[go: up one dir, main page]

WO2018159432A1 - 間葉系幹細胞及び医薬組成物 - Google Patents

間葉系幹細胞及び医薬組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2018159432A1
WO2018159432A1 PCT/JP2018/006364 JP2018006364W WO2018159432A1 WO 2018159432 A1 WO2018159432 A1 WO 2018159432A1 JP 2018006364 W JP2018006364 W JP 2018006364W WO 2018159432 A1 WO2018159432 A1 WO 2018159432A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mesenchymal stem
stem cells
cells
cell
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/006364
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
惟 上野
秀紀 野中
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rohto Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority to JP2019502921A priority Critical patent/JPWO2018159432A1/ja
Priority to EP18760998.7A priority patent/EP3591038A4/en
Priority to US16/490,790 priority patent/US20200016211A1/en
Priority to CN201880006900.3A priority patent/CN110177872A/zh
Publication of WO2018159432A1 publication Critical patent/WO2018159432A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1777—Integrin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood

Definitions

  • the present invention relates to a mesenchymal stem cell and a pharmaceutical composition.
  • Mesenchymal stem cells are pluripotent progenitor cells isolated from bone marrow for the first time by Friedenstein (1982) (Non-patent Document 1). It has been clarified that mesenchymal stem cells exist in various tissues such as bone marrow, umbilical cord, and fat, and mesenchymal stem cell transplantation is expected as a new treatment method for various intractable diseases ( (See Patent Documents 1 and 2). Recently, it is known that cells having equivalent functions exist in stromal cells such as adipose tissue, placenta, umbilical cord, and egg membrane. Therefore, the mesenchymal stem cell may be referred to as a stromal cell (Mesenchymal Stroma Cell).
  • the present invention aims to provide mesenchymal stem cells that are highly safe as pharmaceuticals in the situation described above.
  • mesenchymal stem cells mesenical stem (stromal) cells; MSCs
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • TF tissue factor
  • a pharmaceutical composition comprising the mesenchymal stem cell according to any one of [1] to [5].
  • a method for treating a disease characterized by using mesenchymal stem cells in which tissue factor (TF) is lowly expressed.
  • TF tissue factor
  • a method for treating a disease comprising using mesenchymal stem cells in which at least one integrin gene selected from the group consisting of ITGA11, ITGA1, ITGB5, ITGBL1, ITGB1 and ITGAV is lowly expressed.
  • a method for treating a disease comprising using mesenchymal stem cells in which at least one integrin gene selected from the group consisting of ITGA4, ITGA9, ITGA7, and ITGA10 is highly expressed.
  • mesenchymal stem cells that are highly safe when used as pharmaceuticals.
  • FIG. 1 is a diagram showing the cell size (particle diameter) of the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 2 shows TF mRNA expression in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing cell surface protein expression (FACS analysis) of TF in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 4 shows ITGB5 mRNA expression in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 5 shows ITGB1 mRNA expression in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 6 shows ITGA1 mRNA expression in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 7 shows ITGA11 mRNA expression in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram showing the cell size (particle diameter) of the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 2 shows TF mRNA expression in the mesenchymal stem cells of
  • FIG. 8 is a graph showing ITGAV mRNA expression in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 9 shows ITGA4 mRNA expression in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 10 shows ITGB1 mRNA expression in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 11 shows ITGA1 mRNA expression in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 12 shows ITGA4 mRNA expression in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 13 is a view showing mRNA expression of ITGA11 in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 14 shows ITGAV mRNA expression in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • FIG. 15 shows ITGB5 mRNA expression in the mesenchymal stem cells of the present invention.
  • mesenchymal stem cells of the present invention and pharmaceutical compositions containing the same will be described in detail.
  • mesenchymal stem cells and pharmaceutical compositions containing the same are characterized by low expression of tissue factor (hereinafter also referred to as “TF”).
  • tissue factor hereinafter also referred to as “TF”.
  • Tissue factor is a 47kD glycoprotein consisting of 295 amino acids. TNF, IL-1, acute phase protein, thrombin, endotoxin and other mediators, and brain, lung, placenta-rich tissues Expression (local factors) induces expression on the surface of whole body vascular endothelial cells and monocytes. TF is F. Binds to VII; It is known to be involved in the origin of physiological extrinsic coagulation by activating VII.
  • low expression of TF includes low expression of TF mRNA in cells, low expression of TF protein, or both low expression.
  • the mesenchymal stem cell of the present invention only needs to express TF at a lower level than other cells.
  • the mesenchymal stem cell of the present invention can be used under conventional culture conditions (for example, 10 It is only necessary that TF is expressed at a low level as compared to mesenchymal stem cells obtained by culturing with% FBS-containing Minimum Medium medium (MEM ⁇ ) medium.
  • MEM ⁇ Minimum Medium medium
  • it is 90% or less, more preferably 80% or less, still more preferably 70% or less, and particularly preferably 60% or less compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions.
  • the mesenchymal stem cell of the present invention is characterized in that at least one integrin gene selected from the group consisting of ITGA11, ITGA1, ITGB5, ITGBL1, ITGB1 and ITGAV is low-expressed. Furthermore, the mesenchymal stem cell of the present invention is characterized in that at least one integrin gene selected from the group consisting of ITGA4, ITGA9, ITGA7 and ITGA10 is highly expressed.
  • Integrins are known to be cell surface proteins that interact with extracellular matrix and transmit intracellular signals in response to extracellular matrix information such as cell shape / motility and cell cycle progression.
  • integrin-related gene is low or high means that the mRNA expression of the integrin-related gene is low or high, or the integrin-related gene protein is low or high. Is low expression or high expression.
  • the mesenchymal stem cell of the present invention may be any gene as long as the integrin-related gene is expressed at a low level or high level compared to other cells.
  • the integrin-related gene only needs to be low or highly expressed as compared to the mesenchymal stem cells obtained below (for example, culture with 10% FBS-containing Medium Medium alpha (MEM ⁇ ) medium).
  • Low expression of integrin-related genes is preferably 90% or less, more preferably 80% or less, even more preferably 70% or less, and particularly preferably 60% compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions. It is expressed below.
  • low expression of ITGA1 is preferably 50% or less, more preferably 40% or less, even more preferably 30% or less, particularly preferably compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions. Is expressed at 20% or less.
  • ITGA11 being low-expressed is preferably 10% or less, more preferably 5% or less, still more preferably 1% or less, and particularly preferably 0.5% compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions. It is expressed below.
  • ITGB5 is preferably 70% or less, more preferably 60% or less, still more preferably 50% or less, particularly preferably 40% or less compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions. is doing.
  • ITGB1 is lowly expressed, preferably 90% or less, more preferably 80% or less, even more preferably 75% or less, particularly preferably 70% or less compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions. is doing.
  • the expression of ITGBL1 is preferably 70% or less, more preferably 40% or less, still more preferably 30% or less, particularly preferably 25% or less compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions. is doing.
  • ITGAV is lowly expressed, preferably 80% or less, more preferably 70% or less, even more preferably 60% or less, particularly preferably 35% or less compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions. is doing.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention may have low expression of ITGAE, ITGA ⁇ , ITGB7, or ITGA5 compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions.
  • High expression of an integrin-related gene is preferably 110% or more, more preferably 120% or more, still more preferably 130% or more, particularly preferably 150%, compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions. It is expressed above.
