5 cells / well. It was added to a. black after-learning, after the High Priestess dormer was given intraperitoneally projecting a. 1 to 3 X 10 0 cell Z rats pre mineral oil 0. 5 ml in ⁇ administration mice (BALBZC) After 6 to 20 days, antibody-containing ascites was collected.
  • the monoclonal antibody was purified from the ascites fluid obtained using a protein-A column. That is, ascites 6 to 2 OML an equal volume of binding buffer after dilution with (3. 5M NaC 0. 05% 1 5 M grayed 11 Shin pH9 containing NaN 3. 0), silicon has been turned into in advance binding buffer
  • the antibody was applied to an -A-agarose (Repligen3 ⁇ 43 ⁇ 4) column, and the specific antibody was eluted with an elution buffer (0.1 M citrate buffer containing 0.05% NaN 3 , pH 3.0).
  • the eluate was dialyzed against PBS at 4 ° C for 2 days, and then sterilized by 0.22 m filter (Millipore) and stored at 4 ° C or 180 ° C.
  • Monoclonal antibody class To determine the subclass, the enzymatic link immunosorbent assay (ELISA) method using a purified monoclonal antibody-bound solid phase was performed, ie, 0.1 M charcoal buffer containing antibody 2 / g / ml.
  • the pH 9.6 solution was dispensed in 100 1 portions into a 96-well microplate and allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours according to the method described in Example 5 above, and the binding site of the well was blocked with a block ace.
  • the class and subclass of the immobilized antibody were determined by ELISA using an isotype typing kit (Mouse-TyperTM Sub-Isotyping Kit, manufactured by noisyorad).
  • the competitive method _E I ⁇ of the monoclonal antibody P 2L-lCa (IgGl, ⁇ ) which showed the highest response '14 to human, rat, and human 19P2 ligands (1-31)
  • this antibody shows that although P2L-1C has low reactivity with human [D-Ala 29 ] -19P2 ligand (1-31), human antibody 19P2 ligand (1-30), ⁇ The 19P2 ligand (1–31) -OH and the 19P2 ligand (1–31) G 1 y-Ar g-OH show no cross-reactivity. Recognizing the C-terminal partial structure of —31), it was found to recognize the amide of Phe and C3 ⁇ 4 at the 31st residue [Fig. 6 (a)]. On the other hand, the results of the competitive method—EIA using P2L-2C are shown in FIG. 5 (b).
  • P2L-1T a (IgG 2b , ⁇ ) or P2L-1Ta is the most specific monoclonal antibody showing the highest reactivity to human or rat 19 P 2 ligand (1-131).
  • the results of the competition EIA of P2L-3Ta (IgG Conduct ⁇ ) are shown in Fig. 7.
  • a P2L-3T-HRP complex was prepared using 15 mg of the purified P2L-3Ta fraction and 16 mg of HRP.
  • Buffer EC 10% Block Ace, 0.2% BSA, 0.4M NaCl, 0.05% CHAPS [3-[(cholamidopropyl) dimethylammonio] propane sulfone Acid] and a 0.02 M phosphate buffer (pH 7) diluted with 19 P 2 ligand (1-31) standard solution 100 ⁇ 1, and reacted at 4 ° C for 24 hours.
  • PBS P2L-ITa-HRP prepared in Example 8 above was added (20,000-fold diluted f3 ⁇ 4IOOI in buffer C) and allowed to react at 4 ° C for 24 hours.
  • the enzyme activity on the solid phase was measured using TMB by the method described in Example 5 above (enzyme reaction for 20 minutes).
  • the 19P 2 ligand (1-31) was detected with extremely high sensitivity, that is, the Sandwich method—EIA was performed using human 19 P 2 ligands (1-31) and 19 P 2 ligand (1-31).
  • fmol / we 11 is T ability, and other hypothalamic peptides TRH, LHRH, GHRH, CRF, SST and Oxytocin were not detected at all (Fig. 11).
  • the specificity and sensitivity of the sandwich method 1 EIA using P2L-ICa as a solid-phase antibody and using P2L-3Ta-HRP prepared in Example 8 (2) above as a label were examined.
  • the reactivity to human 19P2 ligand (1-31), 19P2 ligand (12-31) and rat 19P2 ligand (1-31) was examined in the same manner as in Example 9 (1) above. For this, 1,000-fold dilution was used (FIG. 12).
  • the sandwich method _EIA using P2L-3Ta-HRP was carried out using human 19P2 ligand (1-31) at 0.3 fmol / well and 19P2 ligand (12-31) at 1 fmolZwell in rat.
  • the 19P2 ligand (1-31) was detectable with 3 fmolZwell, but the sensitivity was 3-10 times lower than that of the sandwich method using P2L_ITa-HRP.
  • P2L-lCa, P2L-3Ca and an anti-endothelin monoclonal antibody (AwETN40) having the same IgG subclass structure (IgGp ⁇ ) as P2L-ICa as a control antibody were diluted to each concentration, and rat 19P2 After incubating with the ligand (1-31) (5 x 10 " 10 M) for 1 hour at room temperature, the residual activity was measured using 19P2 receptor-expressing CH ⁇ cells. The activity was measured by seeding CHO cells expressing 19P2 receptor at a concentration of 0.5 x 10 5 cells / well in a 24-well plate, culturing for 24 hours, and adding [ 3 H] arachidonic acid to 0.5. C / well was added.
  • rat plasma (1 ml) was concentrated and pretreated with 265 mg (Water s3 ⁇ 4S3 ⁇ 4) of Sep-Pak Plus C18 cartridge
  • 19P2 ligand (1-31) was quantified by the sandwich-EIA described in Example 9 above.
  • the pretreatment method for plasma was as follows: 4 m 1 of 86% ethanol containing 4% acetic acid, 4 m 1 of methanol, 4 m 1 of distilled water, and 4 m 1 of 4% acetic acid sequentially activated on a Sep-Pak Plus C 18 cartridge for 3 m. Plasma 1 lm 1 acidified by adding 4% acetic acid of 1 was loaded.
  • the eluted fraction was evaporated to dryness under reduced pressure, dissolved in 250 ml of buffer 1C, and supplied to the sandwich EIA described in Example 10 above.
  • the results are shown in FIG. Since most of the immunoreactivity of the 19P2 ligand in plasma was detected at the elution position of the synthetic 19P2 ligand (1-31), the sandwich method 1 EIA showed that the 19P2 ligand (1 — 3 1) was detected to have been detected. Therefore, it is believed that the * 3 ⁇ 4 assay provides an important tool in assessing the fluctuation of 19 P 2 ligand in plasma.
  • the monoclonal antibody to the 19 P2 ligand of the present invention (particularly, P2L-1Ca) has extremely high binding ability and neutralizes the arachidonic acid metabolite releasing activity of the 19P2 ligand. Can be done. Therefore, when there are abnormalities in the pituitary function regulating action (eg, prolactin secretion action), central nervous regulation action, and function regulation action considered to be possessed by the 19P2 ligand, diagnostic and prophylactic agents for various diseases when abnormalities are present. It can be used for medicines and therapeutics.
  • the pituitary function regulating action eg, prolactin secretion action
  • central nervous regulation action e.g, central nervous regulation action
  • function regulation action considered to be possessed by the 19P2 ligand
  • diagnostic and prophylactic agents for various diseases when abnormalities are present can be used for medicines and therapeutics.
  • the 19P2 ligand or a 19P2 ligand or the like was obtained by an immunoassay using a sandwich method using the monoclonal antibody of the present invention (particularly, a sandwich method using the monoclonal antibody and an antibody recognizing an intermediate portion of the 19P2 ligand).
  • the derivative can be quantified with high sensitivity and specificity. This quantification method can be used to elucidate the physiological function of 19 P 2 ligand or its derivative

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Description

明 細 書 抗体およびその用途 謹分野
本発明は、 19 P 2リガンドまたはその誘導体に結合特異性を有する新規なモノクロ一ナ ル抗体に関する。 更に詳しくは、 腿抗体反応に基づく 19P 2リガンドまたはその誘導体 の定量法の開発、 および、 中和活性を利用して 19P 2リガンドまたはその誘導体が関与す る疾患の診断あるいは予防 .治麵の開発に有用な抗体に関する。 背景腿
19P2リガンドは、 ォーファン G蛋白質共役型レセプ夕一（19P2)に対するリガンド として見出された新規ペプチドであり、 脳 （特に視床下部） に最も多く存在し、 またそのレ セプタ一である 19P 2が丁垂体に最も多く局 ¾Efることから、 新規の視床下部ホルモン （ 向下垂体性ホルモン） の一つであると考えられている。 また、 19P2リガンドは、 その配 列から （1) 31 残基よりなる 19P2- L31 (31個のアミノ酸からなるペプチド） と、
(2) 12番目の Thrより始まる 19P2-L20 (20個のアミノ酸からなるペプチド） の 存在が推測されている （WO 97/24436) 。
〔以下、 31個のアミノ酸からなる 19P2リガンドを、 19P2リガンド （1— 31) 、 または、 19?2— 31と呼び、 20個のアミノ酸からなる 19P 2リガンドを、 19P 2リガンド （12— 31) 、 または、 19P2-L20と呼ぶ場合もある。 〕
ゥシ、 ヒトおよびラットの 19 P 2リガンド （1— 31) のアミノ酸配列を以下に示す。
〔ゥシ 19P2リガンド （1— 31) 〕 （配列番号： 1)
H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp- Tyr-Al a- G 1 y-Arg-G 1 y- 11 e-Arg-Pro-Va 1 -G 1 y- Ar g- Phe - NH2
〔ヒト 19P2リガンド （1一 31) 〕 （配列番号： 2) H-Ser- Arg-Thr- His-Arg- His- Ser-Met-Glu- lie- Arg- Thr-Pro-Asp- lie- Asn- Pro- Ala- Trp - Tyr-Al a-Ser-Arg-G ly-Il e-Arg-P ro-Val-Gl y-Arg-Phe-NH2
〔ラット 19P2リガンド （1— 31) 〕 （配列番号： 3)
H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Thr-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp- Tyr-Thr-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2
ゥシ、 ヒトおよびラットの 19 P 2リガンド （12— 31) のアミノ酸配列を以下に示す
〔ゥシ 19 P 2リガンド （12— 31) 〕 （配列番号： 12)
H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2
〔ヒト 19P2リガンド （12— 31) 〕 （配列番号： 5)
H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2
〔ラット 19 P 2リガンド （12— 31) 〕 （配列番号： 13)
H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Thr-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2
