[go: up one dir, main page]

WO1999039571A1 - Cellules souches embryonnaires d'animaux non humains et de tels animaux possedant des genes alleles de chaine lourde de myosine des muscles lisses - Google Patents

Cellules souches embryonnaires d'animaux non humains et de tels animaux possedant des genes alleles de chaine lourde de myosine des muscles lisses Download PDF

Info

Publication number
WO1999039571A1
WO1999039571A1 PCT/JP1999/000505 JP9900505W WO9939571A1 WO 1999039571 A1 WO1999039571 A1 WO 1999039571A1 JP 9900505 W JP9900505 W JP 9900505W WO 9939571 A1 WO9939571 A1 WO 9939571A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
smooth muscle
myosin heavy
heavy chain
muscle myosin
Prior art date
Application number
PCT/JP1999/000505
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takashi Harigai
Kazuhide Hasegawa
Tomoyasu Sugiyama
Makoto Kuroo
Youichi Nabeshima
Ryozo Nagai
Original Assignee
Vessel Research Laboratory Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vessel Research Laboratory Co., Ltd. filed Critical Vessel Research Laboratory Co., Ltd.
Priority to EP99902843A priority Critical patent/EP1053677A4/en
Publication of WO1999039571A1 publication Critical patent/WO1999039571A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/02—Cells from transgenic animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • Akitoda has a mutant smooth muscle myosin heavy chain gene
  • the present invention relates to a novel strain of animal and a method for producing the same, and a novel embryonic stem cell used for the production. More specifically, it is useful as a new research material for biomedical research on the physiological function and gene expression mechanism of smooth muscle myosin heavy chain in blood vessels, etc., and is also useful for the study of the pathophysiology of circulatory diseases and the development of therapeutic agents.
  • the present invention relates to an animal having a mutated smooth muscle myosin heavy chain gene used as a simple experimental animal, a method for producing the same, and a novel embryonic stem cell used for the production thereof. Background art
  • the myosin heavy chain of vascular smooth muscle cells expresses two types of isoforms, SM1 and SM2, in differentiated smooth muscle cells, and these two are selected from the same chromosomal gene (SM1 gene).
  • SM1 gene chromosomal gene
  • SMemb chromosomal gene
  • the present invention provides a mutant animal having a mutant gene in which the function of a smooth muscle myosin heavy chain gene is substantially lost by manipulating the smooth muscle myosin heavy chain gene by using a genetic engineering technique.
  • the purpose of the present invention is to provide embryonic stem cells which can be applied to the production and differentiation experiments of such mutant animals.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a smooth muscle myosin heavy chain gene mutant animal using such embryonic stem cells.
  • the present invention provides a method for culturing cells from the above embryonic stem cells or mutant animals. And to provide cells having a mutation in the smooth muscle myosin heavy chain gene whose genetic background is clear. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-described problems, and as a result, have found that a homologous combination between a smooth muscle myosin heavy chain gene derived from a mouse chromosome and a vector DNA designed and prepared for homologous recombination.
  • the gene has a substantially non-functional smooth muscle myosin heavy chain gene, and replaces the original smooth muscle myosin heavy chain gene.
  • the present invention has been completed.
  • the inventors have succeeded in differentiating cells mutated with the production of animals or culturing cells from the produced animals to obtain new cells, thereby completing the present invention.
  • the present invention includes the following inventions (1) to (15).
  • the mutant gene is obtained by deleting at least a part of the base sequence of a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene, thereby inserting a foreign gene into the chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene, or It is obtained by replacing a foreign gene with at least a part of a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene, or a combination thereof, and the above-described operation substantially serves as a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene.
  • the mutant gene is obtained by deleting at least a part of the base sequence of a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene, thereby inserting a foreign gene into the chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene, or It is obtained by replacing a foreign gene with at least a part of a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene, or a combination thereof, and the above-described operation substantially serves as a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene.
  • the mutant gene is obtained by inserting a repo allele into a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene
  • the non-human animal or progeny thereof according to (8).
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a homologous recombination strategy for mutating a mouse / smooth muscle myosin heavy chain gene, primers used for PCR, and probes used for Southern plotting.
  • FIG. 2 shows the results of Southern blot analysis of ES cell chromosome DNA in which homologous recombination has occurred.
  • FIG. 3 is a photograph showing the result of PCR showing that the chromosome of SM 1 BMC # 1 has a mutated gene by homologous recombination.
  • FIG. 4 shows the number of galactosidase-positive cells in a culture dish coated with laminin.
  • the non-human animal embryonic stem cell of the present invention or a cell derived therefrom is a mutant smooth muscle that does not substantially function as a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene (sometimes simply referred to as “wild-type gene”). It is characterized by including the myosin heavy chain gene (sometimes simply referred to as “mutant gene”).
  • the expression that the mutant gene does not substantially function as a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene means that the gene product (translation product) of the mutant gene is a wild-type chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain. Means that it cannot be obtained as a protein with the same structure as Specifically, a mutant gene that “does not substantially function as a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene” can be obtained by genetic engineering techniques, for example, by deleting at least a part of the nucleotide sequence of the gene or deleting a foreign gene. Obtained by insertion or substitution.
  • Mutant genes that do not function substantially include, for example, those in which the promoter has been destroyed due to deletion or substitution of the nucleotide sequence in the promoter region and whose transcriptional activity has been lost, and those that have been stable due to deletion or substitution of the nucleotide sequence in the untranslated region.
  • a transcript cannot be obtained, or a gene product cannot be obtained due to deletion or substitution of the nucleotide sequence of the translation region encoding the gene product or insertion of another gene, or a gene product cannot be obtained. Even if the protein is obtained, the protein does not function as a smooth muscle myosin heavy chain.
  • a non-human animal embryonic stem cell containing a mutant gene that does not substantially function as a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene refers to a mutation as described above in the smooth muscle myosin heavy chain genomic gene. Refers to a non-human animal embryonic stem cell that has substantially lost its function as a smooth muscle myosin heavy chain gene by artificially adding the same. In such a non-human animal embryonic stem cell, for example, by inserting another gene into the smooth muscle myosin heavy chain gene, the mutant gene substantially functions as a smooth muscle myosin heavy chain gene. Embryonic stem cells (ES cells) of non-human animals that do not have them.
  • ES cells Embryonic stem cells
  • the term "cells derived therefrom” refers to a cell line obtained by culturing the embryonic stem cell according to the present invention or a cell obtained by inducing differentiation of the embryonic stem cell according to the present invention. Means cells derived from embryonic stem cells. At this time, "cells obtained by inducing differentiation of embryonic stem cells” Depending on the situation, differentiation into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, myocardium, etc. can be achieved by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed. Series, Vol. 8, pp. 147, 1995, Shinichi Aizawa, Yodosha, etc.) The cells having the mutant myosin heavy chain gene thus obtained are useful for studying the action and function of the smooth muscle myosin heavy chain gene and protein in vitro.
  • the non-human animal of the present invention includes both an animal in which the smooth muscle myosin heavy chain gene is heterozygously mutated and an animal in which the smooth muscle myosin heavy chain gene is mutated.
  • the non-human animal of the present invention also includes a chimeric animal in which the smooth muscle myosin heavy chain gene is partially or deficient in a part of its constituent cells.
  • the non-human animal used in the present invention is not particularly limited as long as it can produce a chimeric animal, and can be applied to all non-human animals such as mammals, birds, amphibians, and fish.
  • mammals such as egrets, pigs, sheep, sheep, goats, goats, and rat mice are preferably used, and furthermore, the ontogeny and life cycle Due to their short length and relative ease of reproduction, rodents such as mice and rats, particularly mice, are particularly preferably used to create animal models.
  • the cell of the present invention there is a method for producing a cell having a smooth muscle myosin heavy chain gene which does not substantially function by a mutation means.
  • the produced cell is an embryonic stem cell
  • the animal of the present invention can be obtained by producing a chimeric animal from this cell. Create animals with heterozygous or homozygous mutations in the smooth muscle myosin heavy chain gene in all
  • cells can be obtained by isolating and culturing cells from an animal having the mutant gene thus produced.
  • a method of obtaining a substantially non-functional smooth muscle myosin heavy chain gene includes a method of deleting (deleting) at least a part of the nucleotide sequence of a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene, A method of replacing a base to a stop codon, a method of inserting a foreign gene into a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene, and a method of replacing a foreign gene with at least a part of a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene
  • a method known in the art is used.
  • the deletion, insertion or substitution site is not particularly limited as long as the site of the function of the smooth muscle myosin heavy chain gene product is substantially lost, and the target site is the site of the smooth muscle myosin heavy chain gene. It may be a promoter region, an untranslated region, a translated region, or the like.In addition, one or more sites may be used as a target, and a plurality of sites may be used as targets. In this case, the gene manipulation means applied to each site may be the same or different. However, for efficient and complete loss of gene function, it is preferable to target the translation region.
  • the foreign gene when a foreign gene is inserted or replaced into a wild-type gene, the foreign gene includes a reporter gene and a drug resistance gene, for example, neomycin resistance gene (neo), herpes virus Ruthymidine kinase (HSV-tk), diphtheria toxin A fragment gene (DT-A), and the like, among which it is preferable to insert a reporter gene into a wild-type gene.
  • neomycin resistance gene neo
  • HSV-tk herpes virus Ruthymidine kinase
  • DT-A diphtheria toxin A fragment gene
  • reporter gene for example, neomycin resistance gene (neo), herpes virus Ruthymidine kinase (HSV-tk), diphtheria toxin A fragment gene (DT-A), and the like, among which it is preferable to insert a reporter gene into a wild-type gene.
  • repo overnight gene refers to a gene that is linked
  • the expression of the reporter gene (for example, when the reporter gene is 1 ac Z, it becomes a substrate)
  • Cells expressing the target gene can be detected with the naked eye using the coloration of the dye as an index, and the presence or absence of expression can be easily detected, which is preferable. Therefore, by using a reporter gene, in the case of a heterozygous animal having a mutated gene, the expression cells can be detected using the reporter gene expression as an index, and at the same time, the other chromosomal locus can be detected. It is hoped that the regulation of expression of the functional (non-mutated) smooth muscle myosin heavy chain gene maintained above will be examined.
  • the reporter gene that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a commonly used reporter gene.
  • Zeogene (CAT) Luciferase gene (L uc) derived from white pepper, and green fluorescent protein gene (GFP) derived from jellyfish.
  • CAT Zeogene
  • L uc Luciferase gene
  • GFP green fluorescent protein gene
  • the 3-galactosidase gene (1 acZ) derived from Escherichia coli is preferable because histological analysis can be easily performed using a visible light chromogenic substrate.
  • the gene having a smooth muscle myosin heavy chain gene which does not substantially function is contained.
  • the means for producing cells to be transformed but homologous recombination is preferred.
  • Homologous recombination techniques are known in the art and are not particularly limited, but can be performed, for example, as follows.
  • the chromosome-derived smooth muscle myo heavy chain gene of the animal species whose mutation is to be mutated to the smooth muscle myo heavy chain gene is isolated by a conventional method.
  • methods for isolating the chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene include, for example, a part of the smooth muscle myosin heavy chain gene whose base sequence has already been reported from the genomic DNA library or cDNA.
  • a method for obtaining a clone of a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene containing an untranslated region by screening using plaque hybridization using a part of the gene as a probe is used.
  • a homologous recombination targeting vector for mutating the smooth muscle myosin heavy chain gene is prepared.
  • Design of the targeting vector for homologous recombination is to delete or replace part or all of the wild-type gene with another non-homologous nucleotide sequence, and then delete or replace the wild-type gene with another sequence.
  • the upstream and downstream regions surrounding the homologous portion may be designed to have a nucleotide sequence homologous to the smooth muscle myosin heavy chain gene.
  • a reporter gene When inserted into the smooth muscle myosin heavy chain gene, it may be designed so that the heterologous sequence portion contains the reporter gene sequence.
  • the sequence of the translation region of the smooth muscle myosin heavy chain gene may be partially or entirely deleted or replaced with another non-homologous nucleotide sequence, and the translation frame of the reporter gene may be replaced with the smooth muscle myosin heavy chain. It is preferably designed to match the translation frame of the chain gene.
  • genes commonly used for drug selection such as neomycin, are selected so that selection by drug resistance is possible.
  • Syn resistance gene neo
  • herpesvirus thymidine kinase thymidine kinase
  • HSV-tk diphtheria toxin A fragment gene
  • DT-A diphtheria toxin A fragment gene
  • genes can be used as marker genes to select cells into which the vector has been incorporated or cells in which the target homologous recombination is likely to occur (see Biomedical Series, Vol. Vol. 43-82, 1959, Shinichi Aizawa, Yodosha, etc.). For example, when it has neo, it shows resistance to aminoglycoside antibiotics such as G418, and when it has HSV 1 tk, it shows sensitivity to nucleic acid derivatives such as ganciclovir.
  • the targeting vector for homologous recombination is a fragment obtained by cloning a chromosome-derived smooth muscle myosin heavy chain gene and cleaving it with an appropriate restriction enzyme or a fragment obtained by PCR (polymerase chain reaction).
  • the more amplified DNA fragment and the like are ligated to a fragment containing linker DNA, a reporter gene and a drug resistance marker gene synthesized by a DNA synthesizer or the like in an appropriate order according to the above design. (Ligation), and the preparation of the vector DNA for homologous recombination can be performed by any ordinary DNA recombination technique in a test tube.
  • the targeting vector for homologous recombination thus prepared is introduced into an appropriate cell.
  • the cells used here are preferably those derived from an animal closely related to the animal to be produced and usually used for producing chimeric animals such as embryonic stem (ES) cells.
  • the method for introducing DNA into cells is a conventional method, for example, an electoral poration method, a calcium phosphate method, a lipofection method, and a DE AE-dextran method. The law can be used.
