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WO2018143469A1 - 遺伝子増幅システム、流路チップ、回転駆動機構、及び遺伝子増幅方法 - Google Patents

遺伝子増幅システム、流路チップ、回転駆動機構、及び遺伝子増幅方法 Download PDF

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Publication number
WO2018143469A1
WO2018143469A1 PCT/JP2018/003953 JP2018003953W WO2018143469A1 WO 2018143469 A1 WO2018143469 A1 WO 2018143469A1 JP 2018003953 W JP2018003953 W JP 2018003953W WO 2018143469 A1 WO2018143469 A1 WO 2018143469A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
channel
flow path
meandering
heater
chip
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/003953
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
真人 齋藤
高橋　和也
民谷　栄一
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人大阪大学 filed Critical 国立大学法人大阪大学
Priority to JP2018566166A priority Critical patent/JPWO2018143469A1/ja
Publication of WO2018143469A1 publication Critical patent/WO2018143469A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to a gene amplification system, a channel chip, a rotation drive mechanism, and a gene amplification method.
  • ddPCR digital droplet PCR
  • PCR polymerase chain reaction
  • Non-Patent Document 1 discloses a method of rotating a microchannel and producing a droplet in a centrifugal field.
  • the microchannel is a channel having a width and depth (height) on the order of micrometers.
  • the microchannel has a width and depth of 1 ⁇ m or more and less than 1 mm.
  • One cycle of PCR includes two steps. Specifically, one cycle of PCR includes a heating step and a cooling step. In the heating step, the PCR solution is heated. In the cooling step, the heated PCR solution is cooled.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide a gene amplification system and a gene amplification method capable of performing ddPCR more rapidly. Another object of the present invention is to provide a channel chip and a rotation drive mechanism that can be used in a gene amplification system.
  • the gene amplification system of the present invention includes a flow path chip and a rotation drive mechanism.
  • the channel chip has a meandering channel.
  • the meandering channel meanders to one side and the other side.
  • the rotation drive mechanism has a rotation shaft and rotates the flow channel chip around the rotation shaft.
  • the rotation drive mechanism rotates the flow channel chip to impart buoyancy to the droplets in the meandering channel, thereby moving the droplets along the meandering channel.
  • the rotation driving mechanism includes a heater stage and a driving device.
  • the heater stage has a plurality of heater surfaces set at different temperatures.
  • the drive device rotates the heater stage around the rotation axis.
  • the rotation drive mechanism holds the flow path chip so that the meandering flow path is disposed across the plurality of heater surfaces.
  • the plurality of heater surfaces include a first heater surface and a second heater surface.
  • the first heater surface is set to a first temperature.
  • the second heater surface is set to a second temperature different from the first temperature.
  • the rotational drive mechanism has an end on the one side of the meandering channel facing the first heater surface, and an end on the other side of the meandering channel is the second heater surface.
  • the flow channel chip is held so as to face the surface.
  • the meandering channel includes a first inclined channel and a second inclined channel.
  • the first inclined channel extends to the one side.
  • the second inclined channel extends to the other side.
  • first inclined channel and the second inclined channel are inclined with respect to a radial direction orthogonal to the rotation axis.
  • the meandering channel includes a plurality of the first inclined channels and a plurality of the second inclined channels.
  • first inclined flow path and the second inclined flow path are alternately arranged along the radial direction.
  • the flow channel chip further includes a droplet supply chamber.
  • the droplet supply chamber supplies the droplet to the starting end of the meandering flow path.
  • the droplet supply chamber has a shape whose width becomes narrower toward a start end of the meandering flow path.
  • the droplet supply chamber has a triangular shape.
  • a triangular top of the droplet supply chamber is connected to a starting end of the meandering channel.
  • the flow channel chip further includes a liquid introduction chamber and an introduction flow channel.
  • a liquid is introduced into the liquid introduction chamber.
  • the introduction channel communicates with the liquid introduction chamber and the meandering channel.
  • the introduction flow path includes a meandering flow path at an intermediate portion thereof.
  • the channel chip of the present invention includes a meandering channel.
  • the meandering channel meanders to one side and the other side.
  • buoyancy is applied to the droplets in the meandering channel, and the droplets move along the serpentine channel.
  • the rotation drive mechanism of the present invention rotates the flow channel chip around the rotation axis.
  • the channel chip has a meandering channel.
  • the meandering channel meanders to one side and the other side.
  • the rotational drive mechanism includes a heater stage and a drive device.
  • the heater stage has a plurality of heater surfaces set at different temperatures.
  • the drive device rotates the heater stage around the rotation axis.
  • the rotation drive mechanism holds the flow path chip so that the meandering flow path is disposed across the plurality of heater surfaces.
  • the plurality of heater surfaces include a first heater surface and a second heater surface.
  • the first heater surface is set to a first temperature.
  • the second heater surface is set to a second temperature different from the first temperature.
  • the rotational drive mechanism has an end on the one side of the meandering channel facing the first heater surface, and an end on the other side of the meandering channel is the second heater surface.
  • the flow channel chip is held so as to face the surface.
  • the first heater surface extends along a radial direction orthogonal to the rotation axis.
  • the second heater surface is arranged side by side with the first heater surface and extends along the radial direction.
  • the gene amplification method of the present invention is a method of amplifying a gene using a channel chip.
  • the channel chip has a meandering channel and a liquid introduction chamber.
  • the meandering channel meanders on one side and the other side.
  • the liquid introduction chamber communicates with the meandering flow path.
  • the gene amplification method includes a step of holding the flow channel chip with respect to a heater stage so that the meandering flow channel is disposed across a plurality of heater surfaces, and the plurality of heater surfaces are set to different temperatures.
  • the end portion on the one side of the meandering channel faces the first heater surface, and the other side of the meandering channel is on the other side.
  • the flow path chip is held with respect to the heater stage so that the end faces the second heater surface.
  • the first heater surface is set to a first temperature
  • the second heater surface is set to a second temperature different from the first temperature. .
  • ddPCR can be performed more rapidly.
  • FIG. 14B is a sectional view taken along line XIVB-XIVB shown in FIG. It is a figure which shows a part of introduction channel, droplet supply chamber, and a meandering channel which concern on embodiment of this invention. It is a figure which shows a part of introduction channel, droplet supply chamber, and a meandering channel which concern on embodiment of this invention. It is a figure which shows a part of introduction channel, droplet supply chamber, and a meandering channel which concern on embodiment of this invention. It is a figure which shows a part of introduction channel, droplet supply chamber, and a meandering channel which concern on embodiment of this invention. It is a figure which shows a part of introduction channel, droplet supply chamber, and a meandering channel which concern on embodiment of this invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the rotation speed and the movement speed of droplets according to Examples 2 to 4 of the present invention. 6 is a graph showing the relationship between the rotation speed and the time required to complete one cycle of PCR according to Examples 2 to 4 of the present invention.
  • A is a figure which shows the detection result of the fluorescence which concerns on Example 5.
  • FIG. (B) is a figure which shows the detection result of the fluorescence which concerns on a comparative example.
  • FIG. 1 is a plan view of the flow path chip 1.
  • the flow channel chip 1 includes a substrate 11.
  • the substrate 11 includes a liquid introduction chamber 12, an introduction channel 13, a droplet supply chamber 14, a meandering channel 15, and a storage chamber 16.
  • the introduction flow path 13 and the meandering flow path 15 are typically micro flow paths. However, the introduction flow path 13 and the meandering flow path 15 are not limited to micro flow paths.
  • the introduction channel 13 and the meandering channel 15 may have a channel width of 1 mm and a depth (height) of 1 mm, for example.
  • the liquid introduction chamber 12 and the like are formed on the substrate 11 by, for example, a fine processing technique.
  • the liquid introduction chamber 12 and the like can be formed by soft lithography.
  • Soft lithography is a technique for molding a relatively soft material such as silicone rubber.
  • the liquid introduction chamber 12 or the like can be formed by photolithography and a dry process (dry etching) or a wet process (wet etching).
  • the liquid introduction chamber 12 and the like can be formed by injection molding or cutting.
  • the shape and size of the substrate 11 are not particularly limited as long as the liquid introduction chamber 12 and the like can be formed.
  • the substrate 11 has a rectangular shape.
  • the length of the substrate 11 in the longitudinal direction LD is, for example, 70 mm
  • the length of the width direction WD perpendicular to the longitudinal direction LD of the substrate 11 is, for example, 50 mm.
  • the material of the substrate 11 is not particularly limited as long as the liquid introduction chamber 12 and the like can be formed, but is preferably a material that does not inhibit PCR.
  • the material of the substrate 11 is preferably a material that does not hinder the observation (detection) of fluorescence.
  • the substrate 11 may be made of silicone rubber, glass, cycloolefin polymer (COP), or polycarbonate (PC).
  • the liquid introduction chamber 12 is formed at one end of the substrate 11 in the longitudinal direction LD.
  • one side of the substrate 11 in the longitudinal direction LD is the upper side
  • the other side of the substrate 11 in the longitudinal direction LD is the lower side.
  • the liquid introduction chamber 12 has an inlet (opening), and the liquid is introduced into the liquid introduction chamber 12 through the inlet.
  • the inlet is formed in the ceiling of the liquid introduction chamber 12.
  • the liquid is an oil such as fluorine oil and a PCR solution.
  • the PCR solution is introduced after the oil is introduced. More specifically, after the introduction channel 13, the droplet supply chamber 14, and the meandering channel 15 are filled with oil and the oil is supplied to the storage chamber 16, the PCR solution is introduced.
  • the PCR solution typically includes a sample solution, a primer, a DNA polymerase, a DNA molecule to be amplified (target sequence), deoxynucleotide triphosphate (dNTP), and a buffer solution. PCR solutions can also contain fluorescent dyes or probe DNA.
  • the sample liquid contains DNA, and the DNA has DNA molecules to be amplified.
  • the sample liquid is a turbid liquid containing, for example, influenza virus, norovirus, or other infectious disease virus.
  • the sample liquid is a turbid liquid containing drug-resistant bacteria, enterohemorrhagic E. coli, and other infectious bacteria.
  • the sample liquid is a turbid liquid containing microorganisms or animal cells.
  • the sample solution is an extract of DNA or RNA of influenza virus, norovirus, or other infectious disease virus.
  • the sample liquid is an extract of DNA or RNA of drug-resistant bacteria, enterohemorrhagic Escherichia coli, or other infectious bacteria.
  • the sample liquid is an extract of DNA or RNA of microorganisms or animal cells.
  • the PCR solution may be prepared after the reverse transcription process is performed on the sample liquid.
  • a reverse transcription process may be included in the PCR step.
  • the reverse transcription process is a process of synthesizing complementary DNA for RNA by reverse transcriptase.
  • the depth (height) of the liquid introduction chamber 12 is not particularly limited.
  • the liquid introduction chamber 12 may have a depth selected from a range of 10 ⁇ m to 1 mm.
  • the volume of the liquid introduction chamber 12 is preferably larger than the total value of the volume of the introduction channel 13, the volume of the droplet supply chamber 14, and the volume of the meandering channel 15. Under this condition, the introduction flow path 13, the droplet supply chamber 14, and the meandering flow path 15 can be filled with oil, and the oil can be supplied to the storage chamber 16.
  • the introduction channel 13 allows the liquid introduction chamber 12 and the droplet supply chamber 14 to communicate with each other.
  • the start end of the introduction flow path 13 is connected (communication) with the liquid introduction chamber 12, and the end of the introduction flow path 13 is connected (communication) with the droplet supply chamber 14.
  • the introduction channel 13 includes a first introduction channel 13a and a second introduction channel 13b.
  • the first introduction flow path 13 a includes the start end of the introduction flow path 13.
  • the first introduction flow path 13 a extends from the liquid introduction chamber 12 to the other end portion in the longitudinal direction LD of the substrate 11 and then extends in the width direction WD of the substrate 11.
  • the channel width and depth of the first introduction channel 13a are not particularly limited.
  • the first introduction channel 13a may have a channel width and depth selected from a range of 10 ⁇ m to 1 mm.
  • the second introduction channel 13 b includes the end of the introduction channel 13.
  • the second introduction channel 13 b extends from the end of the first introduction channel 13 a in the longitudinal direction LD of the substrate 11 and is connected to the droplet supply chamber 14.
  • the channel width and depth of the second introduction channel 13b may be the same as or different from the channel width and depth of the first introduction channel 13a.
  • the second introduction channel 13b may have a channel width selected from a range of 10 ⁇ m to 1 mm.
  • the second introduction channel 13b has a narrower channel width than the first introduction channel 13a.
  • the second introduction flow path 13b may have a depth selected from a range of 10 ⁇ m to 1 mm.
  • the second introduction channel 13 b has a depth shallower than that of the droplet supply chamber 14.
  • the droplet supply chamber 14 is formed at the other end of the substrate 11 in the longitudinal direction LD.
  • the droplet supply chamber 14 communicates (connects) with the starting end of the meandering channel 15.
  • the droplet supply chamber 14 supplies a PCR solution droplet generated at the terminal end of the introduction channel 13 (near the interface between the introduction channel 13 and the droplet supply chamber 14) to the meandering channel 15.
  • the droplet of the PCR solution is generated when the droplet supply chamber 14 is filled with oil.
  • the shape of the droplet supply chamber 14 is not particularly limited, but preferably includes a shape for guiding the droplet of the PCR solution to the meandering channel 15.
  • the shape of the droplet supply chamber 14 on the side of the meandering channel 15 is a triangle, and the top of the triangle is connected to the starting end of the meandering channel 15. With this shape, a droplet of the PCR solution can be guided to the meandering channel 15.
  • the depth of the droplet supply chamber 14 is not particularly limited.
  • the droplet supply chamber 14 may have a depth selected from a range of 10 ⁇ m to 1 mm.
  • the droplet supply chamber 14 has a deeper depth than the second introduction channel 13b.
  • the meandering flow path 15 extends to one side in the longitudinal direction LD of the substrate 11 while meandering in the width direction WD of the substrate 11.
  • the end of the meandering channel 15 communicates (connects) with the accommodation chamber 16.
  • the meandering flow path 15 is formed at the other end of the substrate 11 in the longitudinal direction LD.
  • the width and depth of the meandering channel 15 are not particularly limited as long as the PCR solution droplets can pass through the meandering channel 15.
  • the meandering channel 15 may have a channel width and depth selected from a range of 10 ⁇ m to 1 mm.
  • the storage chamber 16 is formed between the liquid introduction chamber 12 and the meandering channel 15. Therefore, the liquid introduction chamber 12, the storage chamber 16, and the meandering flow path 15 are arranged in this order along the longitudinal direction LD of the substrate 11.