下垂体ホルモンの調節因子である視床下部ホルモンの異常は様々な病態と関連している。 視床下部ホルモンの一つと考えられる 19 P 2リガンドは、 下垂体ホルモンが関与する何ら 力 ^作用を有すると考えられるが、 その生理機能についてはまだ未解明な部分が多い。 従つ て、 19 P 2リガンドの生理作用を解明するために、 19 P 2リガンドを簡便かつ高感度に 検出 ·定量する測定系が切望されていた。 発明の開示
本発明は、 19 P 2リガンドまたはその誘導体を感度よく特異的に定量することができる モノクローナル抗体、 および該抗体を用いる 19 P 2リガンドまたはその誘導体の検出 ·定 量法を提供することを目的とする。 本発明者らは、 上記課題を解決するために貌意研究を重ねた結果、 19P2リガンドまた はその誘導体の異なる部分を特異的に認識する複数のモノクローナル抗体を作製し、 これら 抗体を用いることにより 19 P 2リガンドまたはその誘導体の高感度の優れた検出 ·定量法 を開発した。 さらに研究を行った結果、 本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明は、 19P 2リガンドまたはその誘導体の C端側の部分ペプチドに特異的に 反 る抗体 （好ましくは、 モノクローナル抗体） 、 19 P2リガンドまたはその誘導体の 中心部分の部分ペプチドに特異的に反 る抗体 （好ましくは、 モノクローナル抗体） 、 該 モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞、 該抗体およびハイプリドーマ細胞の製 造法、 該抗体を用いた競合法あるいはサンドィツチ法による 19 P 2リガンドおよびその誘 導体の免疫測定法などに関する。
さらに詳しくは、 本発明者らは 〔Cys 17〕 19P2リガンド （17— 31) および〔Cys 2 5〕 19P2リガンド （12— 25) を免疫原として、 モノクローナル抗体を複数作製し、 これらを組み合わせることにより、 19 P 2リガンドまたはその誘導体を高感度にかつ特異 的に検出し得る免疫測定法を開発した。 即ち、 ゥシチログロブリン （BTG) と 〔Cys 17〕 1 9 P 2リガンド （17— 31) および 〔Cys 25〕 19P2リガンド （12— 25) との複合体 を 原として 19 P 2リガンド （1— 31) またはその誘導体の C端部および中間部を認 識するモノク口一ナル抗体、 例えば？ 2L- 1 C aおよび P 2L- IT を確立した。 これ らの抗体は、 西洋ヮサビバーオキシダ一ゼ（醫）標識化した CCys 17〕 19P2リガンド （ 17-31) および〔Cys 25〕 19 P 2リガンド （12— 25) を用いる競合法免疫測定法 では、 この 1種類のモノクロ一ナル抗体を組み合わせることにより、 19P2- L31およ び 19 P 2- L 20に対して極めて高感度なサンドィツチ-免疫測定法を与えることが明かと なった。 本発明により、 19P 2リガンドを簡便に力つ高感度に測 ¾fることが^ T能となり 、 生体成分中の 19P2リガンドの変動をモニタ一することによりその生理機能の解明に大 いに粒つものと思われる。
即ち、 本発明は、
(1) 19P2リガンドまたはその誘導体の C端側の部分ペプチドに特異的に反応するモノ クロ一ナル抗体、
(2) マウス I gGである上記 (1) 記載のモノクローナル抗体、
(3) ?2 —1じ&または？2し_2〇&で標示される上記 (2) 記載のモノクローナル 抗体、
(4) 19 P 2リガンドまたはその誘導体の中間部分べプチドに特異的に反 Ιίするモノク口 —ナル抗体、
(5) マウス I gGである上記 (4) 記載のモノクローナル抗体、
(6) P2L— ITaで標示される上記 (5) 記載のモノクローナル抗体、
(7) 上記 (1) または上記 （4) 記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする被 検液中の 19 P 2リガンドまたはその誘導体の定量法、
(8) 上記 (1) 記載の抗体と上記 （4) 記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴と する被検液中の 19 P 2リガンドまたはその誘導体の定量法、 および、
(9) 上記 (1) または上記 (4) 記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細 胞などに関する。
さらに、 本発明は、
(10) 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識することを特徴 とする 19 P 2リガンドまたはその誘導体の C端側の部分べプチドに特異的に反 ること を特徴とするモノク口一ナル抗体、
(11) 配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識することを特 徴とする 19 P 2リガンドまたはその誘導体の中間部分ペプチドに特異的に反応することを 特徴とするモノク口一ナル抗体、
(12) 上記 (10) または上記 (11) 記載の抗体を用いることを特徴とする被検液中の 19 P 2リガンドまたはその誘導体の定量法、
(13) 上記 (11) 記載の抗体と、 上記 (10) 記載の抗体を用いることを特徴とする被 検液中の 19 P 2リガンドまたはその誘導体の定量法、
(14) 高プロラクチン血症の診断に用いられる上記 （12) または （13) 記載の定量法 などに関する。
上記 (1) 記載のモノクローナル抗体の好ましい態様としては、
(0 19 P 2リガンドカ 歹 IJ番号： 1、 酉己歹 IJ番号： 2、 酉己歹 IJ番号： 3、 配歹 ϋ番号 5または酉己 列番号： 12で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである上記 （10) 記載のモノクロ —ナル抗体、
(ii) 19 P 2リガンドの誘導体力 ¾1己列番号： 7で表されるアミノ酸配列を有するぺプチ ド、 d«己列番号： 1、 配列番号： 2または配列番号： 3で表されるアミノ酸配列の第 18番 目〜 31番目のアミノ酸配列を有するペプチドであって C端がアミドであるペプチド、 @|己 列番号： 5または配列番号： 12で表されるアミノ酸配列の第 8番目〜 20番目のアミノ酸 配列を有するぺプチドまたは④配列番号： 1〜酉己列番号： 7、 配列番号： 10または 11で 表されるアミノ酸配列の C の 9残基のアミノ酸配列を有するペプチドである第 （10) 記載のモノクローナル抗体、
(iii) 19 P 2リガンドまたはその誘導体の C端側の部分べプチドが、 19 P 2リガンドの N端のアミノ酸から数えて 20番目以降のアミノ酸配列を有する部分ペプチドである上記 ( 10) 記載のモノクロ一ナル抗体、
(iv) 抗体が己列番号： 9で表される (：*¾がカルボン酸となったアミノ酸配列を有する部 分ペプチドを認識しないことを特徴とする上記 (10) 記載のモノクローナル抗体、
(v)抗体が己列番号： 7で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識するが、配列 番号： 8で表されるアミノ酸配列を認識しないことを特徴とする上記 (10) 記載のモノク 口一ナル抗体、
(vi) 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を る部分ペプチドを認識するが、 配列番号 ： 10で表される C末端の Pheが欠けたアミノ酸配列を有するペプチドを認識しないことを 特徴とする上記 （10) 記載のモノクロ一ナル抗体、
(vii) ?2 _1じ&または？2 一2じ&で標示される上記（10)記載のモノクローナ ル抗体、
(viii) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 5および ffi列番号： 12 で表されるアミノ酸配列を^"るペプチドに対して中和活性を #fる上記 (10) 記載のモ ノクローナル抗体などがあげられる。
上記 (4) 記載のモノクローナル抗体の好ましい態様としては、
(i) 19 P 2リガンドカ 己列番号： 1、 配列番号： 2、 酉己列番号： 3、 配列番号： 5または 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである上記 （11) 記載のモノク 口一ナル抗体、
(ii) 19P2リガンドの誘導体力 ¾¾Ξ列番号： 1で表されるアミノ酸配列の第 12番目〜 24番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 ®S己列番号： 2で表されるアミノ酸配列の第 1 2番目〜 24番目のアミノ酸配列を有するペプチドまたは @g己列番号： 3で表されるァミノ 酸配列の第 12番目〜 24番目のアミノ酸配列を有するペプチドである上記 (11) 記載の モノクローナル抗体、
(iii)配列番号： 4または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを認識し ない上記 （11) 言己載のモノクローナル抗体、
(iv) P2L— IT aまたは P 2 L— 3 T aで標示される上記 （11) 記載のモノクロ一ナ ル抗体などがあげられる。
また、 好ましいハイプリドーマ細胞として、
(i)上記（10) または（11)記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞 などがあげられる。
上記 （12) 記載の定量法の好ましい態様としては、
(0上記（10) または上記 （11)記載のモノクローナル抗体と、 被検液およ 識化 1 9 P 2リガンドまたはその誘導体とを競合的に反応させ、 言娥体に結合した標謝匕 19 P 2 リガンドまたはその誘導体の割合を測定することを特徴とする被検液中の 19 P 2リガンド またはその誘導体の定量法などがあげられる。
上記 （13) 記載の定量法の好ましい態様としては、
(i)担体上に不溶化した 19 P 2リガンドまたはその誘導体に対する抗体、標識化された 1 9 P 2リガンドまたはその誘導体に対する抗体およ «検液を反応させた後、 不溶化担体上 の標 の活性を測定することを特徴とし、 担体上に不溶化した 19 P 2リガンドまたはそ の誘導体に対する抗体およ 識化された 19 P 2リガンドまたはその誘導体に対する抗体 の一方が上記 （10) 記載のモノクローナル抗体であり、 他方が上記 （11) 記載のモノク 口一ナル抗体であることを特徴とする被検液中の 19 P 2リガンドまたはその誘導体の定量 法、
(i i) 上記 （ 11 ) 記載のモノク口一ナル抗体が P 2 L _ 1 T aまたは P 2 L— 3 T aで標 示されるモノクローナル抗体である上記 (0記載の定量法、
(iii) 担体上に不溶化した 19P2リガンドに対する抗体および標識化された 19P2リ ガンドに対する抗体の一方が P 2 L— 1 C aまたは P 2L-2C aで標示されるモノク口一 ナル抗体であり、 他方が？ 2L- ITaまたは P 2 L— 3 T aで標示されるモノク口一ナル 抗体である上記 (i) 記載の定量法、
(iv) 担体上に不溶化した 19 P 2リガンドに対する抗体およ 識化された 19 P 2リガ ンドに対する抗体の一方が P 2 L— 1 C aで標示されるモノク口一ナル抗体であり、 他方が P2L_2Ca、 P 2 L_ IT aまたは P 2 L— 3 T aで標示されるモノクローナル抗体で あり、 19 P 2リガンドまたはその誘導体が己列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有する ペプチド、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、 配列番号： 3で表され るアミノ酸配列を有するペプチド、 およびほたは） 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列 を有するペプチドである上記 (0記載の定量法、
(V) 担体上に不溶化した 19Ρ2リガンドに対する抗体および標識ィ匕された 19Ρ2リガ ンドに対する抗体の一方が P 2L-2C aで標示されるモノクローナル抗体であり、 他方が P2L_lCa、 P2L— IT aまたは P 2 L— 3 T aで標示されるモノクローナル抗体で あり、 19 P 2リガンドまたはその誘導体が己列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有する ペプチド、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、 配列番号： 3で表され るアミノ酸配列を有するペプチド、 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を有するぺプチ ドおよび（または） 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである上記 (i ) 記載の定量法、 (vi) 担体上に不溶化した 19 P 2リガンドに対する抗体およ ^識化された 19 P 2リガ ンドに対する抗体の一方が P 2 L— 1 T aで標示されるモノクローナル抗体であり、 他方が P2L— 1C aまたは P 2 L— 2 C aで標示されるモノクローナル抗体であり、 19P2リ ガンドまたはその誘導体が己列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、 配列番 号： 2で表されるアミノ酸配列を有するぺプチド、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を るペプチド、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を るペプチドおよび（または） 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を ¾ るペプチドである上記 (i)記載の定量法など があげられる。
本発明における 19P 2リガンドとしては、 アミノ酸 31¾Sからなる 19P2リガンド (1-31) とアミノ酸 20残基からなる 19P 2リガンド （12— 31) がある。 例えば 、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するゥシ 19P 2リガンド （1— 31) 、 配列 番号： 2で表されるアミノ酸配列を るヒト 19 P 2リガンド （1— 31) 、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を有するラット 19 P 2リガンド （1— 31) 、 配列番号： 5で 表されるアミノ酸配列を有するラット 19P2リガンド （12— 31) または配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列を有するゥシ 19 P 2リガンド （12— 31) などが用いられる 本発明における 19 P 2リガンドの誘導体としては、 例えば、 上記 19 P 2リガンドの N 端部のアミノ酸がそれぞれ 16ないし 17残難度欠落したもの、 C端部のアミノ酸が 1残 基欠落したもの、 L—グリシンを D—ァラニンに置換したもの、 C アミドをカルボン酸 に変換したもの、 C端側に L—グリシンと L—アルギニンを付加したもの、 L一システィン を付加したもの、 N端部にァセチル基を有するものなどが用いられる。 具体的には、 ① 19 P2-L31のアミノ酸配列から第 1番目〜 16番目のアミノ酸配列が欠如した配列番号： 4で表されるペプチド、 （ϋ己列番号： 4で表されるペプチドの Ν*¾にァセチル基が付加し た配列番号： 6で表されるペプチド、 ③ 19Ρ2— L31のアミノ酸配列の第 29番目のグ リシンが D-ァラニンに変換した Η- Ser- Arg- Thr- His- Arg- His-Ser- Met- Glu- lie- Arg- Thr- Pro-Asp-I 1 e-Asn-Pro-Al a-Trp-Tyr-Al a-Ser-Arg-Gly-I 1 e-Arg-Pro-Val-D-Al a-Arg-Phe-NH2 で表されるペプチド、 ®19P2-L31の C端側に L一グリシンと L—アルギニンを付カロ した配列番号： 8で表されるペプチド、 ⑤ 19 P 2— L 31のアミノ酸配列の C アミド をカルボン酸に変換した配列番号： 9で表されるぺプチド、 ⑥ 19P2— L31のアミノ酸 配列の第 31番目の P heが欠如した配列番号： 10で表されるペプチドなどが用いられる 0
これらの 19 P 2リガンドまたはその誘導体は、 （a) 例えばヒト、 サル、 ラット、 マウ スなどの哺乳動物から自体^の方法で調製することもできるし、 （b) ペプチド ·シンセ サイザ一等を使用する自体^ Πのべプチド合成方法で化学的に合成することもできる。
本発明における 19 P 2リガンドまたはその誘導体の C端側の部分ペプチドとしては、 配 列番号： 7で表されるァミノ酸配列の第 18番目〜 31番目のァミノ酸配列を有するぺプチ ドであって、 その N端にシスティンが付加したぺプチドカ挙げられる。
本発明における 19 P 2リガンドまたはその誘導体の C端側の部分ペプチドに特異的に反 Ιίする抗体 （好ましくは、 モノクローナル抗体） としては、 例えば 19Ρ2リガンドまたは その誘導体を認識する抗体などが用いられる。
より具体的には、 これらの抗体の中でも、
( i ) 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を有する部分べプチド （即ち、 19 P 2リガン ド （1 8—31) ) を認識するが、 配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を有する部分べ プチド （即ち、 19P2リガンド （12— 24) ) を認識しない抗体、
(i i) 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を有する部分べプチド （即ち、 19 P 2リガン ド （1 8— 31) ) を認識し、 配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を Tる部分べプチ ド （即ち、 19P2リガンド （12— 24) ) を認識する抗体が挙げられる。
上記 （i) 、 (ii) の抗体のなかでも、 マウス I gGであるもの、 さらには抗体のサブクラ スが κであるものが好ましく用いられる。
上記 （ i ) の抗体の中でも、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を るゥシ 19 P 2 リガンド （1— 31) 、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有するヒト 19P2リガン ド （1— 31) 、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を有するラット 19P2リガンド （ 1— 31) 、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を有するヒト 19 P 2リガンド （12— 31) および（または） 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を^るゥシ 19 P2リガ ンド （12— 31) を特異的に認識する抗体がより好ましく、 さらには H- Ser- Arg-Thr- His- Arg- His-Ser- Met- Glu- lie- Arg- Thr- Pro-Asp- Ile-Asn- Pro- Ala- Trp- Tyr- Ala-Ser- Arg - Gly-Ile-Arg-Pro-Val-D-Ala-Arg-Phe-NH2で表されるアミノ酸配列を有するヒト 19 P 2リ ガンド [D- A l a29] (1-31) を認識するが、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列 を るヒト 19P2リガンド （1— 30) 、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列を有す るゥシ 19 P 2リガンド （ 1 _ 31 ) - 0H、配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するゥ シ 19 P 2リガンド （1— 31) -G 1 y-A 1 a-OHを認識しない抗体が好ましい。