  • the smooth muscle myosin heavy chain gene of the chromosome derived from the introduced cell has been recombined in two homologous sequence regions with the targeting vector. As a result, a mutant locus is formed in which the sequence surrounded by these regions is replaced with a sequence derived from the vector DNA.
  • Cells into which the targeting vector has been incorporated can be selected based on the expression of a marker gene such as a drug resistance gene derived from the vector DNA, for example, by culturing in the presence of a drug for an appropriate period.
  • a marker gene such as a drug resistance gene derived from the vector DNA
  • cells in which mutations have occurred due to homologous recombination can be performed by the PCR method (Experimental Medicine, Separate Volume Biomanual Series, Vol. 8, pp. 83-103, 1995). (Shinichi Aizawa, Yodosha, etc.) ⁇ ⁇ Analysis and selection by Southern blotting method (“Engineering Engineering Experiment Manual”, supervised by Tatsuji Nomura, Motoya Katsuki, 1987, Kodansha), etc. Confirm that the mutations that occur are generated.
  • a non-human animal embryonic stem cell having the mutant gene of the present invention can be obtained.
  • a chimeric animal of the present invention is provided by using a cell having a mutant locus obtained by the above method.
  • the above concept is described in detail below.
  • a chimeric mouse is produced by the agglutination method
  • cells eg, ES cells
  • a mutant locus has been generated for example, ES cells
  • an early embryo (8-cell stage) in which the zona pellucida is removed is used.
  • Embryo And transplanted into the uterus of pseudopregnant mice to obtain offspring.
  • the offspring obtained in this way are subjected to the same PCR method and Southern blotting method as described above, as well as the color of the offspring and, if a reporter gene is inserted, detection of the reporter gene product. Screen offspring with the mutated gene. Thereby, a non-human animal containing the mutant gene of the present invention can be obtained.
  • the chimeric animal thus obtained can be bred by breeding with an animal of an appropriate strain of the same species, and the phenotype of the pup is used as an index in the same manner as described above to obtain the target ES. Identify chimeric mice with germ cells derived from the cells. By repeating such crosses, progeny of non-human animals containing the mutant gene of the present invention are obtained.
  • an animal having a smooth muscle myosin heavy chain gene heterozygously mutated can be obtained from the offspring of the chimeric animal obtained by crossing the above-obtained chimeric animal with an animal of an appropriate strain of the same species.
  • homozygous mutant animals can be obtained from their offspring. Whether the animal has a heterozygous or homozygous mutation in the smooth muscle myosin heavy chain gene can be confirmed by analyzing the chromosomal DNA by PCR and Southern blotting in the same manner as described above.
  • the method of breeding animals produced according to the present invention does not require any special method, and can be bred in the same manner as normal animals.
  • a cell obtained by separating and culturing from the chimeric non-human animal or its progeny obtained by the above method.
  • Cells in the above concept means cells isolated and cultured from a part of the body of the chimeric non-human animal or its progeny obtained above, It may be a somatic cell or a germ cell, but preferably a somatic cell, particularly a somatic cell that can be subcultured, such as a bone marrow cell and a smooth muscle cell, is preferably used.
  • the cells separated and cultured according to the present invention are cultured using methods known in the art.
  • mice embryonic stem cells derived from the mouse strain 129 were used for gene mutation.
  • a chromosome-derived gene containing the translational origin of the smooth muscle myosin heavy chain of another strain of mice was prepared, and this gene was transformed into PstI and Spe Digestion with I yielded a fragment of approximately 0.8 Kb.
  • Plaque hybridization was performed by a conventional method using the thus obtained genomic DNA fragment (approximately 0.8 Pb) of the mouse smooth muscle myosin heavy chain (labeled with 32 P by the random primer method) as a probe.
  • the mouse smooth muscle myosin heavy chain gene of interest was cloned from the 129 SV mouse dienomic library-1 (Stratagene). As a result of screening about 100,000 clones, three positive clones were obtained. When phage DNA was prepared from these clones, it was found that all clones had a Not I digested fragment of about 15 kb.
  • the targeting vector for homologous recombination shown in FIG. 1 was designed.
  • the entire codon encoding the smooth muscle myosin heavy chain from the start codon to the stop codon is not contained in one exon but divided into multiple exons. ing.
  • the open squares in the SM1 gene allyl in FIG. 1 indicate exons containing the translation initiation site of the smooth muscle myosin heavy chain gene.
  • it was designed to prevent the expression of the smooth muscle myosin heavy chain protein without destroying the transcription control system as much as possible. The method for preparing the same will be described in detail below.
  • the targeting vector for homologous recombination prepared in the present Example is, as shown in FIG. 1, composed of the start codon of the smooth muscle myosin heavy chain gene.
  • the translation frame of the Escherichia coli / 5-galactosidase gene (1 ac Z in FIG. 1) is ligated downstream so that it matches the translation frame of SM1, and the neomycin resistance gene (neo in FIG. 1) and The herpesvirus thymidine kinase gene (tk in Fig. 1) is ligated in the forward direction.
  • a 4.5 kb, 4.5 kb fragment 5 'of the 3 _ galactosidase gene A homologous region of about 5 kb from the smooth muscle myosin heavy chain gene is added 3 'to the 3' side of the thymidine kinase gene, and diphtheria toxin A is 5 'to the 4.5 kb sequence.
  • Fragment gene (D in Fig. 1) T-A) is linked, and a sequence of B1uescript plasmid (not shown) is linked upstream of the T-A).
  • the fragments (ie, 1acZ, neo, and tk) to become parts are sequentially ligated by a conventional method of genetic manipulation using Escherichia coli as a host.
  • a diphtheria toxin A fragment gene was ligated to the outside of the 5'-side homologous region, whereby a targeting plasmid for homologous recombination of about 21 kb was obtained.
  • the targeting plasmid for homologous recombination includes a Cre-1 o XP system on both sides of neo and tk (Experimental Medicine Bio Manual Series, Volume 8). , the first 7 1-8 2 pages, 1 9 9 5 years, Shinichi Aizawa al., sheep soil, Inc., etc.) adopted, 1 of 341 116 0? There is an array ( ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in Fig. 1). This makes it possible to remove neo and tk by expressing the Cre protein derived from bacteriophage P1 after obtaining a homologous recombinant.
  • the thus obtained evening targeting plasmid for homologous recombination was cleaved with the restriction enzyme SrfI to be linearized, and used for the following introduction into ES cells.
  • ES cells are maintained in an undifferentiated state by LIF (leukemia inhi
  • LIF leukemia inhi
  • the cells were cultured on a feeder cell using a medium supplemented with a bitory factor.
  • the ES cell culture medium includes Dulbecco's modified Eagle's medi urn (High glucose), Gibco, Code No. 11960- 1 5% fetal calf serum to 010), manufactured by 5 X 1 0 4 U / m 1 of LIF (AMRAD Corp.), 1 0- 4 M 2-mercaptoethanol, non-essential amino acids (Gibco, Code N o. 11360-013), sodium pyruvate (manufactured by Gibco, Code No. 1114 0-019), and L-glutamine (manufactured by Gibco, code No. 25030-024), and penicillin potassium as an antibiotic.
  • ES medium includes Dulbecco's modified Eagle's medi urn (High glucose), Gibco, Code No. 11960- 1 5% fetal calf serum to 010), manufactured by 5 X 1 0 4 U / m 1 of LIF (AMRAD Corp.), 1 0- 4 M 2-mercaptoethanol, non-essential
  • streptomycin sulfate were added to the final concentrations of 50 U / m1 and 50 g / m1, respectively.
  • a feeder cell a mouse embryo-derived primary cultured fibroblast (EF cell, manufactured by Lifetech Oriental), which had been arrested by mitomycin C treatment, was cultured until it became confluent.
  • ES cells were seeded 1 0 cm tissue about 3 X 1 0 6 cells per culture culture dish on feeder cells at 3 7 ° C, 5% C_ ⁇ 2, were cultured in the above medium, 2-3 The cells were subcultured daily. The medium was changed every day.
  • the primers used for PCR include the two primers shown in Fig. 1, namely, primer 1 and a primer corresponding to the sequence further upstream from the 5'-side homologous region of the targeting vector for homologous recombination.
  • a primer obtained by synthesizing a primer 1-2 corresponding to 1 ac Z sequence in one targeting vector using a DNA synthesizer was used.
  • the base sequences of the primers 1 and 2 are as follows.
  • Wild-type and mutant ES cell smooth muscle myosin heavy chain genes were examined by Southern blotting. Using a fragment of about 0.7 kb in FIG. 1 as a specific probe, the procedure was as follows. Genomic DN from cultured ES cells
  • A is prepared, digested with the restriction enzyme BamHI, then electrophoresed on a 0.8% agarose gel, and treated with nylon membrane (nylon membrane).
  • FIG. 2 shows the results of Southern blotting digested with the restriction enzyme BamHI at this time. As is clear from FIG. 2, only about 20 kb of wild-type DNA was detected in wild-type ES cells, and four out of six ES cells were detected.
  • Chimera mice are produced by mixing the early embryos (8-cell embryos) from which the zona pellucida has been removed with each ES cell that has been dissociated by the treatment with tribcine and co-generating them.
  • the 8-cell stage embryos were extracted from the oviduct and ovum of the superovulated mouse for oocyte collection. Transfer the collected 8-cell stage embryos to acidic Tyrode's solution and dissolve the zona pellucida.
  • the ES cells used for agglutination are treated with trypsin to give a certain amount of cell mass (10 to 15 cells).
  • C_ ⁇ 2 incubator base one coater (3 7 ° C, 5% C_ ⁇ 2), collect the cells that did not adhere to the petri dish.
  • C_ ⁇ 2 incubator one 3 7 ° (:, and cultured overnight at 5% C_ ⁇ 2) to prepare a chimeric embryo.
  • mice are generally allowed to give birth spontaneously, but if they are not born on the scheduled date (usually 17 days after transplantation), the fetus is removed by cesarean section. The offspring of the born mice were raised in foster parents as usual.
  • the chimeric mouse obtained in (5) was crossed with a C57BL / 6J mouse, and it was examined whether or not a litter derived from ES cells could be obtained. If the germ cells of the chimeric mouse are derived from ES cells, the resulting offspring will have a coat color other than black. When more than 1500 offspring were obtained from 11 chimeric mice, 7 brown offspring were obtained. Furthermore, when the gene was confirmed by the PCR method, among these, the mutant type was confirmed in 4 pups. This confirmed that ES cells were differentiated in the germline of the chimeric mice thus produced.
  • a heterozygous mouse having a mutant smooth muscle myosin heavy chain gene was generated from the chimeric mouse.
  • the chimeric mouse in which ES cells were confirmed to have differentiated into the germ line in the above was obtained by mating with a C57BLZ6J mouse, Hetero mice harboring the mutant smooth muscle myosin heavy chain gene were obtained from offspring.
  • chromosomal DNA is extracted from the cells of the tail and PCR or Southern hybridization using another primer is performed according to the method described above. —A substance having galactosidase activity was determined to be a hetero mouse (for details, see Example 2).
  • the tail of the hetero mouse obtained in Example 1 was cut off and fixed by incubating with a fixing solution (2% formaldehyde, 0.2% daltaraldehyde) at room temperature for 10 minutes. After washing with PBS, X-Gal reaction solution
  • the induction of differentiation of the recombinant ES cells was performed according to the method of Drab, M. et al. (FASEB J. 11, 9, 05- 9 15, 1997). After culturing the recombinant ES cells 40-2 obtained in Example 1 (4) to confluence on feeder cells, treat them with 0.25% trypsin and 0.04% EDTA. As a result, the recombinant ES cells were peeled off. Next, about 4 ⁇ 10 6 cells were seeded per 10 cm gelatin-coated petri dish.
  • the cells were washed with PBS reaches the Konfurue cement and cultured in ES medium, and treated with 0.2 5% trypsin and 0. 0 4% ED TA. Leave at room temperature for 1-2 minutes to allow cells to After detachment, 10 ml of medium (DMEM, 10% fetal serum) was added, and the cell suspension was transferred to a bacterial culture dish. At this time, the culture was divided into one to three culture dishes from one 10 cm petri dish. Cells cannot adhere and form cell clumps. The culture was changed every two days and the culture was continued for 7 days.
  • DMEM 10% fetal serum
  • the cell aggregate was collected by spontaneous sedimentation, fresh medium was added, and the resultant was spread on a gelatin-coated 24-well culture dish. Two to three cell aggregates were placed per well. The next day, 1 0- 8 M retinoic acid and 0. 5 X 1 ( ⁇ 3 ⁇ dibutyryl cyclic AMP (dibutyryl-cyclicAMP) were cultured for 5 days with the addition of. Further replaced with regular medium, 3 7 ° .
  • Example 4 Isolation and culture of bone marrow cells
  • the femur was excised from the chimeric mouse obtained in Example 1 (5), and both ends were cut off with scissors.
  • a 5 ml culture medium EM medium containing 10% fetal bovine serum and 5 OmM 2-mercaptoethanol
  • EM medium containing 10% fetal bovine serum and 5 OmM 2-mercaptoethanol
  • Cell clumps were loosened by passing them through an lml syringe.
  • Loosened cells were transferred to a culture dish for tissue culture, and cultured in the same culture medium in C 0 2 incubator 3 3 ° C (5% C0 2).
  • the floating cells were removed by changing the medium once a week, and the adherent stromal cells were cultured as bone marrow cells.
  • Example 5 Generation of SM1 reporter bone marrow cell line
  • the SV40 large T antigen gene used in this example was prepared as follows. Temperature sensitive SV40 large ⁇ p SV ts A58 ori (-) described by Ochito et al. Was used as a plasmid for antigen gene expression (Jpn. J. Cancer Res. 82: 1344, This was cut with the restriction enzyme Bg1I, and the obtained fragment of about 7 kb containing the SV40 large T antigen gene was used as a fragment for gene introduction into cells.
  • the temperature-sensitive SV40 large T antigen gene prepared above was introduced into the bone marrow stromal cells of Example 4 cultured for about one month to prepare a cell line.
  • the gene was introduced into the cells using LIPOFECTAMINE (manufactured by GIBCO BRL) according to the attached protocol. Generally, about 9 mg of gene was used per 6 cm diameter culture dish (about 1 ⁇ 10 5 cells). Cells that formed colonies three weeks after gene transfer were isolated using a pipetman and used as a cloned cell line SM1BMC # 1.
  • the mutant bone marrow cells, SM 1 BMC # 1, obtained in this way were submitted to the Ministry of International Trade and Industry, Deposit No. FE RM P-166678, and based on the Budapest Treaty from the original deposit at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the Ministry of International Trade and Industry on January 20, 2001 Deposit (international deposit) transfer procedures were taken and assigned a deposit number of FE RM BP-6266.
  • Example 5 After washing the SM1BMC # 1 of Example 5 cultured in a tissue culture dish with PBS, incubate with a fixative (2% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde) at room temperature for 10 minutes to fix. did. After washing with PBS, use X-Ga1 reaction solution (5 mM potassium ferricyanide, 5 mM potassium ferrosyanide, 2 mM magnesium chloride, lmg Zml X-Gal, PBS) at 37 ° C for 4 hours. Incubated 1 ⁇ .
  • a fixative 2% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde
  • the ⁇ -galactosidase activity was measured by washing the cells with PBS, replacing the cells with a preservative solution (4% formaldehyde), and counting the positive cells under a microscope with the cells that stain blue as positive cells. As a result, the presence of positive cells was confirmed.
  • the cells or animals of the present invention can be used as new research materials and disease state models for biomedical research such as the role of the smooth muscle myosin heavy chain gene in blood vessels and other unknown physiological functions and gene expression mechanisms. Is expected.
  • an animal containing a mutant gene in which a smooth muscle myosin heavy chain gene is mutated and a reporter gene such as a 3-galactosidase gene is inserted has the following excellent characteristics.
  • the expression of a repo overnight gene in a mutant gene located on one chromosomal locus (for example, when the repo overnight gene is a 0-galactosidase gene, a dye serving as a substrate)
  • the expression of cells can be detected using an index as an index, and the expression regulation of a functional smooth muscle myosin heavy chain gene maintained on the other chromosomal locus can be examined.
  • cells or animals according to the present invention can be a convenient test system for evaluating new drugs for atherosclerosis and for studying the bioavailability or effects of compounds such as older drugs on atherosclerosis. Be expected.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