  • the storage chamber 16 stores oil and droplets of the PCR solution.
  • the storage chamber 16 has an outlet (opening) for discharging gas.
  • the outlet is formed in the ceiling portion of the storage chamber 16.
  • the depth of the storage chamber 16 is not particularly limited.
  • the storage chamber 16 may have a depth selected from a range of 10 ⁇ m to 1 mm.
  • the volume of the storage chamber 16 is typically larger than the liquid introduction chamber 12. Since the storage chamber 16 has a larger volume than the liquid introduction chamber 12, it is possible to suppress leakage of liquid such as oil from the outlet of the storage chamber 16.
  • the flow channel chip 1 can further include at least one spacer 17 disposed in the liquid introduction chamber 12.
  • the flow channel chip 1 may further include at least one spacer 17 disposed in the storage chamber 16.
  • the ceiling of the liquid introduction chamber 12 may bend depending on the area of the liquid introduction chamber 12.
  • the spacer 17 in the liquid introduction chamber 12 it is possible to prevent the ceiling portion of the liquid introduction chamber 12 from being bent.
  • the spacer 17 in the storage chamber 16 it is possible to prevent the ceiling portion of the storage chamber 16 from being bent.
  • FIG. 2 is a front view of the flow path chip 1.
  • the flow channel chip 1 further includes a floor member 18.
  • the floor member 18 is disposed below the substrate 11 and constitutes a floor portion such as the liquid introduction chamber 12.
  • the material of the floor member 18 is not particularly limited, but is preferably a material that does not inhibit PCR.
  • the material of the floor member 18 is preferably a material that does not hinder the observation (detection) of fluorescence.
  • the rigidity of the floor member 18 is preferably higher than the rigidity of the substrate 11.
  • the floor member 18 can be a glass substrate.
  • the rigidity of the floor member 18 is higher than the rigidity of the substrate 11, the floor member 18 supports the substrate 11. Therefore, it is possible to suppress the substrate 11 (flow channel chip 1) from being bent by the floor member 18. In other words, the rigidity of the channel chip 1 can be increased. Therefore, when moving the flow path chip 1 to the fluorescence detection field after the PCR step is completed, it is possible to reduce the risk of liquid (oil etc.) leaking from the flow path chip 1.
  • the rigidity of the floor member 18 may be higher or lower than the rigidity of the substrate 11.
  • the rigidity of the floor member 18 may be the same as the rigidity of the substrate 11.
  • the floor member 18 can be glass, cycloolefin polymer, polycarbonate, or a crimp seal.
  • the flow path chip 1 may include a lid member instead of the floor member 18.
  • the flow path chip 1 includes a lid member, the top and bottom of the substrate 11 are reversed and the lid member is disposed above the substrate 11.
  • the lid member constitutes a ceiling portion of the liquid introduction chamber 12 or the like. Therefore, when the flow channel chip 1 includes the lid member, the inlet of the liquid introduction chamber 12 and the outlet of the storage chamber 16 are formed in the lid member.
  • the material of the lid member is not particularly limited, but is preferably a material that does not inhibit PCR, like the floor member 18.
  • the material of the lid member is preferably a material that does not hinder the observation of fluorescence.
  • FIG. 3 is an enlarged view showing a part of the flow path chip 1. Specifically, FIG. 3 shows an enlarged view of the meandering flow path 15 of the flow path chip 1.
  • the meandering flow path 15 meanders to one side and the other side of the width direction WD of the substrate 11.
  • one side of the width direction WD of the substrate 11 is the right side
  • the other side of the width direction WD of the substrate 11 is the left side.
  • One end of the meandering channel 15 is disposed on the first heater surface 31a
  • the other end of the meandering channel 15 is disposed on the second heater surface 32a.
  • the first heater surface 31a is set to the first temperature.
  • the second heater surface 32a is set to a second temperature different from the first temperature.
  • the first heater surface 31a (first temperature) is set to a temperature for executing the PCR heating step
  • the second heater surface 32a (second temperature) executes the PCR cooling step.
  • Set temperature for. Therefore, the second heater surface 32a is set to a temperature lower than that of the first heater surface 31a.
  • the 1st heater surface 31a (1st temperature) is set to the temperature selected from the range of 90 to 98 degreeC.
  • the temperature of the second heater surface 32a is set according to the amplification target DNA molecule.
  • the 2nd heater surface 32a (2nd temperature) is set to the temperature selected from the range of 50 to 70 degreeC.
  • the droplets of the PCR solution reciprocate between the heating field and the cooling field by moving through the meandering flow path 15.
  • One cycle of PCR is completed when the droplet of PCR solution passes through the heating field and the cooling field once.
  • the meandering flow path 15 shown in FIG. Therefore, the number of PCR cycles is 30.
  • count of folding back the meandering flow path 15 is not limited to 60 times. The number of times the meandering channel 15 is folded back can be changed as necessary.
  • the length L1 of the meandering channel 15 along the longitudinal direction LD of the substrate 11 is changed according to the number of PCR cycles. Specifically, the length L1 of the meandering channel 15 becomes longer as the number of PCR cycles is increased. For example, when the number of PCR cycles is 30, the length L1 of the meandering flow path 15 may be 20 mm.
  • the meandering flow path 15 is formed in the first heater surface 31 a and the second heater surface so that the area overlapping the second heater surface 32 a is larger than the area overlapping the first heater surface 31 a. It is made to oppose 32a (temperature control field).
  • the meandering flow path 15 is disposed such that a portion extending from the center of the width direction WD of the substrate 11 to the other end faces the second heater surface 32 a.
  • FIG. 4 is a diagram showing a configuration of the rotation drive mechanism 3.
  • the rotation drive mechanism 3 includes a heater stage 30, a disk-shaped base 40, and a drive device 50.
  • the heater stage 30 is fixed to the base 40, and the driving device 50 rotates the heater stage 30 and the base 40 about the rotation axis AX (center axis).
  • the heater stage 30 and the base 40 are made of, for example, aluminum or copper, and the driving device 50 is typically a motor.
  • the driving device 50 is preferably capable of controlling the rotation speed (number of rotations).
  • the material of the heater stage 30 and the base 40 is not limited to aluminum or copper, it is preferable that it is a material with high heat conductivity.
  • the heater stage 30 will be further described.
  • the heater stage 30 has the first heater surface 31a and the second heater surface 32a described with reference to FIG. As shown in FIG. 4, the first heater surface 31 a and the second heater surface 32 a extend along a radial direction orthogonal to the rotation axis AX. Moreover, the 1st heater surface 31a and the 2nd heater surface 32a are located in a line at intervals.
  • one end of the meandering channel 15 is disposed on the first heater surface 31a, and the other end of the meandering channel 15 is on the second heater surface 32a. Be placed. Accordingly, the flow channel chip 1 described with reference to FIGS. 1 to 3 is set with respect to the rotational drive mechanism 3 such that the longitudinal direction LD thereof is along the radial direction of the rotational drive mechanism 3. As a result, the liquid introduction chamber 12, the storage chamber 16, and the meandering channel 15 are arranged in this order along the radial direction. Specifically, among the liquid introduction chamber 12, the storage chamber 16, and the meandering channel 15, the liquid introduction chamber 12 is closest to the rotation axis AX (rotation center).
  • the heater stage 30 includes a first heater stage 31 and a second heater stage 32.
  • the first heater stage 31 has a first heater surface 31a
  • the second heater stage 32 has a second heater surface 32a.
  • the first heater stage 31 heats the first heater surface 31a to the first temperature.
  • the second heater stage 32 heats the second heater surface 32a to the second temperature.
  • the first heater stage 31 includes an annular connecting part 311 and a plurality of first heating parts 312.
  • the connecting portion 311 is disposed around the rotation axis AX.
  • the plurality of first heating units 312 extend radially from the coupling unit 311 around the rotation axis AX. Accordingly, each of the first heating units 312 is disposed along the radial direction.
  • the first heater stage 31 shown in FIG. 4 has four first heating units 312.
  • the four first heating units 312 are typically provided with an angular interval of 90 degrees.
  • Each first heating unit 312 includes a protrusion 313 that protrudes upward.
  • the protrusion 313 extends in the radial direction.
  • the ridge portion 313 has a rectangular parallelepiped shape, and the upper surface of the ridge portion 313 constitutes the first heater surface 31a.
  • the length of the protrusion 313 in the radial direction is determined according to the length L1 of the meandering channel 15 described with reference to FIG. For example, when the length L1 of the meandering channel 15 is 20 mm, the length in the radial direction of the protrusion 313 is 20 mm or more.
  • the second heater stage 32 includes a disk-shaped main body 321 and a plurality of second heating units 322.
  • the main body 321 is disposed below the first heater stage 31 and separated from the first heater stage 31.
  • Each of the second heating parts 322 protrudes upward from the main body part 321 and extends in the radial direction.
  • the second heater stage 32 shown in FIG. 4 has four second heating units 322.
  • the four second heating units 322 are typically provided with an angular interval of 90 degrees.
  • Each of the second heating sections 322 has a second heater surface 32a.
  • the 2nd heating part 322 is a rectangular parallelepiped shape, and the upper surface of the 2nd heating part 322 comprises the 2nd heater surface 32a.
  • the length of the second heating unit 322 in the radial direction is determined according to the length L1 of the meandering flow path 15 described with reference to FIG. For example, when the length L1 of the meandering flow path 15 is 20 mm, the radial length of the second heating unit 322 is 20 mm or more.
  • the width of the second heater surface 32a is preferably larger than the width of the first heater surface 31a. Since the second heater surface 32a has a larger width than the first heater surface 31a, the region of the meandering flow path 15 that overlaps the second heater surface 32a is made larger than the region that overlaps the first heater surface 31a. Becomes easier.
  • the separation member 33 is fixed to the center portion of the main body portion 321 of the second heater stage 32, and supports the first heater stage 31 so that the first heater stage 31 is separated from the main body portion 321 of the second heater stage 32.
  • the material of the separation member 33 is not particularly limited, but is preferably a material having high heat resistance.
  • the material of the spacing member 33 may be a resin such as polycarbonate or polyphenylene sulfide (PPS).
  • the separation member 33 includes a large diameter portion 331 and a small diameter portion 332.
  • the small diameter portion 332 is fixed on the large diameter portion 331, and the large diameter portion 331 is fixed to the central portion of the main body portion 321 of the second heater stage 32.
  • a step shape (step) is formed by the large diameter portion 331 and the small diameter portion 332, and the connecting portion 311 of the first heater stage 31 is fixed around the small diameter portion 332 (step).
  • the first heater stage 31 is disposed at a position separated from the main body portion 321 of the second heater stage 32 by the height of the large diameter portion 331.
  • the large diameter portion 331 and the small diameter portion 332 may be formed integrally.
  • the separation member 33 supports the first heater stage 31 so that the first heater surface 31a and the second heater surface 32a are arranged with a space therebetween.
  • the separation member 33 supports the first heater stage 31 such that thermal interference between the adjacent first heater surface 31a and the second heater surface 32a is reduced.
  • the distance between adjacent first heater surface 31a and second heater surface 32a may be 1 mm.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a part of the gene amplification system 100.
  • the gene amplification system 100 includes the flow path chip 1 described with reference to FIGS. 1 to 3 and the rotation drive mechanism 3 described with reference to FIG.
  • the rotation drive mechanism 3 rotates the channel chip 1 around the rotation center X (around the rotation axis AX).
  • the rotation direction RD is a clockwise direction.
  • the rotation drive mechanism 3 holds the flow channel chip 1 so that the liquid introduction chamber 12 in the liquid introduction chamber 12 and the like is closest to the rotation center X.
  • the gene amplification system 100 rotates the channel chip 1 around the rotation center X in a state where the meandering channel 15 is opposed to the first heater surface 31a and the second heater surface 32a (temperature control field), and ddPCR is performed. Execute.
  • FIG. 6 is a flowchart showing the gene amplification method according to this embodiment.
  • the gene amplification method according to this embodiment includes steps S601 to S607.
  • steps S601 to S607 will be described.
  • the flow path chip 1 is held by the rotation drive mechanism 3 in step S601. After the flow path chip 1 is held by the rotational drive mechanism 3, oil is introduced into the liquid introduction chamber 12 in step S602.
  • step S603 the rotation drive mechanism 3 rotates the flow path chip 1 around the rotation axis AX (rotation center X).
  • the introduction channel 13, the droplet supply chamber 14, and the meandering channel 15 are filled with oil, and the oil is supplied to the storage chamber 16.
  • the temperatures of the first heater surface 31a and the second heater surface 32a are set in step S604. Specifically, the first heater surface 31a is set to a temperature for executing a PCR heating step, and the second heater surface 32a is set to a temperature for executing a PCR cooling step.
  • the PCR solution is introduced into the liquid introduction chamber 12 in step S605.
  • the rotation driving mechanism 3 rotates the flow path chip 1 around the rotation axis AX (rotation center X).
  • AX rotation center X
  • a droplet of the PCR solution is generated at the end portion of the introduction channel 13, and ddPCR is performed in the meandering channel 15.
  • the droplets of the PCR solution that have passed through the meandering flow path 15 are stored in the storage chamber 16.
  • step S607 the channel chip 1 is moved to the fluorescence detection field, and the presence or absence of DNA in each droplet is determined by detecting fluorescence.
  • FIGS. 7 to 11 are schematic diagrams showing a gene amplification method using the gene amplification system 100.
  • FIG. 7 to 11 are schematic diagrams showing a gene amplification method using the gene amplification system 100.
  • the flow path chip 1 is set in the rotation drive mechanism 3 (step S601). Specifically, the flow path is such that one end of the meandering flow path 15 is disposed on the first heater surface 31a and the other end of the meandering flow path 15 is disposed on the second heater surface 32a. The chip 1 is held on the heater stage 30. Thereafter, the oil 71 is introduced into the liquid introduction chamber 12 (step S602). For introducing the oil 71, a pipetter 72 is typically used.
  • the rotation drive mechanism 3 rotates the flow channel chip 1 in the rotation direction RD about the rotation axis AX (rotation center X) (step S603).
  • the oil 71 flows from the liquid introduction chamber 12 to the storage chamber 16.
  • the rotation of the flow path chip 1 is continued until all the oil 71 is discharged from the liquid introduction chamber 12.
  • the first heater surface 31a and the second heater surface 32a are heated, the first heater surface 31a is set to the first temperature, and the second heater surface 32a is set to the second temperature.
  • the first heater surface 31a (first temperature) is set to a temperature selected from the range of 90 ° C. to 98 ° C.
