WO1999011792A1

WO1999011792A1 - Anticorps a simple brin dirige contre une proteine noyau du virus de l'hepatite b, gene correspondant et agent therapeutique de l'hepatite b les contenant

Info

Publication number: WO1999011792A1
Application number: PCT/JP1998/003921
Authority: WO
Inventors: Masato Yamamoto; Hiroko Yamamoto; Naoki Tohdoh; Norio Hayashi
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
Priority date: 1997-09-02
Filing date: 1998-09-02
Publication date: 1999-03-11
Also published as: CN1276830A; US6562599B1

Description

明細書

B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に対する単鎖抗体、その遺伝子、及びこれらを用いた B型肝炎治療剤技術分野

本発明は、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に対する単鎖抗体、その遺伝子、及びこれらを用いた B型肝炎治療剤に関する。さらに詳しくは、 B型肝炎ウィルスのコア一タンパク質に結合することにより、該ウィルスの D N A合成を抑制することを特徴とする単鎖抗体、該単鎖抗体をコードする D N A、該 D N Aを含有するベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体、前記単鎖抗体の生産方法、ならびにこれら単鎖抗体あるいはその遺伝子を用いた B型肝炎治療剤に関する。

背景技術

本邦において、 B型肝炎ウィルス（以下、本明細書においては H B Vと略称する場合がある）は C型肝炎ウィルスと並んで、慢性肝炎の原因の多くを占めている。近年のワクチン接種による母子感染の予防の結果、ウイルス保有者率は低下する傾向にあるものの、依然として B型慢性肝炎患者は相当数存在し、その治療は原発性肝癌の防止という点で大変重要である。

B型慢性肝炎患者に対する治療は、インターフェロン療法、ステロイド離脱療法、プロパゲルマニウム療法等の宿主免疫を惹起してウィルス排除を目指す方法や、抗ウィルス剤療法（アデニンァラビノシドモノフォスフエート（以下、本明細書においては a r a— AM Pと略す場合がある）、ラミブジン）が行われているが、インタ一フエロン療法では、ウィルス活性の血清学的マーカーの一時的減少は起こるが、長期間の臨床的改善は見られず、また a r a— AM Pは効果は見られるが、現在のところ満足できる成績を挙げているとは言い難い。ィンターフェロンと a r a—AM Pを交互に投与して併用する方法では、神経毒性が現れ、使用法に問題点がある。また、 B型急性肝炎の一種である B型劇症肝炎は、致死性の高い疾患であるが、その効果的な治療薬は存在していないのが現状である。従って、従来の方法とは異なった機序による抗 B型肝炎ウィルス療法の開発が強く望まれているが、有用なものは未だ得られていないのが実情である。

抗ウィルス療法の一つに、ウィルス抗原に特異的な抗体を使用する方法がある。抗体を細胞内で発現させる方法は、抗体の高い特異性ゆえに宿主細胞に傷害を与えずに標的抗原のみを阻害しうる可能性があるが、 I g G を細胞外から投与したのでは細胞への取り込み効率が低いため、細胞内にあるウィルス抗原の機能を阻害し得ない。また、抗ウィルス抗原一 I g G の H鎖と L鎖の遺伝子を本来の抗体産生細胞でない細胞に導入した場合には、導入遺伝子から発現した H鎖と L鎖が抗体産生細胞における場合と同程度に効率よくジスルフィド結合を形成し、活性型の I g Gを産生するとは限らない。

一方、抗体の L鎖由来の可変領域（以下、本明細書においてはと略す場合がある）及び H鎖由来の可変領域（以下、本明細書においては V „ と略す場合がある）部分の c D N Aを、自由度の高いペプチド配列をコードする適当なオリゴヌクレオチドリンカ一をはさんで結合させた一続きのじ D N Aを発現させることで産生されるタンパク質は、ジスルフィド結合を有さない構造をとりながら、抗原に対して特異的に結合することが可能である。かかるタンパク質は「単鎖抗体」と呼ばれ、前記 I g Gのように抗体産生細胞で発現させて本来の立体構造を形成させなくてもよく、抗体産生細胞以外で発現させても、抗原に特異的に結合する活性を有するのが特徴である（Mc C a f f e r t y J. e t a 1. , N a t u r e (L o n d o n) , 348, 552- 554 (1 990) ； Ma r k s J . D. e t a 1. ， J . Mo 1. B i o l . 222, 581— 597 (1 991) ) 。

単鎖抗体の疾患への適用を目指した研究例としては、例えば癌に対するものとしては、（a) 単鎖抗体と毒素等の生理活性物質の c DNAをつないで発現させて、標的細胞などを攻撃し、減少させる効果を期待するもの、 ( b ) 単鎖抗体自体の抗原への特異的結合がもたらす効果を期待するもの等が挙げられる。

前記（a) の具体的な例としては、 TGF_aやジフテリアトキシンなどの毒素を、抗 EG F R—単鎖抗体（S c hm i d t M. a n d We I s W. , B r. J . C a n c e r, 74， 853— 862 (1 99 6) ) 、抗 e r b B_2—単鎖抗体（W e 1 s W. e t a 1. , C a n c e r Re s. ， 52 63 1 0— 631 7 ( 1 992) 、 S c h m i d t M. a n d We 1 s W. , B r. J . C a n c e r, 74, 853 -862 ( 1 996) ) 、抗 CD40—単鎖抗体（F r a n c i s c o J A. e t a 1. , C a n c e r Re s. ， 55, 3099— 3 104 (1 995) ) につなげたもの、好酸球由来のニューロトキシンを抗トランスフエリンレセプタ単鎖抗体につないだもの（N e w t o n D L. e t a l . , J. B i o l . Ch em. , 269, 2673

9-26745 (1 994) ) などの検討が報告されている。即ち、トキシンと単鎖抗体との結合体を作成し、標的細胞などに対して特異的に単鎖抗体を結合させ、単鎖抗体が結合した標的細胞のみを毒素により壊死させることを期待したものである。

また前記（b) の具体的な例としては、 e r b B— 2 (G r i m J . e t a 1 . ， Am. J . R e s p i r . C e l 1 . Mo 1 . B i o l . ， 1 5, 3 4 8 - 3 5 4 ( 1 9 9 6) ； J a n n o t CB. , e t a 1 . ， O n c o g e n e , 1 3， 2 7 5 - 2 8 2 ( 1 9 9 6) ) 、 EGF R (J a n n o t C B . , e t a l . ， O n c o g e n e , 1 3， 2 7 5 - 2 8 2 (1 9 9 6) ) 、 R a s (We r g e TM. , e t a

1 . ， F E B S 1 e t t . ， 3 5 1， 3 9 3— 3 9 6 ( 1 9 94) ) に対する単鎖抗体の検討が報告されている。また、抗 MHC—単鎖抗体を表面に発現するようにした MMLVを用いて、 MHCへの直接運搬への応用が図られている。

ウィルスに対し、疾患への適用を目指した研究例としては、 H I Vに対するもの（Wu Y. e t a l . ， J . V i r o l . ， 70， 3 2 9 0 - 3 2 9 7 ( 1 9 9 6) ； L e v y— M i n t z P. , J . V i r o 1 . , 7 0， 8 8 2 1 - 8 8 3 2 ( 1 9 9 6) ； Mh a s h i l k a r AM. e t a 1 . , EMBO J . , 1 4， 1 5 4 2 - 1 5 5 1 ( 1 9 9 5) ) 、 F o o t— a n d— m o u t h d i s e a s e v i r u s に対するもの（Ma s o n P. e t a l . , V i r o l o g y, 2 2 4， 5 4 8— 5 5 4 ( 1 9 9 6) ) 、 T i c k— b o r n e f r a v i v i r u sに対するもの（J i a n g W. , J . V i r o l . , 6 9, 1 04 4 - 1 04 9 ( 1 9 9 5) ) などが報告されている。このなかで、 H I Vに対する単鎖抗体の標的は、 R e v (Wu Y. e t a 1 . , J .

