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WO2003018539A1 - Compose lipide amphotere et son utilisation - Google Patents

Compose lipide amphotere et son utilisation Download PDF

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Publication number
WO2003018539A1
WO2003018539A1 PCT/JP2002/008419 JP0208419W WO03018539A1 WO 2003018539 A1 WO2003018539 A1 WO 2003018539A1 JP 0208419 W JP0208419 W JP 0208419W WO 03018539 A1 WO03018539 A1 WO 03018539A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lipid
compound
zwitterionic
water
lipid compound
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/008419
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Eishun Tsuchida
Shinji Takeoka
Keitaro Sou
Katsura Mori
Original Assignee
Oxygenix Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oxygenix Co., Ltd. filed Critical Oxygenix Co., Ltd.
Priority to EP02796353A priority Critical patent/EP1420010B1/en
Priority to DE60239468T priority patent/DE60239468D1/de
Priority to CA002458474A priority patent/CA2458474C/en
Priority to AT02796353T priority patent/ATE502005T1/de
Publication of WO2003018539A1 publication Critical patent/WO2003018539A1/ja
Priority to US10/782,851 priority patent/US6965049B2/en

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06104Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113Asp- or Asn-amino acid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/41Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
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    • A61K9/1272Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
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    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07C237/02Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/04Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C237/12Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
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    • A61K47/16Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/186Quaternary ammonium compounds, e.g. benzalkonium chloride or cetrimide

Definitions

  • the present invention relates to a zwitterionic lipid compound and its use, and particularly to a zwitterionic lipid compound which can be easily synthesized, has high biocompatibility and high biodegradability, and a surface utilizing its excellent molecular assembly characteristics It relates to its use as a modifier, dispersion stabilizer, drug carrier, oxygen carrier.
  • choline-type phospholipids such as diacylglycerophosphocholine are widely used.
  • Zwitterionic lipids are known to form stable bilayers by electrostatic interaction between their polar heads, and are used as the main component of the endoplasmic reticulum membrane .
  • the physicochemical and physiological properties of the endoplasmic reticulum reflect the properties of the hydrophilic groups of the lipid constituting the membrane of the endoplasmic reticulum. For example, if a mixture of polyethylene dalicol and a lipid having a carbohydrate in the hydrophilic part is mixed at an arbitrary ratio, the residence time in blood varies. In addition, the ability of various saccharides, antibodies, proteins, oligopeptides, and the like to be carried on the surface of the endoplasmic reticulum can enhance the ability of the endoplasmic reticulum to accumulate at specific sites. In all of these applications, the endoplasmic reticulum mainly containing choline-type phospholipids has been conventionally used, and suitable alternative lipids for choline-type phospholipids are practically used. It has not been.
  • Saturated phospholipids are expensive in raw materials, complicated to synthesize, and It is very expensive because the purification using a mosquito column is indispensable. Therefore, vesicles containing saturated phospholipids as the main component of the membrane, when used for biological administration, can be used as a carrier for expensive drugs in small doses such as anticancer drugs.
  • the use is limited to However, double-stranded zwitterionic lipids such as choline-type phospholipids form stable molecular aggregates. It can be expected to be used not only in large-volume bioadministration agents but also in various fields such as foods, cosmetics, toys, and dyes.
  • an object of the present invention is to provide a novel zwitterionic lipid.
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the above situation, and as a result, have succeeded in synthesizing a double-stranded amphoteric lipid compound having an amino group and a carboxyl group in a hydrophilic portion.
  • the synthesis is extremely simple, and the purification utilizes the difference in solubility. Therefore, it is not necessary to use column purification, and a large amount can be supplied at a high yield.
  • the zwitterionic lipid compound forms a stable bilayer membrane vesicle in an aqueous medium, and can enclose a water-soluble substance in the internal phase of the vesicle with high efficiency. That is, according to the present invention, the following formula (I):
  • the zwitterionic lipid compound of the present invention represented by the formula (I) can be synthesized as follows.
  • a long-chain alkyl ester of an amino acid represented by is synthesized.
  • the reaction between the amino acid represented by the formula (A) and the long-chain alcohol represented by the formula (B) is carried out by acid-catalyzed dehydration condensation and active esterification.
  • Method an acid anhydride method, a mixed acid anhydride method and the like.
  • dehydration condensation using an acid catalyst is the most convenient, and purification is also easy.
  • heating is necessary for dehydration condensation using an acid catalyst, if the raw material is unstable to heating, another method is selected.
  • the reaction with the amino acid long-chain alkyl ester represented by (C) can be carried out using an active ester method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydride method or the like.
  • solid-phase synthesis can be performed in the same manner as ordinary peptide synthesis.
  • the above-described method for synthesizing the zwitterionic lipid compound of the present invention is simple and provides the desired zwitterionic lipid compound at a high yield. Can be.
  • the as-synthesized amphoteric lipid compound can be purified using the difference in solubility in a solvent, and there is no need to use column purification.
  • the amino acid as the raw material has an asymmetric carbon
  • the amino acid can be synthesized using any of the D-form, the L-form, and a mixture containing the D-form and the L-form at an arbitrary ratio. Can be implemented in a similar manner.
  • an amphoteric lipid compound with high optical isomer purity is required depending on the application, it is preferable to use a D-form or L-form amino acid having high optical isomer purity as a raw material.
  • the product may be separated by an optical isomer separation column or the like.
  • the hydrophobic group When the zwitterionic lipid compound of the present invention contacts the hydrophilic / hydrophobic interface, the hydrophobic group is oriented toward the hydrophobic surface, and the zwitterionic group is oriented toward the aqueous medium, so that the hydrophobic surface is modified into a hydrophilic surface.
  • It can be used as a surface modifier for separation fillers, various sensors, cell culture substrates, etc. It can also be used as an emulsifier, stabilizer, dispersant, solubilizer, admixture, wetting agent, penetrant, viscosity modifier, etc. for drugs used in pharmaceuticals, foods, cosmetics, toiletries, dyes, etc. .