  • high expression of ITGA10 is preferably 200% or more, more preferably 500% or more, still more preferably 750% or more, particularly preferably compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions. Is expressed over 900%.
  • High expression of ITGA7 is preferably 150% or more, more preferably 200% or more, still more preferably 300% or more, particularly preferably 400% or more compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions. is doing.
  • High expression of ITGA9 is preferably 130% or more, more preferably 150% or more, still more preferably 200% or more, particularly preferably 250% or more compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions. is doing.
  • ITGA4 is highly expressed, preferably 120% or more, more preferably 150% or more, still more preferably 180% or more, particularly preferably 200% or more compared to mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions. is doing.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention may have higher expression of ITGA3 or ITGB3 than mesenchymal stem cells obtained under conventional culture conditions.
  • mesenchymal stem cells are one or more cells belonging to the mesenchymal system (bone cells, cardiomyocytes, chondrocytes, tendon cells, adipocytes, etc.), preferably two or more cells, more preferably three or more types. It means a cell that has the ability to differentiate into cells and can proliferate while maintaining the ability.
  • the term mesenchymal stem cell used in the present invention means the same cell as the stromal cell, and does not particularly distinguish them. Moreover, it may be simply described as a mesenchymal cell.
  • tissues containing mesenchymal stem cells include adipose tissue, umbilical cord, bone marrow, umbilical cord blood, endometrium, placenta, amniotic membrane, chorion, decidua, dermis, skeletal muscle, periosteum, dental follicle, periodontal ligament, Examples include dental pulp and tooth germ.
  • an adipose tissue-derived mesenchymal stem cell means a mesenchymal stem cell contained in an adipose tissue, and may be referred to as an adipose tissue-derived stromal cell.
  • adipose tissue-derived mesenchymal stem cells adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, placenta-derived mesenchymal stem cells from the viewpoints of efficacy and treatment for various diseases.
  • Dental pulp-derived mesenchymal stem cells are preferred, adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells are more preferred, and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells are more preferred.
  • the mesenchymal stem cells in the present invention may be derived from the same species as the subject to be treated (subject) or from a different species.
  • examples of the mesenchymal stem cell species in the present invention include humans, monkeys, horses, cows, sheep, pigs, dogs, cats, rabbits, mice, rats, and preferably cells derived from the same species as the subject to be treated (subject). It is.
  • the mesenchymal stem cells in the present invention may be derived from the subject (subject) to be treated, that is, autologous cells (allogeneic), or derived from another subject of the same species, ie, allogeneic cells (allogeneic). ). Preferred are allogeneic cells (allogeneic).
  • the mesenchymal system in the pharmaceutical composition of the present invention is prepared by pre-culturing donor cells that have been prepared in advance and cryopreserved. Can be used as stem cells. Therefore, compared to the case of preparing and using autologous mesenchymal stem cells, commercialization is easy, and from the viewpoint that a certain effect can be easily obtained stably, the mesenchymal stem cells in the present invention, More preferably, it is allogeneic.
  • the mesenchymal stem cell means an arbitrary cell population including the mesenchymal stem cell.
  • the cell population is at least 20% or more, preferably 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 96%, 97%, 98 % Or 99% are mesenchymal stem cells.
  • an adipose tissue means a tissue containing stromal cells including adipocytes and microvascular cells, and is, for example, a tissue obtained by surgical excision or aspiration of mammalian subcutaneous fat.
  • Adipose tissue can be obtained from subcutaneous fat.
  • the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells described later are preferably obtained from the same animal as the subject of administration, and considering administration to humans, human subcutaneous fat is more preferable.
  • An individual supplying subcutaneous fat may be alive or dead, but the adipose tissue used in the present invention is preferably a tissue collected from a living individual.
  • liposuction is exemplified by PAL (power assist) liposuction, Erconia laser liposuction, or body jet liposuction. From the viewpoint of maintaining the state of cells, ultrasound is used. It is preferable not to use.
  • the umbilical cord is a white tubular tissue that connects the fetus and the placenta, and is composed of umbilical vein, umbilical artery, collagenous tissue (Wharton's Jelly), umbilical matrix itself, etc., and mesenchymal stem cells Including many.
  • the umbilical cord is preferably obtained from the same animal as the subject (administration subject) using the mesenchymal stem cells of the present invention, and more preferably in consideration of administering the mesenchymal stem cells of the present invention to humans.
  • the human umbilical cord is a white tubular tissue that connects the fetus and the placenta, and is composed of umbilical vein, umbilical artery, collagenous tissue (Wharton's Jelly), umbilical matrix itself, etc.
  • mesenchymal stem cells Including many.
  • the umbilical cord is preferably obtained from the same animal as the subject (administration subject) using the mesenchymal stem cells of the present invention, and more
  • the bone marrow refers to a soft tissue filling the bone lumen, and is a hematopoietic organ.
  • Bone marrow fluid is present in the bone marrow, and the cells present therein are called bone marrow cells.
  • Bone marrow cells include erythrocytes, granulocytes, megakaryocytes, lymphocytes, adipocytes and the like, as well as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, vascular endothelial progenitor cells, and the like.
  • Bone marrow cells can be collected, for example, from human iliac bone, long bone, or other bone.
  • the tissue-derived mesenchymal stem cells such as adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, and bone marrow-derived mesenchymal stem cells are adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, respectively. It means any cell population containing mesenchymal stem cells derived from each tissue such as stem cells and bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • the cell population is at least 20% or more, preferably 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 96%, 97%, 98 % Or 99% are mesenchymal stem cells derived from each tissue such as adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, and bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells in the present invention include, for example, growth characteristics (for example, population doubling ability from passage to aging, doubling time), karyotype analysis (for example, normal Karyotype, maternal or neonatal line), surface marker expression by flow cytometry (eg FACS analysis), immunohistochemistry and / or immunocytochemistry (eg epitope detection), gene expression profiling (eg gene chip array; Polymerase chain reaction such as reverse transcription PCR, real-time PCR, conventional PCR), miRNA expression profiling, protein array, protein secretion such as cytokine (eg, plasma coagulation analysis, ELISA, cytokine array), metabolite (metabolome analysis), book Features by other methods known in the field It may be kicked.
  • growth characteristics for example, population doubling ability from passage to aging, doubling time
  • karyotype analysis for example, normal Karyotype, maternal or neonatal line
  • surface marker expression by flow cytometry eg FACS analysis
  • mesenchymal stem cells are not particularly limited, for example, it can be prepared as follows. That is, mesenchymal stem cells are isolated and cultured from adipose tissue, umbilical cord, bone marrow, and other tissues according to a method known to those skilled in the art, and anti-TF antibody that specifically binds to TF is used to produce low TF expressing cells. It can be obtained by separating with a cell sorter or removing cells with high TF expression with magnetic beads or the like.
  • mesenchymal stem cells with low TF expression can also be obtained by inducing mesenchymal stem cells with low TF expression by culturing using a specific medium.
  • 50% or more of the cell population is preferably low TF expression, 70% or more is preferably low TF expression, and 80% or more is low TF expression. More preferably, 90% or more is particularly preferably low TF expression, and most preferably a substantially uniform cell population with low TF expression.
