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WO2002043865A1 - Procedes et dispositifs de transport et de concentration d'un analyte present dans un echantillon - Google Patents

Procedes et dispositifs de transport et de concentration d'un analyte present dans un echantillon Download PDF

Info

Publication number
WO2002043865A1
WO2002043865A1 PCT/FR2001/003743 FR0103743W WO0243865A1 WO 2002043865 A1 WO2002043865 A1 WO 2002043865A1 FR 0103743 W FR0103743 W FR 0103743W WO 0243865 A1 WO0243865 A1 WO 0243865A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
container
analyte
bottleneck
magnetic particles
volume
Prior art date
Application number
PCT/FR2001/003743
Other languages
English (en)
Inventor
Pierre Puget
Patrick Pouteau
Frédéric Ginot
Patrice Caillat
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
Biomérieux Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique, Biomérieux Sa filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
Priority to AU2002222057A priority Critical patent/AU2002222057A1/en
Priority to US10/416,207 priority patent/US7569398B2/en
Priority to EP01998402A priority patent/EP1343586B1/fr
Priority to DE60110256T priority patent/DE60110256T2/de
Priority to AT01998402T priority patent/ATE293494T1/de
Publication of WO2002043865A1 publication Critical patent/WO2002043865A1/fr

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    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical or biological applications