  • the amphoteric lipid compound of the present invention can be dispersed alone in an aqueous medium, or mixed with cholesterol or other amphipathic molecules to be dispersed, whereby hydrophobic interaction between the hydrophobic parts thereof is achieved.
  • the molecular packing state is high and stable molecular aggregates (micellar, fibrous, flat, roll, vesicle, etc.) are formed.
  • the vesicles for example, Since a water-soluble drug can be encapsulated in the membrane or a recognition site can be carried on the membrane surface, it can be used for a drug delivery system.
  • hemoglobin is encapsulated in the endoplasmic reticulum phase, the endoplasmic reticulum can be used as an oxygen carrier.
  • sterols may be added as a stabilizing agent as another membrane component.
  • sterols include, for example, ergosterol, cholesterol, etc., and preferably cholesterol.
  • ergosterol e.g., ergosterol, cholesterol, etc.
  • cholesterol e.g., glycerol
  • the preferred properly is 2 0-5 0 mol%.
  • Negatively charged lipids include diphosphyl phosphatidinoregulicellolone, diacinolephosphatidic acid, diacil phosphatidylinositol, diasil phosphatidyl inositol, fatty acids, and hydrophilic parts.
  • Carboxylic acid-type lipids containing one carboxylic acid and having two or more alkyl chains in the water-phobic region can be used.
  • Polyethylene glycol-type lipids for example, lipids in which poly (ethylene glycol) is covalently bonded to amino groups of poly (glycylphosphatidylethanol) in the endoplasmic reticulum membrane (glycerol) Polyethylene is added to the hydroxyl group of the Polyethylene glycol is shared with the carboxyl and amino groups of dianolekyl derivatives of lipids and trifunctional amino acids (eg, glutamic acid, lysine) to which glucose is covalently bonded.
  • poly (ethylene glycol) is covalently bonded to amino groups of poly (glycylphosphatidylethanol) in the endoplasmic reticulum membrane (glycerol)
  • polyethylene is added to the hydroxyl group of the Polyethylene glycol is shared with the carboxyl and amino groups of dianolekyl derivatives of lipids and trifunctional amino acids (eg, glutamic acid, lysine) to which glucose is covalently bonded.
  • Incorporating bound lipids, etc. greatly suppresses endoplasmic reticulum aggregation and increases the blood retention time after administration.
  • Polyethylene glycol type lipids are used as membrane components. May be added. It is effective to mix 0.01 to 5 mol% of a polyethylene glycol type lipid in a mixed lipid obtained by mixing cholesterol or a negatively charged lipid with the amphoteric ionizable lipid of the present invention in an arbitrary ratio. but it is, and rather is preferred in an amount of 0.1 to 1 mol 0/0.
  • the molecular weight of the polyethylene glycol chain of the polyethylene glycol-type lipid is preferably about 2,000 to 12,200.
  • the aqueous medium pure water, physiological saline, various buffers, or a solution in which a water-soluble drug is dissolved in these aqueous media can be used.
  • the pH of the aqueous medium is acidic
  • the amphoteric lipoic acid aion becomes a carboxylic acid when the pH of the aqueous medium is acidic.
  • the zwitterionic lipid compound is no longer zwitterionic as the um becomes an amine. However, if you need to control the surface charge of the ER! ) If the H value does not hinder the change of the aggregation form of the zwitterionic lipid compound molecule, the pH is not limited.
  • the set due to the change in pH If the purpose is to release vesicle inclusions by utilizing the morphological change in reverse, or to separate and isolate the vesicles from the dispersion medium by phase separation, the pH according to the purpose may be used. I just need.
  • the particle diameter of the endoplasmic reticulum formed using the amphoteric lipid compound of the present invention is preferably 100 to 300 nm.
  • the particle size of the endoplasmic reticulum can be determined, for example, by adding an aqueous medium to the mixed lipid powder and hydrating and swelling the mixture, by static hydration, a portex mixer, a forced agitator, an ultrasonic irradiator, a homogenizer, and a microfluidizer. First, it can be adjusted by a high-pressure extruder (extruder), freezing and thawing.
  • the combination of freeze-thaw and high-pressure extruder significantly improves the permeability of the filter, thereby shortening the processing time and improving the yield.
  • the water-insoluble drug that is not encapsulated can be separated from the encapsulated endoplasmic reticulum by gel filtration, ultracentrifugation, or ultrafiltration membrane treatment.
  • hemoglobin solution When a hemoglobin solution is used as an aqueous medium to be encapsulated in the endoplasmic reticulum, erythrocytes derived from humans and pests are lysed by a conventional method, and only stromal components are removed by centrifugation or ultrafiltration. Hemoglobin solution, purified hemoglobin solution from which hemoglobin was isolated, or recombinant hemoglobin solution in which the hemoglobin concentration was increased to 10 g / dL or more by ultrafiltration. Can be used.
  • hemoglobin concentration in the aqueous solution of hemoglobin is 20 to 50 g / dL in order to supply a sufficient amount of oxygen to living tissues. It is preferred.
  • an organic phosphorous compound such as inositolitolic acid or pyridoxal 5 'phosphoric acid (PLP) may be added for controlling the oxygen affinity of hemoglobin.
  • PBP pyridoxal 5 'phosphoric acid
  • thiols such as homocystine and dal thione, water-soluble vitamins and the like may be added as a reducing agent for hemoglobin.
  • Catalase or superoxide dismutase may be added as an active oxygen remover.
  • zwitterionic lipid 3 in which glutamic acid as a hydrophilic part was bound to compound 1 with a carboxylic acid group at the ⁇ -position was synthesized as follows.
  • an amphoteric lipid 5 in which glutamic acid as a hydrophilic part was bound to compound 1 via a carboxylic acid group at the ⁇ -position was synthesized as follows.