  • the method for preparing mesenchymal stem cells with low or high expression of each integrin-related gene (protein) is not particularly limited, and for example, it can be prepared as follows. That is, integrin-related gene (protein) low-expressing cells are specifically bound to integrin-related proteins by isolating and culturing mesenchymal stem cells from adipose tissue, umbilical cord, bone marrow, and other tissues according to methods known to those skilled in the art. Can be obtained by separating the cells with a cell sorter or removing cells with high expression of integrin-related protein with magnetic beads or the like.
  • Integrin-related gene (protein) high-expressing cells are specifically bound to integrin-related proteins by isolating and culturing mesenchymal stem cells from adipose tissue, umbilical cord, bone marrow, and other tissues according to methods known to those skilled in the art.
  • the antibody can be obtained by separation using a cell sorter.
  • mesenchymal stem cells with low or high expression of integrin-related gene (protein) by culturing using a specific medium, mesenchymal stem cells with low or high expression of integrin-related gene (protein) It can also be acquired.
  • 50% or more of the cell population is preferably a cell showing each characteristic (integrin-related gene (protein) low expression or high expression), and 70% or more shows each characteristic. More preferably, it is a cell, more preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more, and most preferably a uniform cell population substantially showing each characteristic.
  • Mesenchymal stem cells can be prepared by methods well known to those skilled in the art. Below, the preparation method of an adipose tissue origin mesenchymal stem cell is demonstrated as an example.
  • Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells may be obtained, for example, by the production method described in US Pat. No. 6,777,231.
  • the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells can be produced by a method including the following steps (i) to (iii). it can:
  • washing may be performed by sedimentation with vigorous stirring using a physiologically compatible saline solution (eg, phosphate buffered saline (PBS)).
  • PBS physiologically compatible saline
  • impurities also called debris, such as damaged tissue, blood, and red blood cells
  • washing and sedimentation are generally repeated until the debris is totally removed from the supernatant. Since the remaining cells exist as lumps of various sizes, in order to dissociate them while minimizing damage to the cells themselves, the washed cell lumps are made to have an enzyme (eg, an enzyme that weakens or breaks cell-cell junctions).
  • collagenase dispase or trypsin.
  • the amount of such enzyme and the duration of treatment vary depending on the conditions used, but are known in the art.
  • the cell mass can be broken down by other treatment methods such as mechanical agitation, ultrasonic energy, thermal energy, etc., but with minimal cell damage
  • an enzyme in order to minimize harmful effects on cells, it is desirable to deactivate the enzyme using a medium or the like after a suitable period of time.
  • the cell suspension obtained by the step (i) includes a slurry or suspension of aggregated cells, and various kinds of contaminated cells such as erythrocytes, smooth muscle cells, endothelial cells, and fibroblasts. Therefore, the cells in the aggregated state and these contaminated cells may be separated and removed, but they can be removed by adhesion and washing in step (iii) to be described later. May be. When contaminating cells are separated and removed, this can be achieved by centrifugation that forcibly separates the cells into a supernatant and a precipitate. The resulting precipitate containing contaminating cells is suspended in a physiologically compatible solvent.
  • Suspended cells may contain erythrocytes, but erythrocytes are excluded by selection by adhesion to the individual surface described later, and thus a lysis step is not always necessary.
  • a method for selectively lysing erythrocytes for example, a method well known in the art such as incubation in a hypertonic medium or a hypotonic medium by lysis with ammonium chloride can be used. After lysis, the lysate may be separated from the desired cells, for example, by filtration, centrifugation, or density fractionation.
  • the cells in step (ii), in order to increase the purity of the mesenchymal stem cells in the suspended cells, the cells may be washed once or continuously several times, centrifuged, and resuspended in the medium. Alternatively, cells may be separated based on cell surface marker profile or based on cell size and granularity.
  • the medium used in the resuspension is not particularly limited as long as it is a medium capable of culturing mesenchymal stem cells, but such a medium includes basal medium added with serum and / or albumin, transferrin, fatty acid, One or more serum substitutes such as insulin, sodium selenite, cholesterol, collagen precursor, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol, and the like may be added.
  • substances such as lipids, amino acids, proteins, polysaccharides, vitamins, growth factors, low molecular compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, etc. are added as necessary. May be.
  • basal medium examples include IMDM, Medium 199, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), MEM, MEM ⁇ , Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's F16 medium, and RP's F16 medium.
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • MEM MEM
  • MEM ⁇ MEM ⁇
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • RP's F16 medium RP's F16 medium.
  • MCDB201 medium mixed medium thereof and the like.
  • the serum examples include, but are not limited to, human serum, fetal bovine serum (FBS), bovine serum, calf serum, goat serum, horse serum, pig serum, sheep serum, rabbit serum, rat serum and the like.
  • FBS fetal bovine serum
  • bovine serum bovine serum
  • calf serum goat serum
  • horse serum horse serum
  • pig serum sheep serum
  • rabbit serum rat serum
  • 5 v / v% to 15 v / v% preferably 10 v / v% may be added to the basal medium.
  • fatty acid examples include, but are not limited to, linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, palmitoyl acid, palmitic acid, and stearic acid.
  • lipid examples include, but are not limited to, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and the like.
  • Amino acids include, but are not limited to, for example, L-alanine, L-arginine, L-aspartic acid, L-asparagine, L-cysteine, L-cystine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-glycine and the like.
  • proteins include, but are not limited to, ecotin, reduced glutathione, fibronectin and ⁇ 2-microglobulin.
  • polysaccharide examples include glycosaminoglycans, and among the glycosaminoglycans, hyaluronic acid, heparan sulfate and the like are particularly exemplified, but the polysaccharide is not limited thereto.
  • Growth factors include, for example, platelet derived growth factor (PDGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), transforming growth factor beta (TGF- ⁇ ), hepatocyte growth factor (HGF), epidermal growth factor (EGF) Examples include, but are not limited to, connective tissue growth factor (CTGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), and the like.
  • PDGF platelet derived growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor beta
  • HGF hepatocyte growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • CTGF connective tissue growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • a (xeno-free) medium that does not contain components derived from different species such as serum.
  • examples of such a medium include mesenchymal systems from PromoCell, Lonza, Biological Industries, Veritas, R & D Systems, Corning, and Roto.
  • a medium provided as a medium prepared in advance for stem cells (stromal cells) may be used.
  • the appropriate cell density and the appropriate cell medium are used on the solid surface without differentiating the cells in the cell suspension obtained in step (ii).
  • Culture under culture conditions the “solid surface” means any material that enables binding and adhesion of the adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in the present invention.
  • such a material is a plastic material that has been treated to promote the attachment and adhesion of mammalian cells to its surface.
  • the shape of the culture vessel having a solid surface is not particularly limited, but a petri dish or a flask is preferably used. The cells are washed after incubation to remove unbound cells and cell debris.
  • cells that finally remain attached and adhered to the solid surface can be selected as a cell population of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.
  • the surface antigen may be analyzed by a conventional method using flow cytometry or the like. Further, the ability to differentiate into each cell line may be examined, and such differentiation can be performed by conventional methods.
  • the mesenchymal stem cell in the present invention can be prepared as described above, but it expresses TF at a low level, and at least one integrin selected from the group consisting of ITGA11, ITGA1, ITGB5, ITGBL1, ITGB1 and ITGAV
  • at least one integrin gene selected from the group consisting of ITGA4, ITGA9, ITGA7 and ITGA10 it may be defined as a cell having the following characteristics: ; (1) It exhibits adhesiveness to plastic under the culture conditions in a standard medium. (2) The surface antigens CD44, CD73, CD90 are positive, CD31, CD45 are negative, (3) Differentiating into bone cells, adipocytes, and chondrocytes under culture conditions.