Definitions

  • the present invention relates to a method for transporting an analyte present in a sample, to a process, concentration of an analyte present in a sample, and a device for the implementation of these methods.
  • immunological tests in which the chemical reaction is an antibody / antigen recognition, or more generally a protein / ligand reaction, and tests by nucleic acid (s) probes in which hybridization between nucleic acids is detected.
  • a diagnostic test is all the better if it has both high sensitivity and specificity. It is all the more sensitive as it makes it possible to detect a small quantity of analyte sought. It is all the more specific since it is positive only for the analyte sought and not for similar analytes.
  • analyte is meant all or part of the corpuscle or molecule which it is desired to isolate, change the medium and / or concentrate to be used and / or highlighted such as a microorganism, a bacterium, " a fungus, a virus, a eukaryotic cell; a chemical compound; a molecule such as a peptide, a protein, an enzyme, a polysaccharide, a lipid, a lipoprotein, a lipopolysaccharide, a nucleic acid, a hormone, an antigen, an antibody, a growth factor, a hapten; a cell such as a tumor cell etc.
  • Numerous diagnostic tests are carried out after stages of extraction of the target analytes from the biological samples, of purification to eliminate parasitic products which penalize the performance of the test, of concentration of the target analytes to increase the quantity of analyte per unit of volume of buffer, and dissolving the target analytes in buffer to make them chemically accessible.
  • Biologists have entirely conventional means for concentrating an analyte, notably using centrifugation, filtration and / or magnetic sedimentation techniques. These techniques. require solution transfers and manipulations of the analyte which lead to an inevitable reduction in the amount of analyte that can be analyzed.
  • the actual centrifugation or magnetic sedimentation steps may have to be repeated several times, the limit on the number of repetitions being imposed by the minimum volume of solution which can be easily handled and reliably with a conventional pipette.
  • This minimum volume is of the order of ten micro-liters. Below that, you lose the liquid and therefore the analyte by transporting it in "large" containers such as pipette tips, flasks, etc.
  • the present invention meets this need, and has not only the advantage of overcoming the aforementioned drawbacks, but also many other advantages that those skilled in the art will not fail to note.
  • the present invention provides a method of transporting an analyte present in a sample in which: a solution A is prepared from the sample in which the analyte is fixed on magnetic particles, a solution is introduced into a first container connected via a bottleneck to a second container, and we move by means of a magnetic system
  • transport of the analyte within the meaning of the present invention is meant displacement of the analyte from one container to another container, with or without the liquid medium in which the analyte is present.
  • the present invention also provides " a method of concentrating an analyte present in a sample in which: - a solution A is prepared from the sample in which the analyte is fixed on magnetic particles, the solution A is introduced in a first container of volume ⁇ connected via a bottleneck to a second container of volume ⁇ , the volume ⁇ being smaller than the volume ⁇ , and the analyte fixed on the magnetic particles is moved by means of a magnetic system from the first container to the second container via the bottleneck, the second container being filled with solution A and / or another solution.
  • the analytes are defined above.
  • the preparation of solution A from the sample comprises a step in which the analyte is preferably fixed reversibly on magnetic particles.
  • the usefulness of this reversibility is explained below.
  • the magnetic particles have an adequate size, in particular with the analyte to be isolated, and with the volume of solution A. They can be of sub-micrometric size, for example when the analyte is a molecule.
  • the quantity of particles used depends in particular on the nature and the quantity of analyte to be fixed, it is preferably in sufficient number to fix all of the analyte.
  • the magnetic particles which can be used in the process of the present invention can be, for example, products such as those of the trademark Dynabeads from the company Dynal (Norway) or MACS from the company Miltenyi Biotec (Germany), or also products from the Immunicon Corp. (USA).
  • the usable magnetic particles are conventionally used in molecular and cellular biology. They must in particular be superparamagnetic in order to spontaneously rebroadcast after cancellation of the magnetic field. Examples of protocols for fixing or capturing the analyte on magnetic particles can be found, for example, in the references Bioscience Product Catalog 2000, and Mil tenyi Biotec, Magnetic Cell Sorting, Separation of Biomolecules 1999.
  • the main particles available are particles of Dynal, Seradyn, BioMag, Spherotec or Estapor (registered trademarks). Such particles can be coated with capture oligonucleotides, by adsorption or covalence.
  • Documents US-A-4, 672, 040 and US-A-5, 750, 338 describe methods usable for the present invention. An embodiment particularly interesting 'to' these magnetic particles is described in the patent applications filed by one of the applicants under the following references:
  • these are heat-sensitive magnetic particles each having a magnetic core covered with an intermediate layer.
  • the intermediate layer is itself covered by an external layer based on a polymer capable of 'interact with at least one biological molecule, the external polymer is thermosensitive and has a critical temperature lower _ solubility (LCST) predetermined between 10 and ' : 100 ° C and preferably between 20 and 60 ° c.
  • This outer layer is synthesized from cationic monomers, which generate a polymer with the capacity to link nucleic acids.
  • This intermediate layer isolates the magnetic charges from the nucleus, in order to avoid the problems of inhibiting the techniques of amplification of these nucleic acids.
  • the analyte reversibly attached to the magnetic particles can be released from said particles in the second container. Indeed, it may be necessary to release the analyte so that it can more easily access, or be more easily accessible, chemical reagents and / or the means used to demonstrate it.
  • the magnetic particles released from the analyte can be moved out of the second container by means of a magnetic system.
  • This can be useful for example to avoid any harmful interaction of the particles with the released analytes and / or with chemical reagents and / or means used to demonstrate this.
  • the release of the desired analyte, or elution of the analyte can be carried out for example in a buffer solution for example by heating or another suitable method.
  • the release methods which can be used are all the conventional methods of the state of the art.
  • Chromatographic techniques offer a whole range of techniques for releasing proteins or other ligand which can be used in the process of the present invention, such as a change in pH or a change in ionic strength, or a change in solvent, or even the transition to buffer containing EDTA or any other metal cation chelating substance if the analyte is attached to the particle by a metal-chelate.
  • the analyte is an oligonucleotide
  • it can for example be heated to a temperature of 50 to 60 ° C. for an oligonucleotide of length 15 to 25 bases to dissociate all the analytes from the magnetic particles.
  • the magnetic system is a system for creating a fixed or variable magnetic field generating the application of a force on the magnetic balls, capable of immobilizing or moving them. It can consist of a set of magnets or coils.
  • Coils of this type are for example produced collectively by means of the abovementioned technologies for producing read / write heads for hard disks.
  • the magnetic particles after having been transported, can be resuspended, for example in the second container, by canceling the. magnetic field created by the magnetic system.
  • the inventors also provide a method for concentrating an analyte present in a sample in which: a solution A is prepared from the sample in which the analyte is fixed on particles magnetic, solution A is introduced into a first container of volume ⁇ connected via a bottleneck to a second container of volume ⁇ , the volume ⁇ being smaller than the volume ⁇ , - it is moved by means of a magnetic system 1 ' analyte fixed on the magnetic particles from the first container to the bottleneck, the analyte fixed on the magnetic particles is released from said particles at the bottleneck, the analyte is transported by displacement of a liquid bottleneck to the second container.
  • the analyte can be released in the second container, and the analyte can be moved either by transporting the . liquid containing the analytes, either with transport by displacement of a liquid from the second container to a third container.
  • the magnetic particles released from the analyte can be moved from the second container to the first container via the bottleneck, or from the bottleneck to said first container, by means of a magnetic system.
  • the analyte can be released from the magnetic particles by modification of the physical or chemical conditions, for example by heating or by reaction with at least one substance present in the other solution.
  • an agent for immobilizing the analyte can be attached to all or part of at least one wall of the second container or of any support solid present in said second container.
  • Such supports can for example be constituted by silica beads, solid, hollow or porous glass beads, quartz particles, grains of sand, grains of vermiculite, zeolite and / or feldspar, glass wool and / or rock, clay beads, cork particles, polystyrene, polyethylene, polypropylene, small size agglomerated polyethylene beads, of variable porosity and thickness, latex beads, beads coated with gelatin and grains of resin.
  • the bottleneck may be in the form of a capillary.
  • This form may be advantageous for example to limit the diffusion of the analyte from the second container to the first container when said analyte has been released from the magnetic particles.
  • the present invention also provides a method for detecting an analyte in a sample in which: a concentration of the analyte is carried out by means of a concentration method of the present invention, - the analyte in the second container or in any other container connected directly or indirectly to the second container.
  • the second container or reaction chamber or any other container connected directly or indirectly to the second container may contain one or more reagents or solids " in solution intended to react directly or indirectly with the analyte. indirectly, it is understood that several successive chemical reactions can be carried out on the analyte or one of its derivatives obtained.
  • Magnetic particles in the form of pellets are described in the state of the art, for example in document EP-A-0 811 694.
  • the manufacture of the pellets is also well described in the state of the art, for example in documents US-A-4, 678, 812 and US-A-5, 275, 016. This production mentioned above can be used for the synthesis of the other pellets which will be explained below, such as:
  • - a tablet which comprises structural constituents, such as dNTPs, primers or ions, allowing subsequent amplification as described in patent US-A-5,098,893 or the article "Ambient-temperature-stable molecular biology reagents "R. Ramanujam et al., Product Application Focus, vol. 14, No. 3 (1993), 470-473, for example, - a pellet containing functional constituents, such as enzymes which, associated with the structural constituents mentioned above, allow the conduct of an amplification.
  • structural constituents such as dNTPs, primers or ions
  • pellets are given in patent US-A-4,891,319, patent applications WO-A-87/00196 and WO-A-95/33488 or the article "Extraordinary stability of enzymes dried in trehalose: simplified molecular biology ", from C. Colaley et al., Bio / Technology, vol. 10, September 1992, 1007-1011.
  • the analyte to be demonstrated is a nucleic acid
  • it can be demonstrated by a nucleic acid chip technology.
  • the second container can therefore be a reservoir of a microcomponent, for example of a biochip, for example of a DNA chip.
  • biochip any solid support on which ligands are fixed, and in particular by a DNA chip, is meant any solid support on which nucleic acids are fixed.
  • the method for fixing " ligands can be carried out in various ways and in particular by adsorption or covalence, such as, for example, in situ synthesis by photolithography techniques or by a piezoelectric system, by capillary deposition of preformed ligands. illustration, examples of these biochips applied to DNA chips are given in the publications of G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, p. 40-44, 1998; F.
  • the second container can also be an inlet chamber to another container using another method. So the second container can be linked directly or indirectly to another container used for other chemical reactions or process steps targeting the analyte or one of its derivatives such as purification, amplification, labeling, etc.
  • the other container or chamber may be a PCR chamber for amplifying a gene, possibly with then an analysis in a laboratory on a chip ("micro-total analysis system": MicroTas).
  • Micro-total analysis system MicroTas
  • all amplification techniques can be used.
  • ' for the amplification of nucleic acids, ' there are, among others, the following techniques:
  • reagents can be used, such as lyophilized reagents, for example to make a homogeneous test for detection of the analyte, for example by fluorescence transfer.
  • the analyte is defined above.
  • the present invention also provides a device for transporting an analyte fixed on magnetic particles present in a liquid, said device comprising: a first container intended to contain a liquid and_ connected via a bottleneck to a second container, a system magnetic allowing to move the magnetic particles on which is fixed the analyte from the first container to the second container via the bottleneck.
  • the volumes of the first and second containers are preferably adapted to the volumes of solutions to be handled. These volumes can be less than or equal to 10 ml.
  • the present invention also provides a device for concentrating an analyte fixed on magnetic particles present in a liquid, said device comprising: a first container of volume ⁇ intended to contain a liquid connected via a bottleneck to a second container, said second container of volume ⁇ smaller than the volume ⁇ of the first container, and a magnetic system making it possible to move the magnetic particles on which is fixed
  • these containers can be used for example as reaction chambers.
  • the aforementioned techniques also make it possible to produce capillaries of section from a few microns-square to a few hundred thousand microns-squares for the transfer of solutions, or of an analyte fixed on microparticles, according to the present invention, from a first container to a second container, for example from one reaction chamber to another reaction chamber.
  • the ratio of the volumes ⁇ / ⁇ can be, for example, from 10 to 1000.
  • the first container can for example have a volume of about 0.1 to 100 ⁇ l.
  • the second container can have a volume of about 0.01 to 1 ⁇ l.
  • the invention therefore allows a reduction in volume which is 100 to 1000 times greater than that which could be achieved by laboratory practices or automated "macroscopic" systems of the prior art handling liquids with pipettes and vials of a few dozen microliters. It therefore makes it possible to concentrate a sample by the same factor 100 to 1000.
  • the first container and / or the second container can / can have a shape which converges towards said bottleneck.
  • the bottleneck may for example be in the form of a capillary as described in the previous paragraph.
  • the bottleneck may for example have a 'section of between 1 micron 2 to 1 mm 2, preferably 100 ⁇ 2 to 0.1 mm 2.
  • the second container ' and / or the bottleneck may / may be provided with inlet / outlet channels for fluids.
  • These channels obviously have a section adapted according to the volumes of solution that they are intended to contain.
  • these channels can be used to do the necessary washes before the reading step.
  • the aforementioned devices may comprise a vent in the form of a capillary present at the level of the second container and directly connecting the latter to the outside.
  • this vent serves to evacuate the fluid initially present in the container, whether it be air or liquid.
  • the presence of air in the second container is only a possibility.
  • vents in other places, for example at the bottleneck, the first container etc. These venting vents can be controlled for example by ball valves.
  • the invention therefore makes it possible, thanks to the use of micro-technology techniques, to integrate into devices today called labopuce, or "lab-on-a-chip” or even “micro-Total-Analysis-System “(MicroTAS) in Anglo-Saxon terminology.
  • labopuce or "lab-on-a-chip” or even “micro-Total-Analysis-System”(MicroTAS) in Anglo-Saxon terminology.
  • the device of the present invention can be combined with other functions to form a more complete and precise system of biological analysis.
  • the device of the present invention can be the first element of a set comprising:
  • amplification module 2. an amplification module, 3. a separation module, for example by electrophoresis, 4. a detection module.
  • reaction chamber and transfer channels can therefore be confused since these lab chips allow the realization of continuous processes for which the reactions are carried out in capillary, for example in certain capillary electrophoresis and PCR techniques.
  • the invention can for example be useful when the analyte sought is initially present in a sample of large volume but in limited quantity.
  • the proposed invention makes it possible, for example by implementing the aforementioned micro-technologies, to concentrate a solution of molecules which one wishes to detect, or to move an analyte from a first solution to a second solution in a lower volume. microliter, completely inaccessible by conventional laboratory procedures.
  • the present invention can be implemented "for example in an automated in vitro diagnostic system, or a system for detecting biological contaminants in fields such as the food industry and / or industrial microbiological control.
  • the invention can be applied for example for ultra-sensitive detection without amplification of pathogens in a biological sample.
  • the nucleic acids of the pathogens potentially present in a sample can be extracted by standard techniques. They can then be purified and concentrated, still by standard techniques, up to a buffer volume of a few tens of microliters.
  • the use of the device of the present invention or - micro-component makes it possible in this case to concentrate the biological material in the volume of the reaction chamber which corresponds to the second component. There, subsequent stages of hybridization on plane and detection support make it possible to detect the presence or absence of nucleic acids of given sequence, characteristic of the infection of the sample.
  • the use of the invention therefore makes it possible to greatly increase the sensitivity of a test, with equal performance of the detection system.
  • the present invention can for example be applied to improve immunoassays. Indeed, for immunoassays in which there is a sensitivity problem, the use of the invention, as previously described, by concentrating the biological material in a very small volume, makes it possible to greatly increase their sensitivity.
  • the use of the invention makes it possible to concentrate the sample, and therefore to reduce the duration of the immunological reaction.
  • FIG. 1 is a schematic perspective and exploded representation with a partial section of a first embodiment of a device according to the present invention
  • FIG. 2 is a schematic perspective and exploded representation of a second embodiment of a device according to the present invention
  • Figure 3 is a schematic perspective and exploded representation with a partial section of a third embodiment of a device according to the present invention
  • - Figure 4 is a schematic representation of a first magnet usable for implementation of the present invention
  • Figure 5 is a schematic representation of a second magnet usable for the implementation of the present invention.
  • Example 1 example of preparation of solution A
  • the biological sample is processed by conventional molecular biology means to obtain a solution containing the target RNA molecules to be detected; this solution has a volume of 200 microliters and the buffer solution is as follows: Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 1M, triton X-100 0.05%, salmon DNA 0.14 mg / ml.
  • this capture oligonucleotide solution consists of: Tris 10 mM, EDTA ImM, pH 8, capture oligonucleotide 10 1: L / ⁇ l; the capture oligonucleotide is an oligonucleotide, biotynilized in 5 ′, of a sequence for example of 32 bases, complementary to a subsequence of the target DNA. Incubation for 2 hours at 35 ° C.
  • Example 2 device according to a first embodiment of the present invention
  • the device or component described in this example is a micro-component which makes it possible to reduce by a factor of 100 to 1000 the volume of buffer in which a desired analyte is found, while retaining the amount of analyte present in the initial sample. .
  • component 1 The general architecture of component 1 is shown in FIG. 1. It consists of an introduction chamber 3, possibly extended by an introduction device made up of parts 13 and 15, connected to a reaction chamber 7 by l 'Intermediate of a bottleneck 5, here shown in the form of a capillary.
  • the particular shapes of the two chambers are given by way of example.
  • the chambers and the capillary can be of different shape or size depending on the application or the manufacturing technology of the component.
  • Figure 1 suggests a manufacturing method according to which the component is manufactured by engraving the chambers and the bottleneck in a flat material, then by assembling by gluing or any other method of fixing the cover 11. It is a method of possible manufacturing, but the invention is not dependent on this method of manufacture. Any other technology, in particular:
  • a vent 9 allows the evacuation of air or liquid fluids when filling or transferring liquids in the chambers.
  • the sample and the different reagents or buffers can be introduced into the devices in different ways. We give two of them here as examples.
  • This first embodiment is produced by making an orifice in the cover 11 of the device and by equipping this orifice with a conical bowl 15.
  • a cylindrical part 13 is used to hold the conical bowl in position and at sealing between the conical cup and the device.
  • a pipette, a dilutor or syringe tip By applying, for example, a pipette, a dilutor or syringe tip, to the conical cuvette, one can "push" the tampon or reagent inside the device by applying pressure to the liquid. Air or any other liquid or gaseous fluid initially present in the device will be removed from the device via the vent 9. This vent opens here into the reaction chamber, but it may be placed, depending on the case, in other places of the device. We could even possibly have several vents.
  • FIG. 2 A second embodiment for the introduction of liquid into the device is shown in FIG. 2.
  • the liquids are introduced through a capillary 17, itself connected to the outside of the device by an interface, not shown in the figure.
  • the cover 19 does not include an orifice.
  • the method described in this example makes it possible to reduce by a factor of 100 to 1000 the volume of buffer in which a desired analyte is found, while retaining the amount of analyte present in the initial sample. It implements the device shown in the previous example.
  • the component is previously filled with buffer without the desired analyte and without magnetic particle.
  • This tampon can be introduced by pouring the necessary quantity into the conical bowl 15 shown in FIG. 1, and by applying pneumatic pressure in this conical bowl. Once the component has been filled, the excess buffer present in the conical bowl 15 is removed, for example using a pipette.
  • the sample composed of a certain amount of buffer, for example of the order of 30 ⁇ l, in which the analytes sought were previously fixed on magnetic particles and deposited in the conical bowl 15.
  • the magnetic particles are then attracted towards the bottom of the introduction chamber 3 (FIG. 1) using a magnet, for example the magnet 30 of the shape indicated in FIG. 4 positioned under the device, at the plumb of the conical bowl.
  • the magnetic particles are then collected in a small pellet.
  • the base is attracted and transported from its initial position in the first introduction chamber 3, through the capillary 5, in the reaction chamber 7.
  • the analyte is then released from the magnetic particles by heating (elution) inside the reaction chamber 7. During this operation, the magnetic particles are optionally resuspended in the reaction chamber 7 by removing the magnet.
  • the magnetic particles are again collected in a pellet in the reaction chamber 7 again using a magnet, for example of the form presented in FIG. 4. They are then transported again through the capillary 5, but in the opposite direction as previously, from the reaction chamber 7 to the introduction chamber 3, using a magnet, for example of the form presented in FIG. 5.
  • the final result of this sequence of operations is the transport of all the analytes from the conical dish 15 to the reaction chamber 7, of much smaller volume.
  • the component is previously filled with buffer without magnetic particles.
  • the sample composed of a certain amount of buffer, for example of the order of 30 ⁇ l, in which the desired analytes have been previously fixed " on magnetic particles is deposited in the conical cuvette 15.
  • the magnetic particles are attracted to the bottom of the introduction chamber 3 (FIG. 1) using a magnet, for example of the shape indicated in FIG. 4.
  • the magnetic particles are then collected in a small pellet.
  • another magnet for example of the shape shown in Figure 5, arranged so that the device is in its air gap, the base is attracted and transported from its initial position in the capillary 5 (and no longer in the reaction chamber 7).
  • the analyte is released from the magnetic particles by heating (elution) inside the capillary 5. During this operation, the magnetic particles are optionally resuspended in the capillary by removing the magnet.
  • the magnetic particles are again collected in a pellet in the capillary using again a magnet, for example of the form presented in the figure.
  • the analytes are free in solution inside the capillary.
  • the analytes in solution are thus entrained by the displacement of the liquid in the bedroom of. reaction 7.
  • the magnetic particles themselves remain in position in the capillary, held in position in the form of a pellet by the fixed magnet.
  • the magnetic particles are in the form of dry entities already present in the introduction chamber 3. Such entities are well described in US-A-5,750, 338 and 4,672,040.
  • the introduction of the sample into said chamber 3 solubilizes the magnetic particles which then attach to the analyte present from the. departure from said sample.
  • Example 5 Use of the Invention to Demonstrate the Analyte in a Homogeneous Detection Test
  • the analyte is highlighted using the "Molecular Beacons” technique, as described in Tyagi, S. and Kramer, FR, Nat. Biotechnol. 14: 30-308, 1996.
  • this technique consists in putting the target molecules with nucleic probes, the "Molecular Beacons”, which have the following structure: the probe sequence, complementary to the target, is extended on both sides by two arms of a few nucleotides long, complementary to each other.
  • a fluorophore for example the EDANS group
  • a fluorescence inhibitor for example, the DABCYL group is attached to the other arm.
  • the two arms of the probe hybridize to one another and the fluorescence of EDANS is quenched by DABCYL.
  • the probe hybridizes to the target the two groups' located distant from each other, and the fluorescence of EDANS is released.
  • the presence and even the concentration of the analyte is revealed by the fluorescence signal and the intensity of this signal.
  • the implementation of this technique in a device according to the invention is for example the following: 1. Preparation of the solution A to be analyzed, the analyte being a nucleic acid,
  • the analyte is then released from the particles,
  • the advantage of this procedure compared to the state of the art is to concentrate the analyte in an alpha / beta ratio, for example of 100 times, and therefore to relatively reduce the residual fluorescence of the probes.
  • the analyte is demonstrated by hybridization on a DNA chip; the DNA chip has the advantage, compared to the labeling technique presented in Example 5, of being able to do a lot hybridizations in parallel, therefore offering the biologist much greater analytical power.
  • the bottom of the second container 7 is a DNA chip, for example consisting of about twenty hybridization pads.
  • the chip is manufactured by DNA deposition according to standard means of the state of the art of DNA chips.
  • the analyte is a nucleic acid labeled with a fluorescent moiety, eg "fluorescein, by conventional means of the prior art,
  • the hybridization buffer for example: Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 1M, newt X-100
  • washing solution for example Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 1M, triton X-100 0, 5% -,
  • Reading of the fluorescence present on the DNA chip for example by placing the device under an epi-fluorescence microscope equipped with a CCD camera, and using an adequate magnification.
  • concentration of the analyte before its hybridization on the DNA chip allows a faster reaction of the analyte on the DNA chip.
  • This acceleration of the kinetics compared to the state of the art makes it possible either to reduce the hybridization time or to increase the detection sensitivity of the system, since this sensitivity is generally limited by the kinetics of hybridization of the analyte on the DNA chip.
  • Example 7 Use of the invention as an entry point for a ⁇ TAS
  • the invention serves as an entry point to a more complex ⁇ TAS than a device composed only of two containers separated by a bottleneck.
  • ⁇ TAS the one presented by the team of A. Northrup, which consists of an amplification chamber, followed by a capillary electrophoresis of the amplified products and a detection (see Anal. Che. 1996, 68, 4081-4086).
  • the second container is in fact a PCR amplification chamber, for example manufactured by means of microtechnologies.
  • the second container is provided with a heating means, cooling means, and a temperature sensor, which allows to apply to the sample liquid contained in the 'second container 7 cycles thermal.
  • the inlet-outlet 21, 22 of fluid cutting this second container is the electrophoresis injection channel of the amplified sample in the separation capillary.
  • the separation capillary is not shown in our figures (see Figure 1 of the aforementioned article), nor the microreservoirs allowing the application of the electric fields necessary for injection and then for separation by electrophoresis.
  • the second container also contains dry pellets containing all the products necessary for PCR amplification; these products are "glassified" by well-known techniques, and the glass-shaped pellets, in the form of a ball, containing the various products necessary for amplification, are deposited in the second container before the cover is put in place.
  • the manufacture of these caps is well described in the state of the art, for example US-A-4,678,812 and US-A-5, 275, 016.
  • the separation capillary further contains a separation gel, for example hydroxy ethyl cellulose, which itself contains a marker • fluorescent DNA, such as thiazole orange.
  • a separation gel for example hydroxy ethyl cellulose, which itself contains a marker • fluorescent DNA, such as thiazole orange.
  • Detection of the amplified fragments for example by an epi-fluorescence microscope equipped with a photomultiplier, the microscope field being located at the end of the separation capillary.
  • the coupling of the invention to an integrated capillary amplification and electrophoresis system allows:
  • the speed with which the entire chain is carried out on the order of a few minutes for magnetic transport, 10 to 15 minutes for amplification and 1 to 2 minutes for capillary electrophoresis, allows obtaining excellent quality results, without the need to isolate the compartments by valves.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de transport d'un analyte présent dans un échantillon, à un procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon, et à un dispositif pour la mise en oeuvre de ces procédés.Dans le procédé de transport d'un analyte présent dans un échantillon de la présente invention, on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l'analyte est fixé sur des particules magnétiques ; on introduit la solution A dans un premier contenant relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant ; et on déplace au moyen d'un système magnétique l'analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement ; le deuxième contenant étant rempli par tout ou partie de la solution A et/ou par une autre solution.