  • PEG-DPPEA polyethylene glycol-bonded dipalmitoylphosphatidylethanolamine
  • This mixed lipid powder 50 mg was put into a 1-OmL eggplant-shaped flask, and a solution of hemoglobin in carbon monoxide (5 mL) with a concentration of 40 g ZdL was added. The mixture was stirred at room temperature for 2 hours. This was added to a 25 mm diameter EXTRUDER (trade name, manufactured by NOF Liposomes), and pressurized (20 kg / cm 2 ) with a hole diameter of 3.5 mm.
  • acetyl cellulose filter manufactured by Fuji Photo Film
  • the sample thus prepared was subjected to ultracentrifugation (100,000 g, 60 minutes) three times to remove unencapsulated hemoglobin.
  • the ligand can be exchanged for oxygen by irradiating it with white light from a high-pressure sodium lamp using an oxygenator (capiox-ii) and passing oxygen through the gas port.
  • cholesterol quantification and hemoglobin (Hb) quantification were performed on the obtained hemoglobin-containing endoplasmic reticulum.
  • the total lipid weight was determined from the cholesterol quantification, and the hemoglobin weight was divided by the total lipid weight to calculate the hemoglobin / total lipid ratio.
  • the oxygen-bond dissociation equilibrium curve was measured using HEMOX-ANALYZER (trade name, manufactured by TCS). The obtained values are summarized in Table 1.
  • Table 1 shows the values of hemoglobin vesicles prepared in the same manner using dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) instead of compound 3, but there is no significant difference in physical properties. It is clear that the lipid component can be replaced.
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • Compound 5 was dissolved in a micropore form (0.5 mM), and 20 L was spread on a water surface (pure water) filled in an LB film forming apparatus with a micro syringe. Moving the burr Ya one, the water compressed to water pressure ing to 2 5 m N / m (2 8 cm 2 / mi n), to create a single-molecular film. Graphite substrate (1.5 cm X l. 5 c m) was brought into contact with this water surface, and the monomolecular film was adsorbed on the surface of the graphite substrate. After leaving to dry for 24 hours in a desiccant filled with silica gel, the contact angle of the water droplet was measured.
  • the contact angle of the graphite substrate is 152 °
  • the contact angle of the monomolecular film of compound 5 is 32 °
  • compound 5 has a hydrophobic group on the graphite side and both ions
  • the hydrophilic hydrophilic group was oriented toward the surface side, and it was confirmed that the hydrophobic graphite surface was modified into a hydrophilic surface.

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Description

明 細 書
両イオン性脂質化合物およびその用途
技術分野
本発明は、 両イオン性脂質化合物およびその用途に係り、 特に、 簡便に合成でき、 生体適合性、 生分解性の高い両ィォ ン性脂質化合物、 並びにその優れた分子集合特性を利用 した 表面改質剤、 分散安定化剤、 薬物運搬体、 酸素運搬体として のその用途に関する。
背景技術