明糞田曞 倉異型平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を有する
非ヒト動物の胚幹现胞および非ヒト動物 技術分野
本発明は、 新芏な系統の動物及びその生産方法、 ならびにその生産に 䜿甚される新芏な胚幹现胞に関するものである。 さらに詳しくは、 平滑 筋ミオシン重鎖の血管などにおける生理機胜や遺䌝子発珟メカニズム等 の生物医孊的研究に甚いる新しい研究材料ずしお、 さらには埪環噚疟患 の病態生理の研究や治療剀開発のために有甚な実隓動物ずしお䜿甚され る平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を倉異させた動物及びその生産方法、 なら びにその生産に䜿甚される新芏な胚幹现胞に関するものである。 背景技術
平滑筋现胞の興味深い特城は、 その䞭にある筋フむラメントが现胞圢 質に埓っお量的に倉化するだけではなく、 ァむ゜フォヌムスむッチング ず呌ばれる珟象により、 筋フィラメントを構成する構造蛋癜の分子皮が 倉化するこずにある。 血管平滑筋现胞のミオシン重鎖は、 分化した平滑 筋现胞では S M 1 ず S M 2ずいう 2皮類のアむ゜フォヌムが発珟しおお り、 この 2぀は同䞀の染色䜓遺䌝子 S M 1遺䌝子 から遞択的スプラ むシングにより生じおいる。 未分化な胎児期の平滑筋では S M 1 ずずも に S M e m bず呌ばれる別の染色䜓遺䌝子から生じたァむ゜フォヌムが 発珟しおいる。 重芁な点は、 平滑筋分化の指暙ずしおの有甚性をミオシ ン重鎖のアむ゜フォヌムがもっず考えられおいるずころにある。
ミオシン重鎖のアむ゜フォヌムに関する平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子に 関しおは、 ゥサギ c DNA (Nagaiら、 The Journal of Biological C hemistry, 第 2 6 4å·» 1 7号、 第 9 7 3 4〜 9 7 3 7頁、 1 9 8 9 幎 、 およびマりス c DNA (Hasegawaら、 Biochemical and Biop hysical Reseach Communications, 第 2 3 2卷、 第 3 1 3〜 3 1 6 頁、 1 9 9 7幎 などに報告されおいる。 しかし、 平滑筋ミオシン重鎖 遺䌝子を欠損した動物は知られおいない。
䞀方、 平滑筋の培逊现胞に関しおは、 S V 4 0ラヌゞ T䞀抗原遺䌝子 を導入した现胞株が確立 Hasegawaら、 Journal of Moleculer and Cellular Cardiology, 第 2 9巻、 第 2 1 7 7〜 2 1 8 6頁、 1 9 9 7 幎されおいる。 しかし、 现胞の染色䜓の平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子に 倉異を加えるこずにより該遺䌝子の機胜を欠損させた现胞株は未だ知ら れおいない。
このため、 平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子機胜が欠損した现胞や動物は、 平滑筋ミオシン重鎖の血管などにおける生理機胜や遺䌝子発珟メカニズ ム等を研究する䞊で、 さらには平滑筋ミオシン重鎖から起因する埪環噚 疟患の病態生理の研究や治療剀の開発を行うにあたっお、 非垞に有甚で あるず圓然考えられるにもかかわらず、 そのような现胞や動物は未だ開 発されおおらず、 その開発が非垞に切望されおいる。
したがっお、 本発明は、 遺䌝子操䜜技術を甚いお平滑筋ミオシン重鎖 遺䌝子を操䜜し、 これにより実質的に染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺 䌝子の機胜が倱われた倉異型遺䌝子を有する倉異動物、 およびこのよう な倉異動物の生産や分化実隓に応甚しうる胚幹现胞を提䟛するこずを目 的ずしおいる。
たた、 本発明は、 このような胚幹现胞を甚いお平滑筋ミオシン重鎖遺 䌝子倉異動物を生産する方法を提䟛するこずを目的ずしおいる。
さらに、 本発明は、 䞊蚘胚幹现胞あるいは倉異動物から现胞を培逊し お遺䌝的背景の明らかな平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子に倉異を持぀现胞を 提䟛するこずを目的ずしおいる。 発明の開瀺
本発明者らは、 䞊蚘課題を解決するために鋭意怜蚎を行った結果、 マ りス染色䜓由来の平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子ず、 盞同組換え甚に蚭蚈し 調補したベクタヌ D N Aずの間で盞同組換えを起こさせお、 該遺䌝子の D N A配列に異なる配列を挿入するこずにより、 実質的に機胜しない平 滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を有し、 本来の平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の代 わりにレポ䞀倕䞀遺䌝子を発珟する胚幹现胞および動物を人為的に䜜出 するこずに成功した。 これにより、 本発明を完成するに到った。
たた、 動物の䜜出に䌎い倉異を起こした现胞を分化させるあるいは䜜 出した動物から现胞を培逊し新芏の现胞を取埗するこずにも成功し、 こ れによっおも本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 以䞋の  1 ) から  1 5 ) の発明を包含する。
( 1 ) 実質的に染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子ずしお機胜しない 倉異型平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を含む非ヒト動物の胚幹现胞たたはそ れを由来ずする现胞。
( 2 ) 前蚘倉異型遺䌝子は、 染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の塩 基配列の少なくずも䞀郚を削陀するこずによっお、 倖来遺䌝子を染色䜓 由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子䞭に挿入するこずによっお、 若しくは倖 来遺䌝子を染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の少なくずも䞀郚ず眮 換するこずによっお、 たたはこれらの組み合わせによっお埗られ、 か぀ 䞊蚘操䜜によっお染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子ずしおの機胜が 実質的に倱われる、 䞊蚘  1 ) に蚘茉の胚幹现胞たたはそれを由来ずす る现胞。 ( 3 ) 前蚘倉異型遺䌝子はレポヌタヌ遺䌝子を染色䜓由来平滑筋ミオシ ン重鎖遺䌝子䞭に挿入するこずによっお埗られるものである、 䞊蚘 ( 2 ) に蚘茉の胚幹现胞たたはそれを由来ずする现胞。
(4) 前蚘レポ䞀タヌ遺䌝子は /3—ガラクトシダヌれ遺䌝子である、 侊 蚘  3 ) に蚘茉の胚幹现胞たたはそれを由来ずする现胞。
( 5 ) 前蚘非ヒト動物がゲッ歯動物である、 䞊蚘  1 ) 〜 4) のいず れかに蚘茉の胚幹现胞たたはそれを由来ずする现胞。
( 6 ) 前蚘ゲッ歯動物がマりスである、 䞊蚘  5 ) に蚘茉の胚幹现胞た たはそれを由来ずする现胞。
( 7 ) 実質的に染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子ずしお機胜しない 倉異型平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を含む非ヒ卜動物たたはその子孫。
( 8 ) 前蚘倉異型遺䌝子は、 染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の塩 基配列の少なくずも䞀郚を削陀するこずによっお、 倖来遺䌝子を染色䜓 由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子䞭に挿入するこずによっお、 若しくは倖 来遺䌝子を染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の少なくずも䞀郚ず眮 換するこずによっお、 たたはこれらの組み合わせによっお埗られ、 か぀ 䞊蚘操䜜によっお染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子ずしおの機胜が 実質的に倱われる、 䞊蚘  7 ) に蚘茉の非ヒト動物たたはその子孫。
( 9 ) 前蚘倉異型遺䌝子はレポ䞀倕䞀遺䌝子を染色䜓由来平滑筋ミオシ ン重鎖遺䌝子䞭に挿入するこずによっお埗られるものである、 䞊蚘
( 8 ) に蚘茉の非ヒト動物たたはその子孫。
( 1 0 ) 前蚘レポ䞀タヌ遺䌝子は ;3—ガラクトシダヌれ遺䌝子である、 䞊蚘  9 ) に蚘茉の非ヒト動物たたはその子孫。
( 1 1 ) 前蚘非ヒト動物がゲッ歯動物である、 䞊蚘  7 ) 〜  1 0 ) の いずれかに蚘茉の非ヒ卜動物たたはその子孫。
( 1 2 ) 前蚘ゲッ歯動物がマりスである、 䞊蚘  1 1 ) に蚘茉の非ヒト 動物たたはその子孫。
( 1 3 ) 䞊蚘  9 ) 〜  1 2 ) のいずれかに蚘茉の非ヒ卜動物たたはそ の子孫より分離、 培逊しお埗た现胞。
( 1 4) 䞊蚘  1 3 ) に蚘茉の现胞に T抗原遺䌝子を導入しお埗た现胞 ^。
( 1 5 ) S M 1 B M C # 1 ずしお受蚗番号 F ERM B P— 6 6 2 5 号で寄蚗された骚髄现胞株である、 䞊蚘  1 4) に蚘茉の现胞株。 図面の簡単な説明
第 1図は、 マりス ·平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を倉異させるための盞 同組換えのストラテゞ䞀および P C Rに甚いたプラむマヌ、 サザンプロ ッティングに甚いたプロヌブを瀺す暡匏図である。
第 2図は、 盞同組換えの生じた E S现胞染色䜓 DN Aのサザンブロッ ティングによる解析の結果を瀺す図である。
第 3図は、 SM 1 BMC # 1の染色䜓に盞同組換えによる倉異遺䌝子 をも぀こずを瀺す P C Rの結果を瀺す写真である。
第 4図は、 ラミニンコヌトした培逊皿での —ガラク トシダヌれ陜性 现胞数である。 発明を実斜するための最良の圢態
本発明の非ヒ卜動物胚幹现胞たたはそれを由来ずする现胞は、 実質的 に染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子 単に 「野生型遺䌝子」 ず称す るこずもある ずしお機胜しない倉異型平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子 単 に 「倉異型遺䌝子」 ず称するこずもある を含むこずを特城ずするもの である。