また、 上記 (ii) の抗体の中でも、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するゥシ 1 9 P 2リガンド （1— 31) 、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を るヒト 19 P 2 リガンド （1一 31) 、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を有するラット 19 P 2リガ ンド （1— 31) および（または） 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を有するヒト 19 P 2リガンド （12— 31) を特異的に認識する抗体が好ましく、 さらには配列番号： 10 で表されるアミノ酸配列を るヒト 19 P 2リガンド （1— 30) および 列番号： 8で 表されるアミノ酸配列を有するゥシ 19P2リガンド （1— 31) — Gl y— Al a- 0Hを 忍識する抗体が'好ましい。
上記 （ i ) の抗体の代表例としては、 P2L- 1 C aで標示されるモノク口一ナル抗体が あり、 上記 (ii) の抗体の代表例としては、 P 2 L— 2 C aで標示されるモノクロ一ナル抗 体が挙げられる。
次に、 本発明における 19 P 2リガンドまたはその誘導体の中心部の部分ペプチドに特異 的に反 るモノク口一ナル抗体としては、 例えば己列番号： 7で表されるアミノ酸配列を 有する部分ペプチドを認識せず、 配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を有する部分ぺプ チドを認識することを特徴とする 19 P 2リガンドまたはその誘導体に特異的に反 Ιίするモ ノクロ一ナル抗体などが用いられる。 これら抗体のなかでも、 配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列を有するゥシ 19 Ρ 2リガンド （1— 31) 、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配 列を； るヒト 19P2リガンド （1— 31) 、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を有 するラット 19P2リガンド （1— 31) 、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を る ヒト 19P2リガンド （12— 31) 、 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を るゥ シ 19P2リガンド （12— 31) 、 および（または） 配列番号： 13で表されるアミノ酸 配列を # "るラット 19 P 2リガンド （12— 31) を特に認識する抗体が好ましく、 配列 番号： 4または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列から第 1番目〜 16番目のアミノ酸配 列が欠如したアミノ酸配列を有するペプチドを認識しない抗体が好ましい。 なかでも、 マウ ス I gGであるもの、 さらには抗体のサブクラスが κであるものが好ましく用いられる。 具 体的には、 P2L— lTa、 P2L— 2Ta、 P 2 L— 3 T aまたは P 2 L— 4 T aで標示 されるモノクローナル抗体などが用いられる。 これらモノクローナル抗体のなかでも、 特に P2L-1 T aなどが好適である。
以下に、 本発明におけるモノクローナル抗体の ¾ の調製方法、 および該モノクローナル 抗体の製造方法について詳細に説明する。
(1) 擺の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、 例えば 19 P 2リガンドまたは その誘導体、 19P2リガンドと同一の抗原決定基を 1種あるいは 2種以上有する合成ぺプ チドなど何れのものも使用することができる （以下、 これらを単に 19 P 2リガンド と 称することもある） 。
該 19P2リガンドまたはその誘導体としては、 前述したものなどが用いられる。 これら 19 P 2リガンドまたはその誘導体は、 ( a ) 例えばヒト、 サル、 ラット、 マウスなどの哺 乳動物の繊または細胞から自体^ Πの方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製するこ ともできるし、 （b) ペプチド ·シンセサイザ一等を使用する自体公知のペプチド合成方法 で化学的に合成することもできる。 また、 （c) 該 19P 2リガンドまたはその誘導体は、 それをコードする DN Aを含有する形質転換体を培養することによつても i¾tすることがで きる。
(a) 靈乳動物の繊または細胞から調製する場合、 その繊または細胞をホモジナイ ズした後、 酸、 またはアルコールなどで抽出を行い、 該抽出液を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティーク口マトグラフ ィ一などのクロマ卜グラフィ一を組み合わせることにより精製 することができる。
(b) 化学的に合成する場合、 該合成ペプチドとしては、 例えば した天然より精製し た 1 9 P 2リガンド抗原と同一の構造を有するものや、 1 9 P 2リガンド （1— 3 1 ) など のアミノ酸配列において 3個以上、 好ましくは 6個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のァ ミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を 1種あるいは 2種以上含; るべプチド （以下 1 9 P 2 リガンド関連合成ペプチドと略す） などが用いられる。
( c ) DNAを含有する形質転換体を用いて該 1 9 P 2リガンドまたはその誘導体を製造 する場合、 そのリガンドまたはその誘導体をコードする DNAは、 公知のクローニング方法
〔例えば、 Molecular Cloning ( 2 nd ed. ； J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法など〕 に従って作成することができる。該クローニング方法とは 、 （ 1 ) 該ぺプチドのァミノ酸配列に基づきデザィンした D N Aプローブまたは D N Aブラ イマ一を用い、 c DNAライブラリーからハイブリダィゼーション法により該ペプチドをコ —ドする DN Aを含有する形質転換体を得る方法、 または （2 ) 該ペプチドのアミノ酸配列 に基づきデザインした DNAプライマーを用い、 P C R法により該ぺプチドをコ一ドする D NAを含 る形質転換体を得る方法などが挙げられる。
上記したように該¾¾ としてのペプチドは、 ( 1 ) 自体^ Πのペプチドの合成法に従って 、 または （2 ) 本発明のペプチドを含有するペプチドを適当なぺプチダーゼで切断すること によって製造することができる。
該ペプチドの合成法としては、 例えば固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ 、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを S¾tするこ とができる。 の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、 以下 ®(∑ Dに記載された 方 ¾ ^が挙げられる。
① M Bodanszkyおよび Mん 0ndet t i、 ペプチド シンセシス （Pept ide Synthes is), Interscience Publ ishers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、 ザペプチド（The Pept ide), Academic Press, New Y ork (1965年）
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶難出、 蒸留、 カラムクロマトグラフィー、 液 体ク口マトグラフィ一、 再結晶などを組み合わせて該ぺプチドを精製 ることができる 。 上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、 の方法によって適当な塩に変換 することができ、 逆に塩で得られた場合は、 の方法によって遊離体に変換することがで さる。
ペプチドのアミド体は、 アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることがで きる。 そのような樹脂としては例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズ ヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4 —メチルペンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチリレフェニルァセ トアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— ( 2 '， 4 ' -ジメトキシフエ二ルーヒド 口キシメチル） フエノキシ樹脂、 4一 （2 ' , 4 ' -ジメトキシフエ二ルー Fmoc アミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官 能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするペプチドの配列通りに、 自体公知の各種縮合 方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種 保護基を し、 目的のペプチドを取得する。 あるいはクロロトリチル樹脂、 ォキシム樹脂 、 4—ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、 部分的に保護したペプチドを取り出し、 更に常 套手段で保護基を!^し目的のぺプチドを得ることもできる。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、 ぺプチド合成に使用できる各種活性化試 薬を用いることができるが、特に、カルポジイミド類がよい。カルポジイミド類としては DCC 、 Ν, N' -ジィソプロピルカリレポジィミド、 Ν -ェチル - N' - (3-ジメチルァミノプロリリレ） カルボ ジイミドなどが挙げられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H0Bt、 HOOBtなど)とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、文偷酸無水物また は HOBtエステルあるいは HOOBtエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を 行ったのちに樹脂に添力 Ofることができる。 保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に 用いられる溶媒としては、 ぺプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から 選択されうる。 たとえば N, N—ジメチルホルムアミド、 N， N—ジメチルァセトアミド、 N—メチルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化炭 化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスル ホキシド類、 ピリジンなどの三級アミン類、 ジォキサン、 テ卜ラヒドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチルなど のエステル類あるいはこれらの ¾ϋの混合物などが用いられる。 反応 ^^はべプチド結合形 成反応に使用され得ることが知られている範囲から ffil択され、 通常約— 2 0°C〜約 5 0 °Cの範囲から ¾ 1択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常約 1 . 5ないし約 4倍過 剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合力坏十分な場合には保護基 の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。 反応 を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを 用いて未反応アミノ酸をァセチル化して、 後の反応に影響を及ぼさないようにすることがで きる。
原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 たとえば、 Z、 Boc、 ターシャリ一ペンチルォ キシカルボニル、 イソボルニルォキシカルボニル、 4—メトキシベンジルォキシカルボニル 、 C卜 Z、 Br- Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホル ミル、 2 _ニトロフエニルスルフエ二ル、 ジフエ二ルホスフイノチオイル、 Fmocなど力挙げ られる。 カルボキシル基の保護基としては、 たとえば アルキル基、 C 3— 8シクロアル キル基、 C 7— 1 4ァラルキル基の他、 2—ァダマンチル、 4 _ニトロベンジル、 4ーメトキ シベンジル、 4一クロ口ベンジル、 フエナシル基およびべンジルォキシカルポニルヒドラジ ド、 ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、 トリチルヒドラジドなどが挙げられる。 セリンおよびスレオニンの水酸基は、 たとえばエステル化またはエーテル化によって保護 することができる。 このエステルイ匕に適する基としては例えばァセチル基などの低級 (C ^ 6) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルボ二ル基、 エト キシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが挙げられる。 また、 エーテル化に適す る基としては、 たとえばベンジル基、 テトラヒドロビラ二ル基、 夕一シャリーブチル基など である。
チロシンのフエノール 水酸基の保護基としては、 たとえば Bzl、 Cl2-BzK 2—ニトロ ベンジル、 Br- Z、 夕一シャリーブチルなど力举げられる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 Tos、 4-メトキシ- 2, 3, 6-トリメチルベンゼ ンスルホニル、 DNP、 Bom, Bum, Boc、 Trt、 Fmocなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 たとえば対応する酸無水物、 アジド 、 活性エステル [アルコール （たとえば、 ペンタクロロフエノール、 2, 4， 5-トリクロ口フエ ノール、 2, 4-ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコール、 パラニトロフエノール、 H0 B 、 N-ヒドロキシスクシミド、 N-ヒドロキシフタリレイミド、 H0BO とのエステル] などが挙げ られる。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 たとえば対 るリン酸アミドが挙 げられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 たとえば Pd黒あるいは Pd炭素などの触媒の存在下 での水素気流中での接 元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロ メタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、 ジイソ プロピルェチリレアミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩 ¾M理、 また液体アンモニア中ナトリゥムによる還元なども挙げられる。 上記酸処理による脱離反応 は HISに一 2 0 °C〜4 0°Cの で行われるが、 酸処理においてはァニソール、 フエノール 、 チオアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスルフイド、 1, 4 -ブタンジ チオール、 1, 2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒス チジンのイミダゾ一ル保護基として用いられる 2, 4-ジニトロフエニル基はチォフエノール 処理により除去され、 トリブトファンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は上 記の 1， 2 -エタンジチオール、 1, 4 -ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護 に、 希水酸化ナトリウム、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならびにその保護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは の基あるいは の手段から M^Ci択しうる。 ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 まず、 力ルポキシル アミノ酸の α—力 ルポキシル基をアミド化した後、 アミノ¾»こペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該 ぺプチド鎖の の a—了ミノ基の保護基のみを除いたぺプチドと C のカルボキシル 基の保護基のみを除いたペプチド （またはアミノ酸） とを製造し、 この両ペプチドを上記し たような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合によ り得られた保護ペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を^ ¾し、 所望の粗 ペプチドを得ることができる。 この粗ペプチド 知の各種精製手段を駆使して精製し、 主 要画分を凍結乾燥することで所望のぺプチドのアミド体を得ることができる。
ぺプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基を所望の アルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ペプチドのアミド体と同様にして所望の ぺプチドのエステル体を得ることができる。