小胞体を形成する両イオン性脂質としては、 例えばジァシ ルグリ セロホスフォコ リ ン等のコ リ ン型リ ン脂質が広く用い られている。 両イオン性脂質は、 それらの極性頭部間での静 電的相互作用によ り安定な二分子膜を形成する こ とが知られ てお り、 小胞体膜の主成分として利用されている。
小胞体の物理化学的および生理学的性質には、 小胞体の膜 を構成する脂質の有する親水基の性質が反映される。 例えば、 ポリ エチレンダリ コールや糖質を親水部に有する脂質を任意 の割合で混合する とその血中滞留時間が変動する。 また、 各 種糖質、 抗体、 蛋白質、 オリ ゴペプチ ド等を小胞体表面に担 持させる ことによ り 、 小胞体の特定部位への集積能を高める こ ともできる。 し力、し、 これらいずれの用途においても、 従 来コ リ ン型リ ン脂質を主成分とする小胞体が用い られてお り 、 コ リ ン型リ ン脂質に代わる適当な代替脂質は実用されていな い。
飽和型リ ン脂質は、 原料が高価で、 合成が煩雑であ り 、 し かもカラムを用いる精製が不可欠であるため、 非常に高価な ものとなっている。 従って、 飽和型リ ン脂質を膜の主成分と して含有する小胞体は、 生体投与を目的と して用いる場合、 抗がん剤のよう に僅かな投与量で高価な薬物の運搬体と して の使用に限定されている。 しかし、 コ リ ン型リ ン脂質のよう な二本鎖の両イオン性脂質は安定な分子集合体を形成するの で、 簡便な方法で安価に大量合成できるよう になれば、 酸素 運搬体等の大量生体投与剤に留ま らず、 食品、 香粧品、 トイ レタ リー、 染料等の多種領域への用途が期待できる。
従って、 本発明は、 新規な両イオン性脂質を提供する こ と を目的とする。
発明の開示
本発明者らは上記実状に鑑み鋭意研究を行った結果、 アミ ノ基およびカルボキシル基を親水部に有する二本鎖の両ィォ ン性脂質化合物の合成に成功した。 その合成は極めて簡便で あ り、 精製は溶解性の相違を利用するため、 カラム精製を用 いる必要はなく 、 収率高く大量に供給できる。 この両イオン 性脂質化合物は水性媒体中で安定な二分子膜小胞体を形成し、 またその小胞体の内相に水溶性物質を高効率で内包できる。 すなわち、 本発明によれば、 下記式 ( I ) :
Figure imgf000004_0001
O ( I ) (但し、 mと nは各々独立に 1 ないし 4 の整数、 p は 7 ない し 2 1 の整数、 Rは一つが N H 3 +であ り 、 その他の R は全 て H ) で表される両イオン性脂質化合物が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を詳細に説明する。
式 ( I ) で示される本発明の両イオン性脂質化合物は、 以 下のよう にして合成する ことができる。
まず、 式 (A) :
Figure imgf000005_0001
(こ こで、 n は、 式 ( I ) で定義した通り) で示されるアミ ノ酸を式 ( B ) :
HO-(CH2)pCH3 … ( B )
(こ こで、 各 p は、 式 ( I ) で定義した通り) で示される長 鎖アルコールと反応させて、 式 ( C ) :
Figure imgf000005_0002
で示されるアミ ノ酸の長鎖アルキルエステルを合成する。
式 ( A ) で示されるアミ ノ酸と式 ( B ) で示される長鎖ァ ルコールとの反応は、 酸触媒による脱水縮合、 活性エステル 法、 酸無水物法、 混合酸無水物法等を用いて行う ことができ る。 その中でも、 酸触媒による脱水縮合が最も簡便であ り、 精製も容易であるので好ましい。 但し、 酸触媒による脱水縮 合では加熱を必要とするため、 原料が加熱に対して不安定な 場合は、 他の方法を選択する。
他方、 式 (D ) :
R
HO— C— (C) C— OH ( D )
II I /m II
O H O
(こ こで、 mおよび Rは、 式 ( I ) で定義した通り) で示さ れるアミ ノ酸を準備し、 そのアミ ノ基と一方の力ルポキシル 基を常法によ り保護する。 次に、 このアミ ノ基および力ルポ キシル基が保護されたアミ ノ酸を式 ( C ) で示されるァミ ノ 酸長鎖アルキルエステルと反応 (アミ ド結合生成反応) させ た後、 アミ ノ基およびカルボキシル基の保護基を除去する こ とによって、 式 ( I ) で示される本発明の両イオン性脂質化 合物を得る ことができる。
上記ア ミ ノ 基お よび力 ルポキシル基保護ア ミ ノ 酸 と式
( C ) で示されるアミ ノ酸長鎖アルキルエステルとの反応は 活性エステル法、 酸無水物法、 混合酸無水物法等を用いて行 う こ とができる。 また、 通常のペプチ ド合成と同様の方法で 固相合成を行う こともできる。
本発明の両イオン性脂質化合物の上記合成方法は、 簡便で あ り 、 収率高く 目的の両イオン性脂質化合物を供給する こ と ができる。 また、 合成されたままの両イオン性脂質化合物の 精製も溶媒に対する溶解度の差を利用 して行う こ とができ、 カラム精製を用いる必要はない。
なお、 原料としてのアミ ノ酸が不斉炭素を有する場合、 D 体、 L体、 および D体と L体を任意の割合で含む混合物のい ずれの形態にあるアミ ノ酸を用いても合成は同様の方法で実 施できる。 用途によ り光学異性体純度の高い両イオン性脂質 化合物が要求される場合は、 光学異性体純度の高い D体か L 体のアミ ノ酸を原料として用いる こ とが好ま しい。 また、 生 成物を光学異性体分離カラム等で分離してもよい。
本発明の両イオン性脂質化合物は親疎水界面に接触する と その疎水基を疎水性表面に、 両イオン性基を水性媒体に向け て配向するため、 疎水性表面を親水性表面に改質させる こと ができ、 分離用充填剤、 各種センサー、 細胞培養基板等の表 面改質剤と して利用できる。 また、 医薬品、 食品、 香粧品、 トイ レタ リ ー、 染料等に使用される薬剤の乳化剤、 安定剤、 分散剤、 可溶化剤、 混和剤、 湿潤剤、 浸透剤、 粘度調整剤等 として利用できる。
本発明の両イオン性脂質化合物は、 水性媒体に単独、 ある いはコ レステロールやその他の両親媒性分子と混合させて分 散させる こ とによ り 、 それらの疎水部間の疎水性相互作用、 両イオン性基間の静電的相互作用によ り分子充填状態が高く 、 安定な分子集合体 (ミセル状、 繊維状、 平板状、 ロール状、 小胞体等) を形成する。 安定な二分子膜小胞体 (リ ポソ一 ム) を形成させる場合、 その小胞体は、 例えば、 その内水相 に水溶性薬剤を内包させた り 、 あるいは膜表面に認識部位を 担持させた り する こ と ができ るので、 薬物輸送システ ム に利 用できる。 特に、 小胞体内相にヘモグロ ビンを内包させる と、 その小胞体は酸素運搬体と して利用でき る。