以䞋、 本発明を詳现に説明する。 本発明においお、 倉異型遺䌝子が 「実質的に染色䜓由来平滑筋ミオシ ン重鎖遺䌝子ずしお機胜しない」 ずは、 倉異型遺䌝子の遺䌝子産物 翻 蚳産物 が野生型の染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖ず同䞀の構造を持぀ タンパク質ずしお埗られないこずを意味する。 具䜓的には、 「実質的に 染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子ずしお機胜しない」 倉異型遺䌝子 は、 遺䌝子工孊的手法によっお、 䟋えば、 該遺䌝子の塩基配列の少なく ずも䞀郚の削陀たたは倖来遺䌝子の挿入若しくは眮換によっお埗られる。 実質的に機胜しない倉異型遺䌝子ずしおは、 䟋えば、 プロモヌタヌ領域 の塩基配列の欠倱や眮換によっおプロモヌタヌが砎壊され転写掻性が倱 われたもの、 非翻蚳領域の塩基配列の欠倱や眮換によっお安定な転写産 物が埗られなくな぀たもの、 或いは、 遺䌝子産物をコヌドする翻蚳領域 の塩基配列の欠倱や眮換たたは他の遺䌝子の挿入によっお、 遺䌝子産物 が埗られなくな぀たものや、 遺䌝子産物が埗られおもそのタンパク質が 平滑筋ミオシン重鎖ずしお機胜しないものなどが挙げられる。
たた、 本発明においお、 「実質的に染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺 䌝子ずしお機胜しない倉異型遺䌝子を含む非ヒト動物胚幹现胞」 ずは、 平滑筋ミオシン重鎖ゲノム遺䌝子に䞊蚘したような倉異を人為的に加え るこずにより実質的に平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子ずしおの機胜が倱われ た非ヒト動物胚幹现胞をいう。 このような非ヒ卜動物胚幹现胞ずしおは, 䟋えば、 平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子䞭に別の遺䌝子を挿入するこずによ り、 倉異型遺䌝子が実質的に平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子ずしおの機胜を もたない非ヒト動物の胚幹现胞 E S现胞 が挙げられる。
さらに、 本発明においお、 「それを由来ずする现胞」 ずは、 本発明に よる胚幹现胞を培逊しお埗られた现胞系や本発明による胚幹现胞を分化 誘導させお埗た现胞など、 本発明による胚幹现胞を源ずした现胞を意味 する。 この際、 「胚幹现胞を分化誘導させお埗た现胞」 ずは、 適圓な条 件により、 䟋えば高密床に至るたで単局培逊するあるいは现胞集塊を圢 成するたで浮遊培逊するこずにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの皮々 のタむプの现胞に分化 実隓医孊別冊バむオマニュアルシリヌズ、 第 8 卷、 第 1 4 7頁、 1 9 9 5幎、 盞沢慎䞀著、 矊土瀟など させた现胞を いう。 このようにしお埗られた倉異型ミオシン重鎖遺䌝子を持぀现胞は、 平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子やタンパク質の䜜甚、 機胜をィンビトロin vitro)においお怜蚎する䞊で有甚である。
本発明の非ヒト動物には、 平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子がヘテロに倉異 しおいる動物およびホモに倉異しおいる動物のいずれもが含たれる。 た た、 本発明の非ヒト動物には、 その構成现胞の䞀郚においお平滑筋ミオ シン重鎖遺䌝子をぞテロもしくはホモに欠損しおいるキメラ動物も含た れる。
本発明においお䜿甚される非ヒト動物は、 キメラ動物を䜜出できるも のであれば、 特に限定されず、 哺乳動物、 鳥類、 䞡生類及び魚類などの、 ヒト以倖のすべおの動物に適甚できる。 しかしながら、 実際には、 商業 䞊の利甚可胜性などを考慮するず、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッゞ、 ャギ、 ゥシ、 ラッ トゃマりス等の哺乳動物が奜たしく䜿甚され、 さらに個䜓発生及び 生涯のサむクルが短くか぀繁殖が比范的容易である点で、 マりス、 ラッ ト等のゲッ歯動物、 特にマりスが動物モデルを䜜出するのに特に奜たし く䜿甚される。
本発明の现胞を埗る方法ずしおは、 倉異手段によっお実質的に機胜し ない平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を有する现胞を䜜出する方法がある。 た た、 䟋えば、 䜜出した现胞が胚幹现胞であった堎合には、 この现胞から キメラ動物を䜜出するこずによっお、 本発明の動物を埗るこずができる, さらに、 このキメラ動物を甚いおその構成现胞のすべおにおいお平滑筋 ミオシン重鎖遺䌝子がヘテロもしくはホモで倉異しおいる動物を䜜出す るこずができ、 さらに、 これら䜜出した倉異型遺䌝子を有する動物から 现胞を単離培逊し、 现胞を埗るこずもできる。
本発明においお、 実質的に機胜しない平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を埗 る方法ずしおは、 染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の塩基配列の少 なく ずも䞀郚を削陀 欠倱 する方法、 䞀郚塩基を眮換しお終止コ ドン にする方法、 倖来遺䌝子を染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子䞭に挿 入する方法、 および倖来遺䌝子を染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子 の少なくずも䞀郚ず眮換する方法など、 圓該分野においお既知の方法が 䜿甚される。 この際、 欠倱、 挿入たたは眮換郚䜍は、 平滑筋ミオシン重 鎖遺䌝子産物の機胜が実質的に倱われる郚䜍であれば特に限定されず、 タヌゲッ トずする郚䜍は、 平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子のプロモヌタヌ領 域、 非翻蚳領域たたは翻蚳領域などいずれであっおもよく、 たた、 倕䞀 ゲッ 卜ずする郚䜍は䞀箇所であっおもあるいは耇数箇所であっおもよく、 タヌゲッ トずする郚䜍が耇数である際には、 各郚䜍に斜される遺䌝子操 䜜手段は同䞀であっおもあるいは異なるものであっおもよい。 しかしな がら、 効率よくか぀完党に遺䌝子の機胜を欠損させるためには、 翻蚳領 域をタヌゲッ トずするこずが奜たしい。
たた、 䞊蚘方法のうち、 倖来遺䌝子を野生型遺䌝子䞭に挿入たたは眮 換する際には、 倖来遺䌝子ずしおは、 レポヌタヌ遺䌝子、 および薬剀耐 性遺䌝子、 䟋えば、 ネオマむシン耐性遺䌝子 n e o ) 、 ヘルぺスりむ ルスチミゞンリン酞化酵玠 H S V— t k ) 、 ゞフテリアトキシン Aフ ラグメント遺䌝子 D T— A ) 、 などが挙げられ、 これらのうち、 レポ —タヌ遺䌝子を野生型遺䌝子䞭に挿入するこずが奜たしい。 「レポ䞀倕 䞀遺䌝子」 ずは、 目的遺䌝子のプロモヌタヌの発珟を怜出したり匷床を 枬定するためにその目的遺䌝子のプロモヌタヌの䞋流に連結される遺䌝 子をいい、 内因性に認められない安定でか぀枬定容易な酵玠の遺䌝子な どが甚いられる。 䟋えば、 レポヌタヌ遺䌝子を野生型遺䌝子䞭に挿入し お倉異型遺䌝子を䜜補した堎合には、 レポ䞀タヌ遺䌝子の発珟 䟋えば、 レポ䞀倕䞀遺䌝子が 1 a c Zである堎合には、 基質ずなる色玠の発色な ど を指暙にしお目的ずする遺䌝子を発珟する现胞を肉県により怜出す るこずができるので、 発珟の有無が容易に怜出でき、 奜たしい。 したが ぀お、 レポヌタヌ遺䌝子を䜿甚するこずにより、 倉異型遺䌝子を有する ヘテロ型の動物の堎合では、 レポヌタヌ遺䌝子の発珟を指暙にしお発珟 现胞を怜出するこずができるず同時に、 もう䞀方の染色䜓遺䌝子座䞊で 維持されおいる機胜的な 非倉異型の 平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の発 珟調節に぀いおも調べられるこずが期埅される。 たた、 ホモ型の動物で は、 レポ䞀倕䞀遺䌝子の発珟を指暙に発珟现胞を怜出するずずもに、 å¹³ 滑筋ミオシン重鎖遺䌝子が䞡遺䌝子座で欠損した堎合の生理機胜や発珟 調節遺䌝子の倉化を調べるこずが期埅される。 䞊蚘に加えお、 䞊蚘した ように、 レポヌタヌ遺䌝子を䜿甚するず化合物に察する平滑筋ミオシン 遺䌝子の発珟倉化を簡䟿に怜出できるため、 化合物の生物孊的、 医孊的 利甚性もしくは効果の問題の研究のための䟿利な詊隓系ずなりうるこず が期埅される。
本発明に甚い埗るレポヌタヌ遺䌝子は、 䞀般に甚いられるものであれ ばよく特に限定されないが、 䟋えば、 倧腞菌由来の i3 -ガラクトシダ䞀 れ遺䌝子  l a c Z ) 、 バクテリアトランスポゟン由来のクロラムプ ニコヌルァセチル卜ランスフェラ䞀れ遺䌝子 C A T ) 、 ホ倕ル由来の ルシフェラ䞀れ遺䌝子 L u c ) 、 及びクラゲ由来のグリヌンフルォレ セントプロテむン遺䌝子 G F P ) 等が挙げられる。 これらのうち、 可 芖光の発色基質を甚いお組織孊的解析が容易に行える点で、 倧腞菌由来 の 3 -ガラク トシダ䞀れ遺䌝子  1 a c Z ) が奜たしい。
本発明においお、 実質的に機胜しない平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を有 する现胞を䜜出する手段は特に限定されないが、 盞同組換えによるのが 奜たしい。
盞同組換え技術は、 圓該分野においお既知であり、 特に制限されない が、 䟋えば、 以䞋のように行うこずができる。 たず最初に、 平滑筋ミオ 重鎖遺䌝子に倉異をさせようずする動物皮の染色䜓由来平滑筋ミオ 重鎖遺䌝子を、 埓来行われおいる方法により単離する。 この際、 染 色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の単離方法ずしおは、 䟋えば、 ゲノ ム D N Aラむブラリヌから、 すでに塩基配列が報告されおいる平滑筋ミ オシン重鎖遺䌝子の䞀郚あるいは c D N Aの䞀郚をプロヌブずしお甚い お、 プラヌクハむブリダィれヌシペンなどによりスクリヌニングするこ ずによっお、 非翻蚳領域を含む染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の クロヌンを埗る方法が䜿甚される。
次に、 平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を倉異させるための盞同組換え甚倕 —ゲティングベクタヌを䜜補する。 盞同組換え甚タ䞀ゲティングベクタ —の蚭蚈は、 野生型遺䌝子の䞀郚又は党郚を欠倱させるかもしくは非盞 同な別の塩基配列に眮き換え、 その欠倱させるかもしくは別の配列に眮 換した郚分 非盞同な配列郚分 を囲む䞊流及び䞋流の領域に平滑筋ミ オシン重鎖遺䌝子ず盞同な塩基配列を持぀ように蚭蚈すればよい。
平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子䞭にレポヌタヌ遺䌝子を挿入する堎合は、 非盞同な配列郚分にそのレポヌタヌ遺䌝子配列が含たれるように蚭蚈す ればよい。 たた、 この堎合、 平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の翻蚳領域の配 列を䞀郚又は党郚欠倱させるかもしくは非盞同な別の塩基配列に眮き換 えた䞊、 レポヌタヌ遺䌝子の翻蚳フレヌムが平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子 の翻蚳フレヌムず䞀臎するように蚭蚈されるこずが奜たしい。