  • the second heater surface 32a (second temperature) is 50 ° C. to 70 ° C. It is set to a temperature selected from the range of °C or less.
  • the PCR solution 91 is introduced into the liquid introduction chamber 12 as shown in FIG. 9 (step S605).
  • a pipetter 92 is typically used for introducing the PCR solution 91.
  • the rotation drive mechanism 3 rotates the flow path chip 1 in the rotation direction RD about the rotation axis AX (rotation center X) (step S606).
  • the PCR solution 91 flows through the introduction channel 13 and becomes a droplet 91 a at the end portion of the introduction channel 13.
  • the droplet 91 a is supplied to the meandering channel 15 via the droplet supply chamber 14 filled with the oil 71, moves in the meandering channel 15 filled with the oil 71, and is accommodated in the accommodation chamber 16.
  • the interface between the oil 71 and the PCR solution 91 is between the oil 71 (oil phase) and the PCR solution 91 (water phase).
  • a pressure difference due to the density difference occurs.
  • a droplet 91a is generated.
  • a pressure based on centrifugal force is applied to the oil 71 and the PCR solution 91. Therefore, the gene amplification system 100 and the gene amplification method according to the present embodiment generate the droplet 91a by the centrifugal field.
  • the droplet 91a moving through the meandering channel 15 is heated by the first heater surface 31a and then cooled by the second heater surface 32a.
  • ddPCR one cycle of PCR
  • the first heater surface 31a heats the droplet 91a
  • the double-stranded DNA contained in the droplet 91a is separated and single-stranded DNA is generated.
  • the second heater surface 32a cools the droplet 91a.
  • the primer binds to the amplification target DNA molecule in the single-stranded DNA.
  • dNTP binds to the primer by DNA polymerase, and a DNA strand extends from the primer to generate double-stranded DNA.
  • the rotation of the channel chip 1 is continued until a desired amount of the PCR solution 91 is discharged from the liquid introduction chamber 12.
  • the flow path chip 1 is removed from the rotation drive mechanism 3 and moved to the fluorescence detection field as shown in FIG. 11 (step S607).
  • the fluorescence detection field the presence or absence of amplified DNA molecules in each droplet 91a is determined by detecting fluorescence. By counting the number of droplets 91a containing DNA, it is possible to measure the absolute quantification of the DNA (or nucleic acid such as RNA) that is statistically likely to be detected.
  • the excitation light emitted from the excitation light source is applied to the accommodation chamber 16.
  • the excitation light excites the fluorescent dye.
  • the excited fluorescent dye emits fluorescence.
  • the emitted fluorescence is detected by a fluorescence detector. Since the droplet 91a that emits fluorescence contains DNA and the droplet 91a that does not emit fluorescence does not contain DNA, the presence or absence of DNA in each droplet 91a can be determined.
  • the excitation light source can be, for example, a laser light source or a light emitting diode (LED).
  • the fluorescence detector includes, for example, a photomultiplier detector, a condenser lens, and a fluorescence filter.
  • Fluorescence detection methods include intercalator method and hybridization method.
  • intercalator method a fluorescent dye (SYBR green I) that specifically inserts into double-stranded DNA and emits fluorescence is used.
  • the PCR solution 91 to which a fluorescent dye is added is used.
  • the TagMan probe method is the most common hybridization method, and a probe DNA in which a fluorescent dye is bound to an oligonucleotide specific to the DNA sequence is used.
  • the PCR solution 91 to which the probe DNA is added is used.
  • the fluorescent dye used in the TagMan probe method can be, for example, FAM (Carboxyfluorescein).
  • the reverse transcription process is performed before the PCR step.
  • the PCR solution may be prepared after the reverse transcription process is performed on the sample liquid.
  • a reverse transcription process may be included in the PCR step.
  • FIG. 12 is an enlarged schematic view showing a part of the meandering flow path 15.
  • the meandering flow path 15 includes a first inclined flow path 15a and a second inclined flow path 15b.
  • the first inclined channel 15a extends to one side of the substrate 11 in the width direction WD and is connected (communicated) to one end of the second inclined channel 15b.
  • the second inclined channel 15b extends to the other side in the width direction WD of the substrate 11 and is connected (communicated) to the other end of the first inclined channel 15a.
  • the first inclined channel 15 a and the second inclined channel 15 b are inclined with respect to the longitudinal direction LD of the substrate 11. In other words, the first inclined channel 15a and the second inclined channel 15b are inclined with respect to the radial direction orthogonal to the rotation axis AX.
  • the first inclined channel 15a and the second inclined channel 15b are alternately arranged along the longitudinal direction LD (radial direction).
  • the buoyancy F toward the rotation axis AX (rotation center X) with respect to the droplet 91a is caused by centrifugal force. Is granted. Since the first inclined flow path 15a and the second inclined flow path 15b are inclined with respect to the radial direction, the droplet 91a has a meandering flow path 15 (first inclined flow path 15a and It moves toward the rotation axis AX (rotation center X) along the second inclined flow path 15b).
  • the magnitude of the buoyancy F depends on the rotational speed (rotational speed) of the drive device 50 described with reference to FIG. Specifically, the greater the number of revolutions, the greater the buoyancy F and the faster the moving speed of the droplet 91a. Therefore, the moving speed of the droplet 91a can be controlled by controlling the rotation speed of the driving device 50. Therefore, by increasing the number of rotations, it is possible to speed up heat exchange with respect to the droplet 91a, that is, speed up PCR (ddPCR). However, depending on the channel lengths of the first inclined channel 15a and the second inclined channel 15b, if the moving speed of the droplet 91a becomes too fast, appropriate heat exchange may not be performed and PCR may not be performed. is there. Therefore, it is preferable to determine the rotation speed of the drive device 50 according to the flow path lengths of the first inclined flow path 15a and the second inclined flow path 15b.
  • FIG. 13 is an enlarged view showing a part of the meandering flow path 15.
  • the first inclined channel 15 a and the second inclined channel 15 b have an inclination of an angle ⁇ with respect to the longitudinal direction LD of the substrate 11.
  • the angle ⁇ is larger than 0 °
  • the droplet 91a moves in the meandering flow path 15 using the buoyancy F described with reference to FIG.
  • the angle ⁇ and the length L2 of the meandering channel 15 in the width direction WD of the substrate 11 are not particularly limited as long as the PCR heating step and the cooling step can be performed.
  • the angle ⁇ can be selected from a range of 10 ° or less.
  • the length L2 of the meandering channel 15 can be selected from a range of 1 mm or more and 20 mm or less.
  • FIG. 14A is an enlarged view showing a part of the substrate 11. Specifically, FIG. 14A shows an enlarged view of the vicinity of the second introduction flow path 13b.
  • FIG. 14B is a cross-sectional view taken along line XIVB-XIVB shown in FIG.
  • the substrate 11 further includes a terrace structure 19.
  • the introduction flow path 13 includes a terrace portion 13c.
  • the terrace portion 13 c is formed between the end of the second introduction flow path 13 b and the droplet supply chamber 14.
  • the terrace structure 19 includes a second introduction flow path 13b (straight line portion) and a terrace portion 13c.
  • the width W2 of the terrace portion 13c along the width direction WD of the substrate 11 is larger than the flow path width W1 of the second introduction flow path 13b.
  • the channel width of the terminal portion of the second introduction channel 13b is expanded by the terrace portion 13c.
  • the depth of the terrace portion 13c is equal to the depth h1 of the second introduction channel 13b, and is shallower than the depth h2 of the droplet supply chamber 14.
  • each part of the terrace structure 19 are not particularly limited as long as the droplet 91a can be generated.
  • the width W2 of the terrace portion 13c can be 100 ⁇ m.
  • the terrace length L3 of the terrace portion 13c along the longitudinal direction LD of the substrate 11 may be 30 ⁇ m.
  • the depth h2 of the droplet supply chamber 14 is 100 ⁇ m
  • the depth h1 of the second introduction flow path 13b and the terrace portion 13c may be 30 ⁇ m.
  • the diameter of the droplet 91a can be controlled by the dimensions of each part of the terrace structure 19. Typically, the diameter of the droplet 91a is not less than 10 ⁇ m and not more than 300 ⁇ m.
  • the channel width W1 of the second introduction channel 13b is 30 ⁇ m
  • the width W2 of the terrace portion 13c is 100 ⁇ m
  • the terrace length L3 is 30 ⁇ m
  • the depth h1 of the second introduction channel 13b and the terrace portion 13c Is 30 ⁇ m, a droplet 91a having a diameter of about 95 ⁇ m is generated.
  • FIGS. 15 to 20 are views showing a part of the introduction flow path 13, the droplet supply chamber 14, and a part of the meandering flow path 15. Specifically, FIGS. 15 to 20 show the state in which the droplet 91a is supplied from the droplet supply chamber 14 to the meandering flow path 15 in time series.
  • the speed at which the droplet 91a moves through the droplet supply chamber 14 is faster than the speed at which the droplet 91a moves through the meandering channel 15. This is because the droplet 91 a moves in the direction of the buoyancy F in the droplet supply chamber 14.
  • the droplet supply chamber 14 has a shape whose width becomes narrower toward the start end of the meandering flow path 15. With this shape, the droplet 91a can be supplied to the meandering channel 15 more smoothly. More preferably, the width of the droplet supply chamber 14 is narrowed along the direction of the buoyancy F. By narrowing the width of the droplet supply chamber 14 along the direction of the buoyancy F, the droplet 91a can be guided more smoothly toward the starting end of the meandering channel 15.
  • the shape for guiding the droplet 91a to the meandering channel 15 is not limited to a triangle.
  • the droplet supply chamber 14 may include an arc shape (a part of the circumferential surface) whose width becomes narrower toward the starting end of the meandering flow path 15.
  • the droplet 91a reciprocates between the heating field (first heater surface 31a) and the cooling field (second heater surface 32a) using the buoyancy F as a driving force. Therefore, ddPCR can be performed more rapidly than the configuration in which the temperature of the temperature control field is transitioned between two temperatures.
  • the moving speed of the droplet 91a can be controlled by controlling the rotation speed. Therefore, ddPCR can be performed more quickly by controlling the number of rotations and increasing the moving speed of the droplet 91a. Furthermore, by controlling the rotation speed, it is possible to control the time during which the droplet 91a moves through the heating field and the time during which the droplet 91a moves through the cooling field. Therefore, ddPCR can be performed reliably.
  • the droplet 91a moves in the meandering flow path 15 using the buoyancy F as a driving force. Therefore, it is not necessary to feed the oil phase (oil 71). As a result, the amount of oil phase (oil 71) used can be reduced. Therefore, the running cost can be reduced. Furthermore, since a solution driving unit such as a micropump is not required, the gene amplification system 100 (ddPCR system) can be downsized.
  • the droplet 91a is surrounded by the oil 71, the adsorption of the droplet 91a to the channel wall surface can be suppressed. Therefore, sample loss can be reduced and efficiency can be increased.
  • the generation of the droplet 91a in the centrifugal field and the PCR in the temperature control field can be achieved by one apparatus (rotation drive mechanism 3). Therefore, ddPCR can be performed simply by dripping the oil 71 and the PCR solution 91 onto the flow path chip 1 and the rotation drive mechanism 3 rotating the flow path chip 1. Can do.
  • the generation of the droplet 91a and the PCR can be performed within one chip. Therefore, ddPCR can be performed more simply and rapidly.
  • the PCR solution 91 is introduced into the liquid introduction chamber 12 after the temperatures of the first heater surface 31 a and the second heater surface 32 a are set, but the PCR solution 91 is introduced into the liquid introduction chamber 12. After that, the temperature of the first heater surface 31a and the second heater surface 32a may be set.
  • the channel chip 1 is rotated in the clockwise direction, but the channel chip 1 may be rotated in the counterclockwise direction.
  • the rotation drive mechanism 3 includes four sets (temperature control fields) of the first heater surface 31a and the second heater surface 32a, but the present invention is not limited to this form.
  • the rotational drive mechanism 3 may include one, two, or three pairs of the first heater surface 31a and the second heater surface 32a, or five pairs of the first heater surface 31a and the second heater surface 32a. You may have more than one.
  • the introduction channel 13 of the channel chip 1 may include a meandering channel 13d as shown in FIG.
  • FIG. 21 is a plan view of a channel chip 1 according to another embodiment of the present invention.
  • the introduction flow channel 13 includes a meandering flow channel 13d.
  • the meandering flow path 13 d is formed between the liquid introduction chamber 12 and the droplet supply chamber 14. More specifically, the meandering flow path 13d is formed in the first introduction flow path 13a.
  • the heater stage 30 has two heater surfaces (the first heater surface 31a and the second heater surface 32a), and the meandering channel 15 is disposed across the two heater surfaces.
  • the heater stage 30 may have three or more heater surfaces. Three or more heater surfaces are set to different temperatures.
  • the meandering channel 15 is disposed across three or more heater surfaces. Since the heater stage 30 has three or more heater surfaces, the temperature gradient of the temperature control field can be controlled more freely.
  • Example 1 First, the flow channel chip 1 used in Example 1 will be described.
  • the flow channel chip 1 shown in FIG. 1 was used.
  • the substrate 11 was made of silicone rubber.
  • the depths of the liquid introduction chamber 12, the droplet supply chamber 14, and the storage chamber 16 were 100 ⁇ m.
  • the channel width and depth of the first introduction channel 13a were both 100 ⁇ m.
  • the terrace structure 19 described with reference to FIGS. 14A and 14B the flow path width W1 of the second introduction flow path 13b is 30 ⁇ m, the width W2 of the terrace portion 13c is 100 ⁇ m, and the terrace length L3 is 30 ⁇ m, the depth h1 of the second introduction flow path 13b and the terrace portion 13c was 30 ⁇ m.
  • the length L1 of the meandering flow path 15 along the longitudinal direction LD of the substrate 11 was 20 mm.
  • the length L2 of the meandering channel 15 along the width direction WD of the substrate 11 was 3.5 mm.
  • the channel width and depth of the meandering channel 15 were both 100 ⁇ m.
  • the angle ⁇ at which the first inclined channel 15a and the second inclined channel 15b are inclined with respect to the radial direction (longitudinal direction LD) was 4 °.
  • Example 1 fluorine oil was used as the oil 71. Further, instead of the PCR solution 91 (aqueous phase), water colored in red was used.
  • the channel chip 1 was rotated around the rotation axis AX at a rotation speed of 440 rpm.
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of Example 1.