本発明の両イ オン性脂質化合物を小胞体の膜主成分と して 利用する場合、 その他の膜成分と してステロール類を安定化 剤と して添加 しても よい。 そのよ う なステ ロール類と しては 例えば、 エルゴステロール、 コ レステ ロ ール等が挙げられる が、 好ま しく はコ レステロ一ノレである。 コ レ ステ ロ一ノレの含 有量に制限はないが、 小胞体膜の安定性を考慮すれば 5〜 5 0 モル 0 /0、 好ま しく は 2 0〜 5 0 モル%である。 膜成分中に 負電荷脂質を混合させる こ とで小胞体同士の凝集が抑制され 被覆層数が減少 して内包効率が増大するので、 負電荷脂質を 成分と して添加 しても よい。 負電荷脂質と しては、 ジァシル ホス フ ァ チジノレグ リ セ ロ ーノレ、 ジア シノレホス フ ァ チジン酸、 ジァシルホス フ ァ チジルイ ノ シ ト ール、 ジァ シルホス フ ァ チ ジルセ リ ン、 脂肪酸、 親水部に 1 つのカルボ ン酸を含有し疎 水部に二本以上のアルキル鎖を有するカルボン酸型脂質 (例 えば、 グノレタ ミ ン酸のジアルキル誘導体にマロ ン酸ゃコノヽク 酸を共有結合させた脂質等) が使用でき る。 負電荷脂質の含 有量は 1〜 5 0 モ ノレ 0 /0であ る こ と が好ま し く 、 5〜 2 0 モ ル%である こ と が特に好ま しい。 小胞体膜中にポ リ エチレン グ リ コ ール型脂質 (例えば、 ジァ シルホス フ ァ チジルェタ ノ ールのア ミ ノ基にポ リ エチ レンダリ コ ールを共有結合させた 脂質、 グリ セロールのジァ シル誘導体の水酸基にポリ エチ レ ング リ コ ールを共有結合させた脂質、 三官能性ア ミ ノ酸 (例 えば、 グルタ ミ ン酸、 リ シン) のジァノレキル誘導体のカルボ キシル基やア ミ ノ基にポリ エチレング リ コールを共有結合さ せた脂質等) を導入する こ と によ り 小胞体凝集が大幅に抑制 され、 投与後の血中滞留時間が増大する ので、 ポ リ エチ レン グ リ コール型脂質を膜成分と して添加 しても よい。 本発明の 両イ オン性脂質にコ レステロールや負電荷脂質を任意の割合 で混合した混合脂質中に 0 . 0 1 〜 5 モル% のポ リ エチ レン グ リ コール型脂質を混合させる場合が有効であるが、 好ま し く は 0 . 1 〜 1 モル 0 /0 の量である。 0 . 1 モノレ 0 /0よ り 少なレヽ 場合は凝集抑制効果が弱く な り 、 また 1 モル%よ り 多い場合 は小胞体内相に伸びたポ リ エチ レ ンダ リ コ ール鎖の排除体積 効果によ り 封入効率が低下する傾向を示す。 ポリ エチレング リ コ ール型脂質のポ リ エチ レンダリ コ ール鎖の分子量は 2, 0 0 0〜 1 2 , 0 0 0程度が好ま しい。
上記水性媒体と しては純水、 生理食塩水、 各種緩衝液、 あ るいはこ れ ら の水性媒体に水溶性薬剤を溶解させた溶液を用 いる こ と ができ る。 水性媒体の p Hが酸性である と、 両ィォ ン性脂質化合物の力ルポン酸ァユオンはカルボン酸とな り 、 水性媒体の P Hがアル力 リ 性である と両イ オン性脂質化合物 のアンモ ウムがァ ミ ンと なって、 両イオン性脂質化合物は 両イオン性ではなく なる。 しかしなが ら、 小胞体の表面電荷 を制御する必要がある場合や!) H値によって特に安定性の低 下ゃ両イ オン性脂質化合物分子の集合形態の変化等に支障が 無い場合は P Hの制限はない。 また、 p Hの変化による集合 形態の変化を逆に利用 して小胞体内包物を放出させる こ とや 小胞体を分散媒体か ら相分離させ単離する こ とを目的とする 場合には、 目的に応じた p Hであればよい。
また、 本発明の両イオン性脂質化合物を用いて形成される 小胞体の粒子径は、 1 0 0〜 3 0 0 n mである ことが好まし い。 この小胞体の粒子径は、 例えば混合脂質粉末に水性媒 を加えて水和、 膨潤させ、 静置水和法、 ポルテッ クスミキサ 一、 強制撹拌機、 超音波照射機、 ホモジナイザー、 マイ ク ロ フルイ ダィザ一、 高圧押出機 (ェクス トル ^ダー) 、 凍結融 解等によ り調整する ことができる。 特に、 凍結融解と高圧押 出機を組み合わせる ことによ り、 フィルターの透過性が著し く 向上するため、 処理時間が短縮、 収率が向上する。 内包さ れなかつた水溶性薬剤はゲルろ過や超遠心分離や限外ろ過膜 処理によ り内包小胞体と分離できる。
小胞体中に内包させる水性媒体としてヘモグロビン溶液を 使用する場合、 ヒ ト 由来、 ゥシ由来の赤血球を常法によって 溶血させ、 遠心分離や限外ろ過によ りス ト ローマ成分のみを 除去したス ト ロ一マフ リーヘモグロビン溶液、 ヘモグロ ビン を単離した精製ヘモグロビン溶液、 あるいはリ コ ンビナン ト ヘモグロ ビン溶液であって、 限外ろ過によ り ヘモグロビン濃 度を 1 0 g / d L以上に濃縮したものを使用する こ とができ る。 ヘモグロ ビン内包小胞体を酸素運搬体と して使用する場 合、 充分量の酸素を生体組織に供給するためにはへモグロ ビ ン水溶液中のヘモグロビン濃度は 2 0〜 5 0 g / d Lである こ とが好ましい。 本発明において、 イ ノ シシ トールリ ン酸、 ピ リ ドキサール 5 ' リ ン酸 ( P L P ) 等の有機リ ン化合物をヘモグロ ビンの 酸素親和度調節のために加えてもよい。 また、 ヘモグロ ビン の還元剤としてホモシスティ ン、 ダル夕チオン等のチオール 類、 水溶性ビタミ ン類等を加えてもよい。 活性酸素除去剤と して、 カタラーゼ、 スーパーォキシ ドジスム夕ーゼを加えて もよい。
以下に実施例を挙げて本発明をさ らに説明するが、 本発明 はこれらによ り 限定されるものではない。 なお、 以下の実施 例における化合物 (誘導体) 1 〜 5 の構造は、 最後にまとめ て示してある。
実施例 1
本実施例では、 親水部としてグルタミ ン酸を α位の力ルポ キシル基で化合物 1 に結合させた両イオン性脂質 3 を以下の よう にして合成した。