1 9 P 2リガンド抗原は、 «しゃすいため、 不溶化したものを直接免 することもでき る。 また、 該 1 9 Ρ 2リガンド抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫して もよい。 該担体およひ 体 （キャリア一） と 1 9 P 2リガンド抗原 ひ、プテン） との混合比 は、 担体に結合あるいは吸着させた 1 9 Ρ 2リガンド羅に対して抗体が ¾)率よくできれば 、 どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、 通常八プテン抗原に 対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテ ン 1に対し 0 . 1〜： L 0 0の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。 天然の高分子担体としては、 例えばゥシ、 ゥサギ、 ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや 例えばゥシ、 ゥサギなどの哺乳動物のチログロブリン、 例えばゥシ、 ゥサギ、 ヒト、 ヒッジ などの哺乳動物のヘモグロビン、 キーホールリンペットへモシァニンなどが用いられる。 合 成の高分子担体としては、 例えばポリアミノ酸類、 ポリスチレン類、 ポリアクリル類、 ポリ ビニル類、 ポリプロピレン類などの重合物または供重合物などの各種ラテツクスなどを用い ることができる。
また、 ハプテンとキャリア一の力プリングには、 種々の縮合剤を用いることができる。 例 えば、 チロシン、 ヒスチジン、 トリブトファンを架橋
ァゾニゥム化合物、 アミノ基同志を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物 、 トルエン一 2 , 4—ジイソシァネートなどのジイソシァネート化合物、 チオール基同志を 架橋する N, N' -o-フエ二レンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、 ァミノ基とチォ一 ル基を架 るマレイミド活性エステル化合物、 ァミノ基と力ルポキシル基とを架橋する力 ルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。 また、 アミノ基同志を架橋する際にも、 一 方のアミノ基にジチォピリジル基を衬る活性エステル試薬 （例えば、 S P D Pなど） を反 応させた ί¾ 元することによりチオール基を導入し、 他方のァミノ基にマレイミド活性エス テル試薬によりマレイミド基を導入後、 両者を反応させることもできる。
( 2 ) モノクローナル抗体の作製
1 9 P 2リガンド は、 fiifii動物に対して、 例えばn空内 ax、 静脈 ax， 皮下注射な どの投与方法によって、 抗体産生が T能な部位にそれ自 虫であるいは担体、 希釈剤と共 に投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完 全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は、 通常 2〜6週毎に 1回ずつ、 計 2〜 1 0回程度行われる。 温血動物としては、 例えばサル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス 、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリなどがあげられるが、 モノクローナル抗体作製にはマウ ス、 ラットなどが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体の作製に際しては、 1 9 P 2リガンド腿を免疫された 動物、 た とえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾臓またはリン ノ、 °節を採取し、 それらに含まれる抗体産: 細胞を骨 細胞と融合させることにより、 抗 1 9 P 2リガンドモノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。 血清中の 抗 1 9 P 2リガンド抗体価の測定は、 例えば後記の標識化 1 9 P 2リガンドと«清とを反 応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。 融合操作は既 知の方法、 例えばケ一ラーとミルスタインの方法 〔ネイチヤー （Nature) 、 2 5 6、 4 9 5 ( 1 9 7 5 ) 〕 に従い実施できる。 融合碰剤としては、 ポリエチレングリコール （P E G ) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは P E Gなどが用いられる。 骨墜細 胞としてはたとえば NS— 1、 P3U1、 SP2/0、 AP— 1などがあげられるが、 P 3 U1などが好ましく用いられる。 用いられる抗体産 細胞 （脾) 細胞） 数と骨紘細胞数との 好ましい比率は、 通常 1 ： 1-20： 1禾¾¾であり、 PEG (好ましくは PEG1000〜 PEG6000) が 10〜80%禾號の Μ¾で添加され、 通常 20〜40°C、 好ましくは 3 0〜37°Cで通常 1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施でき る。
抗 19 P 2リガンド抗体産生ハイプリド一マのスクリーニングには種々の方法が使用でき るが、 例えば 19 P 2リガンドあるいは 19 P 2リガンド関連合成ぺプタイドを直接あるい は担体とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイブリドーマ培養上清を添カロ し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞融合に用いられる細 胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを加え 、 固相に結合した抗 19 P 2リガンドモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリ ン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、 放射性物 質や酵素などで標識した 19 P 2リガンドを加え、 固相に結合した抗 19 P 2リガンドモノ クローナル抗体を検出する方法などがあげられる。 抗 19 P 2リガンドモノク口一ナル抗体 のスクリーニング、 育種は通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添 加して、 10〜20%牛胎児血清を含む動物細胞用培地 （例、 RPMI 1640) で行われ る。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗 19P2リガンド抗体価の測 定と同様にして測定できる。
抗 19P 2リガンドモノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクロ一ナル抗体の分離 精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール 法、 等電点 法 、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 DEAE) による劂兑着法、 纖' 去、 ゲルろ過法、 抗 原結合固相あるいはプロティン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを 採取し、 結合を讓させて抗体を得る特異的精製法など〕 に従って行われる。
また、 19 P 2リガンドの一部領域と反応する抗 19 P 2リガンド抗体を産生するハイブ リドーマおよび、 19 P 2リガンドとは反応するがその一部領域とは反応しない抗 19 P 2 リガンドモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマのスクリ一二ングはたとえばその一 部領域に相当するべプチドとハイプリドーマが 生する抗体との結合性を測^ ることによ り行うことができる。
以上のようにして得られる① P 2L- 1 C aで標示されるモノクローナル抗体、 ② P 2 L -3C aで標示されるモノク口一ナル抗体およ 1 B) 19 P 2リガンドまたはその誘導体の中 心部分の部分ペプチドに特異的に反 ίίすることを特徴とする抗体 P 2 L— 3 T aで標示され るモノクローナル抗体は、 それぞれ 19P2リガンドの C端側および中心部分の部分べプチ ドを特異的に認識することができるので、 被検波中の 19 P 2リガンドの定量、 特にサンド ィツチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
即ち、 本発明は、
(1) 本発明の 19P2リガンドまたはその誘導体に対する抗体と、 被検液おょ 識化 1 9 P 2リガンドまたはその誘導体とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化 19P2 リガンドまたはその誘導体の割合を測定することを特徴とする被検液中の 19 P 2リガンド またはその誘導体の定量法、
(2) 担体上に不溶化した 19P2リガンドまたはその誘導体に対する抗体、 標識化された 19P2リガンドまたはその誘導体に対する抗体およ «検液を反応させたのち、 不溶化担 体上の標請 の活性を測定することを特徴とする被検波中の 19 P 2リガンドまたはその誘 の定量法であって、 担体上に不溶化した 19 Ρ 2リガンドまたはその誘導体に対する抗 体およ «識化された 19 Ρ 2リガンドまたはその誘導体に対する抗体の一方が 19 Ρ 2リ ガンドまたはその誘導体の C端側の部分べプチドに特異的に反応することを特徴とする抗体 であり、 他方が己列番号： 11で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド （即ち 19P 2リガンド （12— 24) ) などの 19Ρ2リガンドまたはその誘導体の中間部分を認識す る抗体である定量法などを提供する。
より具体的には、 19 Ρ 2リガンドまたはその誘導体の C端側の部分べプチドに特異的に 反 "ることを特徴とする抗体が P 2L- 1 Caまたは P 2 L— 2 C aで標示されるモノク 口一ナル抗体であり、 配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド （即ち 、 19 P 2リガンド （12— 24) ) などの 19 P 2リガンドまたはその誘導体の中間部分 を認識する抗体が P 2 L _ 1 T aまたは？ 2 L— 3 T aで標示されるモノク口一ナル抗体で ある。
上記の定量法 (2) の中でも、 特に、
体上に不溶化した 19 Ρ 2リガンドに対する抗体およ 識化された 19 P 2リガンド またはその誘導体に対する抗体の一方が P 2L-1C aで標示されるモノクローナル抗体で あり、 他方が P 2 L— 1 T aまたは P 2 L-3T aで標示されるモノク口一ナル抗体であり 、 19 P 2リガンドが ¾己列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 5または配 列番号： 12で表されるアミノ酸配列を有するぺプチドである定量法、
(¾旦体上に不溶化した 19P2リガンドに対する抗体およ «識化された 19P2リガンド またはその誘導体に対する抗体の一方が P 2L-2C aで標示されるモノク口一ナル抗体で あり、 他方が P 2L- ITaまたは？ 2L-3T aで標示されるモノク口一ナル抗体であり 、 19P2リガンドカ ¾己列番号： 1、 酉己列番号： 2、 配列番号： 3、 酉己列番号： 5または酉己 列番号： 12で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである定量法などが好適である。 以下に本発明の 19 P 2リガンドまたはその誘導体 （以下、 19 P 2リガンドと略称する ) の定量法 （免疫測定法） について、 より詳細に説明する。
本発明の抗体は 19 P 2リガンドを認識することができるので、 19 P 2リガンドの測定 あるいは§哉染色などによる検出を行なうことができる。 これらの目的には、 抗体 ^の ものを用いてもよく、 また抗体分子の F (ab') 2、 Fab'あるいは Fab画分などを用 いてもよい。 本発明の抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなぐ 被測定液 中の舰量 （例えば、 19P2リガンド量） に対応した抗体、 舰もしくは抗体—腿複合 体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の i) を含む標準液を用いて 作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法、 サンドイッチ法など力好適に用いられるが 、 感度、 特異性の点で後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 放射性同位元素、 酵素、 蛍光物質 、 発光物質などが用いられる。 放射性同 素としては、 例えば 1 2 5 I、 1 3 1 I、 3H、 1 4 Cなどが、 上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば /3—ガラクト シダ一ゼ、 j3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸 脱水素酵素などが、 蛍光物質としては、 例えばフルォレスカミン、 フルォレツセンイソチォ シァネートなどが、 発光物質としては、 例えばルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリ ン、 ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。 さらに、 抗体あるレゝは 1 9 P 2リガンドと標識 剤との結合にピオチン一アビジン系を用いることもできる。
あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常蛋白質あるい は酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。 担体として は、 例えばァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不溶性多糖類、 例えばポリスチレ ン、 ポリアクリルアミド、 シリコンなどの合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。 サンドィツチ法においては、 不溶化した抗 1 9 P 2リガンド抗体に被検液を反応 ( 1次反 応） させ、 さらに標識化抗 1 9 P 2リガンド抗体を反応 （2次反応） させた後、 不溶化担体 上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の 1 9 P 2リガンド量を定量することがで きる。 1次反応と 2次反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。 標識 化剤およ 溶ィ匕の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドィツチ法によ る免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類 である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いても よい。
本発明のサンドィツチ法による 1 9 P 2リガンドの測定法においては、 1次反応と 2次反 応に用いられる抗 1 9 P 2リガンド抗体とは 1 9 P 2リガンドの該抗体と結合する部位カ湘 異なる抗体が好ましく用いられる。 即ち、 例えば 1次反応で用いられる抗体が 1 9 P 2リガ ンドの C端側の部分ペプチドを認識する場合は、 2次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端側の部分ペプチド以外 （即ち、 N端側または中間部の部分ペプチド） を認識する抗体が 用いられる。
具体的に、 本発明のサンドイッチ免疫測定法に用いられる 1 9 P 2リガンドの C端側の部 分べプチドに特異的に反 JiTTるモノク口一ナル抗体としては、 [Cys17] ヒ卜 19 P 2リガン ド （17— 31) を免觸として作製したモノクローナル抗体が用いられる。 本発明者らは 、 このような抗体を産生するハイブリド一マを 8種赚立した。 中でもハイブリド一マ P 2 L一 1 Cが 生する抗体は、 鍵するパ一ォキシダ一ゼ標識化 19 P 2リガンド （17— 3 1) を用いる競合法の酵素免疫測定法において、 ヒト、 ゥシおよびラット 19P 2リガンド (1— 31) と反応した （ΒΖΒ0 = 0· 5を与える ¾¾f髓： 3 ηΜ、 1. 1 ng/well ) 。 さらに、 する [Cys 25] 19P2リガンド （12— 25) を免疫原として作製した 19P2リガンドの中間部の部分ペプチドを認識するモノクローナル抗体のうち、 特に P 2 L一 1 T aと組み合わせたサンドィツチ法に用いた場合、 予想外にも 19 P 2リガンドをよ り高感度に測定できること力明らかとなった （検出感度、 0. 1 ί mo 1 /well) 。 即ち、 本発明のサンドィツチ法酵素免疫測定法に適した 19 P 2リガンドの C端側の部分べプチド に特異的に反応するモノク口一ナル抗体は、 必ずしも 19 P 2リガンド （1— 31) に対し て高親和性である必要はない。 このような抗体として、 例えば、 ？2 ー1丁&などが好都 合に用いられる。
一方、 本発明のサンドィツチ免疫測定法に用いられる 19 P 2リガンドの中間部の部分べ プチドを認識するモノク口一ナル抗体としては、 [Cys 25] 19 P 2リガンド （12— 25 ) を^^として作製した抗体が好適に用いられる。 本発明者らは、 これらの抗体を産生す るハイプリドーマを 12種類作製した （表 2 ) 。 これらの抗体の 19 P 2リガンド （12— 25 ) に対する反応性を ί¾Βするバーオキシダ一ゼ標識化 19 Ρ 2リガンド （12— 25) を用いる競合法により調べたところ、 4種類の抗体が 19Ρ 2リガンド （12— 25) に良 好な反応' 14を有していた （ΒΖΒ0 = 0. 5を与える ii i :：！〜 4 nM、 0. 9〜1. 6 ng/well) 、 P 2 L— 1 T aと P 2 L— 3 T aが 19 P 2リガンド （1— 31) に良好 な反応性を有していた。 そのなかでも特に P 2L- 1 T aが極めて高感度のサンドィツチ— 測定法を与えることが明らかとなった。 また、 P 2 L— 1 T aは 19 P 2リガンド （12— 31) とも同程度の反応性を示した。 即ち、 本発明において、 サンドイッチ法に適した 19 P 2リガンドの中間部の部分ペプチドを認識する抗体として、 19P2リガンド （12— 2 4) に対する抗体を数種類提供するが、 特に P 2 L— I T aが好適に用いられる。