V i r o l . ， 7 0 3 2 9 0 - 3 2 9 7 (1 9 9 6) ) 、 T a t (Mh a s h i l k a r AM. e t a 1 . , EMB O J . , 1 4， 1 5 4 2 - 1 5 5 1 (1 9 9 5) ) などの非構造タンパク質に対するものである。 R e Vタンパク質は、 H I V— 1の感染細胞中で発現された RREを持つ H I V— 1の mRNAに結合し、 g a g、 p o l、 e n vの発現を促進するものであり、これに対して単鎖抗体を結合させることにより Re Vは不活化し、 g a g、 p o l、 e n vの発現を抑制することによりウィルスの増殖を抑制することができる。

また、 Ta tタンパク質はトランスァクチべ一ター活性を持っており、単鎖抗体を特異的に結合させることにより、この働きを抑制し H I Vの增殖を押さえるものである。また、 T i c k— b o r n e f r a v i v i r u sに対する単鎖抗体の標的は、ウィルス表面抗原に対するものであり、中和活性を持ち、表面抗原に対するモノクローナル抗体由来の単鎖抗体を、ゥィルス表面の構造タンパク質へ結合させることにより、ウィルスの感染及びウィルスタンパク質の合成を低下させるものである。

しかしながら、これらの単鎖抗体の標的となる抗原は、いずれも非構造タンパク質又はウィルス表面の構造タンパク質である。ウィルス表面抗原である場合は、強い i mmu n o-p r e s s u r eを受けているため、標的となる抗原の変異が起こり易く、そのため単鎖抗体の特異的結合が妨げられる欠点を有している。例えば、 H I V等のエンベロープ領域には超可変領域という変異し易い領域が存在し、これが単鎖抗体の特異的結合を阻害する原因となりうる。また非構造タンパク質である場合は、ウィルス表面抗原と比較して少ないが変異が起こることもあり、同様に単鎖抗体の結合が妨げられる欠点を有している。

—方、 HBVに対する単鎖抗体の例としては、唯一、 HBVの表面抗原に対する単鎖抗体の例が知られている（B i o t e c h n i q u e s 1 8 : 83 2 (1 995) ， WO 95/33832) 。しかしこれは、前記の表面抗原に対する単鎖抗体であるため、標的となる抗原に変異が生じ、特異的結合が阻害される欠点を有している。また、前記の HBVに対する単鎖抗体は、単に抗原の精製ゃィムノアッセィへの適用を目的として作製されたものに過ぎない。

発明の開示

したがって本発明は前記の従来の課題を鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に対する単鎖抗体、その遺伝子、及びこれらを用いた B型肝炎治療剤を提供することにある。さらに詳しくは、 B型肝炎ウィルスのコア一タンパク質に結合することにより、該ウィルスの DNA合成を抑制することを特徴とする単鎖抗体、該単鎖抗体をコードする DNA、該 DNAを含有するべクタ一、該ベクターによって形質転換された形質転換体、前記単鎖抗体の生産方法、ならびにこれら単鎖抗体あるいはその遺伝子を用いた B型肝炎治療剤を提供することにある。

本発明者等は、前記課題を解決するための手段として、 B型肝炎ウィルスの増殖がへパドナウィルス属特有の過程で行われることに着目し、新規の B型肝炎ゥィルス増殖抑制法の開発を行った。

B型肝炎ウィルスの増殖は下記のような過程を経て行われることが知られている。

血中のウィルス粒子内おいては、ウィルス遺伝子は、 1 0%程度の一本鎖部分を持つ環状不完全二重鎖 DN Aとして存在するが、細胞に感染後、核移行すると一本鎖部分が修復されて閉環ニ本鎖 DNAとなり、 4つのォ一プン ' リーディング . フレームからウイノレスタンパク質の mRNAとプレゲノム RN Aが細胞の RN Aポリメラーゼによって転写される。この中で、プレゲノム RNAが B型肝炎ウィルス · DNAポリメラーゼ及び逆転写酵素と共にコア一タンパク質より成るコア一粒子内にパッケージングされ、コア一粒子内で逆転写による（一）鎖 DNAの合成と部分的な（+ ) 鎖合成の後に外皮タンパク質で覆われ、成熟 B型肝炎ウィルス粒子が細胞外に放出される。

プレゲノム R N Aからの逆転写の過程でコアータンパク質が重要な役割を果たしていると考えられており、またパッケージングされうる構造をとるにはコア一タンパク質が必須であると考えられている（G a n e m， D. , He p a d o n a v i r i d a e a n d t e i r r e p l i c a t i o n. , I n " F i e l d s V i r o l o g y" (B. N. F i e l d s, D. M. Kn i p e, a n d P. M. How l e y , E d s . — i n— Ch i e f ) . 3 r d e d . 2703-2737 (1 9 96) L i p p i n c o t t— Ra v e n P u b l i s h e r s, P h i l a d e l p h i a ; H i r s h, R. e t a 1. , N a t u r e 344 552- 555 (1 990) ； L a v i n e m J . e t a 1. ， J . V i r o l . ， 63 4257-4263 (1 989) ) 。従って、このコア一タンパク質の機能を阻害することが可能であれば、力プシド内で起こる逆転写以降のウィルス成熟過程を抑制することが期待される。

力プシドは細胞内に存在するため、コア一タンパク質の機能を阻害する薬剤は細胞内に存在する必要がある。細胞内でコア一タンパク質の機能を阻害する方法としては、抗コア一タンパク質抗体を細胞内で発現させる方法や変異コア一タンパク質を発現させる方法が考えられる。

本発明者等は、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質でマウスを感作し、脾臓より RNAを精製し、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に対する抗体の V_L 及び V_B 部分のポリペプチドをコードする c DN A断片を PC R法により調製後、コア一タンパク質に対する単鎖抗体（抗コア一タンパク質一単鎖抗体と略す。）を取得し、本発明を完成するに至ったものである。また、前記遺伝子を哺乳動物発現ベクターに導入し、 B型肝炎ウィルス持続産生ヒト由来培養細胞内で抗コア一タンパク質一単鎖抗体を発現させたところ、該形質転換細胞内で転写される B型肝炎ウィルスの m R N Aは、陰性対照の形質転換体の m R N Aと量的に差はなかったが、 B型肝炎ゥィルスの複製中間体 DN Aの存在量の有為な減少、即ち B型肝炎ウィルスの増殖抑制を認めることに成功し、本発明に至ったものである。

すなわち、本発明の要旨は、

( 1 ) B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体をコードすることを特徴とする DNA、

(2) (A) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする DNA、

(B) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードする DNA、

(C) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA、

(D) 配列番号： 3に記載の塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなる DNA、及び

(E) (A) 〜（D) のいずれか記載の DNAに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A、

からなる群より選ばれる DNAを含んでなる、前記（1) 記載の DNA、

(3) (F) 配列番号： 6に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードする DNA、

(G) 配列番号： 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードする DNA、 (H) 配列番号： 5に記載の塩基配列からなる DNA、

( I) 配列番号： 5に記載の塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなる DNA、及び

( J) (F) 〜（I) のいずれか記載の DN Aに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A、

(4) 下記の、（A) 〜（E) で示される DNAからなる群より選ばれる DNAと、（F) 〜（J) で示される DNAからなる群より選ばれる D N Aを共に含んでなる、前記（1) 記載の DNA、

(A) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする DNA、

(C) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA、

(D) 配列番号： 3に記載の塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなる DNA、

(E) (A) 〜（D) のいずれか記載の DNAに、ストリンジェントな条件下でハイプリダイズする D N A、

(F) 配列番号： 6に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードする DNA、

(G) 配列番号： 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードする DNA、

(H) 配列番号： 5に記載の塩基配列からなる DNA、 ( I ) 配列番号： 5に記載の塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなる DNA、及び

( J) (F) 〜（I ) のいずれか記載の DNAに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A、

(5) (K) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする DNA、

(L) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリぺプチドをコ一ドする DNA、

(M) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNA、

(N) 配列番号： 1に記載の塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、揷入又は付加された塩基配列からなる DNA、及び

(O) (K) 〜（N) のいずれか記載の DNAに、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA、

(6) 前記（1) 〜（5) いずれか記載の DNAにコードされる、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体、

(7) 前記（1) 〜（5) いずれか記載の DNAを含有するベクター、

(8) 前記（7) 記載のベクタ一によって形質転換された形質転換体、 (9) 前記（8) 記載の形質転換体を、前記（1) 〜（5) いずれか記載の DNAにコードされる単鎖抗体の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体の生産方法、