たた、 このタヌゲティングベクタヌ䞭には、 薬剀耐性による遞択が可 胜であるように、 薬剀遞択に通垞甚いられる遺䌝子、 䟋えば、 ネオマむ シン耐性遺䌝子 n e o) 、 ヘルぺスりィルスチミゞンリン酞化酵玠
(H S V - t k) 、 ゞフテリアトキシン Aフラグメント遺䌝子  D T— A) 等が挿入されおいるこずが望たしい。 これら遺䌝子は、 ベクタヌが 取り蟌たれた现胞や目的ずする盞同組換えの起こっおいる可胜性の高い 现胞を遞択するためのマヌカヌ遺䌝子ずしお利甚するこずができる 実 隓医孊別冊バむオマニュアルシリヌズ、 第 8巻、 第 4 3〜 8 2頁、 1 9 9 5幎、 盞沢慎䞀著、 矊土瀟など 。 䟋えば、 n e oを有する堎合は G 4 1 8などのアミノグリコシド系抗生物質に察しお耐性を瀺し、 H S V 侀 t kを有する堎合はガンシクロノィルなどの栞酞誘導䜓に察しお感受 性を瀺す。
盞同組換え甚タヌゲティングベクタ䞀は、 染色䜓由来平滑筋ミオシン 重鎖遺䌝子をクロ䞀ニングし、 これを適圓な制限酵玠で切断しお埗られ る断片やこの断片を P C R (polymerase chain reaction) 法などに より増幅した DN A断片などを、 DN A合成機などにより合成されたリ ンカ䞀 D N A、 レポヌタヌ遺䌝子及び薬剀耐性マ䞀カヌ遺䌝子を含む断 片などず、 前蚘のような蚭蚈に埓っお適圓な順序で結合 連結 させれ ばよく、 盞同組換え甚のベクタヌ DN Aの調補の操䜜は、 いずれも詊隓 管内での通垞の DN A組換え技術により行うこずができる。
次に、 このようにしお調補した盞同組換え甚タヌゲティングベクタ䞀 を、 適圓な现胞ぞ導入する。 ここで甚いる现胞は、 䜜出しようずする動 物ず近瞁関係にある動物に由来し、 か぀胚幹 E S) 现胞等のように通 垞キメラ動物の䜜出に甚いられるものが奜たしい。 たた、 DNAを现胞 䞭に導入する方法は、 通垞の方法、 䟋えば、 ゚レク ト口ポレヌシペン法, リン酞カルシりム法、 リポプクション法および D E AE—デキストラ ン法などが挙げられ、 奜たしくぱレク ト口ポレヌション法が䜿甚でき る。 盞同組換え甚タヌゲティングベクタヌが取り蟌たれた现胞のいく぀か においおは、 取り蟌たれた现胞由来の染色䜓の平滑筋ミオシン重鎖遺䌝 子が、 タ䞀ゲティングベクタ䞀ず、 2぀の盞同な配列領域においお組換 えを起こし、 これによりこれら領域に囲たれた配列がベクタヌ D N Aに 由来する配列に眮換された倉異型の遺䌝子座が圢成される。
倕ヌゲティングベクタヌが取り蟌たれた现胞は、 ベクタ䞀 D N A由来 の薬物耐性遺䌝子などのマ䞀カヌ遺䌝子の発珟に基づいお、 䟋えば適圓 な期間薬剀存圚䞋で培逊するこずにより遞択するこずができる。 遞択さ れた现胞のうち、 盞同組換えによる倉異が生じた现胞は、 P C R法 実 隓医孊別冊バむォマニュアルシリヌズ、 第 8巻、 第 8 3〜 1 0 3頁、 1 9 9 5幎、 盞沢慎䞀著、 矊土瀟など ゃサザンブロッテむング法  「発 生工孊実隓マニュアル」 、 野村達次監修、 勝朚元也線、 1987幎、 講談 瀟 などにより解析しお遞択し、 さらに目的ずする倉異が生じおいるこ ずを確認する。 このようにしお、 本発明の倉異型遺䌝子を有する非ヒト 動物胚幹现胞が埗られる。
本発明の他の抂念によるず、 以䞊のような方法により埗られた倉異型 の遺䌝子座を生じた现胞を甚いお、 本発明のキメラ動物が提䟛される。 䞊蚘抂念を以䞋に詳现に説明する。
キメラ動物を䜜出する方法は、 特別な方法を甚いる必芁はなく、 泚入 法や凝集法など通垞行われおいる方法に埓っお行えばよい 现胞工孊別 冊実隓実隓プロトコ䞀ルシリヌズ、 分子医科孊実隓プロトコヌル、 第 2 3 4〜 2 6 6頁、 東京倧孊医科孊研究所孊友䌚線、 1 9 9 5幎、 秀最瀟 など 。
具䜓的には、 䟋えば、 凝集法によっおキメラマりスを䜜出する堎合、 倉異型の遺䌝子座を生じた现胞 䟋えば E S现胞 をトリプシン凊理に よりバラバラにし、 透明垯を倖した初期胚 8现胞期胚 に混ぜお培逊 し、 さらに停劊嚠マりスの子宮に移怍しお産仔を埗る。 このようにしお 埗られた産仔に぀いお、 䞊蚘ず同様の P C R法ゃサザンブロッティング 法、 さらには産仔の毛色やレポヌタヌ遺䌝子が挿入される堎合にはその レポヌタヌ遺䌝子産物の怜出などにより、 目的ずする倉異型遺䌝子を有 する産仔をスクリヌニングする。 これにより、 本発明の倉異型遺䌝子を 含む非ヒ卜動物が埗られる。
このようにしお埗られるキメラ動物は、 同皮の適圓な系統の動物ず亀 配させるこずにより産仔が埗られ、 䞊蚘ず同様にしおこの産仔の衚珟型 を指暙ずしお甚いお、 目的ずする E S现胞に由来する生殖现胞を有する キメラマりスを同定する。 このような亀配を繰り返すこずにより、 本発 明の倉異型遺䌝子を含む非ヒト動物の子孫が埗られおいく。
この際、 䞊蚘で埗られるキメラ動物を同皮の適圓な系統の動物ず亀配 させるこずにより埗られるキメラ動物の産仔からは、 平滑筋ミオシン重 鎖遺䌝子がヘテロに倉異した動物を埗るこずができる。 たた、 埗られた ヘテロ倉異動物同士を亀配させるず、 その産仔の䞭からホモ倉異動物を 埗るこずができる。 平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子がヘテロもしくはホモに 倉異した動物であるこずは、 䞊蚘ず同様にしお、 その染色䜓 D N Aに぀ いお P C R法ゃサザンブロッティング法などにより解析するこずにより 確認できる。
本発明により生産された動物の飌育方法は、 特別な方法を甚いる必芁 はなく、 正垞な動物ず同様な方法により飌育するこずができる。
本発明のさらなる他の抂念によるず、 以䞊のような方法により埗られ たキメラ非ヒト動物たたはその子孫から分離、 培逊されるこずにより埗 られた现胞もたた提䟛される。
䞊蚘抂念における 「现胞」 は、 䞊蚘で埗られたキメラ非ヒト動物たた はその子孫の身䜓の䞀郚から分離、 培逊された现胞ずいう意味であり、 䜓现胞であっおも生殖现胞であっおもよいが、 奜たしくは、 䜓现胞、 特 に、 骚髄现胞及び平滑筋现胞などの、 継代培逊の可胜な䜓现胞が奜たし く䜿甚される。
本発明により分離、 培逊された现胞は、 圓該分野においお既知の方法 を甚いお培逊される。
以䞋、 実斜䟋をもっお、 本発明をより詳现に説明する。
実隓䟋 1  組換え E S现胞ず該 E S现胞由来マりスの䜜補
( 1 ) マりス染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子のクロヌニング 本実隓では、 マりスの胚幹现胞に遺䌝子倉異を起こさせるのに、 1 2 9系マりス由来のものを䜿甚した。 この系統由来のゲノム遺䌝子をク口 䞀二ングするために、 他の系統のマりスの平滑筋ミオシン重鎖の翻蚳開 始点を含む染色䜓由来の遺䌝子を調補し、 この遺䌝子を P s t I及び S p e Iで消化し、 箄 0 . 8 K bの断片を埗た。
このようにしお埗られた玄 0 . 8 K bのマりスの平滑筋ミオシン重鎖 のゲノム D N A断片 ランダムプラむマ䞀法により 32 Pで暙識した を プロヌブずしお甚いお垞法によりプラヌクハむプリダむれヌションを行 うこずにより、 1 2 9 S Vマりスゞ゚ノミックラむブラリ䞀 Stratag ene瀟補 から目的ずするマりスの平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子をクロ䞀 ニングした。 箄 1 0 0䞇個のクロヌンに぀いおスクリ䞀二ングした結果, 3個の陜性クロ䞀ンを埗た。 これらのクロヌンに぀いおファヌゞ D N A を調補したずころ、 いずれのクロヌンも玄 1 5 k bの N o t I切断断片 を有するこずが分かった。 これらの断片をそれぞれプラスミ ド B 1 u e s c r i t I I S K - (東掋玡瀟補 䞭にサブクロヌニングした, このプラスミ ドに぀いお挿入断片の塩基配列を調べたずころ、 3クロヌ ンのうちの 1クロヌンに぀いお、 挿入断片が既報のマりスの平滑筋ミオ ■SJ貝速䌝于 (Hasegawaら、 Biochemical and Biophysical Rese ach Communications, 第 2 3 2巻、 第 3 1 3〜 3 1 6頁、 1 9 9 7 幎 の配列ず䞀臎しおいたこずから、 このクロヌンは確かに目的ずする 平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の翻蚳開始点を含む断片を有するこずが確認 できた。
( 2) 盞同組換え甚タヌゲティングベクタ䞀の構築
本実斜䟋では、 第 1図に瀺される盞同組換え甚タヌゲテむ ングべクタ —を蚭蚈した。 マりスの平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子においおは、 平滑筋 ミオシン重鎖をコヌドする党翻蚳領域の開始コ ドンから終止コ ドンたで がヌ぀のェク゜ン䞭には含たれおはなく、 耇数のェク゜ンに分割されお いる。 第 1図の S M 1遺䌝子のァリルのなかの癜抜きの四角郚分は平滑 筋ミオシン重鎖遺䌝子の翻蚳開始点を含むェク゜ンを瀺す。 なお、 タヌ ゲティングベクタヌの構築にあたり、 転写制埡システムをできるだけ砎 壊するこずなしに平滑筋ミオシン重鎖蛋癜の発珟を防ぐよう蚭蚈した。 以䞋にその調補方法を詳现に説明するが、 本実斜䟋で䜜補される盞同 組換え甚タ䞀ゲティングベクタ䞀は、 第 1図に瀺されるように、 平滑筋 ミオシン重鎖遺䌝子の開始コ ドンの䞋流に倧腞菌 /5—ガラク トシダヌれ 遺䌝子 第 1図䞭の 1 a c Z) の翻蚳フレヌムが S M 1の翻蚳フレヌム ず䞀臎するように連結され、 たた、 ネオマむシン耐性遺䌝子 第 1図䞭 の n e o) 及びぞルぺスりィルスチミゞンリン酞化酵玠遺䌝子 第 1図 䞭の t k) が順方向に連結され、 さらに、 ]3 _ガラク トシダ䞀れ遺䌝子 の 5 ' 偎に玄 4. 5 k b、 ヘルぺスりィルスチミゞンリン酞化酵玠遺䌝 子をはさんで 3 ' 偎に玄 5 k bの平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子由来の盞同 領域が付加され、 さらに、 この玄 4. 5 k bの配列の 5 ' 偎にゞフテリ ァトキシン Aフラグメント遺䌝子 第 1図䞭の DT— A) が連結され、 その䞊流に B 1 u e s c r i p tプラスミ ド 図瀺せず の配列が連結 された構造を有する。 このべクタ䞀により盞同組換えが起きるず、 䞀方 のァリルの平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の翻蚳領域の郚分に、 1 a c Z及 び n e o及び t kが挿入された倉異型の遺䌝子座を生じるこずになる。 以䞋、 本実斜䟋による盞同組換え甚タヌゲティングベクタヌの調補方 法を蚘茉する。