  • FIG. 22 was obtained by imaging the meandering flow path 15 with a high speed camera. As shown in FIG. 22, it was confirmed that the droplet S was generated by rotating the flow channel chip 1 around the rotation axis AX. Further, it was confirmed that the droplet S moved along the meandering channel 15 toward the rotation axis AX, and the meandering channel 15 was filled with the droplet S. In Example 1, a droplet S having a diameter of about 95 ⁇ m was generated.
  • Example 2 to 4 the moving speed of the droplet S was measured using the channel chip 1 having the same configuration as that of Example 1.
  • fluorine oil was used as the oil 71.
  • PCR solution 91 aqueous phase
  • water colored in red was used instead of the PCR solution 91 (aqueous phase).
  • Example 2 the channel chip 1 was rotated around the rotation axis AX at a rotation speed of 440 rpm as in Example 1.
  • Example 3 the flow channel chip 1 was rotated around the rotation axis AX at a rotation speed of 1000 rpm.
  • Example 4 the flow channel chip 1 was rotated around the rotation axis AX at a rotation speed of 1320 rpm.
  • a droplet S having a diameter of about 95 ⁇ m was also generated.
  • FIG. 23A and FIG. 23B are diagrams illustrating the movement of the droplet S according to the second embodiment.
  • FIG. 23A and FIG. 23B were obtained by imaging the meandering flow path 15 with a high-speed camera.
  • FIG. 23B shows the meandering flow path 15 when 30 seconds have elapsed from the time when FIG. 23A was imaged.
  • the arrow indicates the distance that the droplet S has moved in 30 seconds.
  • FIGS. 24A and 24B are diagrams illustrating movement of the droplet S according to the third embodiment.
  • 24A and 24B are obtained by imaging the meandering flow path 15 with a high-speed camera.
  • FIG. 24B shows the meandering flow path 15 when 30 seconds have elapsed from the time when FIG. 24A was imaged.
  • the arrow indicates the distance that the droplet S has moved in 30 seconds.
  • FIG. 25A and FIG. 25B are diagrams illustrating the movement of the droplet S according to the fourth embodiment.
  • FIG. 25A and FIG. 25B were obtained by imaging the meandering flow path 15 with a high speed camera.
  • FIG. 25B shows the meandering flow path 15 when 30 seconds have elapsed from the time when the image of FIG. In FIG. 25B, the arrow indicates the distance that the droplet S has moved in 30 seconds.
  • the moving distance of the droplet S increases as the rotational speed rpm increases.
  • FIG. 26 is a graph showing the relationship between the rotational speed and the moving speed of the droplet S.
  • the horizontal axis indicates the rotational speed
  • the vertical axis indicates the moving speed of the droplet S.
  • the graph shown in FIG. 26 is created by plotting the moving speed of the droplet S acquired from the imaging results shown in FIGS. 23 (a) and 23 (b) to FIG. 25 (a) and FIG. 25 (b). As shown in FIG. 26, it was confirmed that the moving speed of the droplet S increased as the rotational speed rpm increased.
  • FIG. 27 is a graph showing the relationship between the rotation speed and the time required to complete one cycle of PCR.
  • the horizontal axis indicates the rotation speed.
  • the vertical axis indicates the time required to complete one cycle of PCR.
  • the time required to complete one cycle of PCR indicates the time required for the droplet S to reciprocate once through the meandering channel 15.
  • the time required for the droplet S to make one round trip through the meandering channel 15 is the liquid obtained from the imaging results shown in FIGS. 23 (a) and 23 (b) to 25 (a) and 25 (b). It calculated
  • Example 5 and Comparative Example The channel chip 1 used in Example 5 and the comparative example has the same configuration as that of Example 1 except that it includes six types of thermo seals A to F. Specifically, the thermo seals A to F are embedded in the substrate 11 so as to face the meandering flow path 15. Specifically, the thermo seals A to C are opposed to one end of the meandering flow path 15 in the width direction WD of the substrate 11. In other words, the thermo seals A to C are embedded in the substrate 11 so as to face the first heater surface 31a.
  • the color of the thermo seal A becomes green at a temperature of 100 ° C.
  • the color of the thermo seal B becomes green at a temperature of 95 ° C.
  • the color of the thermo seal C becomes green at a temperature of 90 ° C.
  • thermo seals D to F face the other end of the meandering flow path 15 in the width direction WD of the substrate 11.
  • the thermo seals D to F are embedded in the substrate 11 so as to face the second heater surface 32a.
  • the color of the thermo seal D becomes green at a temperature of 65 ° C.
  • the color of the thermo seal E becomes green at a temperature of 60 ° C.
  • the color of the thermo seal F becomes green at a temperature of 55 ° C.
  • Example 5 ddPCR was performed using PCR-6 as a target, using a PCR solution containing genomic DNA of drug-resistant bacteria (IMP-6 positive). In addition, fluorescence was detected after the ddPCR step.
  • the ddPCR step was performed using a solution to which no DNA was added. The solution used in the comparative example contains the same components as in Example 5 except that no DNA was added. Also in the comparative example, fluorescence was detected after the end of the ddPCR step.
  • Example 5 the flow path chip 1 was rotated around the rotation axis AX at a rotation speed of 800 rpm using fluorine oil.
  • the color of the thermo seal B is green
  • the color of the thermo seal E is green. Therefore, it was confirmed that the temperature (first temperature) of the first heater surface 31a can be controlled to about 95 ° C. Moreover, it has confirmed that the temperature (2nd temperature) of the 2nd heater surface 32a was controllable to about 60 degreeC.
  • FIG. 28 (a) is a diagram showing a fluorescence detection result according to Example 5.
  • FIG. 28B is a diagram showing a fluorescence detection result according to the comparative example.
  • the droplet containing the drug-resistant bacterial genomic DNA (Example 5) is associated with DNA amplification compared to the droplet not containing DNA (Comparative Example). Strong fluorescence was observed (detected). Therefore, it was confirmed that ddPCR can be performed by the gene amplification system described in the embodiment.
  • ddPCR can be performed more rapidly, which is useful for a system for measuring absolute quantification of genes.

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Abstract

遺伝子増幅システム（１００）は、流路チップ（１）と、回転駆動機構（３）とを備える。流路チップ（１）は、一方側及び他方側へ蛇行する蛇行流路（１５）を有する。回転駆動機構（３）は、回転軸まわりに流路チップ（１）を回転させる。回転駆動機構（３）は、流路チップ（１）を回転させて、蛇行流路（１５）内の液滴（９１ａ）に浮力を付与することにより、液滴（９１ａ）を蛇行流路（１５）に沿って移動させる。回転駆動機構（３）は、ヒーターステージ（３０）を含む。ヒーターステージ（３０）は、複数のヒーター面（３１ａ、３２ａ）を有する。複数のヒーター面（３１、３２ａ）は、互いに異なる温度に設定される。回転駆動機構（３）は、蛇行流路（１５）が複数のヒーター面（３１ａ、３２ａ）に跨って配置されるように、流路チップ（１）を保持する。

Description

遺伝子増幅システム、流路チップ、回転駆動機構、及び遺伝子増幅方法