  • TF protein By selectively separating cells expressing low TF protein from mesenchymal stem cells obtained by the above step (iii) by an immunological technique using a cell sorter, magnetic beads, etc., TF protein Can be obtained. Further, by performing culture in a specific medium that can induce low expression of TF, low expression of TF in mesenchymal stem cells can be induced, and mesenchymal stem cells expressing low TF can be efficiently obtained. Furthermore, from the mesenchymal stem cells obtained in the above step (iii), using an antibody that specifically binds to an integrin-related protein, the cells are separated with a cell sorter, or cells with high integrin-related protein expression are removed with magnetic beads or the like.
  • Integrin-related gene (protein) low-expressing cell By this, an integrin-related gene (protein) low-expressing cell can be obtained. Integrin-related gene (protein) highly expressing cells are obtained from the mesenchymal stem cells obtained in the above step (iii) by separating them with a cell sorter using an antibody that specifically binds to the integrin-related protein. be able to. In addition, by inducing mesenchymal stem cells with low or high expression of integrin-related gene (protein) by culturing using a specific medium, mesenchymal stem cells with low or high expression of integrin-related gene (protein) It can also be acquired. As an example, a specific method for selective separation of low TF expressing cells by an immunological technique using a cell sorter will be described below.
  • the cell suspension obtained by treating the prepared mesenchymal stem cells with a trypsin / EDTA solution or the like is centrifuged (room temperature, 400 G, 5 minutes) to remove the supernatant.
  • Staining Buffer 1% BSA-PBS
  • Staining Buffer 1% BSA-PBS
  • An antibody PE Mouse anti-human CD142 Clone HTF-1, manufactured by BD Biosciences, 550312
  • PI Buffer prepared by adding Propium iodide solution (manufactured by SIGMA, P4864) to Staining buffer to a final concentration of 5 to 20 ug / mL
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • the mesenchymal stem cell according to the present invention may be a cell that has been appropriately cryopreserved and thawed as long as it has a disease therapeutic effect.
  • cryopreservation can be performed by suspending and cooling mesenchymal stem cells in a cryopreservation solution well known to those skilled in the art.
  • the suspension can be performed by detaching the cells with a release agent such as trypsin, transferring the cells to a cryopreservation container, treating them appropriately, and then adding a cryopreservation solution.
  • the cryopreservation solution may contain DMSO (dimethylsulfoxide) as a frost damage protective agent.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • DMSO substitutes include glycerol, propylene glycol, polysaccharides and sugar alcohols.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • it contains a concentration of 5% to 20%, preferably a concentration of 5% to 10%, more preferably a concentration of 10%.
  • additives described in WO2007 / 058308 may be included.
  • cryopreservation solution for example, cryopreservation provided by Bioverde, Nippon Genetics, Reprocell, Xenoac, Cosmo Bio, Kojin Bio, Thermo Fisher Scientific, etc.
  • a liquid may be used.
  • the cooling rate may be appropriately controlled using a program freezer.
  • the cooling rate may be appropriately selected depending on the components of the cryopreservation solution, and may be performed according to the manufacturer's instructions for the cryopreservation solution.
  • the upper limit of the storage period is not particularly limited as long as the cells cryopreserved under the above conditions are thawed and retain the same properties as before freezing, for example, 1 week or more, 2 weeks or more, 3 weeks or more, 4 weeks or more, 2 months or more, 3 months or more, 4 months or more, 5 months or more, 6 months or more, 1 year or more, or more. Since cell damage can be suppressed by storing at a lower temperature, it may be transferred to a gas phase on liquid nitrogen (from about ⁇ 150 ° C. to ⁇ 180 ° C.). When storing in a gas phase on liquid nitrogen, it can be performed using a storage container well known to those skilled in the art. Although not particularly limited, for example, when storing for 2 weeks or more, it is preferable to store in a gas phase on liquid nitrogen.
  • the thawed mesenchymal stem cells may be appropriately cultured before the next cryopreservation.
  • the mesenchymal stem cells are cultured using the above-described medium capable of culturing mesenchymal stem cells, and are not particularly limited. However, at a culture temperature of about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., the CO 2 -containing air is cultured. It may be performed under an atmosphere. The CO 2 concentration is about 2-5%, preferably about 5%. In culture, after reaching the appropriate confluency for the culture container (for example, cells may occupy 50% to 80% of the culture container), the cells are detached with a release agent such as trypsin.
  • a release agent such as trypsin.
  • the culture may be continued by seeding in a separately prepared culture vessel at an appropriate cell density.
  • typical cell densities are 100 cells / cm 2 to 100,000 cells / cm 2 , 500 cells / cm 2 to 50,000 cells / cm 2 , 1,000 to 10,000 cells. / Cm 2 , 2,000 to 10,000 cells / cm 2, etc. are exemplified.
  • the cell density is between 2,000 and 10,000 cells / cm 2 . It is preferable to adjust the period until reaching appropriate confluency from 3 days to 7 days. During culture, the medium may be changed as necessary.
  • Thawing of cryopreserved cells can be performed by methods well known to those skilled in the art. For example, the method performed by standing or shaking in a 37 degreeC thermostat or a hot water bath is illustrated.
  • the mesenchymal stem cell of the present invention may be a cell in any state, for example, a cell recovered by detaching a cell in culture or a cell frozen in a cryopreservation solution Good.
  • a cell recovered by detaching a cell in culture or a cell frozen in a cryopreservation solution Good Use of the same lot of cells obtained by expanding and culturing in the same lot is preferable in that the same action and effect can be stably obtained and the handling property is excellent.
  • the mesenchymal stem cells in a cryopreserved state may be thawed immediately before use and directly mixed with a solution such as an infusion solution or a medium while being suspended in the cryopreservation solution.
  • the cryopreservation solution may be removed by a method such as centrifugation and then suspended in a solution such as an infusion solution or a medium.
  • the “infusion” in the present invention refers to a solution used in human treatment, and is not particularly limited.
  • physiological saline JP physiological saline, 5% glucose solution, JP Glucose injection, Ringer solution, JP Ringer solution, Lactated Ringer solution, Ringer acetate solution, No. 1 solution (starting solution), No. 2 solution (dehydration replenishment solution), No. 3 solution (maintenance solution), No. 4 solution (postoperative recovery solution) Etc.
  • mesenchymal stem cells of the present invention are used in a pharmaceutical composition, as long as the effects of the present invention are not impaired, in addition to the mesenchymal stem cells, according to their use and form, according to conventional methods, pharmaceutically Acceptable carriers and additives may be included.
  • pharmaceutically Acceptable carriers and additives include isotonic agents, thickeners, sugars, sugar alcohols, preservatives (preservatives), bactericides or antibacterial agents, pH regulators, stabilizers, chelating agents.
  • Oily base Oily base, gel base, surfactant, suspending agent, binder, excipient, lubricant, disintegrant, foaming agent, fluidizer, dispersant, emulsifier, buffer, solubilizer , Antioxidants, sweeteners, sour agents, colorants, flavoring agents, fragrances or refreshing agents, but are not limited thereto.