Description

PROCEDES ET DISPOSITIFS DE TRANSPORT ET DE CONCENTRATION D'UN ANALYTE PRESENT DANS UN ECHANTILLON
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à un procédé de transport d'un analyte présent dans un échantillon, à un procédé , de concentration d'un analyte présent dans un échantillon, et à un dispositif pour la mise en œuvre de ces procédés.
Elle s'inscrit dans tous les domaines dans lesquels il existe un besoin de transporter Un analyte d'une première solution à une deuxième solution, ceci par exemple pour des raisons d'incompatibilité de la solution constituée par l'échantillon, ou d'éléments présents dans cette solution, avec un réactif ou un procédé chimique ciblant l' analyte.
Elle s'inscrit également dans tous les domaines dans lesquels il existe un besoin de concentrer un analyte pour pouvoir le mettre en évidence par exemple en le f isant réagir avec un réactif par ' exemple de transformation et/ou de mise en évidence de l' analyte.
Par exemple, de nombreux tests de diagnostic in vitro consistent à faire réagir chimiquement un analyte recherché" "avec un réactif adéquat. Le ou un des produits de la réaction est ensuite détecté directement ou indirectement .
On peut citer par exemple les tests immunologiques dans lesquels la réaction chimique est une reconnaissance anticorps/antigène, ou de façon plus générale une réaction protéine/ligand, et les tests par sondes d'acide (s) nucléique (s) dans lesquels on détecte une hybridation entre acides nucléiques.
Un test de diagnostic est d'autant meilleur qu'il présente à la fois une sensibilité et une spécificité élevées. Il est d'autant plus sensible qu'il permet de détecter une quantité faible d' analyte recherché. Il est d'autant plus spécifique qu'il n'est positif que pour l' analyte recherché et non pour des analytes semblables .. On entend par analyte tout ou partie de corpuscule ou molécule que l'on désire isoler, changer de milieu et/ou concentrer pour être utilisé et/ou mis en évidence tel qu'un microorganisme, une bactérie," un champignon, un virus, une cellule eucaryote ; un composé chimique ; une molécule telle qu'un peptide, une protéine, un enzyme, un polysaccharide, un lipide, une lipoprotéine, un lipopolysaccharide, un acide nucléique, une hormone, un antigène, un anticorps, uri facteur de croissance, un haptène ; une cellule telle qu'une cellule tumorale etc.
Etat de la technique
De nombreux tests de diagnostic sont réalisés après des étapes d'extraction des analytes cibles des échantillons biologiques, de purification pour éliminer des produits parasites qui pénalisent les performances du test, de concentration des analytes cibles pour augmenter la quantité d' analyte par unité de volume de tampon, et de mise en solution des analytes cibles dans un tampon pour les rendre accessibles chimiquement.
En outre, pour augmenter la sensibilité et la spécificité d'un test permettant de mettre en évidence un analyte, il est parfois nécessaire de réduire le volume du tampon dans lequel se trouve les exemplaires de l' analyte recherché, tout en conservant l'intégralité de ce dernier. Les biologistes ont des moyens tout à fait classiques de concentration d'un analyte utilisant notamment des techniques de centrifugation, de filtration et/ou de sédimentation magnétique. Ces techniques . nécessitent des transferts de solutions et des manipulations de l' analyte qui conduisent à une réduction inévitable de la quantité d' analyte analysable .
Par exemple dans les procédés de centrifugation et de sédimentation magnétique, les étapes de centrifugation ou de sédimentation magnétique proprement dites peuvent devoir être répétées plusieurs fois, la limite du nombre de répétitions étant imposée par le volume minimal de solution qui peut être manipulé facilement et de façon fiable avec une pipette classique. Ce volume minimal est de l'ordre de la dizaine de micro-litre. En-deçà, on perd du liquide et donc de l' analyte en le transportant dans des "gros" contenants tels que des cônes de pipettes, des flacons, etc. En outre, il se pose des problêmes d' évaporation et d'adsorption sur les parois des contenants lors de ces manipulations.
Dans le cas d'une concentration faible d' analyte dans l'échantillon au départ, ceci peut provoquer la disparition totale de l' analyte ou une diminution de sa quantité telle qu'il peut devenir indétectable. Outre les inconvénients précités, ces manipulations sont • coûteuses en matériel et prennent beaucoup de temps .
Ceci reste un problème constant pour de nombreuses applications industrielles, par exemple la détection de microorganismes pathogènes dans un prélèvement biologique ou un échantillon industriel.
Il existe donc un réel besoin d'un procédé et d'un dispositif .permettant de faire passer un analyte d'une première solution à une deuxième solution et/ou de concentrer un analyte tout en conservant la quantité d' analyte présente au départ, ceci par exemple afin d'accroître la sensibilité et la spécificité des tests de diagnostic et de toute réaction chimique dirigée vers l' analyte, et de pallier les inconvénients précités .
La présente invention répond à ce besoin, et présente non seulement l'avantage de pallier aux inconvénients précités, mais aussi de nombreux autres avantages que l'homme du métier ne manquera pas de relever.
Exposé de l'invention
La présente invention fournit un procédé de transport d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, on introduit la solution A dans un premier contenant relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant, et on déplace au moyen d'un système magnétique
1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d' étranglement , le deuxième contenant étant rempli par tout ou partie de la solution A et/ou par une autre solution.
Il est à noter qu'il est également possible que la préparation de l'échantillon dans laquelle 1 ' analyte est fixé sur les particules magnétiques peut être réalisée directement dans le premier contenant. Ceci est également valable pour les procédés de concentration exposés ci-dessous.
Par transport de 1 ' analyte au sens de la présente invention, on entend déplacement de l' analyte d'un contenant à un autre contenant, avec ou sans le milieu liquide dans lequel l' analyte est présent. L'utilité d'un tel transport obtenu grâce au procédé et au dispositif de la présente invention, ainsi que les applications et avantages qui en découlent apparaîtront clairement à l'homme du métier à la lecture de la présente description.
La présente invention fournit également" un procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : - on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, on introduit la solution A dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, et on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d' étranglement , le deuxième contenant étant rempli par la solution A et/ou par une autre solution.
Les analytes sont définis ci-dessus.
La préparation de la solution A à partir de l'échantillon comprend une étape dans laquelle 1' analyte est fixé de préférence de façon réversible sur des particules magnétiques. L'utilité de cette réversibilité est expliquée ci-dessous.
Les particules magnétiques ont une taille adéquate notamment avec l' nalyte à isoler, et avec le volume de solution A. Elles peuvent être de taille sub- micrométrique par exemple lorsque 1 ' analyte est une molécule .
La quantité de particules utilisée est fonction notamment de la nature et de la quantité d' analyte à fixer, elle est de préférence en nombre suffisant pour fixer la totalité de l' analyte. Les particules magnétiques utilisables dans le procédé de la présente invention peuvent être par exemple des produits tels que ceux de la marque de commerce Dynabeads de la société Dynal (Norvège) ou MACS de la société Miltenyi Biotec (Allemagne) , ou encore des produits de la société Immunicon Corp . (USA) .
D'une manière générale, les particules magnétiques utilisables sont classiquement utilisées en biologie moléculaire et cellulaire. Elles doivent être en particulier superparamagnétiques afin de rediffuser spontanément après annulation du champ magnétique. Des exemples de protocoles de fixation ou de capture de l' analyte sur les particules magnétiques peuvent être trouvés par exemple dans les références Bioscience Product Catalogue 2000, et Mil tenyi Biotec, Tri Magnétique de Cellules, Séparation de biomolécules 1999. Les principales particules disponibles sont les particules de Dynal, Seradyn, BioMag, Spherotec ou Estapor (marques déposées) . De telles particules peuvent être revêtues d'oligonucléotides de capture, par adsorption ou covalence. Les documents US-A-4, 672, 040 et US-A-5, 750 , 338 décrivent des procédés utilisables pour la présente invention. Un mode de réalisation particulièrement intéressant ' de "ces particules magnétiques est décrit dans les demandes de brevet déposées par l'un des demandeurs sous les références suivantes :
- PCT/FR 97/00912 sous priorité française du 24 mai 1996, et
- PCT/FR 99/00011 sous priorité française du 6 janvier 1998.
Dans la dernière de ces demandes de brevet, il s'agit de particules magnétiques thermosensibles ayant chacune un noyau magnétique recouvert d'une couche intermédiaire.. La couche intermédiaire est elle-même recouverte par une couche externe à base d'un polymère susceptible d' interagir avec au moins une molécule biologique, le polymère externe est thermosensible et présente une température critique inférieure _ de solubilité (LCST) prédéterminée comprise entre 10 et': 100°C et de préférence entre 20 et 60°c. Cette couche externe est synthétisée à partir de monomères cationiques, qui génèrent un polymère ayant la capacité de lier les acides nucléiques. Cette couche intermédiaire isole les charges magnétiques du noyau, afin d'éviter les problèmes d'inhibition des techniques d'amplification de ces acides nucléiques. Selon l'invention, l' analyte fixé réversiblement sur les particules magnétiques peut être libéré desdites particules dans le deuxième contenant. En effet, il peut être nécessaire de libérer 1 ' analyte pour qu'il puisse accéder plus facilement, ou être plus facilement accessible, à des réactifs chimiques et/ou aux moyens utilisés pour le mettre en évidence.
Selon l'invention, les particules magnétiques libérées de l' analyte peuvent être déplacées hors" du deuxième contenant au moyen d'un système magnétique. Ceci peut être utile par exemple pour éviter toute interaction préjudiciable des particules avec les analytes libérés et/ou avec des réactifs chimiques et/ou des moyens utilisés pour le mettre en évidence.
Selon l'invention, la libération de 1 ' analyte recherché, ou élution de l' analyte, peut être effectuée par exemple dans une solution tampon par exemple par chauffage ou un autre procédé adéquat . Les procédés de libération utilisables sont tous les procédés classiques de l'état de l'art. Les techniques chromatographiques offrent toute une panoplie de techniques de libération de protéines ou autre ligand utilisables dans le procédé de la présente invention, telles qu'un changement de pH ou un changement de force ionique, ou un changement de solvant, ou encore le passage en tampon contenant de l'EDTA ou toute autre substance chélatante des cations métalliques si 1' analyte est fixé à la particule par une technique de métal-chélate. Si l' analyte est un oligonucleotide, on peut par exemple chauffer à une température de 50 à 60°C pour un oligonucleotide de longueur de 15 à 25 bases pour dissocier tous les analytes des particules magnétiques .
Selon l'invention, le système magnétique est un système permettant de créer un champ magnétique fixe ou variable engendrant l'application d'une force sur les billes magnétiques, capable de les immobiliser ou de les déplacer. Il peut être constitué d'un ensemble d'aimants ou de bobines.
Il peut s'agir également d'une bobine intégrée, réalisée par exemple par des procédés de microtechnologie tel qu'un dépôt de matériaux et de résines photosensibles de masquage, une insolation de ces résines, des gravures de motifs à l'échelle du micron, par exemple. Des bobines de ce type sont par exemple fabriquées collectivement au moyen des technologies précitées pour réaliser des têtes de lecture/écriture de disques durs.
Selon l'invention, après avoir été transportées, les particules magnétiques peuvent être remises en suspension, par exemple dans le deuxième contenant, par annulation du. champ magnétique créé par le système magnétique.
Selon une variante de la présente invention, les inventeurs fournissent également un procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : - on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur -des particules magnétiques, on introduit la solution A dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, - on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant jusqu'au goulet d'étranglement, on libère l' analyte fixé sur les particules magnétiques' desdites particules au niveau du goulet d'étranglement, on transporte par déplacement d'un liquide 1' analyte du goulet d'étranglement vers le deuxième contenant .
Selon une variante du procédé de concentration de la présente invention, 1 ' analyte peut être libéré dans le deuxième contenant, et 1 ' analyte peut être déplacé soit sous transport du. liquide contenant les analytes, soit avec transport par déplacement d'un liquide du second contenant vers un troisième contenant. Selon l'invention, on peut déplacer les particules magnétiques libérées de l' analyte du deuxième contenant au premier contenant via le goulet d'étranglement, ou du goulet d'étranglement audit premier contenant, au moyen d'un système magnétique. Selon l'invention, comme décrit ci-dessus, l' analyte peut être libéré des particules magnétiques par modification des conditions physiques ou chimiques par exemple par chauffage ou par réaction avec au moins une substance présente dans l'autre solution. Selon l'invention, un agent d'immobilisation de l' analyte peut être fixé sur tout ou partie d'au moins une paroi du deuxième contenant ou de tout support solide présent dans ledit deuxième contenant. De tels supports peuvent par exemple être constitués par des billes de silice, des billes de verre pleines, creuses ou poreuses, des particules de quartz, des grains de sable, des grains de vermiculite, zéolite et/ou feldspath, de la laine de verre et/ou de roche, des billes d'argile, des particules de liège, des billes de polystyrène, de polyéthylène, de polypropylène, de polyéthylène de petite taille agglomérées, de porosité et d'épaisseur variables, de billes de latex, de billes revêtues de gélatine, et de grains de résine.