　本発明は、遺伝子増幅システム、流路チップ、回転駆動機構、及び遺伝子増幅方法に関する。
　遺伝子（又は核酸）を増幅させるシステムとして、デジタルドロップレットＰＣＲ（以下、「ｄｄＰＣＲ」と記載する）システムが知られている。ｄｄＰＣＲシステムは、オイルに囲まれた液滴（微小区画）内でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ分子の増幅を行うシステムである。ｄｄＰＣＲによれば、ＰＣＲステップ終了後に、各液滴内の増幅されたＤＮＡ分子の有無を判定し、ＤＮＡを含む液滴の数をカウントすることによって、統計的に確からしい検出対象のＤＮＡ（又はＲＮＡなどの核酸）の絶対定量を測定することが可能となる。なお、増幅されたＤＮＡ分子の有無の判定は、蛍光の検出によって行われる。
　オイルに囲まれた液滴は、マイクロ流路を用いて作製される。例えば、非特許文献１には、マイクロ流路を回転させ、遠心場で液滴を作製する手法が開示されている。なお、マイクロ流路は、マイクロメートルオーダーの幅及び深さ（高さ）を有する流路である。具体的には、マイクロ流路は、１μｍ以上１ｍｍ未満の幅及び深さを有する。
Friedrich Schuler et al., 「Digital droplet PCR on disk」, Lab Chip, 2016, 16, 208-216
　しかしながら、一般的なｄｄＰＣＲシステムは、反応系全体の温度を制御する。このため、ＰＣＲの１サイクルを完了するために７５秒以上の時間が必要となる。更に、一般的なｄｄＰＣＲシステムは、液滴の作製を完了した後にＰＣＲステップを実行する。この結果、ＰＣＲの全サイクルを終了するために、２時間から３時間かかる。なお、ＰＣＲの１サイクルは、２つのステップを含む。具体的には、ＰＣＲの１サイクルは、加熱ステップと、冷却ステップとを含む。加熱ステップでは、ＰＣＲ溶液が加熱される。冷却ステップでは、加熱後のＰＣＲ溶液が冷却される。
　本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、より迅速にｄｄＰＣＲを行うことができる遺伝子増幅システム、及び遺伝子増幅方法を提供することにある。また、本発明の他の目的は、遺伝子増幅システムに用いることが可能な流路チップ、及び回転駆動機構を提供することにある。
　本発明の遺伝子増幅システムは、流路チップと、回転駆動機構とを備える。前記流路チップは、蛇行流路を有する。前記蛇行流路は、一方側及び他方側へ蛇行する。前記回転駆動機構は、回転軸を有し、前記回転軸まわりに前記流路チップを回転させる。前記回転駆動機構は、前記流路チップを回転させて、前記蛇行流路内の液滴に浮力を付与することにより、前記液滴を前記蛇行流路に沿って移動させる。前記回転駆動機構は、ヒーターステージと、駆動装置とを含む。前記ヒーターステージは、互いに異なる温度に設定される複数のヒーター面を有する。前記駆動装置は、前記回転軸まわりに前記ヒーターステージを回転させる。前記回転駆動機構は、前記蛇行流路が前記複数のヒーター面に跨って配置されるように、前記流路チップを保持する。
　ある実施形態において、前記複数のヒーター面は、第１ヒーター面と、第２ヒーター面とを有する。前記第１ヒーター面は、第１温度に設定される。前記第２ヒーター面は、前記第１温度とは異なる第２温度に設定される。
　ある実施形態において、前記回転駆動機構は、前記蛇行流路の前記一方側の端部が前記第１ヒーター面に対向するとともに、前記蛇行流路の前記他方側の端部が前記第２ヒーター面に対向するように、前記流路チップを保持する。
　ある実施形態において、前記蛇行流路は、第１傾斜流路と、第２傾斜流路とを含む。前記第１傾斜流路は、前記一方側へ延びる。前記第２傾斜流路は、前記他方側へ延びる。
　ある実施形態において、前記第１傾斜流路及び前記第２傾斜流路は、前記回転軸に直交する径方向に対して傾斜する。
　ある実施形態において、前記蛇行流路は、複数の前記第１傾斜流路と、複数の前記第２傾斜流路とを含む。
　ある実施形態において、前記第１傾斜流路と前記第２傾斜流路とは、前記径方向に沿って交互に配置される。
　ある実施形態において、前記流路チップは、液滴供給室を更に有する。前記液滴供給室は、前記蛇行流路の始端に前記液滴を供給する。
　ある実施形態において、前記液滴供給室は、前記蛇行流路の始端に向かって幅が狭くなる形状を有する。
　ある実施形態において、前記液滴供給室は三角形状を有する。
　ある実施形態において、前記液滴供給室の三角形状の頂部が、前記蛇行流路の始端に接続する。
　ある実施形態において、前記流路チップは、液体導入室と、導入流路とを更に有する。前記液体導入室には、液体が導入される。前記導入流路は、前記液体導入室と前記蛇行流路とに連通する。
　ある実施形態において、前記導入流路はその中間部に蛇行流路を含む。
　本発明の流路チップは、蛇行流路を備える。前記蛇行流路は、一方側及び他方側へ蛇行する。回転軸まわりに前記流路チップを回転させた場合に、前記蛇行流路内の液滴に浮力が付与されて、前記液滴が前記蛇行流路に沿って移動する。
　本発明の回転駆動機構は、流路チップを回転軸まわりに回転させる。前記流路チップは、蛇行流路を有する。前記蛇行流路は、一方側及び他方側へ蛇行する。前記回転駆動機構は、ヒーターステージと、駆動装置とを備える。前記ヒーターステージは、互いに異なる温度に設定される複数のヒーター面を有する。前記駆動装置は、前記回転軸まわりに前記ヒーターステージを回転させる。前記回転駆動機構は、前記蛇行流路が前記複数のヒーター面に跨って配置されるように、前記流路チップを保持する。
　ある実施形態において、前記複数のヒーター面は、第１ヒーター面と、第２ヒーター面とを有する。前記第１ヒーター面は、第１温度に設定される。前記第２ヒーター面は、前記第１温度とは異なる第２温度に設定される。
　ある実施形態において、前記回転駆動機構は、前記蛇行流路の前記一方側の端部が前記第１ヒーター面に対向するとともに、前記蛇行流路の前記他方側の端部が前記第２ヒーター面に対向するように、前記流路チップを保持する。
　ある実施形態において、前記第１ヒーター面は、前記回転軸に直交する径方向に沿って延びる。
　ある実施形態において、前記第２ヒーター面は、前記第１ヒーター面に並んで配置されて、前記径方向に沿って延びる。
　本発明の遺伝子増幅方法は、流路チップを用いて遺伝子を増幅する方法である。前記流路チップは、蛇行流路と、液体導入室とを有する。前記蛇行流路は、一方側及び他方側に蛇行する。前記液体導入室は、前記蛇行流路に連通する。前記遺伝子増幅方法は、前記蛇行流路が複数のヒーター面に跨って配置されるように、前記流路チップをヒーターステージに対して保持する工程と、前記複数のヒーター面を互いに異なる温度に設定する工程と、前記液体導入室に、ポリメラーゼ連鎖反応溶液を導入する工程と、回転軸まわりに前記ヒーターステージを回転させて、前記蛇行流路内の液滴に浮力を付与することにより、前記液滴を前記蛇行流路に沿って移動させる工程とを包含する。
　ある実施形態では、前記流路チップをヒーターステージに対して保持する工程において、前記蛇行流路の前記一方側の端部が第１ヒーター面に対向するとともに、前記蛇行流路の前記他方側の端部が第２ヒーター面に対向するように、前記流路チップをヒーターステージに対して保持する。また、前記複数のヒーター面を互いに異なる温度に設定する工程において、前記１ヒーター面を第１温度に設定し、かつ前記第２ヒーター面を、前記第１温度とは異なる第２温度に設定する。
　本発明によれば、より迅速にｄｄＰＣＲを行うことが可能となる。
本発明の実施形態に係る流路チップの平面図である。 本発明の実施形態に係る流路チップの正面図である。 本発明の実施形態に係る流路チップの一部を拡大して示す図である。 本発明の実施形態に係る回転駆動機構の構成を示す図である。 本発明の実施形態に係る遺伝子増幅システムの一部を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る遺伝子増幅方法を示すフローチャートである。 本発明の実施形態に係る遺伝子増幅システムを用いた遺伝子増幅方法を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る遺伝子増幅システムを用いた遺伝子増幅方法を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る遺伝子増幅システムを用いた遺伝子増幅方法を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る遺伝子増幅システムを用いた遺伝子増幅方法を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る遺伝子増幅システムを用いた遺伝子増幅方法を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る蛇行流路の一部を拡大して示す模式図である。 本発明の実施形態に係る蛇行流路の一部を拡大して示す図である。 （ａ）は、本発明の実施形態に係る基板の一部を拡大して示す図である。（ｂ）は、図１４（ａ）に示すＸＩＶＢ－ＸＩＶＢ線に沿った断面図である。 本発明の実施形態に係る導入流路の一部、液滴供給室、及び蛇行流路の一部を示す図である。 本発明の実施形態に係る導入流路の一部、液滴供給室、及び蛇行流路の一部を示す図である。 本発明の実施形態に係る導入流路の一部、液滴供給室、及び蛇行流路の一部を示す図である。 本発明の実施形態に係る導入流路の一部、液滴供給室、及び蛇行流路の一部を示す図である。 本発明の実施形態に係る導入流路の一部、液滴供給室、及び蛇行流路の一部を示す図である。 本発明の実施形態に係る導入流路の一部、液滴供給室、及び蛇行流路の一部を示す図である。 本発明の他の実施形態に係る流路チップの平面図である。 本発明の実施例１の結果を示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は、本発明の実施例２に係る液滴の移動を示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は、本発明の実施例３に係る液滴の移動を示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は、本発明の実施例４に係る液滴の移動を示す図である。 本発明の実施例２～４に係る回転速度と液滴の移動速度との関係を示すグラフである。 本発明の実施例２～４に係る回転速度とＰＣＲの１サイクルを完了するために必要な時間との関係を示すグラフである。 （ａ）は、実施例５に係る蛍光の検出結果を示す図である。（ｂ）は、比較例に係る蛍光の検出結果を示す図である。
　以下、図面を参照して本発明の実施形態を説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されない。図中、同一又は相当部分については同一の参照符号を付して説明を繰り返さない。
　まず図１を参照して、本実施形態に係る流路チップ１について説明する。図１は、流路チップ１の平面図である。流路チップ１は、基板１１を備える。基板１１は、液体導入室１２と、導入流路１３と、液滴供給室１４と、蛇行流路１５と、収容室１６とを含む。
　導入流路１３及び蛇行流路１５は、典型的にはマイクロ流路である。但し、導入流路１３及び蛇行流路１５は、マイクロ流路に限定されない。導入流路１３及び蛇行流路１５は、例えば、１ｍｍの流路幅と１ｍｍの深さ（高さ）とを有し得る。
　液体導入室１２等（液体導入室１２、導入流路１３、液滴供給室１４、蛇行流路１５、及び収容室１６）は、例えば微細加工技術によって基板１１に形成される。例えば、液体導入室１２等は、ソフトリソグラフィーによって形成され得る。ソフトリソグラフィーは、シリコーンゴムのような比較的柔らかい素材を成型する技術である。あるいは、液体導入室１２等は、フォトリソグラフィーとドライプロセス（ドライエッチング）又はウェットプロセス（ウェットエッチング）とによって形成され得る。あるいは、液体導入室１２等は、射出成型、又は切削加工によって形成され得る。
　基板１１の形状及びサイズは、液体導入室１２等を形成することが可能である限り、特に限定されない。本実施形態において、基板１１は、長方形の形状を有する。また、基板１１の長手方向ＬＤの長さは、例えば７０ｍｍであり、基板１１の長手方向ＬＤに直交する幅方向ＷＤの長さは、例えば５０ｍｍである。
　基板１１の材料は、液体導入室１２等を形成することが可能である限り、特に限定されないが、ＰＣＲを阻害しない材料であることが好ましい。また、基板１１の材料は、蛍光の観察（検出）を阻害しない材料であることが好ましい。例えば、基板１１は、シリコーンゴム、ガラス、シクロオレフィンポリマー（Ｃｙｃｌｏ－ｏｌｅｆｉｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒ；ＣＯＰ）、又はポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ；ＰＣ）によって構成され得る。
　液体導入室１２は、基板１１の長手方向ＬＤの一方側の端部に形成される。なお、図１において、基板１１の長手方向ＬＤの一方側は上側であり、基板１１の長手方向ＬＤの他方側は下側である。
　液体導入室１２には、液体が導入される。具体的には、液体導入室１２は入口（開口）を有し、入口を介して液体導入室１２内に液体が導入される。入口は、液体導入室１２の天井部に形成される。本実施形態において、液体は、フッ素オイルのようなオイル、及びＰＣＲ溶液である。具体的には、オイルが導入された後に、ＰＣＲ溶液が導入される。より詳しくは、導入流路１３、液滴供給室１４、及び蛇行流路１５がオイルによって充填され、収容室１６にオイルが供給された後に、ＰＣＲ溶液が導入される。
　ＰＣＲ溶液は、典型的には、検体液と、プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、増幅対象ＤＮＡ分子（ターゲットシーケンス）と、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）と、バッファー溶液とを含む。また、ＰＣＲ溶液は、蛍光色素又はプローブＤＮＡを含み得る。検体液は、ＤＮＡを含み、ＤＮＡは増幅対象ＤＮＡ分子を有する。検体液は、例えば、インフルエンザウィルス、ノロウィルス、その他の感染症ウィルスを含む混濁液である。あるいは、検体液は、薬剤耐性菌、腸管出血性大腸菌、その他の感染症細菌を含む混濁液である。あるいは、検体液は、微生物又は動物細胞を含む混濁液である。あるいは、検体液は、インフルエンザウィルス、ノロウィルス、その他の感染症ウィルスのＤＮＡ又はＲＮＡの抽出液である。あるいは、検体液は、薬剤耐性菌、腸管出血性大腸菌、その他の感染症細菌のＤＮＡ又はＲＮＡの抽出液である。あるいは、検体液は、微生物、又は動物細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの抽出液である。なお、検出対象がＲＮＡである場合、検体液に対して逆転写プロセスを実行した後にＰＣＲ溶液を調製してもよい。あるいは、逆転写プロセスをＰＣＲステップに含めてもよい。逆転写プロセスは、逆転写酵素によってＲＮＡに対する相補ＤＮＡを合成する処理である。
　液体導入室１２の深さ（高さ）は特に限定されない。例えば、液体導入室１２は、１０μｍ以上１ｍｍ以下の範囲から選択された深さを有し得る。液体導入室１２の容積は、導入流路１３の容積と、液滴供給室１４の容積と、蛇行流路１５の容積との合計値よりも大きいことが好ましい。この条件によって、導入流路１３、液滴供給室１４、及び蛇行流路１５をオイルによって充填し、収容室１６にオイルを供給することが可能となる。
　導入流路１３は、液体導入室１２と液滴供給室１４とを連通させる。換言すると、導入流路１３の始端が液体導入室１２と接続（連通）し、導入流路１３の終端が液滴供給室１４と接続（連通）する。導入流路１３は、第１導入流路１３ａと、第２導入流路１３ｂとを含む。