  • typical components include the following carriers and additives.
  • Examples of the carrier include aqueous carriers such as water and hydrous ethanol; examples of the isotonic agent (inorganic salt) include sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride and magnesium chloride; examples of the polyhydric alcohol include , Glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol and the like; Examples of the thickener include carboxyvinyl polymer, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, methylcellulose, alginic acid, polyvinyl alcohol (completely or partially saponified product), polyvinylpyrrolidone, macrogol Sugars such as cyclodextrin and glucose; sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, mannitol and the like (these may be d-form, l-form or dl-form) As a preservative, bactericidal agent or antibacterial agent, for example, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, alkyldiamino
  • the mesenchymal stem cells of the present invention can be provided in various forms according to the purpose, for example, various dosage forms such as a solid preparation, a semi-solid preparation, and a liquid preparation.
  • various dosage forms such as a solid preparation, a semi-solid preparation, and a liquid preparation.
  • solid preparations tablets, powders, powders, granules, capsules, etc.
  • semi-solid preparations [ointment (hard ointment, ointment etc.), creams, etc.]
  • liquid preparations (lotions, extracts, suspensions) Suspensions, emulsions, syrups, injections (including infusions, implants, continuous injections, injections prepared at the time of use), dialysis agents, aerosols, soft capsules, drinks, etc.] patches
  • It can be used in the form of an agent, a poultice and the like.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention can also be used in the form of solutions or emulsions in oily or aqueous vehicles. Furthermore, the mesenchymal stem cells of the present invention can also be applied to the affected area by spraying, and the mesenchymal stem cells of the present invention can also be used in the form of gelation or sheeting at the affected area after spraying. The mesenchymal stem cells of the present invention can be applied to the affected area after the mesenchymal stem cells are formed into a sheet or a three-dimensional structure.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention are physiological saline, JP saline, 5% glucose solution, JP glucose injection solution, Ringer solution, JP Ringer solution, lactated Ringer solution, acetate Ringer solution, bicarbonate Ringer solution, No. 1 solution ( Suspension or dilution using an infusion solution such as start solution), No. 2 solution (dehydration replenisher solution), No. 3 solution (maintenance solution), No. 4 solution (post-surgical recovery solution), or a cell culture medium such as DMEM
  • it is used by suspending or diluting with physiological saline, 5% glucose solution, No. 1 solution (starting solution), more preferably 5% glucose solution, No. 1 solution (starting solution). be able to.
  • the pH of the liquid agent is not particularly limited as long as it is within a pharmaceutically, pharmacologically (pharmaceutically) or physiologically acceptable range.
  • An example is a range of 2.5 to 9.0, preferably 3.0 to 8.5, and more preferably 3.5 to 8.0.
  • the osmotic pressure of the liquid agent is not particularly limited as long as it is within a range acceptable for a living body.
  • a range of preferably 0.7 to 5.0, more preferably 0.8 to 3.0, still more preferably 0.9 to 1.4 can be mentioned.
  • the osmotic pressure can be adjusted by a method known in the art using inorganic salts, polyhydric alcohols, sugar alcohols, saccharides and the like.
  • the osmotic pressure ratio is the ratio of the osmotic pressure of the sample to the osmotic pressure of 286 mOsm (0.9 w / v% sodium chloride aqueous solution) based on the 15th revised Japanese Pharmacopoeia. Measure by referring to the freezing point method.
  • the standard solution for osmotic pressure ratio measurement (0.9 w / v% sodium chloride aqueous solution) was prepared by drying sodium chloride (Japanese Pharmacopoeia standard reagent) at 500 to 650 ° C. for 40 to 50 minutes, and then in a desiccator (silica gel).
  • the mixture is allowed to cool and 0.900 g is accurately weighed and dissolved in purified water to make exactly 100 mL, or a commercially available standard solution for osmotic pressure ratio measurement (0.9 w / v% sodium chloride aqueous solution) is used.
  • the administration route to the subject of the mesenchymal stem cells of the present invention includes oral administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration, intraarterial administration, intrathecal administration, intraperitoneal administration, sublingual administration, transrectal administration, Examples include vaginal administration, intraocular administration, nasal administration, inhalation, transdermal administration, implant, spraying on the liver surface, and direct administration by attaching a sheet, etc., but the mesenchymal stem cells of the present invention are administered intravenously.
  • intravascular administration such as intravenous administration and intraarterial administration is preferred, and intravenous administration is most preferred.
  • the dose (dosage) of the mesenchymal stem cells of the present invention may vary depending on the patient's condition (body weight, age, symptoms, physical condition, etc.) and the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention. From the standpoint of performance, the larger amount tends to be preferable, while from the viewpoint of suppressing the occurrence of side effects, the smaller amount tends to be preferable.
  • the number of cells is 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 12 cells / time, preferably 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 11 cells / time, more preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 10 cells / time, and further preferably 5 ⁇ 10 5. 6 to 1 ⁇ 10 9 pieces / time.
  • the dose per body weight of the patient is 1 ⁇ 10 to 5 ⁇ 10 10 cells / kg, preferably 1 ⁇ 10 2 to 5 ⁇ 10 9 cells / kg, more preferably 1 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 8 cells / kg, and further preferably 1 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10. 7 / kg.
  • this dose may be administered multiple times as a single dose, or this dose may be administered in multiple doses.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention may be administered together with one or more other drugs.
  • other drugs it can be used as a liver therapeutic agent, heart disease therapeutic agent, inflammatory bowel disease therapeutic agent, respiratory agent, nervous system agent, cardiovascular agent, cerebral circulation improving agent, immunosuppressant agent Any drug may be mentioned.
  • liver therapeutic agents examples include hepatitis B therapeutic agents (lamivudine, adefovir, entecavir, tenofovir, etc.), interferon preparations (interferon ⁇ , interferon ⁇ -2b, interferon ⁇ , peginterferon ⁇ -2a, peginterferon ⁇ -2b, etc.
  • hepatitis C drugs ribavirin, terapyrevir, simeprevir, vaniprevir, daclatasvir, asunaprevir, sofosbuvir, etc.
  • corticosteroids prednisolone, methylprednisolone sodium succinate, etc.
  • anticoagulants dry concentrated human antithrombin III
  • antidote calcium edetate disodium hydrate, glutathione, dimethicaprol, sodium thiosulfate hydrate, Sugamasekuna Human serum albumin, liver extract, ursodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, azathioprine, bezafibrate, amino acids (glycine, L-cysteine, L-isoleucine, L-leucine, L-valine, L-threonine, L-serine,
  • therapeutic agents for heart diseases include ACE inhibitors, angiotensin II receptor antagonists, ⁇ -blockers, antiplatelet agents, warfarin, calcium antagonists, nitrates, diuretics, HMG-CoA reductase inhibitors, ancarons Etc.
  • Examples of the therapeutic agent for inflammatory bowel disease include salazosulfapyridine and mesalazine.
  • Examples of the respiratory medicine include dimorpholine, doxapram hydrochloride hydrate, cyberestat sodium hydrate, pirfenidone, pulmonary surfactant, and Dornase alpha.
  • Examples of the nervous system drug include edaravone, interferon beta-1a, interferon beta-1b, fingolimod hydrochloride, riluzole, tartilelin hydrate and the like.