本発明のモノクローナル抗体は、 サンドイッチ法 の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法、 ネフロメトリ一などにも用いることもができる。 競合法では、 被検液 中の願と標識舰とを抗体に対して競合的に反応させたのち、 未反応の標識 (F) と 抗体と結合した標識 ί¾0 (B) とを分離し （BZF分離） 、 Bおよび Fいずれかの標識量を 測定し、 被検液中の fc 量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B/ F分離をポリエチレングリコ一ル、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法や、 第 1 抗体として固相化抗体を用いるかあるいは第 1抗体は可溶性のものを用い、 第 2抗体として 固相化抗体を用いる固相化法などが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の ί¾Ιと固相化 i¾¾とを一定量の標識化抗体に対して 競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは被検液中の舰と翻量の標識化抗体 とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と 液相を分 i る。 次に、 いずれかの相の標識量を測定し被検液中の疆量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で 抗体反応の結果生じた不溶性の 沈降物の量を測 ¾ る。 被検液中の 量が僅かであり、 少量の沈降物し力、得られない場合 にもレ一ザ一の散乱を利用するレーザーネフ口メトリ一などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の 設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術 的 ffi を加えて 1 9 P 2リガンドの測定系を構築すればよい。 これらの H¾的な 手段の 詳細については、 総説、 成書などを参照することができる [例えば、 入江 u 「ラジオィ ムノアツセィ] (講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 u 「続ラジオィムノアツセィ] (講 談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら 編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 rMethods in E ZYMOLOGY 」 Vol. 70 ( Immunochemical Techniques (Part A) ) 、 同書 Vol. 73 ( Immunochemical Techniques (Part B)) 、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part 0 ) 、 同書 Vol. 84 ( Immunochemical Techniques (Part D:Selected I腿漏 assays) ) 、 同書 Vol. 92 (
Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Ant ibodies and General Immunoassay
Methods)) 、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I :Hybridoma Technology and
Monoclonal Ant ibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行） など参照] 。 したがって、 本発明のサンドィツチ免疫測定法により 1 9 P 2リガンドの測定系を構築する場合、 その方 法は^ する実施例に されない。
以上のように、 本発明の抗体は、 1 9 P 2リガンドまたはその誘導体を感度良く定量する ことができるので、 1 9 P 2リガンドの生理機能の解明および 1 9 P 2リガンドの関与する 病態の診断等として有用である。
本発明の明細書において、 アミノ酸等を略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commision on
Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもので あり、 その例を下記する。 アミノ酸に関し^異性体があり得る場合は、 特に明示しなけれ ば' L—体を示すものとする。
PAM ：フエ二ルァセタミドメチル
B o c ： t—ブチルォキシカルボニル
Fmo c ： 9一フルォレニルメチルォキシカルポニル
C 1— Z ： 2—クロ口一ベンジルォキシカルポニル
B r - Z ： 2ーブロモーべンジルォキシカルボニル
B z 1 ：ベンジリレ
C 1 2- B z 1 ： 2， 6—ジクロロべンジル
O c H e X：シク口へキシルエステル
OB z 1 ：ベンジルエステル
T o s ： p—トルエンスルホニル
HONB： N—ヒドロキシー 5 _ノルポルネン _ 2、 3—ジカルボキシイミド
HOB t ： 1—ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル
HOOB t ： 3—ヒドロキシ一 3、 4—ジヒドロ一4—ォキソ一 1、 2、 3— ジン
MeBz 1 ： 4—メチリレベンジレ
B om ：ベンジルォキシメチル
Bum： ブトキシメチル
Tr t ： トリチル
DNP：ジニ卜口フエニル
TFA： 卜リフルォロ酢酸
DMF： N、 N—ジメチルフオルムアミド
DCM:ジクロロメタン
BHA：ベンズヒドリルァミン
pMBHA： p—メチルベンズヒドリルァミン
CHO：ホルミル
D I E A：ジィソプロピルェチルァミン
2Ac—ヒト 19P2リガンド： [AcPro , Tyr(Ac)20]ヒト 19 P 2リガンド （17— 31)
G 1 y ：グリシン
A 1 a ：ァラニン
Va 1 ：バリン
Leu ：ロイシン
I 1 e ：ィソロイシン
S e r ：セリン
Th r ：スレ才ニン
Cy s ：システィン
Me t ：メチォニン
G 1 u ：グルタミン酸
As ：ァスパラギン酸 Ly s
:リジン
Ar g ：アルギニン
H i s ：ヒスチジン
Phe ：フエニリレアラニン
Ty r ：チロシン
T r p ： トリブトファン
Pro ：プロリン
As n ：ァスパラギン
G 1 n ：グルタミン
本明細書において用いられる配列番号は、 以下のぺプチドのアミノ酸配列を表す。 〔配列番号： 1〕 ゥシ 19P2リガンド （1— 31)
H-Ser-Arg- Ala- His- Gin- His- Ser- Met- Glu-Ile-Arg-Thr- Pro-Asp- lie - Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2
〔配列番号： 2] ヒト 19P2リガンド （1— 31)
H-Ser-Arg-Thr-His-Arg-His-Ser-Met-Glu-lle-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-
Asn- Pro- Ala-Ίϊρ- Tyr- Ala- Ser- Arg- Gly- lie- Arg- Pro-Va卜 Gly- Arg- Phe- NH2
〔配列番号： 3〕 ラッ卜 19 P 2リガンド （1— 31)
H-Ser-Arg-Al a- Hi s- Gin- Hi s-Ser-Met-Glu-Thr-Arg-T r-Pro-Asp-11 e - Asn - Pro- Ala- Trp- Tyr- Thr- Gly- Arg- Gly- lie- Arg- Pro- Va卜 Gly- Arg- Phe- NH2
〔配列番号： 4) ヒト 19 P 2リガンド （17— 31)
H-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2
〔配列番号： 5〕 ヒト 19 P 2リガンド （ 12— 31)
H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro- Val-Gly-Arg-Phe-NH2
〔配列番号： 6) ヒト 19 P 2リガンド （17— 31) のジァセチル体
Ac-Pro-Ala-Trp-Tyr(Ac)-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号： 7〕 [Cy s 17] ヒト 19P2リガンド （17— 31)
H-Cys -A 1 a-Trp-Tyr-A 1 a-Ser-Arg-G ly-Il e-Arg-Pro-Va 1 _G 1 y-Arg-Phe-NH2
〔配列番号： 8〕 ゥシ 19P2リガンド （1— 31) G 1 y-Ar g-OH
H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro- Al a-Trp-Tyr-A 1 a-G 1 y-Arg-G ly-Il e-Arg-P r o-Va 1 -G 1 y-Arg-Phe-G 1 y-Arg-OH
〔配列番号： 9〕 ゥシ 19P2リガンド （1— 31) -OH
H-Ser- Arg-Ala- His-Gln- His-Ser- Met- Glu-Ile- Arg-Thr- Pro- Asp- lie - Asn-P ro-Al a-Trp-Tyr-A 1 a-G 1 y-Arg-G ly-Il e-Arg-P ro-Val-Gl y-Arg-Phe-OH
〔配列番号： 10〕 ヒト 19P2リガンド （1— 30)
H- Ser-Arg-Thr-His- Arg- His-Ser- Met- Glu- lie- Arg-Thr- Pro- Asp- I le- Asn-Pro- Ala- Trp- Tyr- Ala-Ser- Arg- Gly- Ile-Arg- Pro- Va卜 Gly- Arg- NH2
〔配列番号： 11〕 [Cy s25] ヒト 19P2リガンド （12— 25)
H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Cys-NH2
〔配列番号： 12〕 ゥシ 19P2リガンド （12—31)
H-Thr- Pro- Asp-Ile- Asn-Pro- Ala- Ίϊρ- Tyr- Ala- Gly_Arg- Gly-Ile- Arg-Pro- Val-Gly-Arg-Phe-NH2
〔配列番号： 13〕 ラット 19P2リガンド （12— 31)
H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Thr-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro- Val-Gly-Arg-Phe-NH2
の実施例で得られた抗 19 Ρ 2リガンド抗体を産生するハイプリドーマ細胞のうち、 P2L- 1Cおよび P2L— 1Tは平成 10年 3月 18日から通商産業省工業技術院生命ェ
Figure imgf000029_0001
(NIBH) に、 それぞ n¾下の受託番号で寄託されている。
ハイブリドーマ細胞 FERM-BP(NIBH)
P2L- 1 C 6299
P2L-1T 6300
なお、 各ハイプリドーマ細胞から得られる抗体については細胞名の後に aを付けた形で表 す。
以下に、 実験例を含む実施例を示し、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の 範囲を限定するものではない。
〔鍾例 1〕 観の作成
(1) 19P2リガンドの^ g
実験例 1 ゥシ 19P2リガンド （1— 31) の
1) Ser (Bzl)-Arg (Tos) -Al -Hi s (Bom) -Gln-Hi s (Bom) -Ser (Bzl)-Met-Glu (OcHex)-11 e- Arg (Tos) -Thr (Bzl) -Pro-As (OcHex) -11 e-Asn-Pro-Ala-Trp (CHO) -Tyr (Br-Z) -Al a-Gly- Arg(Tos) -Gly-Ile-Arg(Tos) -Pro-Val-Gly-Arg(Tos) -Phe-pMBHA-resin の合成。
市販の p—メチル B HA樹脂 （アプライド ノィオシテムズ、 現パ一キンエルマ一社製） 0.71g(0.5m mole)をべプチド合扁 （アプライド ノイオシテムズ觀 43 OA) の反]¾ に入れ、 ジクロロメタン（D CM)で させた後、 最初のァミノ酸 Boc-Pheを HOBt/DCC法 で活性化し P—メチル BH A樹脂に導入した。 樹脂を 50 TFAZDCMで処理し、 Boc 基を^ ¾してアミノ基を遊離させ、 ジイソプロピルェチルァミン (DIEA)で中和した。 この アミノ基に次のアミノ酸 Boc-Arg(Tos)を HOBt/DCC法で縮合した。 未反応アミノ基の有無 をニンヒドリンテストで調べ反応完了を確認後同様に、 Boc- Gly、 Boc-Val, Boc-Pro, Boc - Arg (Tos), Boc-Ile, Boc-Gly, Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Ala, Boc- Tyr (Br - Z)を順次縮合、 二 ンヒドリンテストで縮合力坏十分であると判明した Boc- Ala、 Boc- Tyr (Br-Z)は再縮合し反 応を完了した。 樹脂を乾燥して半量の樹脂を取り出した残りに、 Boc-Trp (CHO)、 Boc-Ala, Boc-Pro, Boc-Asn、 Boc-Ile, Boc-Asp (OcHex) , Boc-Pro, Boc- Thr (Bzl)、 Boc - Arg (Tos)、 Boc- II e> Boc- Glu (OcHex)、 Boc-Met、 Boc- Ser (Bzl)、 Boc-His (Bom), Boc-Gln, Boc-His (Bom), Boc-Ala, Boc- Arg (Tos), Boc-Ser (Bzl)を同様にニンヒドリンテストで十分な縮合が得られるまで再縮合を くり返した。 全配列アミノ酸が導入され樹脂を 50%トリフルォロ酢酸 (TFA)/DCMで処 理し樹脂上の Boc基を除去後、 樹脂を乾燥し 1. 8gのべプチド樹脂を合成した。
2) Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp- Ty r-A 1 a-G 1 y-Ar g-G 1 y- 11 e-Ar g-P r o-Va 1 -G 1 y-Ar g-Phe-NH,の合成。 1) で得た樹脂を p—クレゾール 3.8g、 1> 4 -ブタンジチオール 1 ml、 匕水素 10mlと共 にテフロン製 匕水素反応装置中で 0°C 60分間反応した。 弗ィ bTl素、 1、 4 -ブタンジチ オール 1 mlを赃留去し、 残留物にジェチルエーテル 100ml を加ぇ辦後、 グラスフィル 夕一上に濾取、 乾燥した。 これを 50%酢 溶液 50ml中に躕蜀、難し、 ペプチドを抽出 した後樹脂と分離し減圧下に約 5 mlまでに濃縮した後、 セフアデックス G-25 (2 x 90 c m) のカラムに付し 50酢酸水で展開し 114 ml〜181 mlの画分を集め凍結乾燥し、 白色粉末 290 mgを得た。 これを LiChroprep(RP-18 (MERCKネ ±¾) を充填した逆相系カラムに つけ 0.1¾ TFA7]Cと 0.1% TF A含有 3 0 %ァセトニ卜リル水溶液を用いたグラジェン ト溶出での精製をくり返し、 ァセトニトリル濃度 25 %前後に溶出される部分を集め凍結乾 燥し、 白色粉末 71 mgを得た。
質 *^析による （M+H) + 3574. 645 (計算値 3574. 847)
HPLC溶出時間 18. 2分
カラム条件
カラム： Wakosil 5C18 (4. 6 10 Omm)
溶離夜： A液 （0.1% TF A?K)
B液 （0.1% TF A含有 50%ァセトニトリル水） を用い
A液から B液へ直線型髓勾配溶出 （25分）
： 1.0 mlZ分 実験例 2 ヒト 19P2リガンド （1— 31) の i¾t
実験例 1と同様に p—メチル BHA樹脂に Boc- Phe、 Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Pro, Boc- Arg(Tos)、 Boc- Ile、 Boc- Gly、 Boc- Arg(Tos)、 Boc-Ser (Bzl), Boc-Ala> Boc-Tyr (Br- Z)、 Boc-Trp(CHO)、 Boc- Ala、 Boc-Pro , Boc-Asn、 Boc- lie、 Boc-As (OcHex)、 Boc-Pro、 Boc - Thr(Bzl)> Boc-Arg(Tos), Boc-Ile, Boc- Glu (OcHex) > Boc- Met、 Boc- Ser (Bzl)、 Boc- His (Bom)、 Boc-Arg (Tos) , Boc-Hi s (Bom) , Boc-Thr (Bz 1 ) , Boc-Arg (Tos) , Boc-Ser(Bzl)をニンヒドリンテス トで十分な縮合が得られるまで再縮合をくり返した。 全配列アミノ酸が導入され樹脂を 丁？八/0 ^1で処理し樹脂上の 基を 後、 樹脂を乾燥し所望のペプチド樹脂を合成 した。 この樹脂を実験例 1と同様の 匕水素処理の後、 やはり同様のクロマト精製で目的 のペプチドを得た。
質 *^析による （M+H) + 3662. 884 (計算値 3662. 905)
HPLC溶出時間 17. 2分
カラム条件
カラム： Wakosil 5C 18 (4. 6x100mm)
溶離夜： A液 （0.1% TFA7J0
B液 （0· 1% TF A含有 50%ァセトニトリル水） を用い
A液から B液へ直線型 勾配溶出 （25分）
1.0 mlZ分 実験例 3 ラット 19P2リガンド （1— 31) の S¾g
実験例 1の 1回目の Boc-Alaと 2回目の Boc- lieを Boc-Thr (Bzl)に変更して合成を進め、 全配列アミノ酸が導入され樹脂を 50%TFA/DCMで処理し樹脂上の Boc基を除去後、 樹 脂を乾燥し所望のペプチド樹脂を得た。 この樹脂を実験例 1と同様に処理、 精製し、 Ser- Arg-Al a- Hi s- Gin- Hi s-Ser-Met-Glu-Thr-Arg-Thr-Pro-Asp-11 e-Asn-Pro-Al a-Trp-Tyr-Thr- G 1 y-Ar g-G 1 y- 11 e-Ar -P r o-Va 1 -G 1 y-Ar g-Phe-NH2の、 白色粉末を得た。
質量分析による （M+H) + 3622. 547 (3622. 826)
HP LC溶出時間 17. 4分
カラム条件
カラム： Wakosil ( 5C18 (4. 6x10 Omm)
溶離夜： A液 （0. U TFA水）
B液 （0.1% TFA含有 50%ァセトニトリル水） を用い
A液から B液へ直線型 «勾配溶出 （ 25分）
&: 1.0 mlZ分 実験例 4 ヒト 19 P 2リガンド （17— 31) の^
実験例 2で Boc-Tyr (Br-Z)までを縮合した樹脂にさらに Boc- Trp (CHO)、 Boc- Al a、 Boc- Pro、 を同様に縮合し、 Boc- Pro- Al a-Trp (CHO) -Tyr (Br-Z) -Al a-Gly-Arg (Tos) -Gly-Il e-Arg (Tos) - Pro-Val-Gly-Arg(Tos) -Phe-pMBHA-resinを得た。 これを実験例 1の 2 ) と同様に 匕水素 処理、 カラム精製し、 白色粉末 70mgを得た。
質 ^·析による （Μ+Η) + 1731. 9 (計算値 1732. 0)
HP LC溶出時間 16. 1分
カラム条件
カラム： Wakosil 5C18 (4. 6x 100mm)
溶離夜： A液 (0.1¾ TFA水）
B液 （0.1% TF A含有 50%ァセトニトリル水） を用い
A液から B液へ直線型髓勾配溶出 （15分）
'顧： 1.0 ml/分 実験例 5 ヒト 19P2リガンド （12— 31) の $¾g
実験例 4で Boc-Proまでを縮合した樹脂にさらに Boc - Asn、 Boc-Ile, Boc-Asp(OcHex), Boc - Pro, Boc-Thr(Bzl)を同様に縮合し、 Boc-Th r (Bz 1 ) -Pro-As (OcHex) - 11 e-As n-P r o-A 1 a- Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Phe- pMBHA-resin を得た。 これを 験例 4と同様に 匕水素処理、 カラム精製し、 白色粉末 6 Omgを得た。
質量分析による （M+H) + 2272. 1260 (計算値 2272. 2100)
HPLC溶出時間 16. 8分
カラム条件
カラム： Wakosil 5C18 (4. 6 100mm)
溶離夜： A液 (0.1¾ TFA水） B液 （0.1% TF A含有 50%ァセトニトリル水） を用い