(10) 前記（6) 記載の単鎖抗体を有効成分とする、 B型肝炎治療剤、 (1 1) 前記（1) 〜（5) いずれか記載の DNAを有効成分とする、 B型肝炎に対する遺伝子治療剤、

(1 2) アデノウイルスベクタ一を用いることを特徴とする、前記（1 1 ) 記載の遺伝子治療剤、

(13) B型肝炎が急性肝炎又は慢性肝炎である、前記（1 1) 又は (1 2) 記載の遺伝子治療剤、に関するものである。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明の DN Aは B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体をコードすることを特徴とする。一般的に単鎖抗体は、抗体の V_H 部分および V_L 部分が自由度の高いペプチド配列をコードする適当なリンカー配列をはさんでなる一続きのペプチドにより構成される。具体的には以下の 1) 〜3) の単鎖抗体が例示される。

1) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなる V_H 部分あるいは該 ₍₁ 部分と機能的に同等な部分を含んでなり、かつ B型肝炎ウィルスコアータンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体。

2) 配列番号： 6に記載のアミノ酸配列からなる部分あるいは該部分と機能的に同等な部分を含んでなり、力、つ B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体。

3) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなる V_H 部分あるいは該 V_H 部分と機能的に同等な部分と、配列番号： 6に記載のアミノ酸配列からなる \ 部分あるいは該 V 部分と機能的に同等な部分とを、組み合わせることにより B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に結合する能力を発現する単鎖抗体。

上記の 1 ) の要件を満たす単鎖抗体をコードする DN Aとしては、 (A) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする DNA、 (B) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードする DNA、

(C) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA、

からなる群より選ばれる DNAを含んでなる DNAであって、 B型肝炎ゥィルスコアータンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体をコードする D

NA等が挙げられる。

配列番号： 3に記載の塩基配列は、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に対する抗体の V_H 部分をコードする DNAの塩基配列であり、配列番号： 4に記載のアミノ酸配列は配列番号： 3に記載の塩基配列から推定されるアミノ酸配列であることから、上記の（A) 〜（E) の DNAは、 B 型肝炎ウィルスコア一タンパク質に対する抗体の V_H 部分又は該 V_H 部分と機能的に同等なポリペプチドをコードする DN Aである。

また、上記の 2) の要件を満たす単鎖抗体をコードする DNAとしては、

(F) 配列番号： 6に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする DNA、

(H) 配列番号： 5に記載の塩基配列からなる DNA、

(J) (F) 〜（I ) のいずれか記載の DNAに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A、

からなる群より選ばれる DNAを含んでなる DNAであって、 B型肝炎ゥィルスコア一タンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体をコードする D NA等が挙げられる。

配列番号： 5に記載の塩基配列は B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に対する抗体の部分をコードする DNAの塩基配列であり、配列番号： 6に記載のアミノ酸配列は配列番号： 5に記載の塩基配列から推定されるアミノ酸配列であることから、上記の（F) 〜 (J) の DNAは、 B 型肝炎ウィルスコア一タンパク質に対する抗体の V_L 部分又は該 \ 部分と機能的に同等なポリべプチドをコードする DN Aである。

また、上記の 3) の要件を満たす単鎖抗体をコードする DNAとしては、下記の、（A) 〜（E) で示される DNAからなる群より選ばれる DNA と、（F) 〜（J) で示される DNAからなる群より選ばれる DNAを共に含んでなる D N Aであって、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体をコードする DNA、

(B) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリぺプチドをコ一ドする DNA、

(C) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA、

(D) 配列番号： 3に記載の塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなる DNA、 (E) (A) 〜（D) のいずれか記載の DNAに、ストリンジヱントな条件下でハイブリダイズする D N A、

(G) 配列番号： 6に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリぺプチドをコ一ドする DNA、

(H) 配列番号： 5に記載の塩基配列からなる DNA、

( I ) 配列番号： 5に記載の塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなる DNA、及び

(J) (F) 〜（ I ) のいずれか記載の DNAに、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする D N A、等が挙げられる。

かかる DNAは、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に対する抗体の V 部分又は該 _[1 部分と機能的に同等なポリペプチドをコードする DN A、及び該抗体の V_L 部分又は該 V_L 部分と機能的に同等なポリべプチドをコードする DNAのいずれも含有するものである。このような、 3) の要件を満たす DNAは、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に対してのみ、特異的に結合する抗体であるためより好ましいものである。

さらに 3) の要件を満たす DNAとしては、

(K) 配列番号： 2に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードする DNA、

(L) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードする DNA、

(M) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNA、 (N) 配列番号： 1に記載の塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、揷入又は付加された塩基配列からなる DNA、及び

(O) (K) 〜（N) のいずれか記載の DNAに、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D N A、

からなる群より選ばれる配列を有する、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に結合する単鎖抗体をコードする DNA等が挙げられる。

ここで、配列番号： 1に記載の塩基配列は、 PRE_HV、 B型肝炎ゥィルスコア一タンパク質に対する抗体の V_H 部分、リンカ一、該抗体の V_L 部分及び T A I Lをコードする D N Aの塩基配列であり、配列番号： 2に記載のァミノ酸配列は配列番号： 1に記載の塩基配列から推定されるアミノ酸配列である。

前記のストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DN Aとしては、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液として、 0. 1 % S D S、 5 0%ホルムアミド、 5 XS SC、 1 XD e n h a r d t試薬、 250 g ノ mLサケ精子 DNAの組成の溶液を用いて、 42 °Cでー晚ハイプリダイズした後、 2 X S S Cを用いて室温で 1時間洗浄、 2 X S S C、 0. 1 % SDSを用いて室温で 30分間、その後 0. 1 X S SC、 0. 1 % SD Sを用いて 50〜65°Cで 30分洗浄するという条件下でハイブリダィズする DNAをいう。

また、前記の塩基及びアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を導入するための方法は特に限定されないが、例えば、制限酵素、ヌクレアーゼなどを用いる方法や、部位特異的変異導入方法（W. I TO, e t a 1. ， G e n e, 1 02, 67— 70 (1 991) ) などにより所望の塩基配列に変異を導入し、このものを発現させるためのベクターに組み込み、宿主を形質転換することにより得ることができる。また、塩基及びアミノ酸の変異において「数個」とは特に限定されないが、上記部位特異的変異導入方法等の周知の方法により欠失、置換、挿入又は付加できる程度の数を指す。

また、単鎖抗体における PRE— HV、リンカ一、 TA I Lに該当する部位のぺプチドのァミノ酸配列及び該ぺプチドをコ一ドする DN Aの塩基配列は特に限定されるものではなく、公知の単鎖抗体におけるそれぞれの部位のぺプチドのアミノ酸配列及び該ぺプチドをコ一ドする DN Aの塩基配列であれば良い。例えば、フアルマシア社製レコンビナントファージアンチボディシステム (Re c omb i n a n t P h a g e An t i b o d y S y s t em) を用いて単鎖抗体を調製する場合、 PRE—

HV、リンカ一、 TA I Lに該当する部位のペプチドのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号： 8、配列番号： 1 0及び配列番号： 1 2に示されるものであり、該ぺプチドをコードする D N Aの塩基配列はそれぞれ配列番号： 7、配列番号： 9及び配列番号： 1 1に示されるものである。

本発明においては、フアルマシア社製レコンビナントファ一ジアンチホティシステム (Re c omb i n a n t P h a g e An t i b o d y S y s t em) 等の単鎖抗体調製用のキットを用いることで容易に本発明の DNAを得ることができる。かかるキットにより得られる本発明の D N Aはベクター中に組み込まれた状態で得られるため、単鎖抗体の発現がより容易に達成される。

以下に、本発明の単鎖抗体の DN Aの調製方法について詳細に説明する。抗 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質抗体は、動物を、抗原としての B型肝炎ウィルスコア一タンパク質とアジュバントの混合物を用、て免疫感作させることにより動物内で産生させることができる。

免疫感作の対象となる動物としては特に限定されるものではなく、ゥサギ、モルモット、ャギ、ロバ、ニヮトリ、ラットゃマウス（B a 1 b/c マウス、 SWI S S 3T3マウス， C3Hマウス， C 57BL,6マウスなど）等が挙げられる。

抗原として用いられる B型肝炎ウィルスコア一タンパク質は、例えば遺伝子組み換え法（J. E l e c t r o n M i c r o s c. , (To k y o) ， 43 (6) ， 386— 393 (1 994) ) により得ることができる。