たず、 レポ䞀倕䞀遺䌝子や薬剀耐性遺䌝子を挿入するために、 U. S . E . Mu t a g e n e s i s k i t (フアルマシア瀟補 を甚いお、 B l u e s c r i p tプラスミ ド䞭にサブクロヌニングされた平滑筋ミ オシン重鎖遺䌝子の翻蚳開始点のすぐ䞋流に制限酵玠切断郚䜍 N o t Iサむ ト ができるように倉異させた。
次に、 前蚘のようにしお埗た N o t Iサむ トを利甚しおパヌツずなる 断片 すなわち、 1 a c Z、 n e o及び t k) を順次、 倧腞菌を宿䞻ず する遺䌝子操䜜の垞法により、 連結付加し、 さらに 5 ' 偎の盞同領域の 倖偎にゞフテリァトキシン Aフラグメント遺䌝子を連結し、 これにより 箄 2 1 k bの盞同組換え甚タ䞀ゲティングプラスミ ドが埗られた。
この際、 盞同組換え甚タ䞀ゲティングプラスミ ドには、 第 1図に瀺さ れるように、 n e oず t kの䞡偎に C r e— 1 o X Pシステム 実隓医 孊別冊バむォマニュアルシリヌズ、 第 8巻、 第 7 1〜 8 2頁、 1 9 9 5 幎、 盞沢慎䞀著、 矊土瀟など を採甚しお、 341116 の 1 0 配列 (第 1図䞭の Ι ο χ Ρ) がある。 これにより、 盞同組換え䜓が埗られた あずに、 バクテリオファヌゞ P 1由来の C r e蛋癜を発珟させるこずで、 n e oず t kを倖すこずが可胜ずなる。
このようにしお埗られた盞同組換え甚倕ヌゲティングプラスミ ドを制 限酵玠 S r f Iで切断しお線状化し、 これを以䞋の E S现胞ぞの導入に 䜿甚した。
( 3 ) マりス E S现胞の培逊
E S现胞は、 未分化な状態を維持するために L I F (leukemia inhi bitory factor) を添加した培地を甚い、 フィヌダ䞀现胞䞊で培逊した。
E S现胞培逊甚培地 以䞋、 単に 「E S甚培地」 ず称する ずしおは、 ダリレべッコ改倉ィ䞀クリレ培逊液 (Dulbecco's modified Eagle's medi urn (High glucose), ギブコ瀟補、 Code No.11960-010) に 1 5 % 牛胎児血枅、 5 X 1 04 U/m 1 の L I F (AMRAD瀟補 、 1 0— 4M の 2—メルカプト゚タノヌル、 非必須アミノ酞 ギブコ瀟補、 Code N o.11360- 013) 、 ピルビン酞ナトリりム ギブコ瀟補、 Code No.1114 0-019) 、 及び L䞀グルタミン ギブコ瀟補、 Code No.25030-024) を添加しさらに、 抗生物質ずしおペニシリンカリゥム及び硫酞ストレプ トマむシンをそれぞれ最終濃床 5 0 U/m 1及び 5 0 g/m 1 ずなる ように添加したものを甚いた。 フィヌダ䞀现胞ずしおは、 マむ トマむシ ン C凊理により分化停止させたマりス胚由来初代培逊線維芜现胞 em bryonic fibroblast cell E F现胞、 ラむフテックオリ゚ンタル瀟補 をコンフルェントになるたで培逊したものを甚いた。 E S现胞は、 1 0 c m組織培逊甚培逊シャヌレあたり玄 3 X 1 06现胞をフィヌダ现胞䞊 に播皮しお、 3 7 °C、 5 % C〇2で、 䞊蚘培地で培逊し、 2〜 3 日毎継 代培逊した。 なお、 培地は毎日亀換した。
(4) 盞同組換えによる倉異型 E S现胞の取埗
䞊蚘  3) の E S现胞玄 1 X 1 07個を゚レク ト口ポヌレヌシペン甚 緩衝液 Dulbecco's modified Eagle's medium) 箄 0. 8m l 䞭に 懞濁した。 この懞濁液に、 䞊蚘  2) の線状化したタヌゲティングべク 倕䞀 DNA 1 を添加した埌、 ゚レクトロポ䞀レ䞀シペンを行な぀ た。 ゚レク ト口ポヌレヌシペンは、 Bio Rad瀟補 Gene Pulserを甚い お行なった 条件  field strength 210V, path length 0.4cm, capa citance 500 n F) 。
゚レク ト口ポヌレヌシペン埌、 宀枩で 1 0分間攟眮した。 この懞濁液 を、 1 0 c mの組織培逊甚シャヌレあたり 2〜4 X 1 06现胞ずなるよ うに、 䞊蚘  3 ) ず同様のフィヌダ䞀现胞がたかれおいる 1 0 c mの組 織培逊甚シャヌレ䞊にたいた。 ゚レク ト口ポレヌシペン埌、 3 7 ° (、
5 % C〇2で、 2 日間、 E S甚培地で培逊しおから、 3 0 0 gZm l の G 4 1 8含有 E S培地に亀換した。 薬剀の存圚䞋、 ネオマむシン耐性 E F现胞 フィヌダ䞀现胞 䞊で毎日培地亀換をしながら 1 0〜 1 4日 間、 同条件䞋で培逊した。 生じた薬剀耐性のコロニヌを、 顕埮鏡䞋で独 立にピックアップし、 マむクロピぺッ 卜でピペッティングしお単䞀现胞 ずした埌、 マむクロプレヌト䞭で個別に培逊した。 これらは、 2 4穎プ レヌト— 6穎プレヌト— 1 0 c mシャヌレず順次継代培逊しお、 増殖さ せ、 䞀郚の现胞から染色䜓 DNAを調補した。
薬剀耐性コロニヌ由来の E S现胞から調補された染色䜓 DN Aに぀い お、 P C R法により盞同組換えが起こっおいるか吊かの怜定を行なった: P CR法による怜定は、 実隓医孊別冊バむオマニュアルシリヌズ、 第 8 巻、 第 8 3〜 1 0 3頁、 1 9 9 5幎、 盞沢慎䞀著、 矊土瀟などに蚘茉さ れる公知の方法に準じお以䞋のように行なった。 P C Rに䜿甚されるプ ラむマヌずしおは、 第 1図䞭に瀺した 2぀のプラむマヌ、 すなわち盞同 組換え甚タ䞀ゲティングベクタ䞀の 5 ' 偎盞同領域よりさらに䞊流の配 列に盞圓するプラむマヌ 1及び倕䞀ゲティングベクタヌ内 1 a c Z配列 に盞圓するプラむマ䞀 2を DN A合成機で合成したものを甚いた。 なお 䞊蚘プラむマヌ 1及び 2の塩基配列は、 䞋蚘のずおりである。
プラむマ䞀 1 
5 ' - TG CAGGTT CATAGGAG CAGAG- 3 '
プラむマ䞀 2 
5 ' - G C GGATTGAC C GTAATGGGATAGG- 3 ' 各 E S现胞の染色䜓 D N Aを甚い、 P C Rを、 LA- PCR kit Ver.2 (宝酒造瀟補 を甚いお DNAの倉性  9 8° (、 2 0秒 、 プラむマ䞀 のアニヌリングずプラむマ䞀の䌞長  6 5°C、 1 2分 で 3 5サむクル 行なった。 さらに最埌にプラむマ䞀の䌞長のため、  7 2°C、 1 0分 で 1サむクル行なった。 この埌、 ァガロヌスゲル電気泳動を行った。 䞊蚘 P C R法による怜定の結果、 薬剀耐性コロニヌ 24 0個のうち、 6個の E S现胞の染色䜓 D N Aに぀いお、 P C R埌のァガロヌスゲル電 気泳動で玄 5 k bのバンドが怜出され、 これらの E S现胞は、 盞同組換 えによる平滑筋ミオシン遺䌝子の倉異が起こったものず考えられた。 䞊蚘 6個の E S现胞に぀いお、 さらに盞同組換えが生じおいるこずを 確認するため、 サザンブロッテむング法による解析を行なった。 サザン ブロッテむング法による解析は、 「発生工孊実隓マニュアル」 、 野村達 次監修、 勝朚元也線、 1 9 8 7幎、 講談瀟などに蚘茉の方法に準じ、 以 䞋のように行なった。
野生型ず倉異型の E S现胞の平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を、 サザンブ ロッテむ ング法により調べた。 特異的プロヌブずしお第 1図の玄 0. 7 k bの断片を甚い、 以䞋のように行った。 培逊 E S现胞からゲノム DN
Aを調補しお、 制限酵玠 B amH I で消化したあず 0. 8 %のァガ口䞀 スゲルで電気泳動し、 ナむロンメンブレン nylon membrane) (商品名
 Hybond- N+、 アマシャム瀟補 に転写した。 也燥したナむロンメンブ レンを 6 5 °Cのハむブリダィれ䞀ション溶液  5 X S S P EZ 5 Xデン ハルト溶液 Z 0. 5 % S D S / 2 0 g/m 1 サケ粟子 DNA) 5
0 m 1 䞭で振盪させながら、 32 Pで暙識した D N Aプロヌブを加え、 侀 晚反応させた。 反応終了埌、 ナむロンメンブレンを 0. 1 % S D Sを 含む 2 X S S P E䞭で、 6 5T、 1 0分間掗浄し、 0. 1 % S D Sを 含む 1 X S S P E䞭で、 6 5° (、 1 5分間掗浄し、 さらに、 0. 1 %
S D Sを含む 0. 1 X S S P E䞭で、 6 5° (、 1 5分間掗浄した。 その 埌、 ォ䞀トラゞオグラフィヌを行った。
この際の制限酵玠 B a mH Iで消化した際のサザンブロッティングの 結果を第 2図に瀺す。 第 2図から明らかなように、 野生型 E S现胞では、 箄 2 0 k bの野生型 DN Aのみが怜出され、 6぀の E S现胞のうち 4぀
( 1 8— 2、 4 0 - 2 , 7 2— 2、 及び 9 7— 1 ) に぀いお、 野生型の 箄 2 0 k b断片に加え、 箄 4. O k b断片ず玄 4. 5 k b断片の倉異型 断片が認められた。 この結果から、 1 8— 2、 4 0— 2、 7 2— 2、 及 び 9 7— 1 ず称される 4個の倉異型 E S现胞は、 目的ずする盞同組換え が起こった倉異型 E S现胞であるこずが確認できた。
( 5 ) 倉異型 E S现胞からキメラマりスの䜜補
倉異型平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子をも぀ E S现胞を甚いたキメラマり スの䜜補を、 䞊蚘 4) で埗られた 4個の倉異型 E S现胞の各々に぀い お、 凝集法 现胞工孊別冊実隓実隓プロトコヌルシリヌズ、 分子医科孊 実隓プロトコヌル、 第 2 3 4〜 2 6 6頁、 東京倧孊医科孊研究所孊友䌚 線、 1 9 9 5幎、 秀最瀟や Gene Targeting  A Practical Approach
、 A.LJoyner著、 1 9 9 3幎、 IRL PRESSなど を甚いお、 以䞋の ようにしお詊みた。
透明垯を倖した初期胚  8现胞期胚 を、 卜リブシン凊理によりバラ バラにした各 E S现胞に混ぜお、 䞀緒に発生させるこずでキメラマりス を䜜補する。 8现胞期胚は、 過排卵凊理をした採卵甚マりスの卵管ず子 宮を摘出しその䞭から採取した。 採卵した 8现胞期胚を酞性タむロヌド 液に移し、 透明垯を溶解する。 凝集に甚いた E S现胞は、 トリプシン凊 理し、 ある皋床の现胞塊  1 0〜 1 5個 ずなるように凊理する。 さら にれラチンコヌトしたシャヌレにたき、 1 0〜 1 5分間 C〇2むンキュ ベ䞀タヌ  3 7 °C、 5 % C〇2 ) に静眮し、 シャヌレに接着しなかった 现胞を集める。 透明垯を陀去した胚を 2぀甚いお、 この 2぀の胚で挟み 蟌むように E S塊ず凝集させ、 C〇2むンキュベヌタ䞀  3 7 ° (、 5 % C〇2 ) で䞀晩培逊し、 キメラ胚を調補した。
次に、 以䞋のようにしお、 このようにしお培逊した胚を子宮に移怍す る。 たず、 停劊嚠させたマりスの背を開き、 子宮を匕き出した。 次に、 䞊蚘で䞀晩培逊したキメラ胚を匕き出した子宮ぞ移怍する。 子宮をマり スの䜓内に戻しお、 切り口を瞫合する。 この埌、 マりスは䞀般的には自 然分嚩させるが、 予定日 通垞移怍から 1 7 日埌 に産たれない堎合に は垝王切開しお胎児を取り出した。 生たれたマりスの産仔を通垞ず同様 にしお里芪に生育させた。