A液から B液へ直線型髓勾配溶出 （25分）
1.0 mlZ分 実験例 6 ヒ卜 19 P 2リガンド （17— 31) のジァセチル体の製造
実験例 4のィ匕合物 17. 5mgを 10%ピリジン水に溶解し、 無水酢酸 20 1と約 60 分反応後、 実験例 4と同様に精製し、 10. 7mgの粉末を得た。
質量分析による （M+H) + 1815. 8600 (計算値 1815. 9743) HPLC溶出時間 19. 7分
カラム条件
カラム： Wakosil 5C18 (4. 6x100mm)
溶離夜： A液 （0.1¾ 水）
B液 （0.1% TF A含有 50%ァセトニトリル水） を用い
A液から B液へ直線型?雛勾配溶出 （25分）
1.0 ml/分 実験例 7 [Cys17] ヒト 19P2リガンド （17— 31) の $¾t
実験例 4の樹脂にさらに Boc- Cys(MeBzl)縮合し、 これを同様に弗化水素処理、 カラム精製 し、 白色粉末 50 mgを得た。
質量分析による （M+H) + 1737. 9 (計算値 1737. 6)
HP LC溶出時間 17. 2分
カラム条件
カラム： Wakosil 5C18 (4. 6x100mm)
.： A液 （0.1¾ T FA含有水）
B液 （0.1% TF A含有 50%ァセトニトリル水） を用い
A液から B液へ直線型 勾配溶出 （25分） 磁： 1.0 ml,分 実験例 8 [D-Ala29] ヒト 19P2リガンド （1— 31) の^ t
実験例 2と同様に p—メチル BHA樹脂に Boc-Phe、 Boc-Arg(Tos)を順に導入した後、 Boc-Gly を Boc- D- Ala に代えて導入した。 以後実験例 2と同様に反応し、 Ser(Bzl) - Arg(Tos)-Thr (Bzl)-Hi s (Bom) -Arg(Tos) -His (Bom) -Ser (Bzl)-Met-Glu(OcHex) -I le-Arg(Tos) - Thr (Bz 1) -Pro-Asp (OcHex) -11 e-Asn-Pro-Ala-Trp (CHO) -Tyr (Br-Z) -Al a-Ser (Bzl)-Arg (Tos) - Gly-11 e-Arg (Tos) -Pr o-Va 1 -D-Al a-Arg (Tos) -Phe-pMBHA-r es i n を得た。 この樹脂を実験例 2 と同様に処理、 精製し、 Ser- Arg-Thr- His- Arg- His- Ser- Met- Glu- Ile-Arg- Thr- Pro-Asp-Ile- Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-D-Ala-Arg-Phe-NH2の白色粉末を 得た。
質量分析による （M+H) + 3678. 6 (計算値 3679. 2)
HP LC溶出時間 18. 5分
カラム条件
カラム： YMC— A—301— 3 ODS (4. 6x 10 Omm)
溶離夜： A液 （0.1% TFATK)
B液 （0.1% TF A含有 50%ァセトニトリル水） を用い
A液から B液へ直線型髓勾配溶出 （25分）
磁： 1.0 ml/分 実験例 9 ゥシ 19 P 2リガンド （ 1— 31 ) Gly-Arg-0Hの製造
市販 Boc-Arg(Tos)- 0CH2PAM樹脂（アプライド ノ ィオシテムズ、現パーキンエルマ—社製 ) 0.83g(0.5 m mole)をペプチド合 β¾ϋ (アプライド ノィオシテムズネ ±® 43 OA) の反応 器に入れ、 DCMで 王させた後、 50%TFA/DCMで処理し、 Boc基を駐してアミノ基 を遊離させ、 DIEAで中和した。 このアミノ基に次のアミノ酸 Boc-Glyを HOBt/DCC法で縮 合した。 以後実験例 1と同様の Bocアミノ酸を順次縮合し、 全アミノ酸配列を導入した樹脂 1. 21 gを得た。 この樹脂 0. 59 gを実験例 1と同様に処理、 精製して白色粉末 162 mgを得た。
質 析による （M+H) + 3789. 0105 (計算値 3788. 9477)
HP LC溶出時間 16. 4分
カラム条件
カラム： Wakosil 5C 18 (4. 6x100mm)
溶離夜： A液 （0.1¾ TFA含有水）
B液 （0.1% TF A含有 50%ァセトニトリル水） を用い
A液から B液へ直線型濃度勾配溶出 （ 25分）
¾§: 1.0 mlZ分 実験例 10 ゥシ 19P2リガンド （1— 31) - 0Hの S¾i
市販 Boc - Phe-OCH2PAM樹脂 （アプライド ノ ィオシテムズ、 現パーキンエルマ—社製） 0. 69 g(0.5 m mole)を用い実験例 9と同様に所望するアミノ酸配列通りに順次 Bocアミノ酸 を導入後、 処理精製を行い、 白色粉末を得た。
質量分析による （M+H) + 3575. 7451 (3575. 8254)
HP LC溶出時間 16. 6分
カラム条件
カラム： Wakosil 5C18 (4. 6 10 Omm)
溶離夜： A液 （0.1% TFA含有水）
B液 （0.1% TFA含有 50%ァセトニトリル水） を用い
A液から B液へ直線型髓勾配溶出 （25分）
1.0 mlZ分 実験例 11 ゥシ 19P2リガンド （1— 30) の^ t
実験例 2と同様に p_メチル B HA樹脂に、 Boc-Arg(Tos), Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Ile, Boc-Gly> Boc-Arg(Tos), Boc-Ser (Bzl), Boc-Ala, Boc-Tyr (Br - Z)、 Boc- Trp(CHO), Boc- Ala、 Boc-Pro, Boc-Asn, Boc-Ile, Boc-Asp(OcHex)> Boc-Pro, Boc-Thr (Bzl), Boc- Arg(Tos)、 Boc-Ile, Boc-Glu(OcHex) > Boc- Met、 Boc-Ser (Bzl) , Boc-His (Bom) , Boc-Arg(Tos) > Boc- His (Bom), Boc-Thr (Bzl)、 Boc-Arg(Tos)> Boc-Ser (Bzl)を順次縮合した後、同様に処理精製 白色粉末を得た。
質 * ^折による （M+H) + 3517. 4 (計算値 3518. 0)
HPLC溶出時間 17. 5分
カラム条件
カラム： YMC— A— 301— 3 ODS (4. 6x 10 Omm)
溶 ϋ夜： A液 (0.1¾ TFA7JO
B液 （0.1% TFA含有 50%ァセトニトリル水） を用い
A液から B液へ直線猶艇勾配溶出 （25分）
顧： 1.0 ml,分 実験例 12 [Cys 25] ヒト 19P2リガンド （12— 25) の i¾i
実験例 2 と同様に P—メチル BHA樹脂に、 Boc-Cys (MeBzl) , Boc-Gly, Boc-Arg(Tos) , Boc-Ser (Bzl) > Boc-Al a, Boc-Tyr (Br-Z) , Boc-Trp(CHO) > Boc-Ala, Boc-Pro, Boc - Asn' Boc-Ile, Boc-Asp(0cHex)、Boc- Pro、 Boc-Thr (Bzl),を順次縮合した後、同様に処理精製し、白色粉末を得 た。
質 * ^折による （M+H) + 1549. 5 (計算値 1549. 7)
HPLC溶出時間 15. 3分
カラム条件
カラム： Wakosi 5C 18 (4. 6 100mm)
溶離夜： A液 （0. \% TFA水）
B液 （0.1% TFA含有 50%ァセトニトリル水） を用い
A¾ ^ら B液へ直線型濃度勾配溶出 （25分） : 1.0 ml/分
実験例 13 ゥシ 19 P 2リガンド （ 12 _ 31 ) の |¾i
実験例 1で Boc-Tyr (Br-Z)までを縮合した樹脂にさらに Boc- Trp(CHO), Boc- Ala Boc-Pro, Boc-Asn Boc-Ile, Boc-Asp(OcHex), Boc-Pro, Boc-Thr(Bzl)を同様に縮合し、 Boc-Thr (Bzl)- Pro-As (OcHex) - 1 le-Asn- Pro- Al a-Tr (CHO) -Tyr (Br-Z) -Ala-Gly-Arg (Tos) -Gly-Ile- Arg (Tos) -Pro-Va 1 -Gly-Arg (Tos) -Phe-pMBHA-r es i n 1. 14gを得た。 これを実験例 1の 2) と同様に 匕水素処理、 カラム精製し、 白色粉末 60mgを得た。
質 析による （M+H) + 2242. 149 (計算値 2242. 200)
HP LC溶出時間 10. 4分
カラム条件
カラム： Wakosil 5C 18 (4. 6 10 Omm)
溶離夜： A液 （0. \% TF A含有 15 %ァセトニトリル水）
B液 （0.1% TF A含有 45%ァセトニトリル水） を用い
A液から B液へ直線型濃度勾配溶出 （15分）
1.0 ml/分
〔実施例 2〕 免 ¾ ^の作製
(1) 19P2リガンド（18— 31)を含む免 の作製 上記実施例 1 (実験例 7)で得られた [Cys 1 '] 19P2リガンド（17— 31)と牛チロ グロブリン （BTG) との複合体を作製し、 免麵とした。 即ち、 BTG20mgを、 0.
1Mリン 衝液（pH6. 5) 1. 4mlに溶解させ、 N— （ァ一マレイミドブチリロキシ
) サクシニミド（GMBS) 2. 2mg (8^mo 1) を含む DMF溶液 100 1と混合し
、 室温で 40分反応させた。 反応後、 セフアデックス G— 25カラムで分画したのち、 マレ イミド基の導入された BTG15mgと [Cys 7] 19 P 2リガンド（ 17— 31) 1. 6 mgとを混合し、 4°Cで 2日間反応させた。 反応後、 生理食塩水に対し、 4°Cで 2日間透析 した。
(2) 19P2リガンド（12— 25)を含む免 ¾ ^の作製 上記実施例 1 (実験例 12) で得られた [Cys 2 5] 19P2リガンド（12— 25)と B TGとの複合体を作製し、 免痴京とした。 即ち、 BTG21mgを 0. 1Mリン酸緩衝液 ( pH6. 5) 1. 4mlに溶解させ、 GMBS2. 35mg (8. 4 ΐηο 1) を含む DM
F溶液 100/ 1と混合し、 室温で 40分反応させた。 反応後、 セフアデックス G— 25力 ラムで分画したのち、 マレイミド基の導入された BTG15 mgと [Cys 2 5] 19P2 リガンド（12— 25) 3. 8 mgとを混合し、 4°Cで一晩反応させた。反応後、生理食塩 水に対し 4 °Cで 3日間透析した。
〔実施例 3〕 免疫
6〜 8週令の B A L B / C雌マウスに上記実施例 2記載の免疫原 [Cys 1 ' ] 19 P 2リガ ンド（17— 31)— BTG複合体および [Cys 2 5] 19 P 2リガンド（ 12— 25)— BT G複合体を、 それぞれ約 20 gZ匹を完全フロイントアジュバントとともに皮下免疫した
。 以後 3週間おきに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバントとともに 2〜 3回追加免 疫した。
〔実施例 4〕 酵素標識化 の作製
( 1 ) 西洋ヮサビバ一ォキシダ一ゼ （HR P) 標識化 19 P 2リガンド（ 17— 31 )の作製 上記実施例 1 (実験例 7 ) で得られた [Cys 1 7 ] 19 P 2リガンド（ 17— 31 )と HR P (酵素免疫測定法用、 ベ一リンガ一マンハイム社製） とを架橋し、 酵素免疫測定法 （E IA ) の標識体とした。 即ち、 HRP 6mg (15 Onmo 1) を 0. 95mlの 0. 1Mリ ン隱衝液、 pH6. 5に溶解させ、 GMBS0. 42mg (1. 5 ΓΠΟ 1) を含む DM F溶液 50 1と混合し、 室温で 30分間反応させたのち、 セフアデックス G— 25カラム で分画した。 このようにして作製した、 マレイミド基の導入された HRP 4. 2mg (10
5nmo 1) と実施例 1 (実験例 7)で作製された [Cys 1 7] 19 P 2リガンド（ 17— 31 )0. 55mg (315nmo 1) とを混合し、 4°Cで 1日反応させた。反応後ウルトロゲル Ac A 44 (LKB—フアルマシア社製） カラムで分画し、 HRP標識化 19 P 2リガンド（ 17-31)を得た。
(2) HRP標識化 19P2リガンド （12— 25) の作製 上記実施例 1 (実験例 12) で得られた [Cys 25] 19P2リガンド（12— 25)と HR Pとを架橋し、 EI Aの標識体とした。 即ち、 HRP6mg (15 Onmo 1) を 1. 4m
1の 0. 1Mリン隨衝液、 pH6. 5に溶解させ、 GMBS0. 42mg (1. δ^ηιο
1) を含む DMF溶液 100 1と混合し、 室温で 30分間反応させたのち、 セフアデック ス G— 25カラムで分画した。 このようにして作製した、 マレイミド基の導入された HRP 4. 2mg (105nmo 1) と実施例 1 (12) で作製された [Cys 2 u] 19P2リガン ド（12— 25) 0. 48mg (315 nmo 1) とを混合し、 4°Cで 1日反応させた。 反応 後ウルト口ゲル A c A 44力ラムで分画し、 HR P標識化 19 P 2リガンド（ 12— 25)を 得た。 〔実施例 5〕 抗体価の測定
(1) [Cys 1 7] 19P2リガンド（17— 31)— BTGを免疫したマウスの抗血清中の抗 体価の測定
[Cys 1 7] 19P2リガンド（17— 31)— BTGを免疫中のマウス抗血清中の抗体価を 同様の方法により測定した。 抗マウスィムノグロプリン抗体結合マイクロプレートを作製す るため、 ま ¾マウスィムノグロブリン抗体 （I gG画分、 カッペル觀） を 100 g/ ml含む 0. 1M炭 衝液、 pH9. 6溶液を 96ウェルマイク口プレートに 100 μ 1 ずつ分注し、 4°Cで 24時間放置した。 次に、 プレートをリン睡衝生理食塩水 （PBS、 pH7. 4) で洗浄したのち、 ゥエルの余剰の結合部位をふさぐため 25 %ブロックエース (雪印乳數製） を含む P B Sを 300 1ずつ分注し、 4°Cで少なくとも 24時間処理し た。
上記、 抗マウスィムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ゥエルにバッファー C [ 1%BSA、 0. 4M NaC l、 および 2mM EDTAを含む 0. 02Mリン薩衝液
、 H7. 0] 50μ 1、 バッファ一 Cで希釈したマウス抗 [Cys 1 7] 19P2リガンド（ 17-3 D-BTG脑清 100 m lを加え 4°Cで 16時間反応させた。 次に、 該プレートを
PBSで洗浄したのち、上記実施例 4 (1)で作製した HRP標識化 19P2リガンド（17 — 31) ひ、'ッファ一Cで 300倍 100 1を加え室温で 1日反応させた。次に、該 プレートを P B Sで洗浄したのち、 固相上の酵素活性を TM Bマイクロウエルパーォキシダ —ゼ基質システム （KIRKEGAARD&PERRY LAB, INC, フナコシ薬品取り扱い） 100 1をカロ え室温で 10分間反応させることにより測定した。 反応を 1Mリン酸 10 O 1を加え停止 させたのち、 450 nmの吸収をプレートリーダ一 (B I CHROMAT I C、 大日本製薬 観）で測定した。結果を 〔図 1〕 に示す。免疫した 8匹のマウス全てに 19P2リガンド（ 17-31)に対する抗体価の上昇が認められた。
(2) [Cys 2つ 19P 2リガンド（12— 25)— BTGを免疫したマウスの抗血清中の抗 体価の測定
[Cys ύ ] 19 P 2リガンド（ 12— 25 )— B T Gを免疫中のマウス馳清中の抗体価を同 様の方法により測定した。 バッファ一 Cで希釈したマウス抗 [Cys 2 5] 19P2リガンド（ 12-25)— BTG¾¾&清 100/i 1を加え 4 で 16時間反応させた。次に、該プレ一ト を PBSで洗浄したのち、 上記実施例 4 (2) で作製した HRP標識化 19P2リガンド（
12-25) (バッファ一 Cで 500倍希釈） 100 1を加え室温で 1日反応させた。次に
、 該プレートを PBSで洗浄したのち、 固相上の酵素活性を TMBマイクロウェルパ一ォキ シダ一ゼ基質システム （KIRKEGAARMPERRY LAB, INC, フナコシ薬品取り扱い） I O O I を加え室温で 10分間反応させることにより測定した。 反応を 1Mリン酸 100 1を加え 停止させたのち、 450 nmの吸収をプレートリ一ダ一 (B I CHROMAT I C、 大日本 製薬機） で測定した。 結果を 〔図 2〕 に示す。 免疫した 8匹のマウス全てに 19P 2リガ ンド（12— 25)に対する抗体価の上昇が認められた。 結果を 〔図 2〕 に示す。 免疫した 8 匹のマウスのうち 3匹に比較的高い抗体価が認められた。 〔実施例 6〕 モノク口一ナル抗 19 P 2リガンド抗体の作製
比較的高い抗体価を示したマウスに対して 200〜300 gの免颜を生理爐水 0. 25〜0. 3mlに溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。 最 終免疫 3〜4日後のマウスから脾臓を摘出し、 ステンレスメッシュで ffig、 ろ過し、 ィ一グ ルズ'ミニマム'エッセンシャルメディウム （MEM) に浮遊させ、 藤細胞浮遊液を得た 。 細胞融合に用いる細胞として、 BALBZCマウス由来ミエローマ細胞 P3— X 63. A g 8. Ul (P3U1) を用いた 〔カレント トピックスインマイクロノィォロジ一アンド ィムノロジー、 81、 1 (1978)〕 。 細胞融合は、 原法 〔ネィチヤ一、 256、 495(1975)] に準 じて行なった。 即ち、 脾) E細胞および P 3U1をそれぞれ血清を含有しない MEMで 3度洗 浄し、 脾臓細胞と P 3 U 1数の比率を 10 : 1になるよう混合して、 800回転で 15分間 遠心を行なって細胞を させた。 上清を充分に した後、 を軽くほぐし、 45%ポ リエチレングリコ一ル （PEG) 6000 (コッホラィト觀） を 0. 3ml加え、 37°C 槽中で 7分間静置して融合を行なった。 融合翻胞に毎分 2m 1の割合で MEMを添加 し、 合計 15m 1の MEMを加えた後 600回転 15分間遠心して上清を除去した。 この細 胞 物を 10 %牛胎児血清を含有する G I Tメディウム （和 ¾ 薬） (GIT-10% F
CS) に P3U1が lml当り 2X 10 "個になるように浮遊し、 24穴マルチディッシュ (リンブロネ土製） に 1ゥエル 1 m 1ずつ 192ゥエルに播種した。 播種後、 細胞を 37。 で
5 %炭酸ガスィンキュベータ一中で培養した。 24時間後 HAT (ヒポキサンチン 1 X 10
— 4M、 アミノプテリン 4X 10— 7M、 チミジン 1. 6X 10_3M) を含んだ G I T— 10% FCS培地（HAT培地）を 1ゥエル当り lm 1ずつ添加することにより、 HAT選 択培養を開始した。 HAT選択培養は、 培養開始 3、 6、 9日後に旧液を lml捨てたあと
、 lmlの HAT培地を添力『することにより継続した。 ハイブリド一マの増殖は、 細胞融合 後 9〜： L4日で認められ、培養液が黄変したとき（約 1 X 100セル Zml)、上清を採取し 、 実施例 5に記載の方法に従って抗体価を測定した。 [Cys 1 7] 19P2リガンド （17— 31) —BTGを免疫したマウス由来のハイブリド —マのスクリーニングの典型例として、マウス No.6 (図 1参照）を用いて得られた結果を 〔図 3〕 に示した。 これらも含め計 2種類のハイプリドーマを選択した 〔表 1〕 表 1 抗ヒト 1 9 P 2リガンド（18-31)モノクローナル抗体の反応性 反 応 性 1)
ハイフ'リド -マ株 h(l-31)n h(l-31)-0H b(l-31)n クラスノサブクラス 備考
No.