アジュバントとしては特に限定されるものではなく、通常用いられる公知のアジュバント、例えば、フロイントの完全アジュバントや不完全アジュバントを用いることができる。

免疫感作した動物の脾臓から常法にしたがって P o 1 y (A) 一 RNA を精製し、 mRNAを得、かかる mRNAを逆転写させ、 c DNAを得ることができる。

このような c DNAから、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に対する抗体の V_H 部分をコードする DNA及び部分をコードする DNAを取得する手法としては特に限定されないが、例えば、 V_H 及び V_t 部分のそれぞれに特異的な核酸プローブを用いてハイブリダイゼーションの手法にしたがって c DNAライブラリーから取得する方法、 PCR法を用いて V_H 及び V_t 部分を特異的に増幅させる方法などが挙げられる。

例えば PC R法を用いて行う場合、 V_H 及び \^ 部分のそれぞれに特異的なプライマーペアを用いて、前記の c DNAを铸型として特異的増幅が可能である条件下で PC Rを行うことにより、 V_H 及び V_L 部分のそれぞれをコードする c DN Aを得ることができる。なお、特異的なプライマーペアとしては、先のレコンビナントファージアンチボディシステムに含まれている。得られた V_H 及び V_L 部分のそれぞれの c DN Aは、二本鎖 c DNA を形成させた後、末端を平滑化してファージミドベクタ一等のベクターに連結してもよく、 PCR法や部位特異的変異法などの手法を用いて、制限酵素部位を導入し、制限酵素処理後、ファージミドベクター等に連結してもよい。

例えば、前記のようにして得られた V_H 及び VL 部分のそれぞれの C DNAを、リンカ一部分をコードする DNAと直鎖状に連結し、さらにべクタ一に連結しやすくするため、それぞれの 5' 末端側に制限酵素認識配列を有する、 V_H —リンカ一一の一連の直鎖状 DNAに対するプライマ一ペアを用いて PC R法を行い V_H —リンカ—— V_L の一連の直鎖状 DN Aに制限酵素部位を導入する。

また、ここで用いるベクターとしては、 PRE— HVをコードする DN Aおよび T A I Lをコードする DNAが、 V_H 部分をコードする DNA 一リンカ一一部分をコードする DNAの両末端に結合されるように構築されたベクターを用いることが好ましい。かかるベクターとしては、例えばフアルマシア社製レコンビナントファージアンチボディシスアム (Re c omb i n a n t P h a g e An t i b o d y S y s t ern) に含まれるファージミドべクター ρ CANTAB 5 E等が挙げられる。

このようなキットを用いて得られる本発明の DNAは、ベクターに組み込まれたものである。したがって、例えば該ベクターで E. c o l iを形質転換し、得られた E. c o 1 iクローンにヘルパーファージを感染させることにより、単鎖抗体を提示する組み換えファージを得ることができる。本発明の単鎖抗体は、上記の要件 1) 、 2) 又は 3) のいずれかを満たす本発明の DNAによりコードされるタンパク質である。また、本明細書において単鎖抗体が B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に結合する能力を有するかどうかは、 EL I SA法により、蛍光強度を測定することにより決定することができる。ここで、蛍光強度が、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質と結合しない単鎖抗体を用いた陰性対照より明らかに高く、再現性よく検出され得る単鎖抗体を B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体とする。

本発明のベクターは、上記の本発明の DNAを含有するものである。本発明のベクターの構築に用いられるベクターとしては、本発明の DNAが挿入でき、該 DN Aがコードする単鎖抗体の発現が可能なべクターであれば特に限定されない。具体的には、大腸菌を宿主とする場合は、例えば、ファージミドベクター P CANT AB 5 E (フアルマシア社）等が挙げられ、また、ほ乳動物細胞を宿主とする場合は、例えば、 p Z e o SV2

(インビトロジェン社）等が挙げられる。また、本発明の DN Aをべクタ一に挿入する方法としては特に限定されるものではなく、 T4DNAリガ一ゼ等を用いる方法等の公知の方法を用いることができる。

本発明の形質転換体は、本発明のベクターを所望の宿主細胞に導入することにより得ることができる。

宿主細胞としては特に限定されないが、例えば肝臓癌由来 He pG2、 Ch a n g L i v e r細胞、腎由来アデノウィルス E I A、 E I B形質転換細胞（293) などのヒト細胞、 COS— 1、 COS— 7、 CHO、

N I H 3 T 3などの動物細胞、ョトウガ由来 S f 9細胞などの昆虫細胞、酵母、 E. c o l i K 1 2株誘導体などの大腸菌などが挙げられる。ヒト由来の HBVに対する単鎖抗体を発現する目的には、ヒト由来の培養細胞がより好ましい。

本発明の DNAを含有するべクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えばリン酸カルシウム法、エレクト口ポーレーシヨン法、リポフエクション法、組換えウィルス感染法等の方法を用いることができる。

本発明の、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体の生産方法は、本発明の形質転換体を、本発明の D N Aにコードされる単鎖抗体の発現可能な条件下で培養することを特徴とする。本発明の D N Aを含有するベクター中に組み込まれた単鎖抗体をコードする遺伝子産物が発現可能な条件としては、本発明の D N Aの上流に存在するべクター内のプロモーターからの転写が有効に働くこと、及び翻訳の際に正しいアミノ酸のオープンリ一ディングフレームが組めることが必要である。本発明の単鎖抗体の発現は、前記のような方法により、得られる単鎖抗体の B型肝炎ウィルスコアータンパク質に結合する能力を測定することによって確認できる。

組換体から抗コアータンパク質一単鎖抗体を精製するには、通常の公知の方法により行うことができる。例えば、培養細胞を破砕し、その上清からァフイエティーカラムクロマトグラフィ一等によって発現した目的の単鎖抗体を得ることができる。具体的には、本発明においては、発現した抗コア一タンパク質一単鎖抗体の C末端側の E— t a gに対するァフィニティ一カラムクロマトグラフィ一により、容易に精製することができる。前記のようにして得られた抗コア一タンパク質一単鎖抗体は、 B型肝炎ゥィルスのコア一タンパク質に結合することによりウィルスの D N A合成を抑制する能力を持ち、さらにはウィルスの増殖を抑制する効果をもたらすことができる。

本発明の B型肝炎治療剤は、本発明の抗コア一タンパク質一単鎖抗体そのものを有効成分とする治療剤として使用してもよく、抗コア一タンパク質一単鎖抗体をコードする D N Aを医薬の有効成分として患者に投与し、体内で発現させる遺伝子治療剤として使用してもよい。

抗コア一タンパク質一単鎖抗体そのものを有効成分とする治療剤は、ァジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。剤型として、より具体的には、リポソ一ム製剤、直径数 μ πιのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤などの剤型にすることができる。投与方法としては徐放性のミニペレツト製剤などが挙げられる。更には細胞膜を通過させる際に、細胞膜を通過する効率を上昇させるようなぺプチドを付加することも可能である。具体的には疎水性をもつ領域を単鎖抗体の Ν末側及び C末側に連結させる。また特定の糖鎖を結合させることにより、細胞膜の通過性を上昇させることが可能である。投与量は、患者の保有する Β型肝炎ウィルス量、患者の年齢、体重等により適宜調整することができる力通常 0 . 0 0 1 m g Z k ₈ 回〜1 0 0 0 m g Z k g Z回であり、これを初期時には連日投与、その後、数日ないし数ヶ月に 1回投与するのが好ましい。投与形態としては、剤型に応じて経口、動脈注射、静脈注射、筋肉注射により投与することが可能である。

また遺伝子治療剤として用いる場合、細胞内で抗コア一タンパク質一単鎖抗体を高発現させ、 B型肝炎ウィルスが感染した細胞内においてウィルスの D N A増殖を抑制し、さらには、ウィルスの増殖を抑制することがでさる。

抗コア一タンパク質一単鎖抗体をコードする D N Aを有効成分とする遺伝子治療剤を感染細胞に導入する場合、その投与形態としては非ウィルスベクターによる態様及びウィルスベクターを用いる態様の二つに大別される。即ち、前者の態様としては、直接本発明の D N A分子を細胞に導入する方法（例えば、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法等）、リポソームを用いて D N A分子を導入する方法（例えば、リボソーム法、リポフエクチン法等）、パーティクルガンで担体とともに DN A分子を細胞に移入する方法、マイクロインジヱクシヨン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーシヨン法等が代表的なものである。