この結果、 移怍胚 9 9 8個より産仔 4 7匹が埗られた。 埗られた産仔 を、 毛色 キメラマりスであれば黒色以倖の毛色を呈する により確認 したずころ、 埗られた産仔のうち、 毛色からキメラマりスず刀定された ものは 1 1匹であった。
( 6 ) キメラマりスからの子孫の生産
( 5 ) で埗られたキメラマりスを C 5 7 B L / 6 J系マりスず亀配さ せ、 E S现胞由来の産仔が埗られるか吊かを怜定した。 キメラマりスの 生殖现胞が E S现胞に由来しおいれば、 䜜出される産仔の毛色は黒以倖 を呈する。 1 1系統のキメラマりスから 1 5 0 0匹以䞊の産仔を埗たず ころ、 その䞭に 7仔の茶色の仔が埗られた。 さらに遺䌝子を P C R法で 確認したずころ、 これらのうち、 4仔に぀いおは倉異型を確認できた。 これにより、 䜜補したキメラマりスの生殖现胞系列に E S现胞が分化し おいたものがあるこずが確認された。
以䞊のようにしお、 キメラマりスから倉異型平滑筋ミオシン重鎖遺䌝 子を持぀ヘテロマりスが䜜出された。
なお、 前蚘で生殖现胞系列に E S现胞が分化しおいたこずが確認され たキメラマりスを C 5 7 B L Z 6 J系マりスず亀配させ埗られた茶色の 産仔のうちから、 倉異型平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を持぀ヘテロマりス が埗られた。 野生型かぞテロマりスかは、 尻尟の现胞より染色䜓 DNA を抜出し、 前蚘の方法に埓っお別のプラむマヌを甚いた P C Rあるいは サザンハむプリダむれヌションを行い、 どちらかで倉異型断片が怜出さ れ、 さらに i3—ガラク トシダヌれ掻性を有するものをぞテロマりスず刀 定した 詳现は実斜䟋 2を参照 。
実隓䟋 2  ヘテロマりスのレポヌタヌ遺䌝子の発珟现胞の同定
実斜䟋 1で埗られたヘテロマりスの尻尟を切り、 固定液  2 % ホル ムアルデヒド、 0. 2 % ダルタルアルデヒド で宀枩で 1 0分間むン キュベ䞀トしお固定した。 これを P B Sで掗浄埌、 X— G a l反応液
( 5 mMフェリシアン化カリりム、 5 mMプロシアン化カリりム、 2 mM塩化マグネシりム、 1 m g /m 1 X— G a l、 P B S) で 3 7 °C で 0. 5時間から 1晚むンキュベヌトした。 その結果、 平滑筋现胞に特 異的にレポ䞀倕䞀 /3—ガラク 卜シダ䞀れ 掻性を瀺す青色の染色が認 められた。
実隓䟋 3 組換え E S现胞を i n V i t r oで分化誘導した時の
レポ䞀倕䞀掻性の怜出
組換え E S现胞の分化誘導は Drab, M.らの方法 FASEB J. 1 1 , 9 0 5 - 9 1 5 , 1 9 9 7 ) に埓っお行った。 実斜䟋 1 (4) で埗られ た組換え E S现胞 4 0— 2を支持现胞䞊でコンフルェントにたで培逊し た埌、 これを 0. 2 5 % トリプシン及び 0. 0 4 % EDTAで凊理 するこずにより、 組換え E S现胞をはがした。 次に、 この现胞を、 1 0 c m れラチンコヌトしたシャヌレ 1枚あたり、 箄 4 X 1 06個を播皮 した。 3 7°C、 5 % C02で 2 日間、 E S甚培地で培逊しおコンフルェ ントに達したら P B Sで现胞を掗浄埌、 0. 2 5 % トリプシン及び 0. 0 4 % ED TAで凊理した。 宀枩で 1〜 2分攟眮し、 现胞がシャヌレ からはがれたら、 1 0 m 1 の培地 DMEM 1 0 %ゥシ胎児血枅 を 加え、 现胞浮遊液を现菌培逊甚皿に移した。 この時 1 0 c mのシャヌレ 1枚から 3枚の培逊皿に分けた。 现胞は接着できず、 现胞集合塊を圢成 する。 2 日ごずに培地を亀換しお 7 日間培逊を続けた。 この现胞集合塊 を自然沈降で集め、 新しい培地を加え、 れラチンコヌトした 2 4ゥ゚ル 培逊皿にたいた。 ゥ゚ルあたり、 2〜 3個の现胞集合塊が入るようにし た。 翌日、 1 0—8Mレチノむン酞および 0. 5 X 1 (Γ3Μ ゞブチリル サむクリック AMP (dibutyryl-cyclicAMP) を添加しお 5 日間培逊し た。 通垞の培地に亀換しおさらに、 3 7 °C、 5 % C〇2で 1 2 日間培逊 した。 この間、 4日に䞀床培地亀換した。 このようにしお分化誘導した 现胞を公知の方法 盞沢慎䞀著、 実隓医孊別冊、 バむオマニュアルシリ —ズ、 ゞヌンタヌゲッティング、 矊土瀟、 1 9 9 5) で X— g a l染色 した。
その結果、 䞊蚘 E S现胞を由来ずする分化した E S现胞で i3—ガラク トシダ䞀れ掻性を有するものが埗られたこずを確認した。
実隓䟋 4  骚髄现胞の単離ず培逊
実斜䟋 1 ( 5) で埗られたキメラマりスから倧腿骚を摘出しおその䞡 端をハサミで切り取った。 骚髄现胞の塊の取埗は、 5m lの培逊液  1 0 %牛胎児血枅ず 5 OmM 2—メルカプト゚タノヌルを含有する EM培地 を 2 5 Gの泚射針を぀けた 1 m 1甚泚射噚を甚いお骚の切り 口に泚射しお、 その内容物を吹き出させお行った。 现胞の塊は l m l甹 泚射噚に通すこずによっおほぐした。 ほぐした现胞を組織培逊甚の培逊 皿に移し、 3 3 °Cの C 02むンキュベヌタヌ  5 % C02 ) で同培逊液 で培逊した。 浮遊する现胞は䞀週間に䞀床の培地亀換で取り陀き、 接着 する間質系现胞を骚髄现胞ずしお培逊した。
実隓䟋 5  SM 1 レポヌタヌ骚髄现胞株の䜜補 本実斜䟋で䜿甚した S V 4 0ラヌゞ T抗原遺䌝子を、 䞋蚘のようにし お調補した。 枩床感受性 S V 4 0ラヌゞ ΀抗原遺䌝子発珟甚のプラスミ ドずしお、 垯刀らが蚘茉の p S V t s A 5 8 o r i (―) を䜿甚し Jp n. J. Cancer Res. 8 2 : 1 3 44 1 9 9 1幎 、 これを制限酵玠 B g 1 Iで切断しお、 埗られた S V 4 0ラヌゞ T抗原遺䌝子を含む玄 7 k bの断片を现胞ぞの遺䌝子導入甚断片ずしお䜿甚した。
箄 1ヶ月間培逊した実斜䟋 4の骚髄間質系现胞に、 䞊蚘で調補した枩 床感受性 S V 4 0ラヌゞ T抗原遺䌝子を導入しお现胞株を䜜補した。 な お、 现胞ぞの遺䌝子導入は、 リポプクタミンLIPOFECTAMINE) (G IBCO BRL瀟補を甚いお、 付属のプロトコルに埓っお行った。 䞀般に 盎埄 6 c mの培逊皿 玄 1 X 1 05现胞 あたり、 箄 9 m gの遺䌝子を 甚いた。 遺䌝子導入埌 3週間でコロニヌを圢成した现胞は、 ピペッ トマ ンを甚いお単離し、 クロヌン化现胞株 SM 1 BMC # 1 ずした。 盞同組 換えされた S M 1 レポ䞀倕䞀遺䌝子の確認は P C R反応によっお行った c 䞀般に QIAGEN Blood&Cell culture DNA kit (QIAGEN瀟補 で 粟補した SM 1 BMC # 1の染色䜓遺䌝子を甚い、 SM 1 レポ䞀倕䞀遺 䌝子由来の配列のみを増幅できるようにデザィンされた DN A配列のォ リゎマ䞀 DNA (前述の実斜䟋に蚘茉 をプラむマ䞀ずしお、 LA T a q DNAポリメラヌれ TAKARA瀟補 で暙準的な P C R反応を 行った。 かかる実隓の結果を第 3図に瀺す。 P C R反応液をァガロヌス ゲル電気泳動しお、 ゚ヂゞゥムブロマむ ドで染色した。 SM 1 BMC # 1からは S M 1 レポ䞀倕䞀遺䌝子由来の D N Aを瀺す 5. 1 k bのバン ドが増幅するのが確認された。 すなわち、 SM 1 BMC # 1の染色䜓に は盞同組換えで SM 1 レポ䞀倕䞀遺䌝子を持぀こずが確認された。
このようにしお埗られた倉異骚髄现胞、 SM 1 BMC # 1は、 平成 1 0幎 3月 6 日付で通商産業省工業技術院生呜工孊工業技術研究所に、 受 蚗番号 F E RM P - 1 6 6 8 7号で寄蚗され、 さらに、 平成 1 1幎 1 月 2 0 日付で通商産業省工業技術院生呜工孊工業技術研究所においお、 圓該原寄蚗よりブダペスト条玄に基づく寄蚗 囜際寄蚗 ぞの移管手続 がなされ、 F E RM B P— 6 6 2 5号の受蚗番号が付䞎された。
実隓䟋 6  ;3—ガラク トシダヌれ掻性枬定
組織培逊甚の培逊皿に培逊した実斜䟋 5の S M 1 BM C # 1を P B S で掗浄した埌、 固定液  2 %ホルムアルデヒド、 0. 2 %グルタルアル デヒド で宀枩で 1 0分間むンキュベヌトしお固定した。 これを P B S で掗浄埌、 X— G a 1反応液  5 mMフェリシアン化カリりム、 5 mM プロシアン化カリりム、 2 mM塩化マグネシりム、 l m g Zm l X - G a l , P B S ) で 3 7 °Cで 4時間から 1晚むンキュべ䞀卜した。 β 䞀ガラクトシダ䞀れ掻性枬定は、 现胞を P B Sで掗浄埌、 保存液 4 % ホルムアルデヒド に眮換しお、 青く染たる现胞を陜性现胞ずしお、 陜 性现胞を顕埮鏡䞋で数えるこずによっお行った。 その結果、 陜性现胞の 存圚が確認された。
機械的な刺激を受けた平滑筋现胞をラミニンゃコラヌゲンでコ䞀トし た培逊皿で培逊するず、 S M 1の発珟が倉化するこずが報告されおいる
(Circ. Res. 7 9 ( 5 ) , 1 0 4 6〜 1 0 5 3 , 1 9 9 6幎 。 䞊蚘 の珟象を参考にしお、 S M I B M C # 1をラミニンコヌトした培逊皿で 培逊した堎合、 発珟が倉化するかどうかを調べた。 その結果を第 4図に 瀺す。 第 4図に瀺されるように、 ラミニンコヌトした培逊皿で培逊した S M 1 B M C # 1は、 コントロヌルの培逊皿で培逊したのに比べお陜性 现胞が倚く、 これから刺激による S M 1の発珟倉化を 3 —ガラク トシダ —れ掻性ずしお枬定できるこずが瀺された。 産業䞊の利甚可胜性 以䞊のように、 本発明の现胞あるいは動物は、 実質的に染色䜓由来平 滑筋ミオシン重鎖遺䌝子ずしお機胜しない倉異型平滑筋ミオシン重鎖遺 䌝子を含むこずを特城ずするものである。 したがっお、 本発明の现胞あ るいは動物は、 平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の血管などにおける圹割やそ の他未知の生理機胜や遺䌝子発珟メカニズム等の生物医孊的研究に甚い る新しい研究材料や病態モデルずなるこずが期埅される。 䟋えば、 平滑 筋ミオシン重鎖遺䌝子が倉異するずずもに 3—ガラク トシダヌれ遺䌝子 等のレポヌタヌ遺䌝子が挿入された倉異型遺䌝子を含む動物の堎合、 以 䞋のような優れた特城を有する。 すなわち、 ヘテロ倉異動物の堎合では、 片方の染色䜓遺䌝子座䞊にある倉異型遺䌝子䞭のレポ䞀倕䞀遺䌝子の発 珟 䟋えば、 レポ䞀倕䞀遺䌝子が 0—ガラクトシダヌれ遺䌝子の堎合、 基質ずなる色玠の発色など を指暙にしお発珟现胞を怜出し埗るずずも に、 もう䞀方の染色䜓遺䌝子座䞊で維持されおいる機胜的な平滑筋ミオ シン重鎖遺䌝子の発珟調節に぀いお調べるこずができる。
さらに、 本発明による现胞あるいは動物は、 動脈硬化に察する新しい 薬剀の評䟡や動脈硬化に察する旧来の薬剀などの化合物の生物孊的利甚 性もしくは効果の問題の研究のための䟿利な詊隓系ずなるこずが期埅さ れる。