  • circulatory drugs examples include hepronicart, midodrine hydrochloride, amedinium methylmethyl sulfate, ethylephrine hydrochloride, phenylephrine hydrochloride, and the like.
  • cerebral circulation improving drug examples include ifenprodil tartrate, nicergoline, ipdilast, dihydroergotoxin mesylate, nizophenone fumarate, fasudil hydrochloride hydrate and the like.
  • immunosuppressant examples include cyclosporine, azathioprine, mizoribine, basiliximab, tacrolimus hydrate, gusperimus hydrochloride, mycophenolate mofetil, everolimus and the like.
  • the mesenchymal stem cells and the other drugs may be stored in the same container or stored in another container. It may be. Depending on the type of disease, treatment method, patient condition, etc., other drugs and mesenchymal stem cells may be administered simultaneously or at regular intervals.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention can be suitably used for the treatment of various diseases.
  • visceral diseases specifically heart disease, stomach / duodenal disease, small intestine / colon disease, liver disease, biliary disease, pancreatic disease, kidney disease, lung disease, mediastinal disease, diaphragm disease, pleural disease, peritoneal disease
  • CNS central nervous system
  • peripheral arterial diseases and peripheral venous diseases.
  • Specific diseases include, for example, autoimmune hepatitis, fulminant hepatitis, chronic hepatitis, viral hepatitis, alcoholic hepatitis, nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), nonalcoholic steatohepatitis (Nonalcoholic steatohepatitis (NASH)), non-alcoholic fatty liver (NAFL), liver fibrosis, cirrhosis, liver cancer, fatty liver, drug allergic liver disorder, hemochromatosis, hemosiderosis, Wilson's disease, primary Hepatic diseases such as biliary cirrhosis (PBC), primary sclerosing cholangitis (PSC), biliary atresia, liver abscess, chronic active hepatitis, chronic persistent hepatitis; myocardial infarction, heart failure, arrhythmia, palpitations, cardiomyopathy, false blood Cardiomyopathy, angina, congenital heart disease, valvular heart disease, myocarditis,
  • biliary tract diseases such as acute cholecystitis, acute cholangitis, chronic cholecystitis, cholangiocarcinoma, gallbladder cancer
  • pancreatic diseases such as acute pancreatitis, chronic pancreatitis, pancreatic cancer
  • acute nephritis, chronic nephritis, acute renal failure chronic Renal diseases such as renal failure
  • Diaphragmatic diseases such as diaphragmatic hernia
  • Pleural diseases such as pleurisy, pyothorax, pleural tumor, cancerous pleurisy, pleural mesothelioma
  • Peritoneal diseases such as peritonitis, peritoneal tumor
  • Aseptic meningitis Guillain-Barre syndrome, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), myasthenia gravis, mononeuropathy, polyneuropathy, spinal muscular atrophy, spinal disorder, acute transverse myelitis, spinal cord infarction (false) Hematologic spinal cord disorder), intracranial tumor, spine
  • Neurological diseases such as tumors; CNS disorders such as Alzheimer's disease, cognitive impairment, stroke, multiple sclerosis, Parkinson's disease; fibromyalplasia, peripheral arterial disease (PAD), obstructive thromboangitis (Burger's disease), Kawasaki Peripheral arterial disease such as KD disease; deep vein
  • liver diseases, heart diseases, lung diseases, neurological diseases, peripheral arterial diseases, immunodeficiency diseases that have been confirmed to have sufficient therapeutic effects by mesenchymal stem cells are preferred, among which liver fibrosis, Suitable for the treatment of cirrhosis, myocardial infarction, heart failure, pulmonary fibrosis, interstitial pneumonia, childhood cerebral palsy, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), peripheral arterial disease (PAD), graft-versus-host disease (GVHD) And can be used more suitably for liver fibrosis, cirrhosis, myocardial infarction, heart failure, pulmonary fibrosis, and interstitial pneumonia.
  • liver fibrosis Suitable for the treatment of cirrhosis, myocardial infarction, heart failure, pulmonary fibrosis, interstitial pneumonia, childhood cerebral palsy, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), peripheral arterial disease (PAD), graft-versus-host disease (GVHD)
  • ALS amyo
  • the present invention provides at least one selected from the group consisting of mesenchymal stem cells with low expression of tissue factor (TF), ITGA11, ITGA1, ITGB5, ITGBL1, ITGB1 and ITGAV.
  • TF tissue factor
  • ITGA11 tissue factor
  • ITGA1, ITGB5, ITGBL1, ITGB1 and ITGAV tissue factor
  • a mesenchymal stem cell characterized by low expression of an integrin gene, or at least one integrin gene selected from the group consisting of ITGA4, ITGA9, ITGA7 and ITGA10 is highly expressed
  • a method of treating a disease using a stem cell that is, according to the present invention, by administering the mesenchymal stem cells of the present invention to patients with various diseases, it is possible to achieve a high safety and therapeutic effect for various diseases.
  • the description in the above-mentioned section of [Mesenchymal stem cell and pharmaceutical composition containing it] is applicable.
  • the present invention also includes a method for determining whether or not a mesenchymal stem cell is suitable for treatment of a disease. That is, the determination method of the present invention comprises the step of measuring the expression of tissue factor (TF) of mesenchymal stem cells, at least one integrin gene selected from the group consisting of ITGA11, ITGA1, ITGB5, ITGBL1, ITGB1 and ITGAV. A step of measuring expression, and a step of measuring the expression of at least one integrin gene selected from the group consisting of ITGA4, ITGA9, ITGA7 and ITGA10.
  • TF tissue factor
  • tissue factor (TF) in mesenchymal stem cells is low, and the expression of at least one integrin gene selected from the group consisting of ITGA11, ITGA1, ITGB5, ITGBL1, ITGB1 and ITGAV is low.
  • a cell that has been confirmed to be highly expressed and that the expression of at least one integrin gene selected from the group consisting of ITGA4, ITGA9, ITGA7, and ITGA10 is highly expressed can be determined to be highly safe in disease treatment.
  • the description in the above section [Mesenchymal stem cells and pharmaceutical compositions containing them] can be applied.
  • Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hereinafter “ADSC”) (manufactured by Lonza, product number PT-5006) were cultured from P2 to P4 using a serum-free medium for mesenchymal stem cells (Rohto). In P4 to P5, the cells were cultured for 3 days using a serum-free medium for mesenchymal stem cells or 10% FBS serum medium (Minimum Essential Medium alpha (MEM ⁇ )). The ADSC attached to the flask was peeled off using trypsin, transferred to a centrifuge tube, and centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes to obtain a cell precipitate.
  • ADSC Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells
  • a cell cryopreservation solution (STEM-CELLBANKER (Zenoac)) was added and suspended.
  • the cell suspension was dispensed into a cryotube, stored in a freezer at ⁇ 80 ° C., transferred to a gas phase on liquid nitrogen, and the storage was continued to obtain a frozen stock.
  • Example 1 Hepatitis was induced by a single administration of 20 mg / kg Concanavalin A (manufactured by Sigma-Aldrich) to mice (C57BL / 6, CLEA Japan, 7 weeks old, male). From this frozen stock cell (fat-derived mesenchymal stem cells cultured in serum-free medium for mesenchymal stem cells (Rohto)) or fat-derived cultured in 10% FBS serum medium (MEM) Mesenchymal stem cells) were administered once intravenously at 5 ⁇ 10 7 cells / kg. The cells were thawed, washed with MEM ⁇ (no serum added), suspended in HBSS and used for administration.