後者の態様としては組換えアデノウィルス、レトロウイルス等のウィルスベクターを用いた方法等が代表的なものであり、より具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、シンビスウィルス、センダイウィルス等の DN Aウィルス又は RN Aウィルスに、抗コア一タンパク質一単鎖抗体をコードする DNAを組み込んで細胞内に導入する方法等が挙げられる。

これらのうち、アデノウイルスは肝組織への移行性が極めて高く、また感染効率も他のウィルスベクターを用いた場合よりもはるかに高いことが知られている。従ってアデノウィルスベクター系を用いることが好ましい。これらの方法の何れかを用いることによって抗コア一タンパク質一単鎖抗体遺伝子を B型肝炎ウィルス感染細胞に導入することが可能である。また、非ウィルスベクターによる遺伝子治療では、局所投与等によって感染細胞の近傍に遺伝子を導くことが望ましいが、ウィルスベクターによる遺伝子治療では、必ずしも局所投与をする必要はなく静脈内投与も可能である。

また、本発明の遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、 DN

Aを直接体内に導入する i n V i V o法、及びヒトからある種の細胞を取り出し体外で DNAを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻す e x V i v o法がある。（日経サイエンス、 1 994年 4月号、 20— 45頁； 1 997年 9月号、 27— 62頁。月刊薬事、 36 (1) 、 23— 48 (1 994) 。実験医学， 12 (1 5) (1 994) ) 。本発明では、 i n v i v o法がより好ましい。製剤中の DNAの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができるが、通常 0.0001- 100mg、好ましくは 0.001-10m_gであり、これを数日ないし数ケ月に 1回投与するのが好ましい。

抗コア一タンパク質一単鎖抗体を有効成分として含有する B型肝炎治療剤、及び抗コア一タンパク質一単鎖抗体をコードする DN Aを有効成分として含有する B型肝炎に対する遺伝子治療剤は、 B型肝炎ウィルスにより弓 Iき起こされる B型肝炎に対する治療剤であり、該 B型肝炎は、急性肝炎であっても慢性肝炎であってもよい。

図面の簡単な説明

図 1は、クローン 1 C 9及びクローン γ 9を用いての E L I S Α法における吸光度を示すグラフである。

図 2は、ウェスタンブロット解析の結果を示す電気泳動の写真である。左のレーン：分子量マーカー（30KDa) ；右のレーン： 1 C9抗体産生ファージを感染させた HB 21 5 1のペリプラズム（s F v) である。図 3は、単鎖抗体由来の mRN Aについてのノーザンブロット解析の結果を示す電気泳動の写真である。レーン 1〜3 ： _P Z e o SVy 9を導入して得られたクローン（N4、 N7、 N8) 由来の RNA；レーン 4〜 6 : p Z e o SV l C 9を導入して得られたクローン（P 3、 P 8、 P 9) 由来の RNAである。

図 4は、図 3と同じ解析を別のクローンについて行った結果を示す電気泳動の写真である。レーン i〜4 ： _P Z e o SV l C 9を導入して得られたクローン（P 9、 P I 2— 2、 P 1 0、 P 20) 由来の RNA (図中 s F v) ；レーン 5、6 : p Z e o SVy 9を導入して得られたクローン (N4、 N 8) 由来の RNA (図中 s F v) である。図 5は、 HBVの mRNAについてのノーザンブロット解析の結果を示す電気泳動の写真である。レーン：！〜 3 ： p Z e o S V 9を導入して得られたクローン（N4、 N7、 N 8) 由来の RNA；レーン 4〜 6 ： p Z e o S V 1 C 9を導入して得られたクローン（P 3、 P 8、 P 9) 由来の RNAである。

図 6は、図 5と同じ解析を別のクローンについて行つた結果を示す電気泳動の写真である。レ一ン 1〜4 ： p Z e o SV l C 9を導入して得られたクロ一ン（P 9、 P 1 2— 2、 P 1 0、 P 20) 由来の RNA；レーン 5、 6 ： p Z e o S V γ 9を導入して得られたクローン（Ν4、 Ν 8) 由来の RNAである。

図 7は、形質転換体由来の Β型肝炎ウィルス DN Αのサザンブロット解析の結果を示す電気泳動の写真である。

形質転換体染色体 DN A中の B型肝炎ウィルスの DN Aはバンドの "I" の位置に見られ、 B型肝炎ウィルスの複製中間体 DNAはバンドの "S" の位置（一本鎖 DNA) 、 "D_; " の位置（直鎖状二本鎖 DN

A) に見られる。レーン 1は分子量マーカー（l k bラダー）、レーン 2 〜7は p Z e o S V 9を導入して得られたクローン由来の D N A (レ一ン 2、レーン 3 : N4 DNA ; レーン 4、レーン 5 : N7 DNA；レーン 6、レ一ン 7 ： N 8 DNA) 、レーン 8〜： 1 3は p Z e o S V 1 C 9を導入して得られたクロ一ン由来の DNA (レーン 8、レーン 9 ： P 3

DNA；レ一ン 1 0、レーン 1 1 ： P 8 DNA；レーン 1 2、レーン 1 3 ： P 9 DNA) である。

図 8は、図 7と同じ解析を別のクローンについて行った結果を示す電気泳動の写真である。図中、 I、 Dl、 Sは図 7と同じものを示す。 D2は、環状二本鎖 DNAを示す。レーン 1 ：分子量マ一カー、レーン 2〜5 ： p Z e o S V 1 C 9を導入して得られたクローン（P9、 P12- 2、 ρ10、 p20) 、レーン 6、 7 ： p Z e o S Vy 9を導入して得られたクローン（N4、 N8) 由来の DNAである。

図 9は、免疫沈降したタンパク質のウェスタンブロット解析の結果を示す電気泳動の写真である。 p Z e o S νγ 9を導入して得られたクローン

(Ν8) 由来の、レーン 1 ：抗血清；レーン 2 ：抗 HBVコア一タンパク質抗体による免疫沈降後のタンパク質である。また、 p Z e o SV l C9 を導入して得られたクローン（P 1 2— 2) 由来のタンパク質の、レーン 3 ：抗血清；レーン 4 ：抗 HBVコア一タンパク質抗体による免疫沈降後のタンパク質である。

図 1 0は、 pZeoSVlC9導入 HB611細胞と pZeoSV₇9導入 HB611細胞における細胞増殖を示すグラフである。騸は pZeoSVT/9導入 HB611細胞、譬は pZeoSVl C9導入 HB611細胞である。

.図 1 1は、単鎖抗体遺伝子を挿入したコスミドクローン DNAの制限酵素による切断結果を示す電気泳動の写真である。左の写真（A) は 1C9遺伝子を挿入したコスミドベクター、右の写真 (B) は 9遺伝子を挿入したコスミドベクターの切断結果である。（A) レーン 2， 3 : H i n d I I I， X b a I消化、レーン 5， 6 ： Nh e I , S p e l消化、レーン 1， 4 ：サイズマーカー、（B) レーン 1， 2 : Nh e I， S p e I消化、レーン 4, 5 : H i n d I I I , Xb a l消化、レーン 3， 6 ：サイズマーカーである。

図 1 2は単鎖抗体遺伝子を発現する各種のアデノウィルスベクター DN Aの制限酵素 Xho Iによる切断結果を示す電気泳動の写真である。写真 (A) は 1C9遺伝子をもつアデノウィルスベクター、写真（B)は γ 9遺伝子を持つアデノウイノレべクタ一の各クローンである。（Α)レーン 1、 1 0 :サイズマーカー；レーン 2 ： AxlCAwt；レーン 9 ： 1C9遺伝子挿入コスミド；レーン 3〜8 ：アデノウイルスの各クローン、（B) レーン 1、 1 6 :サイズマーカ一；レーン 2 ： AxlCawt;レーン 1 5 ： γ 9遺伝子揷入コスミド；レーン 3〜 14 ：アデノウィルスの各クローンである。