Selon l'invention, le goulet d'étranglement peut être sous la forme d'un capillaire. Cette forme peut être intéressante par exemple pour limiter la diffusion de l' analyte du deuxième contenant vers le premier contenant lorsque ledit analyte a été libéré des particules magnétiques.
La présente invention fournit également un procédé de mise en évidence d'un analyte dans un échantillon dans lequel : on procède à une concentration de l' analyte au moyen d'un procédé de concentration de la présente invention, - on met en évidence l' analyte dans le deuxième contenant ou dans tout autre contenant relié directement ou indirectement au deuxième contenant .
Le deuxième contenant ou chambre de réaction ou tout autre contenant relié directement ou indirectement au deuxième contenant peut contenir un ou des réactif (s) secs ou "en solution destiné (s) à réagir directement ou indirectement avec l' analyte. Par indirectement on entend que plusieurs réactions chimiques successives peuvent être réalisées sur 1' analyte ou un de ses dérivés obtenu. Des particules magnétiques sous forme de pastilles sont décrites dans l'état de la technique, par exemple dans le document EP-A-0 811 694. La fabrication des pastilles est également bien décrite dans l'état de la technique, par exemple dans les documents US-A-4 , 678 , 812 et US-A-5, 275 , 016. Cette fabrication évoquée ci-dessus peut être utilisée pour la synthèse des autres pastilles qui seront exposées par la suite, telles que :
- une pastille qui comporte des constituants structurels, comme des dNTP, des amorces ou des ions, permettant l'amplification ultérieure telle que décrite dans le brevet US-A-5, 098 , 893 ou l'article "Ambiant- temperature-stable molecular biology reagents" R. Ramanujam et al., Product Application Focus, vol. 14, n°3 (1993) , 470-473, par exemple, - une pastille contenant des constituants fonctionnels, tels que des enzymes qui, associés avec les constituants structurels précédemment cités, permettent la conduite d'une amplification. Des exemples de telles pastilles sont donnés dans le brevet US-A-4 891 319, les demandes de brevet WO-A-87/00196 et WO-A-95/33488 ou l'article "Extraordinary stability of enzymes dried in trehalose : simplified molecular biology", de C. Colaço et al., Bio/Technology, vol. 10, September 1992, 1007-1011. On peut par exemple prévoir, selon la présente invention, des plots d'hybridation fixés sur une surface du deuxième contenant de manière à ce qu'ils soient accessibles à l' analyte lorsqu'il se trouve dans le deuxième contenant . Ceci peut être réalisé par exemple sous la forme d'une puce à ADN intégrée. Ainsi, selon la présente invention, lorsque l' analyte à mettre en évidence est un acide nucléique, il peut être mis en évidence par une technologie de puce à acide nucléique. Selon la présente invention, le deuxième contenant peut donc être un réservoir d'un microcomposant, par exemple d'une biopuce, par exemple d'une puce à ADN. Par biopuce, on entend tout support solide sur lequel sont fixés des ligands, et en particulier par une puce à ADN, on entend tout support solide sur lequel sont fixés des acides nucléiques. La méthode de fixation "des ligands peut être réalisée de différentes manières et notamment par adsorption ou covalence comme par exemple la synthèse in situ par les techniques de photolithographie ou par un système piézo-électrique, par dépôt capillaire de ligands préformés. A titre d'illustration, des exemples de ces biopuces appliqués aux puces à ADN sont donnés dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, p. 40-44, 1998 ; F. Ginot, Human Mutation, 10, p. 1-10, 1997 ; J. Cheng et al., Molecular diagnosis, 1(3), p. 183-200, 1996 ; T. Livache et al., Nucleic Acids Research, 22(15), p. 2915-2921, 1994 ; J. Cheng et al., Nature
Biotechnology, 16, p. 541-546, 1998 ou dans les brevets
US 4,981,783 (Augenlicht) , US 5,700,637 (Southern), US
5,445,934 (Fodor) , US 5,744,305 (Fodor) , US 5,807,522
(Brown) . Selon l'invention, le deuxième contenant peut être aussi une chambre d'entrée vers un autre contenant d'un autre procédé. Ainsi, le deuxième contenant peut être relié directement ou indirectement à un autre contenant utilisé pour d'autres réactions chimiques ou étapes de procédé ciblant l' analyte ou un de ses dérivés telle qu'une purification, une amplification, un marquage, etc. Par exemple, l'autre contenant ou chambre peut être une chambre de PCR pour amplifier un gène, éventuellement avec ensuite une analyse dans un laboratoire sur puce ("micro-total analysis system" : MicroTas) . Néanmoins, toutes les techniques d'amplification peuvent être utilisées.' Ainsi, pour l'amplification des acides nucléiques, ' il existe entre autres les techniques suivantes :
- PCR (Polymerase Chain Reaction) , telle que décrite dans les brevets US-A-4 683 195, US-A-4 683 202 et US-A-4 800 159,
- LCR (Ligase Chain Reaction) , exposée par exemple dans la demande de brevet EP-A-0 201 184,
- RCR (Repair Chain Reaction) , décrite dans la demande de brevet O-A-90/01069,
- 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet O-A-90/06995 ,
- NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) . avec la demande de brevet O-A-91/02818 , - SPSR (Single Primer Séquence Replication) avec le brevet "US-A-5 194 370, et
- TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5 399 491.
Selon l'invention, d'autres réactifs peuvent être utilisés, tels que des réactifs lyophilisés, par exemple pour faire un test homogène de détection de 1' analyte, par exemple par transfert de fluorescence. Selon l'invention, de manière non limitative, l' analyte est défini ci-dessus.
La présente invention fournit également un dispositif de transport d'un analyte fixé sur des particules magnétiques présent dans un liquide, ledit dispositif comprenant : un premier contenant destiné à contenir un liquide et_ relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant, un système magnétique permettant de déplacer les particules magnétiques sur lesquelles est fixé 1' analyte du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement. Selon l'invention, les volumes des premier et deuxième contenants sont de préférence adaptés aux volumes de solutions à manipuler. Ces volumes peuvent être inférieurs ou égaux à 10 ml.
La présente invention fournit également un dispositif de concentration d'un analyte fixé sur des particules magnétiques présent dans un liquide, ledit dispositif comprenant : un premier contenant de volume α destiné à contenir un liquide relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant, ledit deuxième contenant de volume β plus petit que le volume α du premier contenant, et un système magnétique permettant de déplacer les particules magnétiques sur lesquelles est fixé
1' analyte du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement. Certains éléments de ces dispositifs ont déjà été décrits pour le procédé de la présente invention, et devrons être pris en considération avec la description ci-dessous . Selon la présente invention, ces contenants sont utilisables par exemple comme chambres de réaction. Les techniques précitées permettent également de réaliser des capillaires de section de quelques microns-carrés à quelques centaines de milliers de microns-carrés pour le transfert de solutions, ou d'un analyte fixé sur des microparticules, selon la présente invention, d'un premier contenant à un deuxième contenant, par exemple d'une chambre de réaction à une autre chambre" de réaction. Selon l'invention, le rapport des volumes α/β peut être par exemple de 10 à 1000.
Selon l'invention, le premier contenant peut par exemple avoir un volume d'environ 0,1 à 100 μl .
Selon l'invention, le deuxième contenant peut avoir un volume d'environ 0,01 à 1 μl .
L'invention permet donc une réduction de volume qui est de 100 à 1000 fois supérieure à ce qui pouvait être atteint par les pratiques de laboratoire ou de systèmes "macroscopiques" automatisés de l'art antérieur manipulant des liquides avec des pipettes et des flacons de quelques dizaines de microlitres. Elle permet de ce fait de concentrer un échantillon par le même facteur 100 à 1000.
En effet des techniques de photolithogravure de substrats solides, par exemple de silicium, de silice, ou de verre, ou de moulage de grande précision de matières plastiques, permettent la réalisation de contenants de dimensions submillimétriques, voire de l'ordre de quelques microns dans au moins une direction, qui peuvent donc avoir des volumes réduits à des fractions de micro-litre. Selon l'invention, le premier contenant et/ou le deuxième contenant peuvent/peut avoir une forme qui converge vers ledit goulet d'étranglement. Le goulet d'étranglement peut être par exemple sous la forme d'un capillaire tel que décrit dans le paragraphe précédent . Selon l'invention, le goulet d'étranglement peut par exemple avoir une' section comprise entre 1 μm2 à 1 mm2, préférentiellement 100 μ 2 à 0,1 mm2.
Selon l'invention, le deuxième contenant' et/ou le goulet d'étranglement peut/peuvent être muni (s) de canaux d'entrée/sortie de fluides. Ces canaux ont bien entendu une section adaptée en fonction des volumes de solution qu'ils sont destinés à contenir. Ainsi, par exemple pour une mise en évidence de l' analyte, lorsqu'il s'agit d'un acide nucléique, dans le deuxième contenant par une hybridation sur des sondes de capture portées par un support solide, ces canaux peuvent être utilisés pour faire les lavages nécessaires avant 1 ' étape de lecture .
Selon l'invention, les dispositifs précités peuvent comprendre un évent sous forme de capillaire présent au niveau du deuxième contenant et reliant directement celui-ci à l'extérieur. Lors des opérations de remplissage et/ou de transfert de fluide dans le deuxième contenant, cet évent sert à évacuer le fluide initialement présent dans le contenant que ce soit de l'air ou du liquide. La présence d'air dans le deuxième contenant n'est qu'une éventualité. Il peut y avoir des évents à d'autres endroits, par exemple au niveau du goulet d'étranglement, du premier contenant etc. Ces évents de mise à l'air libre peuvent être commandés par exemple par des vannes à billes. L'invention permet donc grâce à l'utilisation de techniques de micro-technologies de s'intégrer dans les dispositifs appelés aujourd'hui labopuce, ou "lab-on-a- chip" ou bien encore "micro-Total-Analysis-System" (MicroTAS) dans la terminologie anglo-saxonne. Dans l'exemple "lab-on-a-chip" le dispositif de la présente invention peut être combiné à d'autres fonctions pour former un système plus complet et plus précis d'analyse biologique.
Par exemple, le dispositif de la présente invention peut être le premier élément d'un ensemble comprenant :
1. un module de concentration/réduction de volume,
2. un module d'amplification, 3. un module de séparation, par exemple par électrophorèse, 4. un module de détection.
Un exemple de dispositif intégré comprenant les éléments 2, 3 et 4 ci-dessus est décrit dans la référence M.A. Burns et al . , An Integrated Nanoli ter DNA Analysis Device, Science, vol 282, 16 oct 98.
Dans certaines réalisations de la présente invention, les concepts de chambre de réaction et de canaux de transfert peuvent donc se confondre puisque ces labopuces permettent la réalisation de procédés en continu pour lesquels les réactions se font dans des capillaires, par exemple dans certaines techniques d' électrophorèse capillaire et de PCR.
L'invention peut par exemple être utile quand 1' analyte recherché est initialement présent dans un échantillon de grand volume mais en quantité limitée.
L'invention proposée permet, par exemple par la mise en œuvre des micro-technologies précitées, de concentrer une solution de molécules que l'on veut détecter, ou de déplacer un analyte d'une première solution vers une deuxième solution dans un volume inférieur au microlitre, complètement inaccessible par les procédés classiques de laboratoire.
La présente invention peut être mise en œuvre "par exemple dans un système de diagnostic in vitro automatisé, ou un système de détection de contaminants biologiques dans des domaines tels que l' agroalimentaire et/ou le contrôle microbiologique industriel .
L'invention peut être appliquée par exemple pour la détection ultrasensible sans amplification de pathogènes dans un échantillon biologique. Les acides nucléiques des pathogènes potentiellement présents dans un échantillon peuvent être extraits par des techniques habituelles. Ils peuvent ensuite être purifiés et concentrés, toujours par des techniques standards, jusqu'à un volume de tampon de quelques dizaines de microlitres.
L'utilisation du dispositif de la présente invention ou - micro-composant permet dans ce cas de concentrer le matériel biologique dans le volume de la chambre de réaction qui correspond au deuxième composant. Là, des étapes ultérieures d'hybridation sur support plan et de détection permettent de détecter la présence ou non d'acides nucléiques de séquence donnée, caractéristique de l'infection de l'échantillon.
L'utilisation de l'invention permet donc d'augmenter très fortement la sensibilité d'un test, à performances égales du système de détection.
La présente invention peut par exemple être appliquée pour améliorer les immuno-essais . En effet, pour les immuno-essais dans lesquels se pose un problême de sensibilité, l'utilisation de l'invention, comme précédemment décrite, en concentrant le matériel biologique dans un volume très faible, permet d'augmenter fortement leur sensibilité.
Pour les immuno-essais où la quantité de matériel biologique à détecter est suffisante, l'utilisation de l'invention permet de concentrer le prélèvement, et donc de diminuer la durée de la réaction immunologique .
D'autres caractéristiques et avantages apparaîtrons encore dans les exemples ci-dessous, donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
Brève description des figures