  • Concanavalin A manufactured by Sigma-Aldrich
  • the HBSS was administered to the cell non-administration group.
  • the cell-free group and the serum-free medium group for mesenchymal stem cells the adipose-derived mesenchymal stem cell-administered group cultured in the serum-free medium for mesenchymal stem cells (Rohto)
  • the total number survived.
  • the 10% FBS serum medium group adipose-derived mesenchymal stem cells cultured in 10% FBS serum medium (MEM ⁇ )
  • all of them died (Table 1).
  • the 10% FBS serum medium group (adipose-derived mesenchymal stem cells cultured in 10% FBS serum medium (MEM ⁇ )) has a safety problem, whereas the serum-free medium for mesenchymal stem cells
  • the group (the mesenchymal stem cells of the present invention obtained by culturing in a serum-free medium for mesenchymal stem cells (Rohto)) was shown to be highly safe.
  • Example 2 The cell size of the adipose-derived mesenchymal stem cells prepared in the same manner as described above was measured using CellInsight CX5 High-Content Screening (HCS) Platform (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • HCS CellInsight CX5 High-Content Screening
  • ADSC (Lonza, part number PT-5006) was cultured from P2 to P4 using a serum-free medium for mesenchymal stem cells (Rohto).
  • P4 to P5 were cultured for 3 days using 10% FBS serum medium (MEM ⁇ ), and frozen stocks were prepared as described above.
  • MEM ⁇ 10% FBS serum medium
  • TF expression of adipose-derived mesenchymal stem cells (Example 3) ADSC (Lonza, product number PT-5006) was cultured from P2 to P4 using a serum-free medium for mesenchymal stem cells (Rohto).
  • a mesenchymal stem cell serum-free medium serum-free medium group
  • 10% FBS serum medium MEM ⁇ , serum medium group
  • ADSC [Expression 1 of integrin-related gene in adipose-derived mesenchymal stem cells] (Example 4)
  • ADSC manufactured by Lonza, part number PT-5006
  • serum-free medium for mesenchymal stem cells Rohto, serum-free medium group
  • FBS serum medium serum medium group
  • a frozen stock was prepared as described above.
  • Each P4 cells caused Nemushi were seeded in 6-well plates at 5,000cells / cm 2, were cultured for 3 days in the two respective media were analyzed gene expression by microarray analysis. The results are shown in Table 2.
  • ADSC [Expression 2 of integrin-related gene in adipose-derived mesenchymal stem cells] (Example 5)
  • ADSC manufactured by Lonza, part number PT-5006
  • serum-free medium for mesenchymal stem cells Rohto, serum-free medium group
  • FBS serum medium serum medium group
  • a frozen stock was prepared as described above.
  • Each P4 cell was put to sleep, seeded in a 6-well plate at 5,000 cells / cm 2 , cultured for 3 days in each of the two types of media, then ADSC total RNA was recovered, and the integrin-related gene ITGB5 and ITGB1 mRNA expression level was measured by quantitative PCR. The results are shown in FIGS.
  • Example 6 [Expression 3 of integrin-related gene of adipose-derived mesenchymal stem cells] (Example 6) Serum-free medium for mesenchymal stem cells (Rohto, Rohto medium group), serum-free medium for mesenchymal stem cells (Lonza, Lonza medium group) ADSC (Lonza, part number PT-5006) from P2 to P4, respectively Alternatively, a frozen stock was prepared by culturing in 10% FBS serum medium (serum medium group).
  • Each P4 cell was put to sleep, seeded in a 6-well plate at 5,000 cells / cm 2 , cultured for 3 days in each of the three types of media, then ADSC total RNA was recovered, ITGA1, an integrin-related gene, ITGA11, ITGAV and ITGA4 mRNA expression levels were measured by quantitative PCR. The results are shown in FIGS.
  • the expression levels of ITGA1, ITGA11, and ITGAV are lower in the serum-free medium group than in the serum medium group, and the expression of ITGA1, ITGA11, and ITGAV is further increased in the Rohto medium group than in the Lonza medium group.
  • the amount was found to be low. It was also found that the serum-free medium group had a higher ITGA4 expression level than the serum medium group, and the Rohto medium group had a higher ITGA14 expression level than the Lonza medium group.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC, manufactured by Lonza, part number PT-5006) and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells from P2 to P4, respectively, a serum-free medium for mesenchymal stem cells (Rohto, serum-free medium group) ) Or 10% FBS serum medium (serum medium group), and a frozen stock was prepared in the same manner as described above.
  • Each P4 cells caused Nemushi were seeded at 5,000cells / cm 2 in 6-well plates, three were cultured for 3 days in each medium, adipose-derived mesenchymal stem cells and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells total RNA was recovered, and the mRNA expression level of ITGB1, which is an integrin-related gene, was measured by quantitative PCR. The results are shown in FIG.
  • ITGB1 As shown in FIG. 10, it was found that the expression level of ITGB1 was lower in the serum-free medium group than in the serum medium group in the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as well as in the fat-derived mesenchymal stem cells.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC, Lonza, part number PT-5006) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (Lonza, model number: PT-2501) for mesenchymal stem cells from P2 to P4, respectively Cultured in serum-free medium (Rohto, serum-free medium group) or 10% FBS serum medium (serum medium group), a frozen stock was prepared in the same manner as described above.
  • Each P4 cell was put to sleep, seeded in a 6-well plate at 5,000 cells / cm 2 , cultured for 3 days in each of three types of media, and then total of fat-derived mesenchymal stem cells and bone marrow-derived mesenchymal stem cells RNA was collected, and mRNA expression levels of ITGA1 and ITGA4, which are integrin-related genes, were measured by quantitative PCR. The results are shown in FIGS.
  • the expression level of ITGA1 is lower in the serum-free medium group and the expression level of ITGA4 in the serum-free medium group as well as the fat-derived mesenchymal stem cells than in the serum medium group. I found it expensive.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSC, Lonza, part number PT-5006)
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (Lonza, model number: PT-2501) were designated as P2 to P4.
  • mesenchymal stem cells and a pharmaceutical composition containing the same are provided.