発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。

実施例 1

細胞培養と免疫動物の作製

Β型肝炎ウィルスを持続的に産生するヒト肝芽細胞腫由来細胞株（ΗΒ

6 1 1 〔大阪大学細胞生体工学センター，奈良先端技術大学院大学松原謙一先生より分与、又は P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA, 84 (2) ， 444-448 ( 1 987 ) により同様の細胞が調製可能〕）は、プラスチック製組織培養プレート（Co r n i n g G 1 a s s Wa r e, コ一二ング社製）にて 10%牛胎児血清添加ダルベッコ改変イーグル培地（G i b c o BRL社製）を用いて培養した。 HB 61 1 の培養は 37°C、 5 % C 0₂ の条件下で行った。耐性株選択に用いた Z e o c i n (インビトロゲン社製）と G 41 8の濃度はそれぞれ 1 25 / g / L、 200 μ g /m Lで行つた。

マウスの免疫は以下の如く行った。 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質抗原（50 / gZ250 /i LPBS、化学及び血清療法研究所）と 25◦ μ Lのフロイントの完全アジュバント（ディフコ社製）の混合液を 3匹の体重約 20 gの B a 1 b/cマウスに皮下投与した。 1 0日の間隔を置いてフロイントの不完全アジュバント（ディフコ社製）を用いて追加免疫を 2回繰り返した後、最も抗コア一タンパク質抗体産生量の高かったマウスに B型肝炎ウィルスコア一タンパク質抗原（20 // g) の静脈内投与で最終ブーストをかけた。その 3日後にマウス脾臓を摘出し、 t o t a l R NAを T r i s o 1 (G i b c o B RL社製）を用いて抽出し、 F a s t - t r a c k (インビトロゲン社製）によって p o 1 y (A) — RNA を精製した。

実施例 2

抗 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質一単鎖抗体のクローニングとスクリ一ユング

B型肝炎ウィルスコア一タンパク質抗原に対する単鎖抗体の c DN Aの作製はレコンビナントファージアンチボディシステム（Re c om b i n a n t Ph a g e An t i b o d y S y s t em) (フアルマシア社製）を用いて行った。

その実験操作の概要を以下に示す。上記で得た 25 μ gの mRNAについて逆転写反応を行わせた後、 PCR法により、 V_H 及び V_L 部分の配列のそれぞれに特異的なプライマーペアを用いて V_H 及び VL 部分の。

DNAを増幅した。 V_H 及び V_L 両部分の c DNAを DNAリンカ一配列で直鎖状に連結し、更に末端に制限酵素認識配列を有するプライマーぺァを用いて P CR法により増幅した。このようにして得られた DN Aを制限酵素処理後、ファージミド（p CANTAB 5 E) の S f i I、 No t I切断部位に挿入した。ファージミド p CANTAB 5 Eは、単鎖抗体の

P RE— HV及び TA I Lに対応する DNAを含有するものである。単鎖抗体を提示する組換え一本鎖ファージを得るために、増幅された P CR増幅断片を含むファージミドベクターで大腸菌 TG 1を形質転換し、得られた大腸菌クローンにヘルパーファージ Ml 3K07を感染させ、単鎖抗体を提示する組換えファージを調製した。これらのファージの中から B型肝炎ウィルスコア一タンパク質抗原に対する結合能を有するものを選択するために、コア一タンパク質抗原を固定化した組織培養フラスコに組換えファージ溶液を添加し、コア一タンパク質抗原に結合した組換えファージを再度 TG 1に感染させた。

前記スクリーニング操作を合計 2回行った後、得られた 95の大腸菌クローンからファージ単鎖抗体を産生させ、各々の単離されたクローンについてコア一タンパク質抗原を吸着させた E L I S A用プレートを用いてファージ単鎖抗体の抗原結合能をインダイレクト EL I S A法にて検討した。その結果、 95クローン中 1クローン（1 C 9) が陽性対照と同程度の吸光度を呈し、コア一タンパク質抗原に対して強い結合能を有するファージ単鎖抗体を産生するクローンが得られた。結果を図 1に示す。

なお、 v_H 及び V_L 部分の配列のそれぞれに特異的なプライマーペア、 DNAリンカ一配列、末端に制限酵素認識配列を有するプライマーペア、ファージミド p CANTAB 5E、ヘルパ一ファージ Ml 3 K07は、レコンビナントファージアンチボディシステム（Re c omb i n a n t P h a g e An t i b o d y S y s t em) (フアルマシア社製）に含まれるものである。

実施例 3

選択されたクローン 1 C 9の結合特異性

クローン 1 C 9の結合能がファージベクタ一由来タンパク質によるプレ一トへの非特異的吸着によるものではないことを確認するため、下記の E

L I S Aによる検討を行った。コア一タンパク質抗原を吸着させたゥエル (HB c) 、牛血清アルブミンを吸着させたゥエル（BSA) 、及び 2% 脱脂粉乳でブロッキングのみ行ったゥエル（u n— c o a t e d) で陽性クローン 1 C 9及びコア一タンパク質抗原に結合するファージ単鎖抗体を産生していない陰性対照クローン γ 9由来のファージ抗体について検討を行った結果、コア一タンパク質抗原を吸着させたゥエルでのみ 1 C9が結合能を示し、 "V 9は何れに対しても結合能を示さなかった。この結果を図 1に示す。

実施例 4

クローン 1 C 9の単鎖抗体領域の塩基配列の決定

陽性クローン 1 C 9由来の、ファージミドベクター p CANTAB 5 E に挿入された単鎖抗体をコードする DNA断片を、 Nh e I、 Xh o I認識配列をそれぞれの端に付加したプライマーを用いて P f uポリメラ一ゼで増幅した。用いたプライマ一の塩基配列を配列番号： 1 3及び配列番号： 14に示す。

増幅された断片は一旦クローニングベクター p B 1 u e s c r i p t S K ( + ) (ストラタジーン社製）に挿入し、 DNA塩基配列の決定を行つた。

得られた塩基配列及び推定されるァミノ酸配列を、配列番号： 1及び配列番号： 2に示す。また、抗コア一タンパク質抗体の V_H 及び V_L をコ —ドする DN Aの塩基配列は、配列番号： 3及び配列番号： 5に示し、推定される V_H 及び V_L のアミノ酸配列は配列番号： 4及び配列番号： 6 に示した。

又、 PRE— HV、リンカ一、 TA I Lに該当する部位のペプチドのァミノ酸配列はそれぞれ配列番号： 8、配列番号： 1 0及び配列番号： 1 2 に示されるものであり、該ぺプチドをコードする DNAの塩基配列はそれぞれ配列番号： 7、配列番号： 9及び配列番号： 1 1に示されるものである。なお、塩基配列決定後、上記単鎖抗体をコードする DNA断片を発現ベクター p Z e o SV2に組み込んだプラスミド、 p Z e o SV l C 9を含有する大腸菌 E. c o l i DH 5 a (p Z e o SV l C 9) は、茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている（微生物の表示： E. coli DH 5 a (p Z e o SV l C 9) ；受領日：平成 9年 8月 1日；受託番号： FERM P— 1 6 3 6 1) (国際寄託への変更日：平成 10年 8月 20日、受託番号： FERM B P— 64 6 7 ) 。実施例 5

HB 2 1 5 1で発現させた可溶性単鎖抗体の抗 E— t a g抗体を用いたゥエスタンブロット解析

上記で得られた 1 C 9由来組換えファージを大腸菌 HB 2 1 5 1に再感染させ、可溶性単鎖抗体を産生させた。得られたクローンを 1 mM ED

T A処理に付してペリブラズム溶液を溶出させ、該ペリブラズム溶液 20 μ Lを SDS— PAGEにかけ、単鎖抗体の C末端に付加された E— t a gに対する抗体を用いてウェスタンプロット解析を行った。その結果、図 2 (右のレーン）に示されるように約 30 kD aの単一なバンドが検出された（矢頭）。