( A ) L _グルタ ミ ン酸 ( 2 . 9 6 グラム、 2 0 m m o 1 ) 、 p— トルエンスルホン酸一水和物 ( 4. 5 6 g , 2 4 mm o 1 ) を溶媒ベンゼン ( 1 5 0 m L ) に溶解させ、 生成 水を除去しながら 1 時間還流した。 へキサデシルアルコール ( 1 0 . 6 5 g、 4 4 m m o 1 ) を加え、 1 0 5 °Cで生成水 を除去しながら さ ら に 14時間還流させた。 溶媒を減圧除去 した後、 残分をク ロ口ホルム ( 1 5 0 m L ) に溶解させ、 炭 酸ナ ト リ ウム飽和水溶液 ( 1 5 0 m L ) で 2 回、 水 ( 1 5 0 m L ) で 2 回洗浄した。 ク ロ 口ホルム層を回収し、 硫酸ナ ト リ ウムで脱水後、 溶媒を減圧除去した。 残渣をメタノールか ら 4でで再結晶、 ろ過後乾燥して白色粉末の化合物 1 ( 9 . 5 g、 収率 8 0 % ) を得た。
化合物 1 の分析結果 :
薄層ク ロマ ト グラフィー (シリ カゲルプレー ト、 ク ロロホ ルム /メ タ ノ ール ( 4 / 1 ) (容量 Z容量) : R i : o.79
(モノスポッ 卜)
赤外吸収スぺク トル (cm— 1) : 3385 [リ NH ( NH2) ] ; 1738 [ V c== 0 、エステ Jレ) ]。
ェ!!一 NMRスぺク トル ( CDC13, 500 MHz , δ 、ppm) ) : 0 . 88 ( t , 6 H , ― CH3 ) ; 1.26 ( s , 52 Η , 一 CH2 — CH2 ― ) ; 1 . 62 ( m , 4Η , — CO— O— C一 CH2 ) ; 1. 85 , 2 . 08 ( m , 2H , g lu β 一 CH2 ) ; 2 .46 ( m , 2 Η , glu 7 ― CH2 ) ; 3 .46 ( m, 1H, glu a ― CH> ; 4 . 08 , 4. 12 ( tt, 4H, — CO— O— CH2一 ) o
( B ) 化合物 1 をアミ ノ基および力ルポキシル基保護ダル 夕ミ ン酸と以下のよう にして結合させた。 すなわち、 N— t - B o c — L 一グルタ ミ ン酸 r 一 t —ブチルエステル ( 7 6 4 m g、 2 . 5 2 m m 0 1 ) と D C C ( 5 1 3 m g、 2 . 5 2 m m o 1 ) をジク ロロメタンに溶解し、 4 °Cで 3 0 分撹拌 した後、 化合物 1 ( l g、 1 . 6 8 mm o 1 ) と ト リ ェチル ァミ ン ( 1 7 0 m g、 1 . 6 8 m m o 1 ) を溶解したジク ロ ロメタ ン溶液に滴下する。 反応混合溶液を 2 5 °Cで 5時間撹 拌した後、 グラスフィ ルタ一 ( G 4 ) で反応液を濾過し、 溶 媒を減圧除去する。 メタノール ( 3 0 0 m L ) から 4 °Cで再 結晶してろ過後、 乾燥して、 化合物 1に親水部と してアミ ノ 基およびカルボキシル基保護ダルタミ ン酸を結合させた化合 物 2 を白色固体として得た ( 1 . 1 5 g、 収率 7 8 % ) 。
化合物 2 の分析結果 :
薄層ク ロマ トグラフィ ー (シリ カゲルプレー ト、 ク ロロホ ルム Zメ タ ノ ール ( 4 / 1 ) (容量 Z容量) : R f : 0. 81 (モノスポッ ト) 。
赤外吸収スペク トル ( cm—つ : 1737 ( V c ==。 (エステ ル) ) ; 1665 ( リ c =。 (ア ミ ド) ) ; 1570 ( (5 N - H (アミ ド ) 。
ェ!!一 NMRスぺク 卜ル ( CDC13, 500MHz , (5 ( ppm ) ) : 0 . 88 ( t , 6 H , 一 CH3 ; 1.26 ( s, 52 H , — CH2 — CH2 一 ) ; 1.44、 1.46 ( s , 18 H , CH3— C— ) ; 1. 62 ( m , 4 H , — CO — 0 — C — CH2 ) ; 1. 88 - 2 .25 ( m , 4Η , glu β 一 CH2 ) ; 2 . 31 - 2 .44 (m, 4H, glu T ― CH2) ; 4 . 06 , 4.1 ( t, 4H, — CO— O— CH2— ) ; 4. 13 ( br , 1H, — CH— CONH 一 ) ; . 57 ( m, 1H, — CH— CO— O— ) ; 5 .25 ( br , 1H, ー 0— CO— NH— ) ; 6.90 ( d , 1Η, amide) 。
( C ) 化合物 2 ( 1 . 1 5 g、 1 . 3 0 m m o 1 ) を T F A ( 1 0 m L ) に溶解し、 4 °Cで 3 時間撹拌した後、 クロ口 ホルム ( 5 0 m L ) を加え、 炭酸ナ ト リ ウム飽和水溶液で 2 回、 水で 2 回洗浄した。 ク ロ 口ホルム層を無水硫酸ナ ト リ ウ ムで脱水した後、 溶媒を減圧除去した。 ベンゼン ( 1 0 m L ) に溶解後、 未溶解成分を濾過して濾液を凍結乾燥し、 両 イ オン性脂質 3 を白色固体と して得た ( 0 . 8 9 g、 収率 9 2 % ) 。 化合物 3 の分析結果 :
薄層ク ロマ ト グラフィ ー (シリ カゲルプレー ト、 ク ロ ロホ ルム / メ タ ノ ール ( 4Z l) (容量 /容量) : R f : 0 .24 (モノ スポッ ト) 。
赤外吸収スペク トル ( cm—つ : 1739 ( リ c =。 (エステ ル) ) ; 1661 ( レ c=。 (ア ミ ド) ) ; 1567 ( δ Ν.„ (ア ミ ド) ) 。
^•H— NMRス ぺ ク 卜 Jレ 、 CDC13, 500MHz , δ ppm) ) : 0.88 、 t, 6H , ― CH3 ) ; 1.26 ( s , 52 H , — CH2 — CH2 ― ) ; 1 .61 ( m, 4 H , — CO— O— C _ CH2 ) ; 1 .70 - 2 .20 ( m, 4 H , glu j8 一 CH2) ; 2 .32、 2 .41 ( m, 4H, glu 7 一 CH2) ; 3 .40 ( m, 1H, 一 CH— CO— 0 _ ) 4. 07 , 4.12 ( t 4H, — CO— 0— CH2— ) ; 4 .51 ( m , 1 H , — CH— CONH— ) ,
MS ( FAB) C42H7907N2Naにつレ ての計算値 : 746. 6 ; 実 IIJ 値 : 747 .7 (M+ H) +
実施例 2