Claims

9 7 WO 99/39571 PCT/JP99/00505 蚀青 求 の 範 囲
1 . 実質的に染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子ずしお機胜しない 倉異型平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を含む非ヒト動物の胚幹现胞たたはそ れを由来ずする现胞。
2 . 該倉異型遺䌝子は、 染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の塩基 配列の少なくずも䞀郚を削陀するこずによっお、 倖来遺䌝子を染色䜓由 来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子䞭に挿入するこずによっお、 若しくは倖来 遺䌝子を染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の少なくずも䞀郚ず眮換 するこずによっお、 たたはこれらの組み合わせによっお埗られ、 か぀䞊 蚘操䜜によっお染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子ずしおの機胜が実 質的に倱われる、 請求の範囲第 1項に蚘茉の胚幹现胞たたはそれを由来 ずする现胞。
3 . 該倉異型遺䌝子はレポ䞀倕䞀遺䌝子を染色䜓由来平滑筋ミオシン 重鎖遺䌝子䞭に挿入するこずによっお埗られるものである、 請求の範囲 第 2項に蚘茉の胚幹现胞たたはそれを由来ずする现胞。
4 . 該レポ䞀倕䞀遺䌝子は /3—ガラク トシダ䞀れ遺䌝子である、 請求 の範囲第 3項に蚘茉の胚幹现胞たたはそれを由来ずする现胞。
5 . 該非ヒト動物がゲッ歯動物である、 請求の範囲第 1項から第 4項 のいずれかに蚘茉の胚幹现胞たたはそれを由来ずする现胞。
6 . 該ゲッ歯動物がマりスである、 請求の範囲第 5項に蚘茉の胚幹现 胞たたはそれを由来ずする现胞。
7 . 実質的に染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子ずしお機胜しない 倉異型平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を含む非ヒト動物たたはその子孫。
8 . 該倉異型遺䌝子は、 染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の塩基 配列の少なくずも䞀郚を削陀するこずによっお、 倖来遺䌝子を染色䜓由 Q
WO 99/39571 PCT/JP99/00505 来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子䞭に挿入するこずによっお、 若しくは倖来 遺䌝子を染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子の少なくずも䞀郚ず眮換 するこずによっお、 たたはこれらの組み合わせによっお埗られ、 か぀䞊 蚘操䜜によっお染色䜓由来平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子ずしおの機胜が実 質的に倱われる、 請求の範囲第 7項に蚘茉の非ヒト動物たたはその子孫 c 9 . 該倉異型遺䌝子はレポ䞀倕䞀遺䌝子を染色䜓由来平滑筋ミオシン 重鎖遺䌝子䞭に挿入するこずによっお埗られるものである、 請求の範囲 第 8項に蚘茉の非ヒト動物たたはその子孫。
1 0 . 該レポ䞀タ䞀遺䌝子は /3—ガラク トシダヌれ遺䌝子である、 請求 の範囲第 9項に蚘茉の非ヒト動物たたはその子孫。
1 1 . 該非ヒ卜動物がゲッ歯動物である、 請求の範囲第 7項から第 1 0 項のいずれかに蚘茉の非ヒ卜動物たたはその子孫。
1 2 . 該ゲッ歯動物がマりスである、 請求の範囲第 1 1項に蚘茉の非ヒ ト動物たたはその子孫。
1 3 . 請求の範囲第 9項から第 1 2項のいずれかに蚘茉の非ヒト動物た たはその子孫より分離、 培逊しお埗た现胞。
1 4 . 請求の範囲第 1 3項に蚘茉の现胞に T抗原遺䌝子を導入しお埗た 现胞株。
1 5 . S M 1 B M C # 1 ずしお受蚗番号 F E R M B P— 6 6 2 5号 で寄蚗された骚髄现胞株である、 請求の範囲第 1 4項に蚘茉の现胞株。
PCT/JP1999/000505 1998-02-05 1999-02-05 Cellules souches embryonnaires d'animaux non humains et de tels animaux possedant des genes alleles de chaine lourde de myosine des muscles lisses WO1999039571A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99902843A EP1053677A4 (en) 1998-02-05 1999-02-05 EMBRYONIC STEM CELLS OF NON-HUMAN ANIMALS AND SUCH ANIMALS HAVING ALLELE CHAIN GENES OF SMOOTH MUSCLE MYOSINE

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP10/39752 1998-02-05
JP3975298 1998-02-05
JP10/76583 1998-03-10
JP10076583A JPH11285333A (ja) 1998-02-05 1998-03-10 倉異型平滑筋ミオシン重鎖遺䌝子を有する非ヒト動物の胚幹现胞および非ヒト動物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1999039571A1 true WO1999039571A1 (fr) 1999-08-12

Family

ID=26379128

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1999/000505 WO1999039571A1 (fr) 1998-02-05 1999-02-05 Cellules souches embryonnaires d'animaux non humains et de tels animaux possedant des genes alleles de chaine lourde de myosine des muscles lisses

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1053677A4 (ja)
JP (1) JPH11285333A (ja)
WO (1) WO1999039571A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001071006A3 (de) * 2000-03-24 2002-04-18 Wolfgang M Franz Verfahren zur isolierung in vito differenzierter körperzellen

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE236977T1 (de) * 1995-01-25 2003-04-15 Vessel Res Lab Co Ltd Verwendung einer rekombinanten dna fÃŒr die herstellung eines medikaments, wobei die rekombinante dna eine dna umfasst, die die sm1- isoform des proteins der schweren kette von myosin der glatten muskulatur codiert

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGAH R, ET AL.: "GENE RECOMBINATION IN POSTMITOTIC CELLS TARGETED EXPRESSION OF CRE RECOMBINASE PROVOKES CARDIAO-RESTRICTED,SITE-SPECIFIC REARRANGEMENT IN ADULT VENTRICULAR MUSCLE IN VIVO", JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, AMERICAN SOCIETY FOR CLINICAL INVESTIGATION, US, vol. 100, 1 January 1997 (1997-01-01), US, pages 169 - 179, XP002921838, ISSN: 0021-9738, DOI: 10.1172/JCI119509 *
HASEGAWA K, ET AL.: "MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION OF MURINE SMOOTH MUSCLE MYOSIN HEAVY CHAINS", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ACADEMIC PRESS INC. ORLANDO, FL, US, vol. 232, 1 January 1997 (1997-01-01), US, pages 313 - 316, XP002921837, ISSN: 0006-291X, DOI: 10.1006/bbrc.1997.6281 *
NAGAI R, ET AL.: "IDENTIFICATION OF TWO TYPES OF SMOOTH MUSCLE MYOSIN HEAVY CHAIN ISOFORMS BY CDNA CLONING AND IMMUNOBLOT ANALYSIS", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, US, vol. 264, no. 17, 15 June 1989 (1989-06-15), US, pages 9734 - 9737, XP002921836, ISSN: 0021-9258 *
See also references of EP1053677A4 *
THOMAS K. R., CAPECCHI R.: "SITE-DIRECTED MUTAGENESIS BY GENE TARGETING IN MOUSE EMBRYO-DERIVEDSTEM CELLS.", CELL, CELL PRESS, US, vol. 51., 6 November 1987 (1987-11-06), US, pages 503 - 512., XP002052221, ISSN: 0092-8674, DOI: 10.1016/0092-8674(87)90646-5 *
YAMAMURA KENICHI: "PRODUCTION OF ANIMAL MODELS BY GENE TECHNOLOGY", BYOUTAI SEIRI, XX, XX, vol. 14, 1 January 1995 (1995-01-01), XX, pages 961 - 966, XP002921835 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001071006A3 (de) * 2000-03-24 2002-04-18 Wolfgang M Franz Verfahren zur isolierung in vito differenzierter körperzellen

Also Published As

Publication number Publication date
EP1053677A4 (en) 2004-12-01
EP1053677A1 (en) 2000-11-22
JPH11285333A (ja) 1999-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4901471B2 (ja) 䜓现胞栞初期化物質のスクリヌニング方法
EP1071471B1 (en) Methods and vectors for making transgenic rodents which ubiquitously express a heterologous gene
JP2022125255A (ja) 欠倱非ヒト動物
AU2008322038B2 (en) Mammalian artificial chromosome vector comprising human cytochrome P450 gene (cluster) and non-human mammalian animal retaining the same
Schachtner et al. Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo
WO2006129696A1 (ja) 哺乳動物由来のホモログ遺䌝子のプロモヌタヌ配列を含む発珟ベクタヌ及びその利甚
Robbins et al. Embryonic stem cells as a model for cardiogenesis
JP5250810B2 (ja) ナヌトロフィン遺䌝子発珟増匷物質のスクリヌニング
JPWO2005054463A1 (ja) レトロトランスポゟンを甚いた哺乳動物のゲノム改倉技術の開発
JP2020145983A (ja) 円圢脱毛症モデル動物
EP1692935A1 (en) Transgenic animal as a model for human pulmonary disease
US6642433B1 (en) Fgl-2 knockout mice
JP2000515386A (ja) 欠損现胞ず非ヒトトランスゞェニック動物
WO1999039571A1 (fr) Cellules souches embryonnaires d'animaux non humains et de tels animaux possedant des genes alleles de chaine lourde de myosine des muscles lisses
EP1226752A1 (en) Transgenic non-human mammals for monitoring change in calcium ion concentration in cells
US7115796B2 (en) Transgenic pig containing heat shock protein 70 transgene
O’Connor et al. Generating Conditional Mutants to Analyze Ciliary Functions: The Use of Cre–Lox Technology to Disrupt Cilia in Specific Organs
US7462757B2 (en) Animal with gene hypoexpression
JP4118579B2 (ja) ノックアりト现胞
WO2006075671A1 (ja) 所望の染色䜓を陀去する方法およびそれを利甚したテむラヌメむド医療
JP4271120B2 (ja) 染色䜓暙識トランスゞェニック非ヒト動物
US20060242723A1 (en) Chimeric mouse with regulated bradeion gene expression
JPH1056915A (ja) レセプタヌ遺䌝子䞍掻性化動物
Avner et al. DLC-1, a Rho GTPase-Activating Protein with Tumor Suppressor Function, Is Essential for Embryonic Development
van Eldik et al. e role of CHAP during heart development: in vivo and in vitro knockdown in mouse and chick

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1999902843

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09601611

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1999902843

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1999902843

Country of ref document: EP