実施例 6

単鎖抗体遺伝子を導入したクローンの単鎖抗体をコードする RNA発現のノーザンブロット解析による検討

陽性クローン 1 C 9及び陰性対照クローン y 9由来の単鎖抗体を発現する遺伝子領域を、哺乳動物細胞発現プラスミドベクター P Z e o SV 2

(ィンビトロゲン社製）の E c o R I切断部位に挿入した。得られた組換え発現ベクター p Z e o S V 1 C 9及び p Z e o S 9を B型肝炎ウイルス産生ヒト肝芽細胞由来細胞株（HB 6 1 1 ) にリン酸—カルシウム法にて導入後、 Z e o c i nに対して耐性を示した各々 3種のクローン（p Z e o SV l C 9導入ク口ーン： P3、 P8、 P9、 p Z e o SVy 9導入ク口ーン： N4、 N7、 N8) を得た。それらのクローンより RNAを調製し、それぞれのクローン由来の RNAについて、それぞれの単鎖抗体の c DNAフラグメント配列をプローブとしてノーザンブロット解析を行い、単鎖抗体由来の RNA量について検討した。ノーザンブロット解析は、 Du p o n t NEN社製のフィルター（ジーンスクリーンプラス（Ge n e s c r e e n p l u s) ) を用いて行った。ハイプリダイゼーションの条件は Du p o n t NEN社のプロトコールに従った。結果を図 3に示す。

図 3に示されるように p Z e o SV I C 9導入クロ一ン（レーン 4〜 6 ： P3、 P8、 P9) 及び p Z e o S V 9導入クローン（レーン:！〜 3 ： N4、

N7、 N8) は何れも導入された単鎖抗体由来の m RNAを産生した。また、何れのクローンを比べても、単鎖抗体由来の mRNA量の差は見られなかつた。

また、 Z e o c i nに対して耐性を示した別のクロ一ンについて同様の処理を行った結果を図 4に示す。図 4中、レーン 1〜4は各々、 pZeoSVlC9 導入クローン（P9、 P12- 2、 P10、 P20) の結果を、また図 4中、レーン 5、 6は各々、 pZeoSVy9導入クローン（N4、 N8) の結果を示す。先の図 3の結果と同様に、何れのクローンも導入された単鎖抗体由来の mRNAを産生し、また、何れのクローンを比べても、単鎖抗体由来の mRNA量に差は見られなかった。

実施例 7

形質転換細胞の B型肝炎ウィルスの R N A及び D N Aの解析

組織培養用 6 c mディッシュ又は 6ゥヱルプレートに単鎖抗体発現形質転換細胞（p Z e o SV l C9導入細胞 H B 61 1及び p Z e o SVy 9 導入細胞 HB 61 1) を植え、コンフルェントになったところで RNA及び DN Aを回収した。

RNAの回収は実施例 1に記載の方法で行い、解析は実施例 6に記載の方法で行った。解析の際に、プローブとして、 HBV DNA (Ge nB a n k Ac c e s s i o n No. X0 1 587) の全長を R e d i p r i me (アマシャム社製）を用いて³² Pでラベルしたものを用いて、

G e n e s c r e e n p l u s (デュポン NEN社製）を用いたノ —ザンブロット解析により、 HB Vの RNA量について検討した。その結果、 p Z e o SV l C 9 (レーン 4〜 6 ；各々 P3、 P8、 P9) 及び p Z e o S V 9 (レーン 1〜3 ；各々 N4、 N7、 N8) を保持する HB 6 1 1形質転換細胞は、何れも同様な B型肝炎ウィルス mRN Aの発現を示した（図

5) 。

また、別のクロ一ンについて同様の処理を行った結果を図 6に示す。図 6中、レーン 1〜 4は各々、 P9、 P12-2、 P10、 P20の結果を、またレーン 5、 6は各々、 N4、 N8の結果を示す。先の図 5の結果と同様に、何れのクローンも同様な B型肝炎ウィルス mRN Aの発現を示した。

DNAの抽出は次のように行った。 6ゥエルディッシュにおいて、 3 m Lの P B Sにて各ゥエルを洗浄後、 1 mLの溶解溶液（1 OmM T r i s -HC 1 , p H 7. 5， 10 mM EDTA, 1 % SDS) を加えてセルスクレーパーにて細胞を回収した。次いで ιΖι 00量のプロティナ —ゼ K (2 Omg/mL) を添加して 37 °Cにてー晚加温し、更に 1 1

00量のRNa s e A (10mg/mL) を加えて 37 °Cで 2時間加温した。上記の処理に付された細胞についてフエノール/クロロホルム Zィソァミルアルコールにより DNAを抽出した後、 1ノ10量の 3 M酢酸ナトリウムと 2倍量のエタノールを加えて DNAを沈殿させた。次いで、 7 0%エタノールで沈殿を洗浄後、 TE溶液（10mM T r i s -HC 1 , pH8. 0, 1 mM EDTA) にて溶解して D N A溶液とした。

このようにして調製された DN Aを制限酵素 H i n d I I Iにて 37°C で 4時間加温して切断し、前記と同様にフエノールノクロ口ホルムィソァミルアルコールによる抽出、エタノールによる沈殿及び 70%エタノールによる洗浄後、 TE溶液に溶解し、 Hy b o n d N⁺ フィルター

(アマシャム社製）を用いてサザンプロット解析を行い、形質転換細胞における HBVの DN A複製中間体量の検討を行った。ハイブリダィゼーシヨンの条件はアマシャム社のプロトコールに従った。また、プローブとしては、先のノーザンプロット解析と同じプロ一プを用いた。

その結果、図 7に示すように、 p Z e o S V 1 C 9導入 HB 61 1 (レーン 8、 9 ： P3、レ一ン10、11 : ?8、レーン 12、13： P9) 及び p Z e o S V γ 9導入 HB 61 1細胞（レーン 2、 3 ： N4、レーン 4、5： N7、レーン 6、7： N8) で検出される宿主染色体に組み込まれた HBVの DN A量は、バンドの濃さに顕著な差異がないことから、何れもほぼ同じコピー数の B型肝炎ウィルス遺伝子が宿主染色体 DN A中に存在することが確認された（図 7 のバンドの " I " の位置）。

しかしながら、 HB Vの複製中間体 DNAの存在量は、図 7のバンドの (直鎖状二本鎖 DNA) " 及び "S (1本鎖DNA) " の位置に示されるように、 p Z e o SVI C 9導入細胞（レーン 8〜 13) では p Z e o SVy 9導入細胞（レーン 2〜 7) に比べ有意に減少しており、この結果は本発明の抗 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質マウス抗体の可変領域を主成分とする単鎖抗体が、 B型肝炎ウィルスの DN A複製の抑制作用、即ち B型肝炎ウィルスの増殖抑制作用を有していることを示すものであるまた、別のクローンについて同様の処理を行った結果を図 8に示す。図 8中、レーン 2〜5は各々、 P9、 P12- 2、 P10、 P20の結果を、またレーン 6、 7は各々、 N4、 N8の結果を示す。

先と同様に、宿主染色体に組み込まれた HBVの DN A量は、

pZeoSVlC9導入クローン及び pZeoSVy 9導入クローンで差が認められなかつたが（図 8中、バンドの I) 、 HB Vの複製中間体 DNAの存在量は、 pZeoSVlC9導入クローンでは pZeoSVy9導入クローンに比べて有意に減少しており（図 8中、ノくンドの D 2、 D 1および S、ここで D 2は環状二本鎖 DNA) 、先の図 7と同じ結果が得られた。

実施例 8

形質転換細胞における単鎖抗体タンパク質産生の解析

pZeoSVlC9導入 HB611クローン（P12 - 2) 及び pZeoSVy 9導入 HB 61 1 クローン（N8) より、溶解バッファー（50mM Tris— HC1 pH7.5, lOmM EDTA, 0.5% Triton X 100, 1 /z g/mlァプロチニン， 1μ g/mlロイぺプチン、 100μ g/ml PMSF, 1 μ g/ml ぺプスタチン A) を用いて細胞のライセートを調製し、このライセート lOO gタンパク/ lmlバッファー 5 μ gに対して 10/ig正常ゥサギ IgG (Dako社）にて precleaningの後、抗 HBVコア一タンパク質ゥサギ抗体（Dako社）、または正常ゥサギ IgG抗体（Dako社）を、各々 5 g用いて抗原抗体反応を行わせた。次に、 I gGが結合する性質をもつプロテイン Gセファロース、 4FF (ブアルマシア社）を 25 1用いて、先の抗原抗体反応物を免疫沈降により回収した。回収物を S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、 sFvの C末端に付加した E- tagに対する抗体を用いて Western blottingを行った。その結果、図 9に示されるように、 P12- 2のライセ一トを用い、抗 HBVコア一タンパク質ゥサギ抗体による免疫沈降を行った場合（レーン 4) にのみ、約 30KDaの単一なバンドが検出された。この結果により、 HBVコア一タンパク質に対する単鎖抗体遺伝子が導入されて HBVの複製が抑制された形質転換細胞（P12 - 2) において、細胞内で単鎖抗体が産生され、この単鎖抗体と HBVコア一タンパク質が複合体を形成していることが確認された。