　第１導入流路１３ａは、導入流路１３の始端を含む。第１導入流路１３ａは、液体導入室１２から、基板１１の長手方向ＬＤの他方側の端部まで延びた後、基板１１の幅方向ＷＤへ延びる。第１導入流路１３ａの流路幅及び深さは特に限定されない。例えば、第１導入流路１３ａは、１０μｍ以上１ｍｍ以下の範囲から選択された流路幅及び深さを有し得る。
　第２導入流路１３ｂは、導入流路１３の終端を含む。第２導入流路１３ｂは、第１導入流路１３ａの終端から、基板１１の長手方向ＬＤへ延びて、液滴供給室１４に接続する。第２導入流路１３ｂの流路幅及び深さは、第１導入流路１３ａの流路幅及び深さと同じであってもよく、異なっていてもよい。例えば、第２導入流路１３ｂは、１０μｍ以上１ｍｍ以下の範囲から選択された流路幅を有し得る。典型的には、第２導入流路１３ｂは、第１導入流路１３ａよりも狭い流路幅を有する。また、第２導入流路１３ｂは、１０μｍ以上１ｍｍ以下の範囲から選択された深さを有し得る。典型的には、第２導入流路１３ｂは、液滴供給室１４よりも浅い深さを有する。
　液滴供給室１４は、基板１１の長手方向ＬＤの他方側の端部に形成される。液滴供給室１４は、蛇行流路１５の始端に連通（接続）する。液滴供給室１４は、導入流路１３の終端部（導入流路１３と液滴供給室１４との界面付近）において発生するＰＣＲ溶液の液滴を、蛇行流路１５に供給する。ＰＣＲ溶液の液滴は、液滴供給室１４がオイルで充填されている状態において発生する。
　液滴供給室１４の形状は特に限定されないが、ＰＣＲ溶液の液滴を蛇行流路１５に誘導する形状を含むことが好ましい。本実施形態において、液滴供給室１４の蛇行流路１５側の形状は三角形であり、三角形の頂部が蛇行流路１５の始端に接続する。この形状により、ＰＣＲ溶液の液滴を蛇行流路１５に誘導することができる。液滴供給室１４の深さは特に限定されない。例えば、液滴供給室１４は、１０μｍ以上１ｍｍ以下の範囲から選択された深さを有し得る。典型的には、液滴供給室１４は、第２導入流路１３ｂよりも深い深さを有する。
　蛇行流路１５は、基板１１の幅方向ＷＤに蛇行しながら、基板１１の長手方向ＬＤの一方側へ延びる。蛇行流路１５の終端は、収容室１６に連通（接続）する。本実施形態において、蛇行流路１５は、基板１１の長手方向ＬＤの他方側の端部に形成される。蛇行流路１５の流路幅及び深さは、ＰＣＲ溶液の液滴が蛇行流路１５を通過できる限り、特に限定されない。例えば、蛇行流路１５は、１０μｍ以上１ｍｍ以下の範囲から選択された流路幅及び深さを有し得る。
　収容室１６は、液体導入室１２と蛇行流路１５との間に形成される。したがって、液体導入室１２、収容室１６、及び蛇行流路１５は、この順序で、基板１１の長手方向ＬＤに沿って配置される。
　収容室１６は、オイル、及びＰＣＲ溶液の液滴を収容する。また、収容室１６は、気体を排出するための出口（開口）を有する。出口は、収容室１６の天井部に形成される。収容室１６の深さは特に限定されない。例えば、収容室１６は、１０μｍ以上１ｍｍ以下の範囲から選択された深さを有し得る。収容室１６の容積は、典型的には、液体導入室１２よりも大きい。収容室１６が液体導入室１２よりも大きい容積を有することにより、収容室１６の出口からオイル等の液体が漏れることを抑制できる。
　なお、図１に示すように、流路チップ１は、液体導入室１２内に配置された少なくとも１つのスペーサー１７を更に備え得る。また流路チップ１は、収容室１６内に配置された少なくとも１つのスペーサー１７を更に備え得る。基板１１の材質が柔らかい材質である場合、液体導入室１２の面積によっては、液体導入室１２の天井部がたわむ可能性がある。液体導入室１２内にスペーサー１７を配置することにより、液体導入室１２の天井部がたわむことを抑制できる。同様に、収容室１６内にスペーサー１７を配置することにより、収容室１６の天井部がたわむことを抑制できる。
　続いて図２を参照して、本実施形態に係る流路チップ１について更に説明する。図２は、流路チップ１の正面図である。流路チップ１は、床部材１８を更に備える。
　床部材１８は、基板１１の下方に配置されて、液体導入室１２等の床部を構成する。床部材１８の材料は特に限定されないが、ＰＣＲを阻害しない材料であることが好ましい。また、床部材１８の材料は、蛍光の観察（検出）を阻害しない材料であることが好ましい。
　基板１１の材料がシリコーンゴムのような比較的柔らかい材料である場合、床部材１８の剛性は、基板１１の剛性よりも高いことが好ましい。例えば、床部材１８はガラス基板であり得る。床部材１８の剛性が基板１１の剛性よりも高い場合、床部材１８は基板１１を支持する。したがって、床部材１８により、基板１１（流路チップ１）がたわむことを抑制できる。換言すると、流路チップ１の剛性を高めることができる。したがって、ＰＣＲステップ終了後に流路チップ１を蛍光検出場へ移動させる際に、流路チップ１から液体（オイルなど）が漏れるおそれを低減できる。
　基板１１の材料が、ガラス、シクロオレフィンポリマー、又はポリカーボネートのような比較的剛性が高い材料である場合、床部材１８の剛性は、基板１１の剛性より高くても、低くてもよい。あるいは、床部材１８の剛性は、基板１１の剛性と同じであってもよい。例えば、床部材１８は、ガラス、シクロオレフィンポリマー、ポリカーボネート、又は圧着シールであり得る。
　なお、基板１１の剛性が比較的高い場合、流路チップ１は、床部材１８に替えて、蓋部材を備えてもよい。流路チップ１が蓋部材を備える場合、基板１１の上下を反転させて、基板１１の上方に蓋部材を配置する。換言すると、蓋部材は、液体導入室１２等の天井部を構成する。したがって、流路チップ１が蓋部材を備える場合、液体導入室１２の入口、及び収容室１６の出口は、蓋部材に形成される。蓋部材の材料は特に限定されないが、床部材１８と同様に、ＰＣＲを阻害しない材料であることが好ましい。また、蓋部材の材料は、蛍光の観察を阻害しない材料であることが好ましい。
　続いて図３を参照して、本実施形態に係る流路チップ１について更に説明する。図３は、流路チップ１の一部を拡大して示す図である。詳しくは、図３は、流路チップ１の蛇行流路１５を拡大して示す。
　図３に示すように、蛇行流路１５は、基板１１の幅方向ＷＤの一方側及び他方側へ蛇行する。図３において、基板１１の幅方向ＷＤの一方側は右側であり、基板１１の幅方向ＷＤの他方側は左側である。蛇行流路１５の一方側の端部は、第１ヒーター面３１ａ上に配置され、蛇行流路１５の他方側の端部は、第２ヒーター面３２ａ上に配置される。
　第１ヒーター面３１ａは、第１温度に設定される。第２ヒーター面３２ａは、第１温度とは異なる第２温度に設定される。本実施形態において、第１ヒーター面３１ａ（第１温度）は、ＰＣＲの加熱ステップを実行するための温度に設定され、第２ヒーター面３２ａ（第２温度）は、ＰＣＲの冷却ステップを実行するための温度に設定される。したがって、第２ヒーター面３２ａは、第１ヒーター面３１ａよりも低い温度に設定される。典型的には、第１ヒーター面３１ａ（第１温度）は、９０℃以上９８℃以下の範囲から選択された温度に設定される。第２ヒーター面３２ａの温度は、増幅対象ＤＮＡ分子に応じて設定される。典型的には、第２ヒーター面３２ａ（第２温度）は、５０℃以上７０℃以下の範囲から選択された温度に設定される。
　本実施形態によれば、ＰＣＲ溶液の液滴は、蛇行流路１５を移動することにより、加熱場と冷却場とを往復する。ＰＣＲ溶液の液滴が加熱場と冷却場とを１回ずつ通過することにより、ＰＣＲの１サイクルが完了する。図３に示す蛇行流路１５は６０回折り返されている。したがって、ＰＣＲのサイクル数は３０サイクルとなる。なお、蛇行流路１５を折り返す回数は６０回に限定されない。蛇行流路１５を折り返す回数は必要に応じて変更され得る。
　基板１１の長手方向ＬＤに沿った蛇行流路１５の長さＬ１は、ＰＣＲのサイクル数に応じて変更される。具体的には、ＰＣＲのサイクル数を増加させるほど、蛇行流路１５の長さＬ１は長くなる。例えば、ＰＣＲのサイクル数が３０サイクルである場合、蛇行流路１５の長さＬ１は２０ｍｍであり得る。
　なお、一般的に、ＰＣＲの冷却ステップは、ＰＣＲの加熱ステップよりも長い時間を必要とする。したがって、蛇行流路１５のうち、第２ヒーター面３２ａと重なる領域が、第１ヒーター面３１ａと重なる領域と比べて大きくなるように、蛇行流路１５を第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａ（温度制御場）に対向させる。例えば、図３に示すように、蛇行流路１５は、基板１１の幅方向ＷＤの中心から他方側の端にわたる部分が第２ヒーター面３２ａと対向するように配置される。
　続いて図４を参照して、本実施形態に係る回転駆動機構３について説明する。図４は、回転駆動機構３の構成を示す図である。回転駆動機構３は、ヒーターステージ３０と、ディスク状の基台４０と、駆動装置５０とを備える。ヒーターステージ３０は基台４０に固定され、駆動装置５０は、ヒーターステージ３０及び基台４０を回転軸ＡＸ（中心軸）まわりに回転させる。ヒーターステージ３０及び基台４０は、例えばアルミニウム製又は銅製であり、駆動装置５０は、典型的にはモーターである。駆動装置５０は、回転速度（回転数）の制御が可能であることが好ましい。なお、ヒーターステージ３０及び基台４０の材料は、アルミニウム又は銅に限定されないが、熱伝導性の高い材料であることが好ましい。以下、ヒーターステージ３０について更に説明する。
　ヒーターステージ３０は、図３を参照して説明した第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａを有する。図４に示すように、第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａは、回転軸ＡＸに直交する径方向に沿って延びる。また、第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａは、間隔をあけて並んでいる。
　図３を参照して説明したように、蛇行流路１５の一方側の端部は第１ヒーター面３１ａ上に配置され、蛇行流路１５の他方側の端部は第２ヒーター面３２ａ上に配置される。したがって、図１～図３を参照して説明した流路チップ１は、その長手方向ＬＤが回転駆動機構３の径方向に沿うように、回転駆動機構３に対してセットされる。この結果、液体導入室１２、収容室１６、及び蛇行流路１５は、この順序で、径方向に沿って配置される。具体的には、液体導入室１２、収容室１６、及び蛇行流路１５のうち、液体導入室１２が最も回転軸ＡＸ（回転中心）に近くなる。
　本実施形態において、ヒーターステージ３０は、第１ヒーターステージ３１と、第２ヒーターステージ３２とを含む。第１ヒーターステージ３１は第１ヒーター面３１ａを有し、第２ヒーターステージ３２は第２ヒーター面３２ａを有する。第１ヒーターステージ３１は、第１ヒーター面３１ａを第１温度に加熱する。第２ヒーターステージ３２は第２ヒーター面３２ａを第２温度に加熱する。
　第１ヒーターステージ３１は、環状の連結部３１１と、複数の第１加熱部３１２とを含む。連結部３１１は、回転軸ＡＸの周りに配置される。複数の第１加熱部３１２は、回転軸ＡＸを中心として、連結部３１１から放射状に延在する。したがって、第１加熱部３１２はそれぞれ、径方向に沿って配置される。図４に示す第１ヒーターステージ３１は、４つの第１加熱部３１２を有する。４つの第１加熱部３１２は、典型的には、９０度の角度間隔をあけて設けられる。
　第１加熱部３１２はそれぞれ、上方に突出する突条部３１３を含む。突条部３１３は、径方向に延びる。本実施形態において、突条部３１３は直方体状であり、突条部３１３の上面が第１ヒーター面３１ａを構成する。
　突条部３１３の径方向の長さは、図３を参照して説明した蛇行流路１５の長さＬ１に応じて決定する。例えば、蛇行流路１５の長さＬ１が２０ｍｍである場合、突条部３１３の径方向の長さは２０ｍｍ以上である。
　第２ヒーターステージ３２は、ディスク状の本体部３２１と、複数の第２加熱部３２２とを含む。本体部３２１は、第１ヒーターステージ３１の下方に、第１ヒーターステージ３１から離されて配置される。
　第２加熱部３２２はそれぞれ、本体部３２１から上方に突出し、径方向に延在する。図４に示す第２ヒーターステージ３２は、４つの第２加熱部３２２を有する。４つの第２加熱部３２２は、典型的には、９０度の角度間隔をあけて設けられる。
　第２加熱部３２２はそれぞれ、第２ヒーター面３２ａを有する。本実施形態において、第２加熱部３２２は直方体状であり、第２加熱部３２２の上面が第２ヒーター面３２ａを構成する。
　第２加熱部３２２の径方向の長さは、図３を参照して説明した蛇行流路１５の長さＬ１に応じて決定する。例えば、蛇行流路１５の長さＬ１が２０ｍｍである場合、第２加熱部３２２の径方向の長さは２０ｍｍ以上である。
　なお、既に説明したように、ＰＣＲの冷却ステップは、一般的に、ＰＣＲの加熱ステップよりも長い時間を必要とする。したがって、第２ヒーター面３２ａの幅は、第１ヒーター面３１ａの幅よりも大きいことが好ましい。第２ヒーター面３２ａが第１ヒーター面３１ａよりも大きい幅を有することにより、蛇行流路１５のうち、第２ヒーター面３２ａと重なる領域を、第１ヒーター面３１ａと重なる領域よりも大きくすることが容易になる。
　図４に示すヒーターステージ３０は、離間部材３３を更に含む。離間部材３３は、第２ヒーターステージ３２の本体部３２１の中心部に固定され、第１ヒーターステージ３１が第２ヒーターステージ３２の本体部３２１から離れるように、第１ヒーターステージ３１を支持する。離間部材３３の材料は特に限定されないが、耐熱性が高い材料であることが好ましい。例えば、離間部材３３の材料は、ポリカーボネート又はポリフェニレンサルファイド（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｙｌｅｎｅｓｕｌｆｉｄｅ；ＰＰＳ）のような樹脂であり得る。
　本実施形態において、離間部材３３は、大径部３３１と、小径部３３２とを含む。小径部３３２は大径部３３１上に固定され、大径部３３１は、第２ヒーターステージ３２の本体部３２１の中心部に固定される。大径部３３１と小径部３３２とによって段形状（ステップ）が形成され、第１ヒーターステージ３１の連結部３１１が、小径部３３２の周り（ステップ）に固定される。この結果、第１ヒーターステージ３１は、第２ヒーターステージ３２の本体部３２１から大径部３３１の高さの分だけ離れた位置に配置される。なお、大径部３３１と小径部３３２とは一体に形成されてもよい。
　また、離間部材３３は、第１ヒーター面３１ａと第２ヒーター面３２ａとが間隔をあけて並ぶように、第１ヒーターステージ３１を支持する。好ましくは、離間部材３３は、隣接する第１ヒーター面３１ａと第２ヒーター面３２ａとの間の熱干渉が互いに小さくなるように第１ヒーターステージ３１を支持する。例えば、隣接する第１ヒーター面３１ａと第２ヒーター面３２ａとの間の間隔は、１ｍｍであり得る。
　続いて図５を参照して、本実施形態に係る遺伝子増幅システム１００について説明する。図５は、遺伝子増幅システム１００の一部を示す模式図である。遺伝子増幅システム１００は、図１～３を参照して説明した流路チップ１と、図４を参照して説明した回転駆動機構３とを備える。回転駆動機構３は、回転中心Ｘまわり（回転軸ＡＸまわり）に流路チップ１を回転させる。本実施形態において、回転方向ＲＤは、時計回りの方向である。図５に示すように、回転駆動機構３は、液体導入室１２等のうち液体導入室１２が回転中心Ｘに最も近くなるように流路チップ１を保持する。遺伝子増幅システム１００は、蛇行流路１５が第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａ（温度制御場）に対向している状態で、流路チップ１を回転中心Ｘまわりに回転させて、ｄｄＰＣＲを実行する。
　続いて図１～図１１を参照して、遺伝子増幅システム１００を用いた遺伝子増幅方法について説明する。図６は、本実施形態に係る遺伝子増幅方法を示すフローチャートである。図６に示すように、本実施形態に係る遺伝子増幅方法は、ステップＳ６０１～ステップＳ６０７を包含する。以下、ステップＳ６０１～ステップＳ６０７について説明する。