1 + + IgGl, κ P2L-1C 2 + + 土
3 + +
4 + + + IgGl, κ P2L-2C 5 土
6 + + 士 IgGl, κ
7 + + IgGl, κ
8 + + IgGM, κ
1) h(卜 31)nはヒト 19P2-L31、 M卜 31)- OHはヒト 19P2リガンド（卜 31)- OHおよび b (卜 31)nは ゥシ 19P2- L31を表す。
2) 100 nMの抗原 [ヒト 19P2- L31、 ヒト 19P2リガンド（1-31)- OH、ゥシ 19P2-L31]が存在した時 + (B/B0 ) <0.50
土 0.50≤(B/Bo)<0.80
0.80≤(B/B。) ただし、 B ：抗原存在時の抗体に結合した HRP標識化ヒト 1 9 P 2リガンド（18- 31)量
B。：抗原非存在時の抗体に結合した HRP標識化ヒト 1 9 P 2リガンド（18- 31)量
[CyS 25] 19P 2リガンド（12— 25)— BTGを免疫したマウス由来のハイプリド— マのスクリーニングの典型例として、マウス No. 1 (図 2参照） を用いて得られた結果を 〔 図 4〕 に示した。 これらも含め計 3種類のハイブリド一マを選択した 〔表 2〕 。 表 2
抗ヒト 19 P 2リガンド（12-24)モノクローナル抗体の反応性 反 応 性 1)
Λィフ'リト' 株 h(l-31)n h(12-31)n r(l-31)n クラス サブクラス 備老
No.
1 + + + P2L-1T
2 + 十 + P2L-3T
3 + + 土 IgGl, κ P2L-2T
4 土 土 士
5 + + 土
6 + + + IgGM, κ P2L-4T
7 士
8 土 土 土
9 土
10 土 + 土
11 + + ± · >—o b
12 土
r c
1) h(卜 31)ηはヒト 19P2 - Ul、h 2 - 31)ηはヒト 19P2 - L20および r (卜 31)πはラット 19Ρ2 - L3Iを表す。
2) 10 ηΜの抗原 [ヒト 19P2- L31, ヒト 19P2- L20, ラット 19P2- L31]が存在した時
Figure imgf000044_0001
土 0.50≤(Β/Β.)<0.75
0.75≤(B/BJ ただし、 B ：抗原存在時の抗体に結合した HRP標識化ヒト 19 P 2リガンド（12- 24)量 B。：抗原非存在時の抗体に結合した: HRP標識化ヒト 19 P 2リガンド（12- 24)量 次に、 これらのハイプリドーマを限界希釈法によるクローニングに付した。 クロ—ニング に際しては、 フィーダ一細胞として BALB/Cマウスの胸腺細胞をゥエル当り 5X 105 個になるように加えた。 クロ一ニング後、 ハイプリドーマを、 あらかじめミネラルオイル 0 . 5mlを觀空内投与されたマウス （BALBZC) に 1〜 3 X 100セル Z匹を腹腔内投 与したのち、 6〜 20日後に抗体含有腹水を採取した。
モノクローナル抗体は得られた腹水よりプロテイン— Aカラムにより精製した。 即ち、 腹水 6〜2 Omlを等量の結合緩衝液 （3. 5M NaC 0. 05%NaN3を含む 1 5 Mグ 11シン pH9. 0) で希釈したのち、 あらかじめ結合緩衝液で 化したリコン -A—ァガロース （Repligen¾¾) カラムに供し、 特異抗体を溶離緩衝 液 （0. 05%NaN3を含む 0. 1Mクェン酸緩衝液、 pH3. 0) で溶出した。 溶出液 は PBSに対して 4°C、 2日間透析したのち、 0. 22 mのフィルタ一（ミリポア社 に より除菌濾過し 4°Cあるいは一 80°Cで保存した。 モノクローナル抗体のクラス ·サブクラ スの決定に際しては、 精製モノクローナル抗体結合固相を用いるェンザィムーリンクトイム ノソ一ベントアツセィ （EL I SA) 法を行った。 即ち、 抗体 2 / g/ml を含む 0. 1M炭 薩衝液、 p H 9. 6溶液を 96ウェルマィクロプレートに 100 1ずつ分注し、 4°Cで 24時間放置した。 上記実施例 5で述べた方法に従って、 ゥエルの の結合部位をブロッ クエースでふさいだのち、 アイソタイプタイピングキット（Mouse- TyperTM Sub-Isotyping Kit ノ ィオラッド社製） を用いる EL I S Aによって固相化抗体のクラス、 サブクラスを調 ベた。
〔実施例 7〕 競合法酵素免疫測定法
(1) 競合法— E I A (その 1)
[Cys 1 7] 19P2リガンド （17— 31) —BTGを免疫頃として作製したモノクロ一 ナル抗体の反応特異性を以下の方法により調べた。 まず、 各モノクローナル抗体溶液の抗体 価を実施例 5 (1) 記載の方法により調べ、 競合法— E I Aに用いる抗体髓として、 標識 体の結合量が飽和結合量の約 50%となる抗体 m¾ (約 30〜 50 n gZm 1 )を決定した。 次に、 上記実施例 5記載の抗マウスィムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに、 決定さ れた にバッファ一 Cで灘された抗体溶液 50 1、 ヒト、 ラットおよびゥシ 19 P 2 リガンド （1— 31) あるいは 19 P 2リガンド咅 15分ぺプタイド、 即ちヒ卜 19 P 2リガン ド （1— 30) 、 ヒト [D- Ala29] — 19P2リガンド （1— 31) 、 ヒト 19P2リガンド (20-31) 、 ゥシ 19P2リガンド （1— 31) - 0H、 ゥシ 19P2リガンド （1— 31 ) -Gly-Arg-OHのバッファ一 C溶液 50 1、 および上記実施例 4 (1) 記載 HRP標識化 19P2リガンド （17— 31) (バッファ一 Cで 400倍希釈） を 50 1加え、 4°Cで 16時間反応させた。 反応後、 PBSで洗浄したのち固相上の酵素活性を上記実施例 5 (1 ) 記載の方法により測定した。 結果を 〔表 1〕 に示す。 いずれの抗体も HRP標識化 19P 2リガンド （17— 31) と反応し、 またヒト 19P2リガンド （1— 31) に対しても反 応性を有していた 〔表 1〕 。 当初選択したモノクローナル抗体 4種類のうちのうち 2種類が ゥシおよびラット 19P2リガンド （1— 31) とも同程度に反応した。 典型例として、 これらの中でヒト、 ラットおよびゥシ 19P2リガンド （1— 31) に対して最も高い反応 '14を示したモノクローナル抗体 P 2L-lCa (I gGl, κ)の競合法 _E I Αの結果を 〔 図 5 (a) ) に示す。 これらの抗体がヒト、 ラットおよびゥシ 19 P 2リガンド （1— 31 ) に対して同程度の反応性を有することが分かる。 P2L— 1Cのヒト 19P2リガンド （ 1—31) の標準曲線から、 （BZB0) =0. 5を与える 19P2リガンド （1一 31) 濃度は、 3nM、 1. 1 ngZwellであることが分かった。 また、 この抗体は P2L— 1C は、 ヒト [D-Ala29] — 19 P 2リガンド （1— 31) との反応性は弱いながらも示すものの 、 ヒト 19 P 2リガンド （1— 30) 、 ゥシ 19 P 2リガンド （ 1— 31 ) - 0Hおよびゥシ 19 P 2リガンド （1— 31) G 1 y-Ar g-OHに対しては交差反応性を示さないことか ら、 19P2リガンド （1— 31)の C端部分の部分構造を認識し、 31残基目の Pheと C¾のアミドを認識することが分かった 〔図 6 (a) 〕 。 一方、 P2L— 2Cを用いた場 合の競合法— E I Aの結果を 〔図 5 (b) 〕 に示した。 P2L— 2C (I gGl, κ) のヒ ト 19P2リガンド （1— 31) に対する反応性 ( (B/B0) =0. 5を与える ί¾ 濃度 ： 1. 5ηΜ、 0. 5ng/well) は、 ゥシ 19P2リガンド （1— 31) に対する反応性 ( (B/B0) 二 0. 5を与える δΐ 濃度： 50ηΜ、 18ng/well) の 33倍、 ラット 19P2リガンド （1— 31) に対する反応性 ( (B/B0) =0. 5を与える ： 200nM、 73ng/well) の 130倍であること； ^分かった。 これらの結果から、 P2 L— 2Cは、 ヒト、 ゥシ、 ラッ卜で配列の異なる 19P 2リガンド （1— 31) の 21残基 の A 1 aおよび 22残基の S e rを強く認識しているものと考えられる。 (2) 競合法— E I A (その 2)
抗 [Cys ム 0] 19P2リガンド（12— 25)— BTGモノクローナル抗体の反応特異性を 同様の方法により調べた。 まず、 各モノクローナル抗碰液の抗体価を実施例 5 (2) 記載 の方法により調べ、 競合法 _E I Aに用いる抗体髓として、 標識体の結合量が飽和結合量 の約 50%となる抗術艇 （約 30〜5 OngZml) を決定した。 次に、 抗マウスィムノ グロプリン抗体結合マイクロプレートに、 決定された にバッファー Cで希釈された抗体 溶液 50 / 1、 ヒトおよびラット 19P 2リガンド （1— 31) あるいは 19P2リガンド 部分ぺプタイド、 即ちヒト 19P2リガンド （12— 31) 、 ヒト 19P2リガンド （17 — 31) およびヒト 19 P 2リガンド （ 17 _ 31 ) のジァセチル体のバッファー C溶液 5 0 1、 および上記実施例 4 (2) 記載 HR P標識化 19 P 2リガンド （12— 25) (バ ッファ一Cで 500倍希釈） を 50 1加え、 4°Cで 16時間反応させた。 反応後、 PBS で洗浄したのち固相上の酵素活性を上記実施例 5 (1) 記載の方法により測定した。 結果を 〔表 2〕 に示す。 いずれの抗体も HR P標識化 19 P 2リガンド （12— 31) と反応し、 またヒト 19P2リガンド （1— 31) およびラット 19P2リガンド （1一 31) に対し ても反応性を有していた。典型例として、 これらの中でヒトあるいはラット 19 P 2リガン ド （ 1一 31 ) に対して最も高い反応性を示したモノク口一ナル抗体として、 P2L- 1T a (I gG2b, κ) あるいは P2L— 3Ta (I gG„ κ) の競合 E I Aの結果を 〔図 7〕 に示す。 P2L_ lTaのヒト 19P2リガンド （1— 3 1) の標準曲線から、 (B/ B0) =0. 5を与えるヒト 19P2リガンド （1一 31) は、 4 nM、 1. 6ng /well であることが分かった。 さらに、 P2L— lTaの 19P 2リガンド （12— 31) に対する反応性 （ （BZB0) =0. 5を与える i¾img: 4 nM、 0. 88ng/well ) はヒト 19P2リガンド （1— 31) と同 ¾¾、 ラット 19P2リガンド （1— 31) に 対する反応性 ( (B/B0) =0. 5を与える観?艇： 1 nM、 0. 4ng/well) は 、 4倍であることが分かった 〔図 7 (a) 〕 。 一方、 P2L_3Taの 19P2リガンドに 対する反応性は、 (B/B0) =0. 5を与えるヒト 19P2リガンド （1一 3 1) 濃度は 、 4 nM、 1. 6ngZwellであることが分かった。 さらに、 P2L— ITaの 19P2 リガンド （ 12— 3 1 ) に対する反応性 ( (B/B0) = 0. 5を与える 髓： 7 n M、 1. 54ng/well) はヒト 19P2リガンド （1— 31) の 1/2、 ラット 19P2 リガンド （1— 31) に対する反応性 ( (B/B0) -0. 5を与える舰髓： 25 η Μ、 0. 4ng/well) は、 6倍であることが分かった 〔図 7 (b) 〕 。 また、 いずれの抗体 はともに、 ヒト 19P2リガンド （17— 31) および 2 Ac—ヒト 19P2リガンド （1 7-31) に対しては交差反応性を示さないことから、 19 P 2リガンド （ 12— 16)の 部分構造を認識することが分かった 〔図 8〕 。 また、 〔図 9〕 に、 これら 2種類の抗体に加 え、 当初選択したヒト 19P2リガンド （1— 31) に対して高い反応性を示したモノクロ —ナル抗体 2種類、 P2L-2T aおよび P 2 L— 4 T aを用いた競合法— E I Aにおける ヒト 19P2リガンド （1— 31) の標準曲線を示した。 これら抗体の （BZB0) =0. 5を与えるヒト 19P2リガンド （1一 31) の濃度は、 3〜5 OnMの範囲にあり、 その 中で P2L— ITaを用いる競合法一 E I Aが最も高感度であり、 約 0. 1 nM [ (BZB 0) =0. 9] のヒト 19P2リガンド （1— 31) が検出可能であった。
〔実施例 8〕 HR P標識化抗 19 P 2リガンドモノク口一ナル抗体の作製