実施例 9

HB611の増殖に対する単鎖抗体の作用

図 7およぴ図 8で示された単鎖抗体による HBV複製抑制効果が、単鎖抗体の産生による細胞の増殖阻害に基づくものではないことを検討するため、 pZeoSVlC9導入 HB611クローン及び pZeoSVy 9導入 HB 6 1 1クローンの増殖性を、 MTTアツセィ（3-[4, 5- dimethylthiazol- 2- yl]- 2, 5 - diphenyltetrazoliumbromide, MTT, Sigma) 用レヽ飞調べ 7こ。

pZeoSVlC9導入 HB611クローン（6種）、 pZeoSV γ 9導入 HB611クローン

(3種）各々の平均値士 SDを求めた結果を図 1 0に示す。図 10中、參は pZeoSVlC9導入 HB611クロ一ンの結果を、また圆は pZeoSVy 9導入 HB611クローンの結果をそれぞれ示す。図 10に示される様に、測定開始から 180 時間後までの各々の形質転換細胞の増殖性に差は認められなかった。従つて、 HBVコア一タンパク質に対する単鎖抗体は、宿主細胞の増殖抑制を起こさせずに、 HBVコア一タンパク質と複合体を形成することによつて直接 H B Vの複製を抑制することが明らかとなつた。

実施例 1 0

組換えコスミドベクタ一の作製

HBVコア一タンパク質に対する単鎖抗体をコードする 1C9遺伝子の開始コドンの AT G配列の 57塩基対上流の E c o R I切断部位から、終始コドン TAGから 1 14塩基対下流の E c o R I切断部位までの、約 1. 1 K bの DNA断片を用いてコスミドベクタ一を作製した。また、 HBVコア一タンパク質に対する単鎖抗体としての活^を持たない y 9遺伝子についても、同様に約 1. 1 Kbの E c o R I断片を用いてコスミドベクターを作製した。具体的には、 Swa Iで切断した p Ax 1 CAw tコスミドべクターに平滑末端化処理した約 1. 1 Kbの前記 E c o R I断片を連結後、挿入断片を含まないコスミドベクターを Sw a Iで消化し、反応液の一部をインビトロパッケージングした。大腸菌 DH 5ひに感染後、出現したコロニーからコスミド DNAを回収し、 H i n d I I I /X b a Iで切断後、

1 %ァガ口一スゲル電気泳動にて解析した。その結果、 1 C 9遺伝子が正方向に揷入されたクローンが 4種、 γ 9が正方向に挿入されたクローンが 3種得られた。その内各々 3種を選別し、 H i n d I I I b a Iまたは S p e I /Nh e Iにより切断した。共に Hindlll, Xbal消化後の断片約 lkb、 Nhel, Spel消化後の断片約 1.7kbおよび約 1. Ikbの断片が検出されることにより、正しい方向に目的の DNA断片が挿入されていることを確認した。制限酵素により確認した結果を図 1 1に示した。

実施例 1 1

組換えアデノウィルスの作製

ヒトアデノウイルス 5型由来非増殖型組換えアデノウイルスベクター

(E 1及び E 3遺伝子を欠失）の E 1遺伝子欠失部位に、前記 1 C 9もしくは y 9の発現単位を挿入した組換えアデノウィルスベクターを作製するため、以下の操作を行った。なお、プロモーターは高発現プロモーターとして特開平 3— 1 6 80 8 7号公報に開示されている CAGプロモーターを用い、また組換えアデノウィルスの作製は既存の方法（M i y a k e e t a 1. ， P r o c . Na t l . Ac a d. S c i . ， Vo l . 9 3， 1 3 20 - 1 3 24 (1 9 96) 、及び特開平 7— 2 9 8 8 7 7) に従つた。

アデノウィルスの E 1遺伝子欠失部位に CAGプロモータ一のみが揷入された組換えアデノウイルスベクター、 Ax 1 CAw t (K a n e g a e e t a 1. , Nu c l e i c Ac i d Re s. 、 23、 3816 一 3821、 1 996) から、既存の方法（特開平 7— 298877) に従いウィルス DNA—末端蛋白質複合体を調製し、制限酵素 E c oT22 I及び C I a Iで同時消化した。この制限酵素消化ウィルス DNA—末端蛋白質複合体と、実施例 1 0で作製した単鎖抗体 1 C 9遺伝子、もしくは単鎖抗体 γ 9遺伝子を挿入したコスミドベクターとを用い、リン酸カルシゥム共沈法で 293細胞を形質転換した。生じた組換えアデノウィルスをクローニング後、ウィルス DNAの制限酵素消化（Xh o l ) により目的ウィルスを選別した。 Xh o lで切断した場合、親ウィルス由来では 4. 8 Kbの DNA断片が検出されるのに対し、目的のクロ一ンは 5. 9 Kb の DNA断片が検出される。ウィルス DN Aの制限酵素消化の結果を図 1 2に示した。解析の結果、 1 C 9遺伝子を発現する組換えアデノウイルスベクターが 2種、及び γ 9遺伝子を発現する組換えアデノウイルスベクタ一が 9種得られた。

1 C 9遺伝子を発現する組換えアデノウィルスベクタ一を遺伝子治療剤として用いることにより、 Β型肝炎ウィルスの増殖を抑制することができる。

産業上の利用の可能性

本発明の DN Αは、抗 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質一単鎖抗体をコードするものであり、該 DNAにコードされる単鎖抗体を細胞内で発現させることで、 B型肝炎ウィルスの DNA合成を抑制し、 B型肝炎ウィルスの増殖を抑えることができる。また、本発明の抗コア一タンパク質一単鎖抗体は、標的がコア一タンパク質抗原であるため、宿主免疫を高めることでウィルス排除を目指す療法では効果が期待し難いプレコア一変異ウイルス症例においても、優れた効果を期待し得る。

Claims

請求の範囲

1. B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体をコードすることを特徴とする DNA。

2. (A) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする DNA、

(C) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA、

からなる群より選ばれる DNAを含んでなる、請求項 1記載の DNA。

3. (F) 配列番号： 6に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドをコードする DNA、

(H) 配列番号： 5に記載の塩基配列からなる DNA、

( J) (F) 〜（ I ) のいずれか記載の DNAに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A、からなる群より選ばれる DNAを含んでなる、請求項 1記載の DNA。

4. 下記の、（A) 〜（E) で示される DNAからなる群より選ばれる DNAと、（F) 〜（J) で示される DNAからなる群より選ばれる D N Aを共に含んでなる、請求項 1記載の DNA、

(C) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNA、

(D) 配列番号： 3に記載の塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、揷入又は付加された塩基配列からなる DNA、

(H) 配列番号： 5に記載の塩基配列からなる DNA、

(J) (F) 〜（ I ) のいずれか記載の DNAに、ストリンジェントな条

5. (K) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする DNA、

(M) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNA、

(N) 配列番号： 1に記載の塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなる DNA、及ぴ

(O) (K) 〜（N) のいずれか記載の DNAに、ストリンジユントな条件下でハイブリダイズする D N A、

6. 請求項 1〜5いずれか記載の DNAにコードされる、 B型肝炎ウイルスコア一タンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体。

7. 請求項 1〜5いずれか記載の DNAを含有するベクター。

8. 請求項 7記載のべクターによつて形質転換された形質転換体。

9. 請求項 8記載の形質転換体を、請求項 1〜 5いずれか記載の DN A にコードされる単鎖抗体の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、 B型肝炎ウィルスコア一タンパク質に結合する能力を有する単鎖抗体の生産方法。

10. 請求項 6記載の単鎖抗体を有効成分とする、 B型肝炎治療剤。

1 1. 請求項 1〜5いずれか記載の DNAを有効成分とする、 B型肝炎に対する遺伝子治療剤。

1 2. アデノウイルスベクタ一を用いることを特徴とする、請求項 1 1 記載の遺伝子治療剤。

1 3. B型肝炎が急性肝炎又は慢性肝炎である、請求項 1 1又は 1 2記載の遺伝子治療剤。