La . figure 1 est une représentation schématique en perspective et éclatée avec une coupe partielle d'un premier mode de réalisation d'un dispositif selon la présente invention,
La figure 2 est une représentation schématique en perspective et éclatée d'un deuxième mode de réalisation d'un dispositif selon la présente invention, La figure 3 est une représentation schématique en perspective et éclatée avec une coupe partielle d'un troisième mode de réalisation d'un dispositif selon la présente invention, - La figure 4 est une représentation schématique d'un premier aimant utilisable pour la mise en oeuvre de la présente invention, et
La figure 5 est une représentation schématique d'un deuxième aimant utilisable pour la mise en oeuvre de la présente invention.
Sur ces figures, les références identiques indiquent des éléments identiques.
Exemples
Exemple 1 : exemple de préparation de la solution A
L'échantillon biologique est traité par des moyens classiques de biologie moléculaire pour obtenir une solution contenant les molécules d'ARN cible à détecter ; cette solution a un volume de 200 microlitres et la solution tampon est la suivante : Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 1M, triton X-100 0,05%, ADN de saumon 0 , 14 mg/ml .
On ajoute à cette solution 2 μl d'une solution d'oligonucléotides de capture ; cette solution d'oligonucléotides de capture est constituée de : Tris 10 mM, EDTA ImM, pH 8, oligonucleotide de capture 101:L/μl ; l 'oligonucleotide de capture est un oligonucleotide, biotynilé en 5', d'une séquence par exemple de 32 bases, complémentaire d'une sous-séquence de l'ADN cible. Incubation pendant 2h à 35°C.
Introduction de 1 μl de particules Immunicon Corporation, streptavidine ferrofluide, non diluées. Incubation 30 minutes à 35°C. Dans ces conditions, plus de 95% des molécules cibles se trouvent immobilisées sur les particules magnétiques .
Exemple 2 : dispositif selon un premier mode de réalisation de la présente invention
Le dispositif ou composant décrit dans cet exemple est un micro-composant qui permet de réduire d'un facteur 100 à 1000 le volume de tampon dans lequel se trouve un analyte recherché, tout en conservant la quantité d' analyte présente dans l'échantillon initial.
L'architecture générale du composant 1 est représentée à la figure 1. Il est constitué d'une chambre d'introduction 3, éventuellement prolongée par un dispositif d'introduction constitué des pièces 13 et 15, reliée à une chambre de réaction 7 par l'intermédiaire d'un goulet d'étranglement 5, ici représenté sous la forme d'un capillaire. Les formes particulières des deux chambres sont données à titre d'exemple. Les chambres et le capillaire peuvent être de forme ou de taille différente suivant l'application ou la technologie de fabrication du composant. La figure 1 suggère un mode de fabrication selon lequel le composant est fabriqué en gravant les chambres et le goulet d'étranglement dans un matériau plan, puis en assemblant par collage ou tout autre mode de fixation le couvercle 11. C'est un mode de fabrication possible, mais l'invention n'est pas dépendante de ce mode de fabrication. Toute autre technologie, en particulier :
• permettant de creuser un matériau directement pour réaliser des cavités de la forme des chambres et du goulet d'étranglement,
• ou qui consisterait à creuser les chambres 3 et 7 ainsi que le goulet d'étranglement dans la plaque supérieure, dans l'exemple dans le couvercle 11, au lieu de les creuser dans la plaque inférieure, pourrait être utilisée pour fabriquer le dispositif.
On peut citer par exemple les techniques à l'image de la "LIGA" utilisant la lithographie, la galvanoplastie et le moulage.
Un évent 9 permet l'évacuation des fluides air ou liquide lorsqu'on remplit ou transfère des liquides dans les chambres .
L'échantillon et les différents réactifs ou tampons peuvent être introduits dans les dispositifs de différentes manières. Nous en donnons deux ici à titre d'exemples.
Ce premier mode de réalisation, illustré sur la figure 1, est réalisé en pratiquant un orifice dans le couvercle 11 du dispositif et en équipant cet orifice d'une cuvette conique 15. Une pièce cylindrique 13 sert à maintenir la cuvette conique en position et à assurer l'étanchéité entre la cuvette conique et le dispositif. En appliquant par exemple une pipette, un embout de diluteur ou de seringue, sur la cuvette conique, on peut "pousser" le tampon ou un réactif à l'intérieur du dispositif en exerçant une pression sur le liquide. L'air ou tout autre fluide liquide ou gazeux initialement présent dans le dispositif sera évacué du dispositif par 1 ' évent 9. Cet évent débouche ici dans la chambre de réaction, mais il pourra être placé suivant les cas à d'autres endroits du dispositif. On pourra même éventuellement disposer de plusieurs évents.
Un second mode de réalisation pour 1 ' introduction de liquide dans le dispositif est représenté à la figure 2. Dans ce mode de réalisation l(a), les liquides sont introduits par un capillaire 17, lui-même connecté à l'extérieur du dispositif par une interface, non représentée sur la figure. Le couvercle 19 ne comprend pas d'orifice.
Exemple 3 : concentration avec transport sur particules magnétiques
Le procédé décrit dans cet exemple permet de réduire d'un facteur 100 à 1000 le volume de tampon dans lequel se trouve un analyte recherché, tout en conservant la quantité d' analyte présente dans l'échantillon initial. Il met en oeuvre le dispositif représenté dans 1 ' exemple précédent .
Le composant est préalablement rempli de tampon sans analyte recherché et sans particule magnétique. Ce tampon peut être introduit en versant la quantité nécessaire dans la cuvette conique 15 représentée sur la figure 1, et en appliquant une pression pneumatique dans cette cuvette conique. Une fois le composant rempli, le tampon en excès présent dans la cuvette conique 15 est retiré, par exemple à l'aide d'une pipette.
L'échantillon composé d'une certaine quantité de tampon, par exemple de l'ordre de 30 μl, dans lequel les analytes recherchés ont été préalablement fixés sur des particules magnétiques est déposé dans la cuvette conique 15.
Les particules magnétiques sont ensuite attirées vers le fond de la chambre d'introduction 3 (figure 1) à l'aide d'un aimant, par exemple l'aimant 30 de la forme indiquée à la figure 4 positionné sous le dispositif, à l'aplomb de la cuvette conique. Les particules , magnétiques sont alors rassemblées en un culot de petite taille.
A l'aide d'un autre aimant, par exemple l'aimant 40 de la forme indiquée à la figure 5, disposé de telle sorte que le dispositif se trouve dans son entrefer "42 , le culot est attiré et transporté de sa position initiale dans la première chambre d'introduction 3, à travers le capillaire 5, dans la chambre de réaction 7.
L' analyte est ensuite libéré des particules magnétiques par chauffage (élution) à l'intérieur de la chambre de réaction 7. Pendant cette opération, les particules magnétiques sont éventuellement remises en suspension dans la chambre de réaction 7 en retirant 1 ' aimant .
Les particules magnétiques sont de nouveau rassemblées en un culot dans la chambre de réaction 7 en utilisant à nouveau un aimant, par exemple de la forme présentée sur la figure 4. Elles sont ensuite transportées à nouveau à travers le capillaire 5, mais en sens inverse que précédemment, de la chambre de réaction 7 vers la chambre d'introduction 3, en utilisant un aimant, par exemple de la forme présentée à la figure 5. Le résultat final de cette suite d'opérations est le transport de la totalité des analytes de la cuvette conique 15 vers la chambre de réaction 7, de volume beaucoup plus faible.
Exemple 4 : concentration avec transport fluidique
Le procédé décrit dans cet exemple est une variante du précédent .
Comme précédemment, le composant est préalablement rempli par du tampon sans particule magnétique. L'échantillon composé d'une certaine quantité de tampon, par exemple de l'ordre de 30 μl , dans lequel les analytes recherchés ont été préalablement fixés"sur des particules magnétiques est déposé dans la cuvette conique 15. Les particules magnétiques sont attirées vers le fond de la chambre d'introduction 3 (figure 1) à l'aide d'un aimant, par exemple de la forme indiquée à la figure 4. Les particules magnétiques sont alors rassemblées en un culot de petite taille. A l'aide d'un autre aimant, par exemple de la forme indiquée à la figure 5, disposé de telle sorte que le dispositif se trouve dans son entrefer, le culot est attiré et transporté de sa position initiale dans le capillaire 5 (et non plus dans la chambre de réaction 7) .
L' analyte est libéré des particules magnétiques par chauffage (élution) à l'intérieur du capillaire 5. Pendant cette opération, les particules magnétiques sont éventuellement remises en suspension dans le capillaire en retirant l'aimant.
Les particules magnétiques sont à nouveau rassemblées en un culot dans le capillaire en utilisant à nouveau un aimant, par exemple de la forme présentée à la figure . A ce moment, les analytes sont libres en solution à l'intérieur du capillaire. En poussant du tampon à 1 ' intérieur du dispositif par une surpression au niveau de la cuvette conique 15, on provoque un déplacement de liquide dans le capillaire vers la chambre de réaction 7. Les analytes en solution sont ainsi entraînés par le déplacement du liquide dans la chambre de. réaction 7. Les particules magnétiques, elles, restent en position dans le capillaire, maintenues en position sous forme de culot par l'aimant fixe.
Le résultat final de cette suite d'opérations "est comme précédemment le transport de la totalité des analytes de la cuvette conique 15 vers la chambre de réaction 7, de volume beaucoup plus faible.
Selon une variante de ce procédé, les particules magnétiques sont sous la forme d'entités sèches déjà présentes dans la chambre d'introduction 3. De telles entités sont bien décrites dans les brevets US-A-5,750, 338 et 4,672,040. L'introduction de l'échantillon, dans ladite chambre 3, solubilise les particules magnétiques qui se fixent alors à 1 ' analyte présent dès le. départ dans ledit échantillon.
Exemple 5 : utilisation de l'invention pour mettre en évidence 1 ' analyte dans un test de détection homogène
Dans cet exemple, 1 ' analyte est mis en évidence en utilisant la technique des "Molecular Beacons", telle qu'elle est décrit dans Tyagi, S. and Kramer, F.R., Nat. Biotechnol. 14:30-308, 1996. Brièvement, cette technique consiste à mettre les molécules cibles avec des sondes nucléiques, les "Molecular Beacons", qui ont la structure suivante : la séquence sonde, complémentaire de la cible, est prolongée de part et d'autre par deux bras de quelques nucléotides de long, complémentaires l'un de l'autre. Un fluorophore, par exemple le groupe EDANS, est fixé à l'un des bras, alors qu'un inhibiteur de fluorescence, par exemple, le groupe DABCYL est fixé à 1 ' autre bras . En l'absence de cible, les deux bras de la sonde s'hybrident l'un sur l'autre et la fluorescence de EDANS est éteinte par le DABCYL. Quand la sonde s 'hybride sur la cible, les deux groupes se' trouvent éloignés l'un de l'autre, et la fluorescence de EDANS est libérée. Ainsi, la présence et même la concentration de l' analyte, est révélée par le signal de fluorescence et l'intensité de ce signal. La mise en oeuvre de cette technique dans un dispositif conforme à 1 ' invention est par exemple la suivante : 1. Préparation de la solution A à analyser, l' analyte étant un acide nucléique,
2. Remplissage du deuxième contenant 7 du dispositif, ainsi que du goulet d'étranglement 5 et du fond 3 du premier contenant par une solution de révélation, contenant les sondes nucléiques précédemment définies nécessaires à la détection de l' analyte.
3. Introduction de la solution A dans le premier contenant 3 prolongé par le cône 15, 4. Concentration magnétique des particules magnétiques dans le fond du premier contenant 3 , puis transport magnétique des particules magnétiques dans le deuxième contenant 7, par exemple selon 1-es modalités décrites dans 1 ' exemple 3 ,
5. Chauffage à 60°C de l'ensemble du dispositif, attente de 1 à 2 minutes à cette température.
L' analyte est alors libéré des particules,
6. Transport magnétique des particules magnétiques du deuxième contenant 7 vers le premier contenant, 7. Mise à la température adéquate pour l'hybridation de la sonde nucléique beacon, par exemple 25°C,
8. Lecture de la fluorescence dans le' deuxième contenant 7 par exemple en plaçant le dispositif sous un microscope à épi-fluorescence équipé d'un photomultiplicateur .
L ' avantage de cette procédure par rapport à 1 ' état de l'art est de concentrer dans un rapport alpha/béta 1' analyte, par exemple de 100 fois, et donc de diminuer relativement la fluorescence résiduelle des sondes
"Molecular Beacons", et ainsi augmenter d'autant le rapport signal sur bruit intrinsèque à cette technique de mise en évidence d'un analyte. La sensibilité du test est donc augmentée d'autant.
Exemple 6 : utilisation de l'invention pour mettre en évidence 1 ' analyte à l'aide d'une puce à ADN
Dans cet exemple, 1 ' analyte est mis en évidence par hybridation sur une puce à ADN ; la puce à ADN a l'avantage, par rapport à la technique de marquage présentée à l'exemple 5, de pouvoir faire beaucoup d'hybridations en parallèle, donc d'offrir au biologiste une puissance analytique bien plus grande.
Dans cet exemple, le fond du deuxième contenant 7 est une puce à ADN, constituée par exemple d'une vingtaine de plots d'hybridation. La puce est fabriquée par dépôt d'ADN selon les moyens standards de l'état de l'art des puces à ADN.
La mise en oeuvre de cette technique dans un dispositif .conforme à 1 ' invention peut être par exemple la suivante :
1. Préparation de la solution A à analyser, l' analyte étant un acide nucléique, marqué par un groupement fluorescent, par exemple dé" la fluorescéine, par des moyens classiques de l'état de l'art,
2. Remplissage du deuxième contenant 7 du dispositif, ainsi que du goulet d'étranglement 5 et du fond 3 du premier contenant par le tampon d'hybridation, par exemple : Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 1M, triton X-100
0,05%, ADN de saumon 0,14 g/ml,
3. Introduction de la solution A dans le premier contenant 15,