(1) P2L-lTa-HRP
P2L-lTalf¾Ili^l 8mg (120 nmo 1) を含む 0. 1Mリン酷锾褸 ίί夜、 ρΗ 6. 8溶液に GMBS 1. 43 mo 1を含む DMF 50 x 1を加え、 室温で 40分反応さ せた。 反応液をセフアデックス G— 25カラム （溶離夜、 0. 1Mリン酸緩衝液、 pH6. 7)で分離し、 マレイミド基の導入された抗体画分 13mgを得た。 次に、 HRP 15. 5 mg (387 nmo 1) を含む 0· 02Μリン薩衝液 (0. 15Μ NaC 1も含む） 、 p H6. 8、 1. 4mlに N—スクシ二ミジル— 3— (2—ピリミジルジチォ） プロピオネー ト（SPDP) 5. 8 mo 1を含む DMF6 O 1を加え、室温で 40分反応させた。次に 、 68 mo 1のジチオスレィ] ^一ルを含む 0. l m BM . (pH4. 5) 0. 4ml を加え、室温で 20分反応させた後セフアデックス G— 25カラム（溶離液、 2mM EDT Aを含む 0. 1 Mリン酷緩衝液、 H6. 0 ) で分離し、 S H基の導入された H R P 11 m gを得た。 次に、 SH基の導入された HRP8mgとマレイミド基の導入された抗体画分 3 mgとを混合し、 コロジオンバッグ （ザルトリウス社製） で約 0. 5mlにまで濃縮したの ち、 4°Cで 16時間放置した。 反応液を溶離液に 0. 1Mリン酸緩衝液、 pH6. 5を用い る Sephac ry l S- 300HRカラム（Pha rmac i a¾SS) に供し、 P2L—1 T a _HR P複合体画分を精製した。
(2) P2L-3Ta-HRP
同様の方法により、 P2L— 3Ta精製画分 15mgと HRP 16mgを用いて P2L— 3T-HRP複合体を作製した。
〔実施例 9〕 サンドイッチ法— E I A
(1) P 2 L— IT a— HRPを用いるサンドイッチ法一 E I Aの特異性と感度
上記実施例 6記載の精製したモノク口一ナル抗体 P 2L— ICaを l O^gZml含む 0 . 1 M炭酷緩衝液、 p H 9. 6溶液を 96ゥエルマイクロプレートに 100 1ずつ分注し 、 4°Cで 24時間放置した。 ゥエルの余剰の結合部位を PBSで 4倍希釈したブロックエー ス 400 1を加え不活化した。
以上のように調製したプレートに、 バッファー EC 〔10%ブロックエース、 0. 2%B SA、 0. 4M NaC l、 0. 05% CHAPS 〔3- [(コラミドプロピル)ジメチルアン モニォ]プロパンスルホン酸〕 を含む 0. 02 Mリン酸緩衝液、 p H 7〕で希釈した 19 P 2 リガンド （1— 31) 標準液 100^ 1を加え、 4 °Cで 24時間反応させた。 P B Sで洗浄 したのち、 上記実施例 8で作製した P2L— ITa—HRP (バッファ一 Cで 20， 000 倍希 f¾ I O O Iを加え、 4°Cで 24時間反応させたが、 標識体濃度としては 30， 00 0倍希釈のものを用いた。 PBSで洗浄したのち、 上記実施例 5記載の方法により TMBを 用いて固相上の酵素活性を測定した （酵素反応 20分） 。 結果を 〔図 10〕 に示すように、 極めて高感度に 19P 2リガンド （1— 31) を検出することがわかった。 即ち、 このサン ドィツチ法— E I Aは、 ヒト 19 P 2リガンド （1— 31) および 19 P 2リガンド （12 -31) を 0. 1 fmolZwell で、 ゥシ 19P2リガンド （1— 31) および 19P2リガ ンド （12— 31) を 0. 1 fmolZwell で、 ラット 19P2リガンド （1— 31) を 0. 03 fmol /we 11 で検出することが T能であり、 他の視床下部べプチド T R H、 L H R H、 GHRH、 CRF、 SSTおよび Oxy t oc i nは全く検出しなかった 〔図 1 1〕 。 した がって、 固相抗体として P 2 L— 1 Cを用い、 標識体として P2L— ITa— HRPを用い るサンドィツチ法— E I Aは、 種にかかわらず 19 P 2リガンド （1— 31) および 19 P 2リガンド （12— 31) を極めて高感度にかつ極めて選択的に検出することが 能である とわかった。
(2) P2L— 3Ta_HRPを用いるサンドイッチ法 _E I Aの特異や生と感度
固層抗体として P2L— I Caを用い、 標識体として上記実施例 8 (2) で作製した P 2 L -3Ta-HRPを用いるサンドィツチ法一 E I Aの特異性および感度を調べた。 上記実施 例 9 (1) と同様にヒト 19P 2リガンド （1— 31) 、 19P2リガンド （12— 31) およびラット 19 P 2リガンド （1— 31) に対する反応性を調べたが、 標識体髓として は、 1, 000倍希釈のものを用いた 〔図 12〕 。 その結果、 P2L—3Ta— HRPを用 いたサンドイッチ法 _E I Aは、 ヒト 19P 2リガンド （1— 3 1) を 0. 3 fmol/well で、 19P2リガンド （12— 3 1) を 1 fmolZwellで、 ラット 19P2リガンド （1— 31) を 3 fmolZwellで検出可能であつたが、 P2L_ ITa—HRPを用いるサンドィ ツチ法一 E I Aと比較して、 3— 10倍感度が低レ ものであった。
〔実施例 10〕 P 2 L— 1 C aによる 19 P 2リガンド （1— 31) の生物活性の中和作用 P2L- 1 C aによる 1 9 P 2リガンド （1— 31) に対する中和活性を 19 P 2レセプ ター発現 CHO細胞を用いたァラキドン酸代謝物放出活性測定系により測定した。 即ち、 P 2L— l Ca、 P2L— 3Caおよびコントロール抗体として P2L— I C aと同じ I gG サブクラス構造 （I gGp κ) である抗エンドセリンモノクローナル抗体 (AwETN4 0) を各濃度に希釈し、 ラット 1 9P2リガンド （1— 3 1) (5 x 10"10M) と室温で 1時間ィンキュベーション後、 残存活性を 19 P 2レセプター発現 CH〇細胞を使用して測 定した。 ァラキドン酸代謝物放出活性の測定は、 19P2レセプ夕一発現 CHO細胞を、 24 well plateに 0.5 x 105 cells/wellでまき、 24時間培養後、 [3H] ァラキドン酸を 0.5 C i/wellとなるように添加した。 [3H] ァラキドン酸添加 24時間後、 細胞を 0. 1% B S Aを含む MEMで洗浄後、 上述の各モノク口一ナル抗体とラット 19 P 2リガンド （1 -31)混和溶液を 500 1 /we 1 1で添加した。 37°Cで 1時間ィンキュベ一ションし た後に、 反応液 5 O O I中 400/x lをシンチレ一夕一 4m 1に加え、 反 夜中に遊離さ れた [3H] ァラキドン酸代謝物の量をシンチレーシヨン ·カウン夕一によりモニタ一した (図 13) 。 その結果、 P2L_lCaは、 19 P 2リガンド （ 1 _ 31 ) の活性を 5 x 10— 10Mで 75%、 5x 10— 9Mで 100%抑制した （図 13 a) 。 一方、 P2L-2 C aは、 19 P 2リガンド （1— 31) の活性を 5x 10— 8Mで 40 %程度の抑制がみられ たのみであった （図 13 b) 。 以上のことから、 P2L_lC aは、 19P2リガンド （ 1-31) のァラキドン酸代謝物放出活性を中和することが明らかとなった。
〔実施例 1 1〕 血漿中の 19P2リガンド （1— 31) の定量
ラット血漿 （lml) を Sep— Pak P l u s C 18カートリッジ 265mg (W a t e r s¾S¾) で濃縮'前処理した後、 19P2リガンド （1— 31) を上記実施例 9記 載サンドイッチ— E I Aにより定量した。血漿の前処理方法は、まず 4%酢酸含有 86%エタ ノール 4m 1、 メタノール 4m 1、 蒸留水 4m 1、 4 %酢酸 4m 1を順次ながして活性化し た Sep— Pak P l u s C 18カートリッジに 3m 1の 4%酢酸を添加し酸性化させ た血漿 lm 1を負荷した。添加後、 10mlの蒸留水で洗浄後、 4%酢酸含有 86%ェタノ一 ル 4ml、 メタノール 4mlで溶出し、 37 °Cの窒素ガス気流下で濃縮した。 濃縮画分を 0 . 25mlのバファー C中で再構成しサンドイッチ— E I Aにより定量した。 結果を [表 3 ] に示した。 ラット血漿中には 0. 2土 0. 03 fmol/mKmean 土 SEM, n=8)の 19P2リ ガンド （1— 31) が存 することが分かった。 表 3 ラッ卜血漿中の 19 P 2リガンドの定量 反 応 性 1)
ラッ卜 N 0. 免疫反応性 19 P 2リガンド
(fmol/ml)
1 0.25
2 0.11
3 0.21
4 0.21
5 0.10
6 0.05
7 0.04
8 0.19
9 0.21
10 0.13
me a n ± S D 0.15 土 0.07
〔実施例 12〕 ラット血漿中の 19P2リガンドの逆相高速液体クロマトグラフィー （RP -HPLC) による検出
上記実施例 11記載ラット血漿中に含まれる 19 P 2リガンド 種を同^ Tるため、 ラ ット血漿 5 Omlを上記実施例 11記載の方法で部分精製し、 この溶出画分を濃縮後〇D S -80TMを用いる逆相 HP LCによって分画した。
カラム条件
カラム： ODS— 80TM (4.6 x 250 mm)
溶離夜： A液 (0. 05%トリフルォロ酢酸含有 5%ァセトニトリル） B液 ( 0. 0 5 %トリフリレオ口酢 有 6 0 %ァセトニトリ レ） 溶出方法：溶離夜 Bの髓を最初の 5分間に 0 %から 3 5 %まで上昇させ、
次に 3 0分間かけて 3 5 - 4 8 %に直線的に上昇させた。
猶： 1 · 0 m 1 Z分
分画： 0. 5m l / t u b e
溶出画分を ffi下、遠 舊乾固したのち、 2 5 0m lのバッファ一 Cに溶解させ上記実施 例 1 0記載のサンドィツチ E I Aに供した。 結果を図 1 4に示す。 血漿中の 1 9 P 2リガン ドの免疫活性はほとんど合成 1 9 P 2リガンド （1— 3 1 ) の溶出位置に検出されたことか ら、 該サンドイッチ法一 E I Aが 1 9 P 2リガンド （1— 3 1 ) を検出していることが ¾認 された。 従って、 *¾定系は血漿中の 1 9 P 2リガンドの変動を石 ^る際の重要な手段を 提供すると考えられる。 産業上の利用可能性
本発明の 1 9 P 2リガンドに対するモノクローナル抗体 (特に、 P 2 L- 1 C a)は、極めて 高い結合能を有し、 かつ 1 9 P 2リガンドのァラキドン酸代謝物放出活性を中和することが 出来る。 従って、 1 9 P 2リガンドが有すると考えられる下垂側能調節作用 （例えば、 プ ロラクチン分泌 作用） 、 中枢神経調節作用、 塍 能調節作用などに、 異常がある場合 の各種疾患の診断薬、 予防薬、 治療薬などに用いること力できる。
本発明のモノクローナル抗体を用いるサンドイッチ法 （特に、 該モノクロナール抗体と 1 9 P 2リガンドの中間部を認識する抗体とを用いるサンドィツチ法） による免疫学的測定法 により、 1 9 P 2リガンドまたはその誘導体を高感度力つ特異的に定量することができる。 この定量方法は 1 9 P 2リガンドまたはその誘導体の生理機能の解明に用いることができる

Claims

請 求 の 範 囲
1. 19 P 2リガンドまたはその誘導体の C端側の部分べプチドに特異的に反 ii fるモノク 口一ナル抗体。
2. マウス I g Gである言青求項 1記載のモノク口一ナル抗体。
3. P 2 L _ 1 C aまたは P 2L-2C aで標示される請求項 2記載のモノクローナル抗体
4. 19 P 2リガンドまたはその誘導体の中間部分べプチドに特異的に反 Jt£するモノクロー ナル抗体。
5. マウス I gGである請求項 4記載のモノクロ一ナル抗体。
6. P2L-lTaで標示される請求項 5記載のモノクローナル抗体。
7. 請求項 1または請求項 4記載のモノク口一ナル抗体を用いることを特徴とする被検波中 の 19 P 2リガンドまたはその誘導体の定量法。
8. 請求項 1記載の抗体と請求項 4記載のモノク口一ナル抗体を用いることを特徴とする被 検波中の 19 P 2リガンドまたはその誘導体の定量法。
9. 請求項 1または請求項 4記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞。
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