　本実施形態に係る遺伝子増幅方法では、まず、ステップＳ６０１において、回転駆動機構３に流路チップ１を保持させる。回転駆動機構３に流路チップ１を保持させた後、ステップＳ６０２において、液体導入室１２にオイルを導入する。
　オイルの導入後、ステップＳ６０３において、回転駆動機構３が流路チップ１を回転軸ＡＸ（回転中心Ｘ）まわりに回転させる。この結果、導入流路１３、液滴供給室１４、及び蛇行流路１５にオイルが充填されるとともに、収容室１６にオイルが供給される。
　流路チップ１の回転終了後、ステップＳ６０４において、第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａの温度が設定される。具体的には、第１ヒーター面３１ａは、ＰＣＲの加熱ステップを実行するための温度に設定され、第２ヒーター面３２ａは、ＰＣＲの冷却ステップを実行するための温度に設定される。
　第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａの温度設定後、ステップＳ６０５において、液体導入室１２にＰＣＲ溶液を導入する。ＰＣＲ溶液の導入後、ステップＳ６０６において、回転駆動機構３が流路チップ１を回転軸ＡＸ（回転中心Ｘ）まわりに回転させる。この結果、導入流路１３の終端部でＰＣＲ溶液の液滴が発生し、蛇行流路１５においてｄｄＰＣＲが行われる。蛇行流路１５を通過したＰＣＲ溶液の液滴は、収容室１６に収容される。
　流路チップ１の回転終了後、ステップＳ６０７において、流路チップ１を蛍光検出場に移動させて、各液滴内のＤＮＡの有無を、蛍光の検出によって判定する。
　続いて図７～図１１を参照して、図６を参照して説明した遺伝子増幅方法を詳しく説明する。図７～図１１は、遺伝子増幅システム１００を用いた遺伝子増幅方法を示す模式図である。
　まず、図７に示すように、流路チップ１が回転駆動機構３にセットされる（ステップＳ６０１）。詳しくは、蛇行流路１５の一方側の端部が第１ヒーター面３１ａ上に配置され、蛇行流路１５の他方側の端部が第２ヒーター面３２ａ上に配置されるように、流路チップ１をヒーターステージ３０上に保持させる。その後、液体導入室１２に、オイル７１を導入する（ステップＳ６０２）。オイル７１の導入には、典型的には、ピペッター７２が使用される。
　液体導入室１２にオイル７１を導入した後、回転駆動機構３が、回転軸ＡＸを中心（回転中心Ｘ）として、流路チップ１を回転方向ＲＤに回転させる（ステップＳ６０３）。この結果、オイル７１が液体導入室１２から収容室１６まで流れる。図８に示すように、流路チップ１の回転は、液体導入室１２からオイル７１が全て排出されるまで続ける。流路チップ１の回転により、導入流路１３、液滴供給室１４、及び蛇行流路１５にオイル７１が充填されるとともに、収容室１６にオイル７１が供給される。
　流路チップ１の回転終了後、第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａを加熱して、第１ヒーター面３１ａを第１温度に設定し、第２ヒーター面３２ａを第２温度に設定する（ステップＳ６０４）。典型的には、第１ヒーター面３１ａ（第１温度）は、９０℃以上９８℃以下の範囲から選択された温度に設定され、第２ヒーター面３２ａ（第２温度）は、５０℃以上７０℃以下の範囲から選択された温度に設定される。
　第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａの温度設定後、図９に示すように、液体導入室１２に、ＰＣＲ溶液９１を導入する（ステップＳ６０５）。ＰＣＲ溶液９１の導入には、典型的には、ピペッター９２が使用される。
　液体導入室１２にＰＣＲ溶液９１を導入した後、回転駆動機構３が、回転軸ＡＸを中心（回転中心Ｘ）として、流路チップ１を回転方向ＲＤに回転させる（ステップＳ６０６）。この結果、図１０に示すように、ＰＣＲ溶液９１は導入流路１３を流れ、導入流路１３の終端部において液滴９１ａとなる。液滴９１ａは、オイル７１によって充填された液滴供給室１４を介して蛇行流路１５に供給され、オイル７１によって充填された蛇行流路１５を移動して収容室１６に収容される。
　詳しくは、オイル７１によって充填された液滴供給室１４にＰＣＲ溶液９１が到達すると、オイル７１とＰＣＲ溶液９１との界面に、オイル７１（油相）とＰＣＲ溶液９１（水相）との間の密度差に起因する圧力差が発生する。この圧力差を駆動力として、液滴９１ａが生成される。なお、オイル７１及びＰＣＲ溶液９１には、遠心力に基づく圧力が付与される。したがって、本実施形態に係る遺伝子増幅システム１００及び遺伝子増幅方法は、遠心場によって液滴９１ａを発生させる。
　蛇行流路１５を移動する液滴９１ａは、第１ヒーター面３１ａによって加熱された後、第２ヒーター面３２ａによって冷却される。この加熱及び冷却により、液滴９１ａ内でＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）の１サイクルが完了する。詳しくは、第１ヒーター面３１ａが液滴９１ａを加熱することにより、液滴９１ａに含まれる２本鎖ＤＮＡが分離して、１本鎖ＤＮＡが生成される。その後、第２ヒーター面３２ａが液滴９１ａを冷却する。この結果、まず、１本鎖ＤＮＡ中の増幅対象ＤＮＡ分子にプライマーが結合する。その後、ＤＮＡポリメラーゼによってｄＮＴＰがプライマーに結合し、プライマーからＤＮＡ鎖が延びて２本鎖ＤＮＡが生成される。
　流路チップ１の回転は、液体導入室１２から所望の量のＰＣＲ溶液９１が排出されるまで続ける。流路チップ１の回転終了後、図１１に示すように、流路チップ１は回転駆動機構３から取り外されて、蛍光検出場まで移動される（ステップＳ６０７）。蛍光検出場では、各液滴９１ａ内の増幅されたＤＮＡ分子の有無が、蛍光の検出によって判定される。ＤＮＡを含む液滴９１ａの数をカウントすることによって、統計的に確からしい検出対象のＤＮＡ（又はＲＮＡなどの核酸）の絶対定量を測定することが可能となる。
　具体的には、蛍光検出場において、励起光光源から出射された励起光が、収容室１６に照射される。励起光は、蛍光色素を励起する。励起された蛍光色素は蛍光を放出する。放出された蛍光を蛍光検出器によって検出する。蛍光を放出する液滴９１ａはＤＮＡを含み、蛍光を放出しない液滴９１ａはＤＮＡを含まないため、各液滴９１ａ内のＤＮＡの有無を判定することができる。励起光光源は、例えば、レーザー光源、又は発光ダイオード（ＬＥＤ）であり得る。蛍光検出器は、例えば、フォトマル検出器、集光レンズ及び蛍光フィルタ等を含んで構成される。
　蛍光の検出方法には、インターカレーター法とハイブリダイゼーション法とがある。インターカレーター法では、二本鎖ＤＮＡに特異的に挿入して蛍光を発する蛍光色素（ＳＹＢＲ　ｇｒｅｅｎ　Ｉ）を用いる。換言すると、蛍光色素が添加されたＰＣＲ溶液９１を用いる。一方、ハイブリダイゼーション法はＴａｇＭａｎプローブ法が最も一般的であり、ＤＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブＤＮＡを用いる。換言すると、プローブＤＮＡが添加されたＰＣＲ溶液９１を用いる。ＴａｇＭａｎプローブ法に用いる蛍光色素は、例えば、ＦＡＭ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）であり得る。
　なお、検出対象がＲＮＡである場合、ＰＣＲステップの実行前に逆転写プロセスを実行する。例えば、検体液に対して逆転写プロセスを実行した後にＰＣＲ溶液を調製してもよい。あるいは、逆転写プロセスをＰＣＲステップに含めてもよい。
　続いて図１２を参照して、液滴９１ａが蛇行流路１５を移動する原理について説明する。図１２は、蛇行流路１５の一部を拡大して示す模式図である。図１２に示すように、蛇行流路１５は、第１傾斜流路１５ａと第２傾斜流路１５ｂとを含む。
　第１傾斜流路１５ａは、基板１１の幅方向ＷＤの一方側へ延びて、第２傾斜流路１５ｂの一方側の端部に接続（連通）する。第２傾斜流路１５ｂは、基板１１の幅方向ＷＤの他方側へ延びて、第１傾斜流路１５ａの他方側の端部に接続（連通）する。第１傾斜流路１５ａ及び第２傾斜流路１５ｂは、基板１１の長手方向ＬＤに対して傾斜している。換言すると、第１傾斜流路１５ａ及び第２傾斜流路１５ｂは、回転軸ＡＸに直交する径方向に対して傾斜している。第１傾斜流路１５ａ及び第２傾斜流路１５ｂは、長手方向ＬＤ（径方向）に沿って交互に配置される。
　密度が異なるオイル７１によって囲まれた液滴９１ａを、回転軸ＡＸ（回転中心Ｘ）まわりに回転させると、遠心力により、液滴９１ａに対して回転軸ＡＸ（回転中心Ｘ）へ向かう浮力Ｆが付与される。第１傾斜流路１５ａ及び第２傾斜流路１５ｂが径方向に対して傾斜していることにより、液滴９１ａは、浮力Ｆを駆動力として、蛇行流路１５（第１傾斜流路１５ａ及び第２傾斜流路１５ｂ）に沿って、回転軸ＡＸ（回転中心Ｘ）へ向かって移動する。
　なお、浮力Ｆの大きさは、図４を参照して説明した駆動装置５０の回転数（回転速度）に依存する。具体的には、回転数が大きいほど浮力Ｆが大きくなり、液滴９１ａの移動速度が速くなる。したがって、駆動装置５０の回転数を制御することにより、液滴９１ａの移動速度を制御できる。よって、回転数を増加させることにより、液滴９１ａに対する熱交換の迅速化、つまりＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）の迅速化を図ることができる。但し、第１傾斜流路１５ａ及び第２傾斜流路１５ｂの流路長さによっては、液滴９１ａの移動速度が速くなり過ぎると適切な熱交換が行われず、ＰＣＲが行われない可能性がある。よって、駆動装置５０の回転数は、第１傾斜流路１５ａ及び第２傾斜流路１５ｂの流路長さに応じて決定することが好ましい。
　続いて図１３を参照して、蛇行流路１５について更に説明する。図１３は、蛇行流路１５の一部を拡大して示す図である。図１３に示すように、第１傾斜流路１５ａ及び第２傾斜流路１５ｂは、基板１１の長手方向ＬＤに対して、角度θの傾きを有する。角度θが０°よりも大きいことにより、図１２を参照して説明した浮力Ｆを駆動力として、液滴９１ａが蛇行流路１５を移動する。
　角度θ、及び、基板１１の幅方向ＷＤにおける蛇行流路１５の長さＬ２は、ＰＣＲの加熱ステップ及び冷却ステップを実行できる限り、特に限定されない。例えば、角度θは、１０°以下の範囲から選択し得る。また、蛇行流路１５の長さＬ２は、１ｍｍ以上２０ｍｍ以下の範囲から選択し得る。
　続いて図１４（ａ）及び図１４（ｂ）を参照して、基板１１について更に説明する。図１４（ａ）は、基板１１の一部を拡大して示す図である。詳しくは、図１４（ａ）は、第２導入流路１３ｂ付近を拡大して示す。図１４（ｂ）は、図１４（ａ）に示すＸＩＶＢ－ＸＩＶＢ線に沿った断面図である。
　図１４（ａ）及び図１４（ｂ）に示すように、基板１１は、テラス構造１９を更に含む。詳しくは、導入流路１３はテラス部１３ｃを含む。テラス部１３ｃは、第２導入流路１３ｂの終端と液滴供給室１４との間に形成される。テラス構造１９は、第２導入流路１３ｂ（直線部）とテラス部１３ｃとによって構成される。
　基板１１の幅方向ＷＤに沿ったテラス部１３ｃの幅Ｗ２は、第２導入流路１３ｂの流路幅Ｗ１よりも大きい。換言すると、テラス部１３ｃによって、第２導入流路１３ｂの終端部の流路幅が拡大される。また、テラス部１３ｃの深さは、第２導入流路１３ｂの深さｈ１と等しく、液滴供給室１４の深さｈ２よりも浅い。これらの条件を満たすテラス構造１９を導入流路１３の終端部に形成することにより、液滴９１ａをより確実に生成することができる。
　テラス構造１９の各部の寸法は、液滴９１ａを生成できる限り特に限定されない。例えば、第２導入流路１３ｂの流路幅Ｗ１が３０μｍである場合、テラス部１３ｃの幅Ｗ２は１００μｍであり得る。また、及び基板１１の長手方向ＬＤに沿ったテラス部１３ｃのテラス長さＬ３は、３０μｍであり得る。液滴供給室１４の深さｈ２が１００μｍである場合、第２導入流路１３ｂ及びテラス部１３ｃの深さｈ１は３０μｍであり得る。
　液滴９１ａの直径は、テラス構造１９の各部の寸法によって制御可能である。典型的には、液滴９１ａの直径は、１０μｍ以上３００μｍ以下である。第２導入流路１３ｂの流路幅Ｗ１が３０μｍであり、テラス部１３ｃの幅Ｗ２が１００μｍであり、テラス長さＬ３が３０μｍであり、第２導入流路１３ｂ及びテラス部１３ｃの深さｈ１が３０μｍである場合、約９５μｍの直径を有する液滴９１ａが生成される。
　続いて図１５～図２０を参照して、蛇行流路１５を移動する液滴９１ａについて説明する。図１５～図２０は、導入流路１３の一部、液滴供給室１４、及び蛇行流路１５の一部を示す図である。詳しくは、図１５～図２０は、液滴９１ａが液滴供給室１４から蛇行流路１５に供給される様子を時系列に示す。
　図１５～図２０に示すように、液滴９１ａが液滴供給室１４を移動する速度は、液滴９１ａが蛇行流路１５を移動する速度と比べて速い。これは、液滴供給室１４において液滴９１ａが浮力Ｆの方向に沿って移動するためである。
　また、本実施形態に係る液滴供給室１４は、蛇行流路１５の始端に向かって幅が狭くなる形状を有する。この形状により、蛇行流路１５に液滴９１ａをよりスムーズに供給することが可能となる。より好ましくは、液滴供給室１４の幅を浮力Ｆの方向に沿って狭くする。液滴供給室１４の幅を浮力Ｆの方向に沿って狭くすることにより、液滴９１ａを蛇行流路１５の始端へ向けてよりスムーズに誘導することが可能となる。なお、液滴９１ａを蛇行流路１５に誘導する形状は、三角形に限定されない。例えば、液滴供給室１４は、蛇行流路１５の始端に向かって幅が狭くなる円弧形状（円周面の一部）を含んでもよい。
　以上、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明した。本実施形態によれば、液滴９１ａが、浮力Ｆを駆動力として、加熱場（第１ヒーター面３１ａ）と冷却場（第２ヒーター面３２ａ）との間を往復する。したがって、温度制御場の温度を２つの温度間で遷移させる構成と比べて、より迅速にｄｄＰＣＲを行うことができる。
　また、本実施形態によれば、回転数の制御によって液滴９１ａの移動速度を制御することができる。よって、回転数を制御して、液滴９１ａの移動速度を速くすることにより、より迅速にｄｄＰＣＲを行うことが可能となる。更に、回転数を制御することにより、液滴９１ａが加熱場を移動する時間と、液滴９１ａが冷却場を移動する時間とを制御することができる。よって、確実にｄｄＰＣＲを行うことができる。
　また、本実施形態によれば、液滴９１ａが浮力Ｆを駆動力として蛇行流路１５を移動する。したがって、油相（オイル７１）を送液する必要がない。この結果、油相（オイル７１）の使用量を削減することができる。よって、ランニングコストを低減することができる。更に、マイクロポンプのような溶液駆動部が不要となるため、遺伝子増幅システム１００（ｄｄＰＣＲシステム）の小型化が可能となる。
　また、本実施形態によれば、液滴９１ａがオイル７１に囲まれるため、液滴９１ａの流路壁面への吸着を抑制することができる。したがって、サンプルロスを低減でき、効率を高めることができる。
　また、本実施形態によれば、遠心場での液滴９１ａの生成と、温度制御場でのＰＣＲとを１つの装置（回転駆動機構３）によって達成できる。したがって、オイル７１とＰＣＲ溶液９１とを流路チップ１に滴下し、回転駆動機構３が流路チップ１を回転させるだけで、ｄｄＰＣＲを行うことができるため、より簡便かつ迅速にｄｄＰＣＲを行うことができる。
　また、本実施形態によれば、１チップ内で液滴９１ａの生成とＰＣＲとを行うことができる。したがって、より簡便かつ迅速にｄｄＰＣＲを行うことができる。
　なお、本発明は上記の実施形態に限られるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々の態様において実施することが可能である。