4. Concentration magnétique des particules magnétiques dans le fond 3 du premier contenant, puis transport magnétique des particules magnétiques dans le deuxième contenant 7, par exemple selon les modalités décrites dans 1 ' exemple 3 , 5. Chauffage à 60°C de l'ensemble du dispositif. L' analyte est alors libéré des particules, 6. Transport magnétique des particules magnétiques du deuxième contenant 7 vers le premier contenant 3 ,
7. Hybridation dans les conditions de température et de durée adéquates pour la puce à ADN considérée. Par exemple, hybridation pendant 30 minutes à 40°C,
8. Lavage par passage dans le deuxième contenant 7,. au moyen de l'entrée et de la sortie de fluide par les ouvertures 21, 22 représenté sur la figure 3, d'une solution de lavage, par exemple Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 1M, triton X-100 0,5%-,
9. Lecture de la fluorescence présente sur la puce à ADN, par exemple en mettant le dispositif sous un microscope à épi-fluorescence équipé d'une caméra CCD, et en utilisant un grossissement adéquat. Comme dans l'exemple précédent, la concentration de l' analyte avant son hybridation sur la puce à ADN permet une réaction plus rapide de 1 ' analyte sur la puce à ADN. Cette accélération de la cinétique par rapport à l'état de l'art permet, soit de diminuer le temps d'hybridation, soit d'augmenter la sensibilité de détection du système, puisque cette sensibilité est en général limitée par la cinétique d'hybridation de 1' analyte sur la puce à ADN.
Exemple 7 : utilisation de l'invention comme point d'entrée d'un μTAS
Dans cet exemple, l ' invention sert de point d ' entrée à un μTAS plus complexe qu ' un dispositif composé seulement de deux contenants séparés par un goulet d'étranglement. Nous prenons comme exemple de μTAS celui présenté par l'équipe de A. Northrup, qui consiste en une chambre d'amplification, suivie d'une électrophorèse capillaire des produits amplifiés et d'une détection (voir Anal. Che . 1996, 68, 4081-4086) .
Dans cet exemple, le deuxième contenant est en fait une chambre d'amplification par PCR, par exemple fabriquée par les moyens des microtechnologies. Ceci signifie que le deuxième contenant est muni d'un moyen de chauffage, d'un moyen de refroidissement, et d'un capteur de température, ce qui permet d'appliquer à l'échantillon liquide contenu dans le ' deuxième contenant 7 des cycles thermiques. L ' entrée-sortie 21, 22 de fluide coupant ce deuxième contenant est le canal d'injection par électrophorèse de l'échantillon amplifié dans le capillaire de séparation. Le capillaire de séparation n'est pas montré sur nos figures (voir figure 1 de l'article sus-cité), ni les microréservoirs permettant l'application des champs électriques nécessaires à l'injection puis à la séparation par électrophorèse.
Le deuxième contenant contient en outre des culots secs contenant tous les produits nécessaires à l'amplification par PCR ; ces produits sont "glassifiés" par des techniques bien connues, et les culots glassifiés, en forme de bille, contenant les divers produits nécessaires à l'amplification, sont déposés dans le deuxième contenant avant mise en place du couvercle. La fabrication de ces culots est bien décrite dans l'état de la technique, par exemple US-A-4,678,812 et US-A-5 , 275 , 016. Le capillaire de séparation contient en outre un gel de séparation, par exemple de l'hydroxy éthyl cellulose, qui lui-même contient un marqueur • fluorescent de l'ADN, par exemple le thiazole orange. Ainsi, les fragments d'ADN seront marqués par le thiazole orange au cours de leur migration électrophorétique dans le capillaire de séparation.
L'utilisation d'un tel dispositif est par exemple la suivante : 1. Préparation de la solution A à analyser, l' analyte étant un acide nucléique,
2. Remplissage de l'ensemble du dispositif, notamment des capillaires, par la solution d' électrophorèse ; les culots de réactifs présents dans le deuxième contenant commencent à s'hydrater,
3. Introduction de la solution A dans le premier contenant 15,
4. Concentration magnétique des particules magnétiques dans le fond du premier contenant
3, puis transport magnétique dans le deuxième contenant 7, selon les modalités de l'exemple 3 ci-dessus,
5. Chauffage à 60°C du deuxième contenant 7. Attente de 10 à 30 minutes selon le culot de réactif à dissoudre. En effet, ce chauffage a principalement pour but d'accélérer la remise en solution des culots de réactifs présents dans le contenant, 6. Cyclage thermique pour effectuer l'opération d'amplification des cibles (il existe des particules magnétiques qui ne gênent pas l'amplification, il n'est donc pas nécessaire de les retirer de la chambre d'amplification), 7. Injection par électrophorèse de l'échantillon amplifié dans le capillaire de sortie, 8. Electrophorèse capillaire dans le capillaire de séparation, par exemple, selon les modalités décrites dans l'article suscité, 9. Détection des fragments amplifiés par exemple par un microscope à épi-fluorescence équipé d'un photomultiplicateur, le champ du microscope étant situé en fin du capillaire de séparation. Dans cet exemple, le couplage de l'invention à un système intégré d'amplification et d' électrophorèse capillaire permet :
• de concentrer l'échantillon avant amplification, par exemple de 100 fois, donc de diminuer le nombre de cycles d'amplification nécessaires (moins 8 cycles environ) , ce qui limite les risques intrinsèques à l'amplification (biais d'amplification selon les séquences, risque de contamination croisée, ...),
• de diminuer le volume de l'échantillon pour l'amplification, donc de diminuer les quantités de réactifs nécessaires à l'amplification d'où un gain de coût sur les réactifs,
• d'augmenter le nombre d'échantillons qu'il est possible de traiter en parallèle dans un même dispositif grâce à la diminution des dimensions de la chambre d'amplification.
Par ailleurs, la rapidité avec laquelle s'effectue l'ensemble de la chaîne, de l'ordre de quelques minutes pour le transport magnétique, de 10 à 15 minutes pour l'amplification et de 1 à 2 minutes pour 1 ' électrophorèse capillaire, permet d'obtenir des résultats d'excellente qualité, sans qu'il soit nécessaire d'isoler les compartiments par des vannes.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de transport d'un analyte présent dans une solution A dans lequel on déplace au moyen d'un système magnétique l' analyte fixé sur des particules magnétiques d'un premier contenant à un deuxième contenant via un goulet d'étranglement, le deuxième contenant étant rempli par ladite solution A et/ou par une autre solution.
2. Procédé de transport d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : on prépare à partir de l'échantillon, dans un premier contenant relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant, une solution A dans laquelle 1 ' analyte est fixé sur des particules magnétiques,
, on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement, le deuxième contenant étant rempli par la solution A et/ou par une autre solution.
3. Procédé de transport d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, on introduit la .solution A dans un premier contenant relié via à un goulet d'étranglement à un deuxième contenant, et on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d' étranglement, le deuxième contenant étant rempli par la solution A et/ou par une autre solution.
4. Procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : - on prépare à partir de l'échantillon, dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, et on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement, le deuxième contenant étant rempli par la solution A et/ou par une autre solution.
5. Procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : - on prépare à partir de l'échantillon une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, on . introduit la solution A dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, et on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d' étranglement, le deuxième contenant étant rempli par la solution A et/ou par une autre solution.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel on libère l' analyte fixé sur les particules magnétiques desdites particules dans le deuxième contenant .
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel on déplace au moyen d'un système magnétique les particules magnétiques libérées de l' analyte hors du deuxième contenant .
8. Procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : - on prépare à partir de l'échantillon, dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, une solution A dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, on déplace au moyen d'un système magnétique 1' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant jusqu'au goulet d'étranglement, on libère l' analyte fixé sur les particules magnétiques desdites particules au niveau du goulet d'étranglement, et on transporte par déplacement de liquide 1' analyte du goulet d'étranglement vers le deuxième contenant, les particules magnétiques étant maintenues au niveau dudit goulet d'étranglement.
9. Procédé de concentration d'un analyte présent dans un échantillon dans lequel : on prépare à partir de 1 ' échantillon une solution A. dans laquelle l' analyte est fixé sur des particules magnétiques, on introduit la solution A dans un premier contenant de volume α relié via un goulet d'étranglement à un deuxième contenant de volume β, le volume β étant plus petit que le volume α, - on déplace au moyen d'un système magnétique 1 ' analyte fixé sur les particules magnétiques du premier contenant jusqu'au goulet d'étranglement, on libère l' analyte fixé sur les particules magnétiques desdites particules au niveau du goulet d'étranglement, et on transporte par déplacement de liquide 1' analyte du goulet d'étranglement vers le deuxième contenant, les particules magnétiques étant maintenues au niveau dudit goulet d'étranglement.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, dans lequel on déplace au moyen d'un système magnétique les particules magnétiques libérées de l' analyte du deuxième contenant au premier contenant via le goulet d'étranglement, ou du goulet d'étranglement audit premier contenant.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, dans lequel l' analyte est libéré des particules magnétiques par modification des conditions physiques ou chimiques par exemple par chauffage ou par réaction avec au moins une substance présente dans l'autre solution.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel un agent d'immobilisation de l' analyte est fixé sur tout ou partie d'au moins une paroi du deuxième contenant ou de tout support solide présent dans ledit deuxième contenant .
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel le goulet d'étranglement est sous la forme d'un capillaire.
14. Procédé de mise en évidence d'un analyte dans un échantillon dans lequel : on procède à une concentration de 1 ' analyte au moyen d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, et on met en évidence l' analyte dans le deuxième contenant ou dans tout autre contenant relié directement ou indirectement au deuxième contenant .
15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel l' analyte est choisi parmi un microorganisme tel qu'une bactérie, un champignon, un virus, un composé chimique, une molécule telle qu'un peptide, une protéine, un enzyme, un polysaccharide, un lipide, une lipoprotéine, un lipopolysaccharide, un acide nucléique, une hormone, un antigène, un anticorps, un facteur de croissance, une cellule tumorale.
16. Procédé selon la revendication 14 ou 15, dans lequel l' analyte étant un acide nucléique, il est mis en évidence par une technologie de puce à acide nucléique, préfèrentiellement à ADN.
17. Dispositif de transport d'un analyte fixé sur des particules magnétiques présent dans un liquide, ledit dispositif comprenant : un premier contenant (3) destiné a contenir un liquide et relié via un goulet d'étranglement (5) à un deuxième contenant (7) , et un système magnétique permettant de déplacer les particules magnétiques sur lesquelles est fixé 1' analyte du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement.
18. Dispositif de concentration d'un analyte fixé sur des particules magnétiques présent dans un liquide, ledit dispositif comprenant : un premier contenant (3) de volume α destiné à contenir un liquide relié via un goulet d'étranglement (5) à un deuxième contenant (7), ledit deuxième contenant de volume β plus petit que le volume α du premier contenant, et un système magnétique permettant de déplacer les particules magnétiques sur lesquelles est fixé 1' analyte du premier contenant au deuxième contenant via le goulet d'étranglement.
19. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18, dans lequel le premier contenant et/ou le deuxième contenant ont une forme qui converge vers le goulet d'étranglement.
20. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, comprenant un évent sous forme de capillaire présent au niveau du deuxième contenant.
21. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 18, dans lequel le système magnétique est constitué d'au moins un aimant externe et/ou une bobine et/ou une bobine intégrée réalisée par un procédé de micro-technologie.
22. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 21, dans lequel le deuxième contenant et/ou le goulet d'étranglement est/sont muni (s) de canaux d'entrée-sortie de fluides.
23. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 22, dans lequel le goulet d'étranglement, a une section comprise entre 1 μm2 à 1 mm2, préférentiellement entre 100 μm2 et 0,1 mm2.
24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 23, dans lequel le rapport des volumes α/β est de 10 à 1000.
25. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 24, dans lequel le premier contenant a un volume d'environ 0,1 à 100 μl .
26. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 17 à 25, dans lequel le deuxième contenant a un volume d'environ 0,01 à 1 μl .
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005050208A3 (fr) * 2003-11-20 2005-12-08 November Ag Procede et dispositif destine au nettoyage ameliore d'une substance liee a des microparticules paramagnetiques
JPWO2005008209A1 (ja) * 2003-07-16 2006-08-31 東洋紡績株式会社 生体成分分離用デバイス、およびそれを用いた生体成分の分離方法