本実施例では、 親水部と してグルタ ミ ン酸を ァ位の力ルポ キシル基で化合物 1 に結合させた両イ オン性脂質 5 を以下の よ う に して合成した。
( A ) 化合物 1 をァミ ノ基および力ルポキシル基保護ダル 夕 ミ ン酸と以下のよ う にして結合させた。 すなわち、 N— t - B o c 一 L — グルタ ミ ン酸 α — t —ブチルエステル ( 3 8 2 m g、 1 . 2 6 m m o 1 ) と D C C ( 2 5 6 m g、 1 . 2 6 mm o 1 ) をジク ロ ロメタ ンに溶解し、 4 °Cで 3 0分撹拌 した後、 化合物 1 ( 5 0 0 m g、 0 . 8 4 m m o 1 ) と ト リ ェチルァミ ン ( 8 5 m g、 0 . 8 4 m m o 1 ) を溶解したジ ク ロロメタン溶液に滴下した。 反応混合溶液を 2 5 °Cで 5 時 間撹拌した後、 グラスフィルター ( G 4 ) で反応液を濾過し、 溶媒を減圧除去した。 メタノール ( 3 0 0 m L ) から 4 °Cで 再結晶してろ過後、 乾燥して、 化合物 1に親水部としてアミ ノ基および力ルポキシル基保護ダルタミ ン酸を結合させた化 合物 4 を白色固体として得た ( 6 2 9 m g、 収率 8 5 % ) 。
化合物 4 の分析結果 :
薄層ク ロマ ト グラフィ ー (シリ カゲルプレー ト、 クロロホ ルム /メ タ ノール (4Ζι) (容量 Z容量) : R f : 0 . 8 4 (モノスポッ 卜) 。
赤外吸収スペク トル ( cm— : 1737 ( レ c = 。 (エステ ル) ) ; 1661 ( レ 。 ( ア ミ ド ) ) ; 1580 ( δ Ν-Η ( ア ミ ド) ) 。
λ ― NMRスぺ ク 卜ル ( CDC 13, 50 ΟΜΗ ζ , δ 、 ppm ) ) : 0 . 88 ( t , 6Η, ― CH3 ) ; 1 . 26 ( s, 52 H , — CH2 — CH2 一 ) ; 1 . 44、 1 . 7 ( s , 18H, CH3 — C一 ) ; 1 . 62 ( m, 4 H , — CO — O — C — CH2 ) ; 1 . 86 - 2 . 22 ( m, 4H , glu β ― CH2) ; 2 . 28 - 2 . 45 ( m , 4H, glu T ― CH2) ; 4 . 05 , 4 . 08 ( t , 4 H , — CO — O— CH2 _ ) ; 4 . 16 ( br, 1H, — O— CO — NH— CH— ) ; 4 . 59 ( m, 1H, — CH— CO— O— ) ; 5 . 20 ( br, 1H, — O— CO— NH— ) ; 6 . 60 ( d, 1H, amide)
( B ) 化合物 4 ( 6 2 9 m g、 0 . 7 1 m m o 1 ) を T F A ( 1 0 m L ) に溶解し、 4 °Cで 3 時間撹拌した後、 ク ロ 口 ホルム ( 3 0 m L ) を加え、 炭酸ナ ト リ ウム飽和水溶液で 2 回、 水で 2回洗浄した。 ク ロ口ホルム層を無水硫酸ナ ト リ ウ ムで脱水した後、 溶媒を減圧除去した。 ベンゼン ( 1 0 m L ) に溶解後、 未溶解成分を濾過して、 濾液を凍結乾燥し、 両イオン性脂質 5 を白色固体として得た ( 4 8 8 m g、 収率 9 2 % ) 。
化合物 5 の分析結果 :
薄層ク ロマ トグラフィ ー (シリ カゲルプレー ト、 クロロホ ルム Zメ タ ノ ール ( 4 / 1) (容量 /容量) : R f : 0.25 (モノスポッ ト) 。
赤外吸収スペク トル (cm— 1) : 1736 ( リ c=。 (エステ ル) ) ; 1650 ( リ c =。 (アミ ド) ) ; 1588 ( δ N-H (アミ ド) ) 。
ェ1¾一: NMRス ぺ ク 卜 レ ( CDC13 , 500 MHz , δ ppm) ) : 0.88 ( t, 6H , 一 CH3 ) ; 1.26 ( s , 52 Η , 一 CH2 — CH2 ― ) ; 1.62 ( m , 4Η, — CO— O— C— CH2) ; 1.94 - 2.20 ( m, 4H, glu β ― CH2) ; 2.40、 2.41 ( m , 4H , glu 7 - CH2 ) ; 3.44 ( br, 1H, _ CH— CO— O— ) 4.06 , 4.10 (t, 4 H , — CO— O— CH2— ) ; 4.47 ( br , 1H , NH2— CH _ CH2 - ) 。
MS ( FAB) C 2H79O7N2 Naにつ いての計算値 : 746.6 ; 実測 値 : 747.7 (M+ H) +
実施例 3
化合物 3 ( 1 5 0 m g、 0 . 2 0 7 m m 0 1 ) 、 コ レステ ロール ( 8 0 m g、 0 . 2 0 7 m m m 0 1 ) 、 ジパルミ トイ ルホスフ ァチジルグリ セロール ( D P P G ) ( 2 9 m g、 0 . P 蘭蘭 19
15
0 4 1 m m ο 1 ) 、 ポリ エチレングリ コール結合ジパルミ 卜 ィルホス フ ァチジルエタ ノールァミ ン ( P E G— D P P E A ) ( 8 m g、 0 . 0 0 1 4 mm o l )を秤量し、 1 0 0 m Lのナス型フラスコに加えた。 こ こにベンゼン ( 1 O mL ) を加え加温しながら完全溶解させた。 この ものを ドライ アイ スーメタノールで凍結して凍結乾燥機に装着し、 1 0時間凍 結乾燥した。 このものに、 D P P Gと等モルの N a O Hを含 む注射用水 ( 2 5 mL ) を添加してマグネッ トスターラーを 用いて撹拌し、 均一に水相に分散させた。 このものを液体窒 素で 3分間凍結した後、 4 0 °Cの恒温槽中に 1 0分間静置し て融解させた。 この操作を 3回繰り返した後、 液体窒素で凍 結させ凍結乾燥機に装着し、 3 0時間凍結乾燥して白色粉末 状の混合脂質粉末を得た。 この混合脂質粉末 ( 5 0 m g ) を 1 O mLのナス型フラスコに投入し、 濃度 4 0 g Z d Lの一 酸化炭素化したヘモグロビン溶液 ( 5 m L ) を加えた後、 マ グネッ トスターラーを用いて室温で 2時間撹拌した。 これを フィ ル夕一径 2 5 mmの EXTRUDER (商品名、 日油リ ポソ一 ム製) に加え、 加圧 ( 2 0 k g / c m 2 ) しながら孔径 3 .