　例えば、本発明の実施形態では、第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａの温度を設定した後に、ＰＣＲ溶液９１を液体導入室１２に導入したが、ＰＣＲ溶液９１を液体導入室１２に導入した後に、第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａの温度を設定してもよい。
　また、本発明の実施形態では、流路チップ１を時計回りの方向に回転させたが、流路チップ１を反時計回りの方向に回転させてもよい。
　また、本発明の実施形態において、回転駆動機構３は、第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａの組（温度制御場）を４つ備えたが、本発明はこの形態に限定されない。回転駆動機構３は、第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａの組を１つ、２つ、又は３つ備えてもよいし、第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａの組を５つ以上備えてもよい。
　また、流路チップ１の導入流路１３は、例えば図２１に示すように蛇行流路１３ｄを含んでもよい。図２１は、本発明の他の実施形態に係る流路チップ１の平面図である。図２１に示す流路チップ１において、導入流路１３は、蛇行流路１３ｄを含む。蛇行流路１３ｄは、液体導入室１２と液滴供給室１４との間に形成される。より詳しくは、蛇行流路１３ｄは、第１導入流路１３ａに形成される。蛇行流路１３ｄを設けることにより、液体導入室１２から液滴供給室１４までのＰＣＲ溶液９１の移動速度を調整して、液滴９１ａの発生頻度（スループット）を調整することが可能となる。
　また、本発明の実施形態では、ヒーターステージ３０が２つのヒーター面（第１ヒーター面３１ａ及び第２ヒーター面３２ａ）を有し、蛇行流路１５が、２つのヒーター面に跨って配置されたが、ヒーターステージ３０は、３つ以上のヒーター面を有してもよい。３つ以上のヒーター面は、互いに異なる温度に設定される。この場合、蛇行流路１５は、３つ以上のヒーター面に跨って配置される。ヒーターステージ３０が３つ以上のヒーター面を有することにより、温度制御場の温度勾配をより自由に制御することが可能となる。
　以下、本発明の実施例について説明する。但し、本発明は、以下で説明する実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　まず、実施例１において使用した流路チップ１について説明する。実施例１では、図１に示す流路チップ１を用いた。基板１１は、シリコーンゴム製であった。液体導入室１２、液滴供給室１４、及び収容室１６の深さは１００μｍであった。第１導入流路１３ａの流路幅及び深さは共に１００μｍであった。図１４（ａ）及び図１４（ｂ）を参照して説明したテラス構造１９において、第２導入流路１３ｂの流路幅Ｗ１は３０μｍ、テラス部１３ｃの幅Ｗ２は１００μｍ、テラス長さＬ３は３０μｍ、第２導入流路１３ｂ及びテラス部１３ｃの深さｈ１は３０μｍであった。基板１１の長手方向ＬＤに沿った蛇行流路１５の長さＬ１は２０ｍｍであった。基板１１の幅方向ＷＤに沿った蛇行流路１５の長さＬ２は３．５ｍｍであった。蛇行流路１５（第１傾斜流路１５ａ及び第２傾斜流路１５ｂ）の流路幅及び深さは共に１００μｍであった。第１傾斜流路１５ａ及び第２傾斜流路１５ｂが径方向（長手方向ＬＤ）に対して傾斜する角度θは４°であった。
　実施例１では、オイル７１としてフッ素オイルを使用した。また、ＰＣＲ溶液９１（水相）の替わりに、赤色に着色した水を使用した。実施例１では、流路チップ１を回転軸ＡＸまわりに回転速度４４０ｒｐｍで回転させた。図２２は、実施例１の結果を示す図である。図２２は、ハイスピードカメラによって蛇行流路１５を撮像して取得した。図２２に示すように、流路チップ１を回転軸ＡＸまわりに回転させることで液滴Ｓが生成されることを確認した。また、液滴Ｓが回転軸ＡＸに向かって蛇行流路１５を移動していき、蛇行流路１５が液滴Ｓによって充填されることを確認できた。実施例１では、約９５μｍの直径を有する液滴Ｓが生成された。
［実施例２～４］
　実施例２～４では、実施例１と構成が同じ流路チップ１を使用して、液滴Ｓの移動速度を測定した。実施例２～４では、実施例１と同様に、オイル７１としてフッ素オイルを使用した。また、ＰＣＲ溶液９１（水相）の替わりに、赤色に着色した水を使用した。
　実施例２では、実施例１と同様に、流路チップ１を回転軸ＡＸまわりに回転速度４４０ｒｐｍで回転させた。実施例３では、流路チップ１を回転軸ＡＸまわりに回転速度１０００ｒｐｍで回転させた。実施例４では、流路チップ１を回転軸ＡＸまわりに回転速度１３２０ｒｐｍで回転させた。なお、実施例３及び４においても、約９５μｍの直径を有する液滴Ｓが生成された。
　図２３（ａ）及び図２３（ｂ）は、実施例２に係る液滴Ｓの移動を示す図である。図２３（ａ）及び図２３（ｂ）は、ハイスピードカメラによって蛇行流路１５を撮像して取得した。図２３（ｂ）は、図２３（ａ）を撮像した時点から３０秒経過した時点での蛇行流路１５を示す。図２３（ｂ）において、矢印は、液滴Ｓが３０秒間で移動した距離を示す。
　図２４（ａ）及び図２４（ｂ）は、実施例３に係る液滴Ｓの移動を示す図である。図２４（ａ）及び図２４（ｂ）は、ハイスピードカメラによって蛇行流路１５を撮像して取得した。図２４（ｂ）は、図２４（ａ）を撮像した時点から３０秒経過した時点での蛇行流路１５を示す。図２４（ｂ）において、矢印は、液滴Ｓが３０秒間で移動した距離を示す。
　図２５（ａ）及び図２５（ｂ）は、実施例４に係る液滴Ｓの移動を示す図である。図２５（ａ）及び図２５（ｂ）は、ハイスピードカメラによって蛇行流路１５を撮像して取得した。図２５（ｂ）は、図２５（ａ）を撮像した時点から３０秒経過した時点での蛇行流路１５を示す。図２５（ｂ）において、矢印は、液滴Ｓが３０秒間で移動した距離を示す。
　図２３（ａ）及び図２３（ｂ）～図２５（ａ）及び図２５（ｂ）に示すように、回転速度ｒｐｍが増加するほど、液滴Ｓの移動距離が延びた。
　図２６は、回転速度と、液滴Ｓの移動速度との関係を示すグラフである。図２６において、横軸は回転速度を示し、縦軸は液滴Ｓの移動速度を示す。図２６に示すグラフは、図２３（ａ）及び図２３（ｂ）～図２５（ａ）及び図２５（ｂ）に示す撮像結果から取得した液滴Ｓの移動速度をプロットして作成した。図２６に示すように、回転速度ｒｐｍが増加するほど、液滴Ｓの移動速度が増加することを確認できた。
　図２７は、回転速度と、ＰＣＲの１サイクルを完了するために必要な時間との関係を示すグラフである。図２７において、横軸は回転速度を示す。また、縦軸は、ＰＣＲの１サイクルを完了するために必要な時間を示す。
　ＰＣＲの１サイクルを完了するために必要な時間は、液滴Ｓが蛇行流路１５を１往復するために必要な時間を示す。液滴Ｓが蛇行流路１５を１往復するために必要な時間は、図２３（ａ）及び図２３（ｂ）～図２５（ａ）及び図２５（ｂ）に示す撮像結果から取得した液滴Ｓの移動速度と、蛇行流路１５の長さＬ２（３．５ｍｍ）とに基づいて求めた。図２７に示すように、回転速度ｒｐｍを増加させることにより、液滴Ｓが蛇行流路１５を１往復するために必要な時間が短くなることを確認できた。
［実施例５、及び比較例］
　実施例５及び比較例において使用した流路チップ１は、６種類のサーモシールＡ～Ｆを含む点を除いて、実施例１と同じ構成を有する。具体的には、サーモシールＡ～Ｆは、蛇行流路１５に対向するように基板１１に埋め込まれている。詳しくは、サーモシールＡ～Ｃは、基板１１の幅方向ＷＤにおける蛇行流路１５の一方側の端部に対向する。換言すると、サーモシールＡ～Ｃは、第１ヒーター面３１ａに対向するように基板１１に埋め込まれている。サーモシールＡの色は、１００℃の温度によって緑色になる。サーモシールＢの色は、９５℃の温度によって緑色になる。サーモシールＣの色は、９０℃の温度によって緑色になる。一方、サーモシールＤ～Ｆは、基板１１の幅方向ＷＤにおける蛇行流路１５の他方側の端部に対向する。換言すると、サーモシールＤ～Ｆは、第２ヒーター面３２ａに対向するように基板１１に埋め込まれている。サーモシールＤの色は、６５℃の温度によって緑色になる。サーモシールＥの色は、６０℃の温度によって緑色になる。サーモシールＦの色は、５５℃の温度によって緑色になる。
　実施例５では、薬剤耐性細菌（ＩＭＰ－６陽性）ゲノムＤＮＡを含むＰＣＲ溶液を用いて、ＩＭＰ－６をターゲットにしてｄｄＰＣＲを行った。また、ｄｄＰＣＲステップ終了後に蛍光の検出を行った。比較例では、ＤＮＡが添加されていない溶液を用いて、ｄｄＰＣＲステップを実行した。比較例で使用した溶液は、ＤＮＡが添加されていないことを除いて、実施例５と同じ成分を含む。比較例においても、ｄｄＰＣＲステップ終了後に蛍光の検出を行った。
　実施例５及び比較例では、フッ素オイルを使用して、流路チップ１を回転軸ＡＸまわりに回転速度８００ｒｐｍで回転させた。サーモシールＡ～Ｃのうち、サーモシールＢの色が緑色となり、サーモシールＤ～Ｆのうち、サーモシールＥの色が緑色となった。したがって、第１ヒーター面３１ａの温度（第１温度）を９５℃程度に制御できることを確認できた。また、第２ヒーター面３２ａの温度（第２温度）を６０℃程度に制御できることを確認できた。
　図２８（ａ）は、実施例５に係る蛍光の検出結果を示す図である。図２８（ｂ）は、比較例に係る蛍光の検出結果を示す図である。図２８（ａ）及び図２８（ｂ）に示すように、薬剤耐性細菌ゲノムＤＮＡを含む液滴（実施例５）において、ＤＮＡを含まない液滴（比較例）と比べて、ＤＮＡ増幅に伴う強い蛍光を観察（検出）できた。したがって、実施形態において説明した遺伝子増幅システムによってｄｄＰＣＲを行うことが可能なことを確認できた。
　本発明によれば、より迅速にｄｄＰＣＲを行うことが可能となり、遺伝子の絶対定量を測定するシステムに有用である。
１　　　　流路チップ
３　　　　回転駆動機構
１１　　　基板
１２　　　液体導入室
１３　　　導入流路
１３ａ　　第１導入流路
１３ｂ　　第２導入流路
１３ｃ　　テラス部
１３ｄ　　蛇行流路
１４　　　液滴供給室
１５　　　蛇行流路
１５ａ　　第１傾斜流路
１５ｂ　　第２傾斜流路
１６　　　収容室
１９　　　テラス構造
３０　　　ヒーターステージ
３１　　　第１ヒーターステージ
３１ａ　　第１ヒーター面
３２　　　第２ヒーターステージ
３２ａ　　第２ヒーター面
５０　　　駆動装置
７１　　　オイル
９１　　　ＰＣＲ溶液
９１ａ　　液滴
１００　　遺伝子増幅システム
ＡＸ　　　回転軸
Ｆ　　　　浮力

Claims (13)

  1. 　一方側及び他方側へ蛇行する蛇行流路を有する流路チップと、
    　回転軸を有し、前記回転軸まわりに前記流路チップを回転させて前記蛇行流路内の液滴に浮力を付与することにより、前記液滴を前記蛇行流路に沿って移動させる回転駆動機構と
    　を備え、
    　前記回転駆動機構は、
    　互いに異なる温度に設定される複数のヒーター面を有するヒーターステージと、
    　前記回転軸まわりに前記ヒーターステージを回転させる駆動装置と
    　を含み、
    　前記回転駆動機構は、前記蛇行流路が前記複数のヒーター面に跨って配置されるように、前記流路チップを保持する、遺伝子増幅システム。
  2. 　前記複数のヒーター面は、第１温度に設定される第１ヒーター面と、前記第１温度とは異なる第２温度に設定される第２ヒーター面とを有し、
    　前記回転駆動機構は、前記蛇行流路の前記一方側の端部が前記第１ヒーター面に対向するとともに、前記蛇行流路の前記他方側の端部が前記第２ヒーター面に対向するように、前記流路チップを保持する、請求項１に記載の遺伝子増幅システム。
  3. 　前記蛇行流路は、
    　前記一方側へ延びる第１傾斜流路と、
    　前記他方側へ延びる第２傾斜流路と
    　を含み、
    　前記第１傾斜流路及び前記第２傾斜流路は、前記回転軸に直交する径方向に対して傾斜する、請求項１又は請求項２に記載の遺伝子増幅システム。
  4. 　前記蛇行流路は、複数の前記第１傾斜流路と、複数の前記第２傾斜流路とを含み、
    　前記第１傾斜流路と前記第２傾斜流路とは、前記径方向に沿って交互に配置される、請求項３に記載の遺伝子増幅システム。
  5. 　前記流路チップは、前記蛇行流路の始端に前記液滴を供給する液滴供給室を更に有し、
    　前記液滴供給室は、前記蛇行流路の始端に向かって幅が狭くなる形状を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の遺伝子増幅システム。
  6. 　前記液滴供給室は三角形状を有し、
    　前記液滴供給室の三角形状の頂部が、前記蛇行流路の始端に接続する、請求項５に記載の遺伝子増幅システム。
  7. 　前記流路チップは、
    　液体が導入される液体導入室と、
    　前記液体導入室と前記蛇行流路とに連通する導入流路と
    　を更に有し、
    　前記導入流路はその中間部に蛇行流路を含む、請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の遺伝子増幅システム。
  8. 　流路チップであって、
    　一方側及び他方側へ蛇行する蛇行流路を備え、
    　回転軸まわりに前記流路チップを回転させた場合に、前記蛇行流路内の液滴に浮力が付与されて、前記液滴が前記蛇行流路に沿って移動する、流路チップ。
  9. 　流路チップを回転軸まわりに回転させる回転駆動機構であって、
    　前記流路チップは、一方側及び他方側へ蛇行する蛇行流路を有し、
    　前記回転駆動機構は、
    　互いに異なる温度に設定される複数のヒーター面を有するヒーターステージと、
    　前記回転軸まわりに前記ヒーターステージを回転させる駆動装置と
    　を備え、
    　前記回転駆動機構は、前記蛇行流路が前記複数のヒーター面に跨って配置されるように、前記流路チップを保持する、回転駆動機構。
  10. 　前記複数のヒーター面は、第１温度に設定される第１ヒーター面と、前記第１温度とは異なる第２温度に設定される第２ヒーター面とを有し、
    　前記回転駆動機構は、前記蛇行流路の前記一方側の端部が前記第１ヒーター面に対向するとともに、前記蛇行流路の前記他方側の端部が前記第２ヒーター面に対向するように、前記流路チップを保持する、請求項９に記載の回転駆動機構。
  11. 　前記第１ヒーター面は、前記回転軸に直交する径方向に沿って延びており、
    　前記第２ヒーター面は、前記第１ヒーター面に並んで配置されて、前記径方向に沿って延びている、請求項１０に記載の回転駆動機構。
  12. 　流路チップを用いて遺伝子を増幅する遺伝子増幅方法であって、
    　前記流路チップは、一方側及び他方側に蛇行する蛇行流路と、前記蛇行流路に連通する液体導入室とを有し、
    　前記遺伝子増幅方法は、
    　前記蛇行流路が複数のヒーター面に跨って配置されるように、前記流路チップをヒーターステージに対して保持する工程と、
    　前記複数のヒーター面を互いに異なる温度に設定する工程と、
    　前記液体導入室に、ポリメラーゼ連鎖反応溶液を導入する工程と、
    　回転軸まわりに前記ヒーターステージを回転させて、前記蛇行流路内の液滴に浮力を付与することにより、前記液滴を前記蛇行流路に沿って移動させる工程と
    　を包含する遺伝子増幅方法。
  13. 　前記流路チップをヒーターステージに対して保持する工程において、前記蛇行流路の前記一方側の端部が第１ヒーター面に対向するとともに、前記蛇行流路の前記他方側の端部が第２ヒーター面に対向するように、前記流路チップをヒーターステージに対して保持し、
    　前記複数のヒーター面を互いに異なる温度に設定する工程において、前記１ヒーター面を第１温度に設定し、かつ前記第２ヒーター面を、前記第１温度とは異なる第２温度に設定する、請求項１２に記載の遺伝子増幅方法。
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