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7078224B1 (en) * 1999-05-14 2006-07-18 Promega Corporation Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles
FR2863626B1 (fr) * 2003-12-15 2006-08-04 Commissariat Energie Atomique Procede et dispositif de division d'un echantillon biologique par effet magnetique
DE102004005193B4 (de) * 2004-02-02 2006-08-24 Medion Diagnostics Gmbh Vorrichtung zur Separation einzelner Partikel von Partikel-Agglutinationen
JP2006053090A (ja) * 2004-08-13 2006-02-23 Alps Electric Co Ltd 検査用プレートと、前記検査用プレートを用いた検査方法
US8623668B2 (en) * 2004-11-05 2014-01-07 Imec Method for transport of magnetic particles and devices therefor
US7502625B2 (en) * 2005-01-20 2009-03-10 Skyworks Solutions, Inc. Integrated multi-band transceiver for use in mobile communication device
EP1907585A4 (fr) * 2005-07-01 2010-04-07 Promega Corp Réseau de particules flottantes destinées à purifier des biomolécules et utilisations de ces particules ou de ce réseau de particules flottantes pour purifier des biomolécules
DE102005039175A1 (de) * 2005-08-18 2007-02-22 Qiagen Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Abtrennen von magnetischen Partikeln aus einer Flüssigkeit
WO2007070381A2 (fr) 2005-12-09 2007-06-21 Promega Corporation Purification d’acide nucleique avec une matrice de liaison
WO2007085980A1 (fr) 2006-01-25 2007-08-02 Koninklijke Philips Electronics N. V. Dispositif pour analyser des fluides
CN101495868A (zh) * 2006-07-28 2009-07-29 博适公司 利用磁性颗粒进行受体结合试验的装置和方法
EP1939629A3 (fr) * 2006-08-11 2011-03-09 Samsung Electronics Co., Ltd. Force centrifuge basée selon un dispositif de contrôle de position magnétique et système micro fluide sous forme de disque
EP2384432B1 (fr) 2007-06-21 2016-12-28 Gen-Probe Incorporated Instruments et réceptacles pour effectuer des procédés
MX2010002079A (es) * 2007-08-24 2010-08-09 Advanced Liquid Logic Inc Manipulacion de esferas en un inyector de gotas.
WO2009038536A1 (fr) * 2007-09-19 2009-03-26 Agency For Science, Technology And Research Dispositif, système et procédé pour le lavage et l'isolation de particules magnétiques dans un flux de fluide continu
EP2072133A1 (fr) * 2007-12-20 2009-06-24 Koninklijke Philips Electronics N.V. Dispositif à plusieurs compartiments doté de particules magnétiques
WO2009091320A1 (fr) * 2008-01-17 2009-07-23 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Procédé pour l'application d'échantillons
US8222397B2 (en) * 2009-08-28 2012-07-17 Promega Corporation Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods
US8039613B2 (en) 2009-08-28 2011-10-18 Promega Corporation Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods
EP2583101B1 (fr) 2010-06-17 2015-09-16 Koninklijke Philips N.V. Analyse multi-épitope
JP6382699B2 (ja) * 2014-11-28 2018-08-29 株式会社東芝 マイクロ分析チップ
CN105424922B (zh) * 2015-12-09 2018-01-19 北京乐普医疗科技有限责任公司 基于磁珠包被抗体的微流控芯片及捕获心肌标志物的方法
AU2018271981A1 (en) * 2017-05-24 2019-12-19 Northwestern University Devices and methods for rapid sample processing and analysis
ES2871925T3 (es) * 2019-03-19 2021-11-02 Ace Medical Tech Co Ltd Dispositivo para clasificar biopartículas utilizando una fuerza generada a partir de dielectroforesis inducida por luz y su método de funcionamiento