0 m、 0. 4 5 z m、 0. 3 0 m , 0. 2 2 ^ mのァセ チルセルロースフィ ルター (富士写真フィルム製) まで順に 通過させた。 作成したサンプルについて超遠心分離 ( 1 0万 g、 6 0分) を 3回繰り返し、 未内包ヘモグロ ビンを除去し た。 人工肺 (capiox- ii) を用 いて これに高圧ナ ト リ ウム ランプか らの白色光を照射して酸素をガスポー トに通過させ る ことによ り酸素に配位子交換する ことが出来る。 こう して 得たヘモグロビン内包小胞体について市販のコ レステロール 定量キッ ト及びヘモグロ ビン定量キッ トを用いてコ レステロ ール定量、 ヘモグロ ビン (H b ) 定量を行った。 コ レステロ ール定量から総脂質重量を求め、 ヘモグロ ビン重量を総脂質 重量で除してヘモグロビン/総脂質比を算出した。 また、 酸 素結合解離平衡曲線は HEMOX - ANALYZER (商品名、 T C S 製) にて測定を行った。 得られた値を表 1 にま とめた。 比較 として化合物 3 の代わり にジパルミ 卜ィルホスフ ァチジルコ リ ン ( D P P C ) を用いて同様に調製したヘモグロ ビン小胞 体の値を表 1 に示すが、 物性の大きな相違は無く 、 コ リ ン型 リ ン脂質成分を代替できることが明らかである。
表 1
Figure imgf000019_0001
実施例 4
化合物 5 をク ロ 口ホルムに溶解させ ( 0 . 5 mM) 、 マイ ク ロシリ ンジにて 2 0 Lを L B膜作成装置に充填した水面 (純水) に展開 した。 バリ ヤ一を移動させ、 水面圧が 2 5 m N /mにな る まで水面を圧縮し ( 2 8 c m 2/min) 、 単分 子膜を作成した。 グラ フ アイ ト基板 ( 1 . 5 c m X l . 5 c m ) をこの水面に接触させ、 単分子膜をグラフ アイ 卜基板表 面に吸着させた。 シリ カゲルを充填したデシケ一夕内に 2 4 時間放置し乾燥させた後、 水滴の接触角を測定した。 グラフ アイ ト基板の接触角が 1 5 2 ° であるのに対し、 化合物 5 の 単分子膜を吸着させた表面では 3 2 ° となり 、 化合物 5 は疎 水基をグラフ アイ ト側に、 両イオン性の親水基を表面側に向 け配向し、 疎水性グラフ アイ 卜表面が親水性表面に改質され ている ことを確認した。
<化合物 1 〜 5 の構造 > 化合物
Figure imgf000020_0001
化合物 2
化合物 3
Figure imgf000020_0002
化合物 4
化合物 5
Figure imgf000021_0001
以上説明したよう に、 本発明によれば、 簡便な方法で安価 に大量合成できる二本鎖の両イオン性脂質化合物が提供され る。

Claims

求 の 範 囲
下記式 ( I )
Figure imgf000022_0001
(但し、 mと n は各々独立に 1 ないし 4 の整数、 p は 7 ない し 2 1 の整数、 Rは一つが N H 3 +であ り 、 その他の Rは全 て Hである) で表される両イオン性脂質化合物。
2 . mが 3 nが 2 である請求項 1 に記載の両イオン性脂 質化合物。
3 . mが 3 nが 2 であ り、 末端力ルポキシル炭素から数 えて 4番目の炭素上の Rが N H 3 +であ り 、 その他の Rが H である請求項 1 に記載の両イオン性脂質化合物。
4 . 請求項 1 に記載の両イオン性脂質化合物を、 疎水性物 質と水性媒体が接触する界面に配向させて、 該疎水性物質の 表面を親水性表面に改質することを包含する表面改質方法。
5 . 請求項 1 に記載の両イオン性脂質化合物を水溶性薬物 と共に水性媒体に分散させて形成される小胞体からなる水溶 性薬剤の運搬体。
6 . 請求項 1 に記載の両イオン性脂質化合物を 4 0 1 0 0 モル%含有する脂質の膜で構成されてお り 、 内水相に水溶 性薬剤が内包され、 水性媒体に分散している粒子径 1 0 0 ~ 3 0 0 n mの小胞体か らなる水溶性薬剤の運搬体。
7 . 内水相に 1 0 〜 4 0 g / d Lのヘモグロ ビンが内包さ れた請求項 6 に記載の運搬体。
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