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994026414A1 (fr) * 1993-05-17 1994-11-24 Syntex (U.S.A.) Inc. Recipient de reaction pour essai par liaison specifique et procede d'utilisation
US5498392A (en) * 1992-05-01 1996-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification device and method
WO1998010267A1 (fr) * 1996-09-04 1998-03-12 Technical University Of Denmark Systeme a microdebit pour separation et analyse de particules
US5863502A (en) * 1996-01-24 1999-01-26 Sarnoff Corporation Parallel reaction cassette and associated devices
US6074827A (en) * 1996-07-30 2000-06-13 Aclara Biosciences, Inc. Microfluidic method for nucleic acid purification and processing
WO2000050172A1 (fr) * 1999-02-23 2000-08-31 Caliper Technologies Corp. Manipulation de microparticules dans des systemes microfluidiques

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5603760A (en) * 1995-09-18 1997-02-18 W. R. Grace & Co.-Conn. Cement admixture capable of inhibiting drying shrinkage and method of using same
FR2758884B1 (fr) * 1997-01-30 1999-04-02 Bio Merieux Procede pour isoler, notamment detecter ou quantifier un analyte dans un milieu

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5498392A (en) * 1992-05-01 1996-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Mesoscale polynucleotide amplification device and method
WO1994026414A1 (fr) * 1993-05-17 1994-11-24 Syntex (U.S.A.) Inc. Recipient de reaction pour essai par liaison specifique et procede d'utilisation
US5863502A (en) * 1996-01-24 1999-01-26 Sarnoff Corporation Parallel reaction cassette and associated devices
US6074827A (en) * 1996-07-30 2000-06-13 Aclara Biosciences, Inc. Microfluidic method for nucleic acid purification and processing
WO1998010267A1 (fr) * 1996-09-04 1998-03-12 Technical University Of Denmark Systeme a microdebit pour separation et analyse de particules
WO2000050172A1 (fr) * 1999-02-23 2000-08-31 Caliper Technologies Corp. Manipulation de microparticules dans des systemes microfluidiques

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005008209A1 (ja) * 2003-07-16 2006-08-31 東洋紡績株式会社 生体成分分離用デバイス、およびそれを用いた生体成分の分離方法
JP4633627B2 (ja) * 2003-07-16 2011-02-16 東洋紡績株式会社 生体成分分離用デバイス、およびそれを用いた生体成分の分離方法
WO2005050208A3 (fr) * 2003-11-20 2005-12-08 November Ag Procede et dispositif destine au nettoyage ameliore d'une substance liee a des microparticules paramagnetiques

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Publication number Publication date
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US7569398B2 (en) 2009-08-04
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ATE293494T1 (de) 2005-05-15

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