  • mesenchymal stem cells that are highly safe when used as pharmaceuticals can be provided.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、医薬品として用いる際に、安全性の高い間葉系幹細胞を提供することを目的とする。　本発明は、組織因子（ＴＦ）が低発現であることを特徴とする、間葉系幹細胞である。また、本発明は、ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢＬ１、ＩＴＧＢ１及びＩＴＧＡＶからなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が低発現であることを特徴とする間葉系幹細胞も含む。さらに、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ７及びＩＴＧＡ１０からなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が高発現であることを特徴とする間葉系幹細胞も含む。上記間葉系幹細胞は他家由来であること、脂肪組織由来であることが好ましい。本発明は、上記間葉系幹細胞を含有する医薬組成物も含む。

Description

間葉系幹細胞及び医薬組成物
　本発明は、間葉系幹細胞及び医薬組成物に関する。
　間葉系幹細胞は、Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ（１９８２）によって初めて骨髄から単離された多分化能を有する前駆細胞である（非特許文献１）。間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯、脂肪等の様々な組織に存在することが明らかにされており、間葉系幹細胞移植は、様々な難治性疾患に対する新しい治療方法として、期待されている（特許文献１～２参照）。最近では、脂肪組織、胎盤、臍帯、卵膜等の間質細胞に同等の機能を有する細胞が存在することが知られている。そのため、間葉系幹細胞を間質細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｃｅｌｌ）と称することもある。
　しかしながら、間葉系幹細胞をマウスの静脈内に投与する研究において、肺における循環障害が原因と考えられる呼吸不全によって、マウスが死亡する例が認められたとの報告があり（非特許文献２～４参照）、安全性の高い間葉系幹細胞の開発が望まれている。
特開２０１２－１５７２６３号公報 特表２０１２－５０８７３３号公報
Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ　Ｆ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，ｐｐ．１４３－１４７，１９９９ Ｆｕｒｌａｎｉ　Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．　Ｒｅｓ．，７７，ｐｐ．３７０－３７６，２００９ Ｔａｔｈｕｍｉ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，　４３１，　ｐｐ．２０３－２０９，　２０１３ Ｓｈｉｒａｔｈｕｋｉ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　４５，　ｐｐ．１３５３－１３５９，　２０１５
　本発明は、上述のような状況の中、医薬品として安全性の高い間葉系幹細胞を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために鋭意研究した結果、本発明者らは、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ（ｓｔｒｏｍａｌ）　ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）を無血清培地で培養することで、安全性の高い間葉系幹細胞が培養できることを見出し、本発明を完成させた。本発明によれば、医薬品として安全性の高い間葉系幹細胞を提供できる。すなわち本発明の要旨は、以下の通りである。
［１］組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ；ＴＦ）が低発現であることを特徴とする、間葉系幹細胞。
［２］ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢＬ１、ＩＴＧＢ１及びＩＴＧＡＶからなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が低発現であることを特徴とする、間葉系幹細胞。
［３］ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ７及びＩＴＧＡ１０からなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が高発現であることを特徴とする、間葉系幹細胞。
［４］他家由来である、［１］～［３］のいずれかに記載の間葉系幹細胞。
［５］脂肪組織由来である、［１］～［４］のいずれかに記載の間葉系幹細胞。
［６］［１］～［５］のいずれかに記載の間葉系幹細胞を含む、医薬組成物。
［７］組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ；ＴＦ）が低発現である間葉系幹細胞を使用することを特徴とする、疾患の治療方法。
［８］ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢＬ１、ＩＴＧＢ１及びＩＴＧＡＶからなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が低発現である間葉系幹細胞を使用することを特徴とする、疾患の治療方法。
［９］ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ７及びＩＴＧＡ１０からなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が高発現である間葉系幹細胞を使用することを特徴とする、疾患の治療方法。
［１０］上記間葉系幹細胞が、他家由来である、［７］～［９］のいずれかに記載の疾患の治療方法。
［１１］上記間葉系幹細胞が、脂肪組織由来である、［７］～［１０］のいずれかに記載の疾患の治療方法。
　本発明によると、医薬品として用いる際に安全性の高い間葉系幹細胞を提供することができる。
図１は、本発明の間葉系幹細胞の細胞サイズ（粒子径）を示す図である。 図２は、本発明の間葉系幹細胞におけるＴＦのｍＲＮＡ発現を示す図である。 図３は、本発明の間葉系幹細胞におけるＴＦの細胞表面タンパク質発現（ＦＡＣＳ解析）を示す図である。 図４は、本発明の間葉系幹細胞におけるＩＴＧＢ５のｍＲＮＡ発現を示す図である。 図５は、本発明の間葉系幹細胞におけるＩＴＧＢ１のｍＲＮＡ発現を示す図である。 図６は、本発明の間葉系幹細胞におけるＩＴＧＡ１のｍＲＮＡ発現を示す図である。 図７は、本発明の間葉系幹細胞におけるＩＴＧＡ１１のｍＲＮＡ発現を示す図である。 図８は、本発明の間葉系幹細胞におけるＩＴＧＡＶのｍＲＮＡ発現を示す図である。 図９は、本発明の間葉系幹細胞におけるＩＴＧＡ４のｍＲＮＡ発現を示す図である。 図１０は、本発明の間葉系幹細胞におけるＩＴＧＢ１のｍＲＮＡ発現を示す図である。 図１１は、本発明の間葉系幹細胞におけるＩＴＧＡ１のｍＲＮＡ発現を示す図である。 図１２は、本発明の間葉系幹細胞におけるＩＴＧＡ４のｍＲＮＡ発現を示す図である。 図１３は、本発明の間葉系幹細胞におけるＩＴＧＡ１１のｍＲＮＡ発現を示す図である。 図１４は、本発明の間葉系幹細胞におけるＩＴＧＡＶのｍＲＮＡ発現を示す図である。 図１５は、本発明の間葉系幹細胞におけるＩＴＧＢ５のｍＲＮＡ発現を示す図である。
　以下、本発明の間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物について詳細に説明する。
［間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物］
　本発明の間葉系幹細胞は、組織因子（以下、「ＴＦ」ともいう）が低発現であることを特徴とする。
　組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ，ＴＦ）は、２９５のアミノ酸からなる４７ｋＤの糖タンパクで、ＴＮＦ、ＩＬ－１、急性相蛋白、トロンビン、エンドトキシンなどのメディエーターや、脳、肺、胎盤などＴＦを多く含む組織の損傷（局所的要因）により、全身の血管内皮細胞や単球の表面に発現が誘導される。ＴＦはＦ．ＶＩＩと結合し、Ｆ．ＶＩＩを活性化することで生理的な外因系凝固の起点に関与することが知られている。
　なお、ＴＦが低発現であるとは、細胞においてＴＦのｍＲＮＡ発現が低発現であること、もしくはＴＦタンパク質が低発現であること、又はその両方が低発現であることを含む。また、本発明の間葉系幹細胞は、他の細胞に比べ、ＴＦが低発現であればよいが、具体的には、本発明の間葉系幹細胞は、従来の培養条件下（例えば、１０％ＦＢＳ含有Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　ａｌｐｈａ（ＭＥＭα）培地による培養）で得られる間葉系幹細胞に比べて、ＴＦが低発現であればよい。好ましくは従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べ９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下、特に好ましくは６０％以下発現している。
　また、本発明の間葉系幹細胞は、ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢＬ１、ＩＴＧＢ１及びＩＴＧＡＶからなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が低発現であることを特徴とする。さらに、本発明の間葉系幹細胞は、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ７及びＩＴＧＡ１０からなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が高発現であることを特徴とする。
　インテグリンは、細胞外マトリックスと相互作用し、細胞の形状・運動性や細胞周期の進行など細胞外マトリックスの情報に応答して細胞内シグナルを伝達する細胞表面タンパク質であることが知られている。
　インテグリン関連遺伝子が低発現もしくは高発現であるとは、細胞においてインテグリン関連遺伝子のｍＲＮＡ発現が低発現もしくは高発現であること、もしくはインテグリン関連遺伝子タンパク質が低発現もしくは高発現であること、又はその両方が低発現もしくは高発現であることを含む。また、本発明の間葉系幹細胞は、他の細胞に比べ、インテグリン関連遺伝子が低発現もしくは高発現であればよいが、具体的には、本発明の間葉系幹細胞は、従来の培養条件下（例えば、１０％ＦＢＳ含有Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　ａｌｐｈａ（ＭＥＭα）培地による培養）で得られる間葉系幹細胞に比べて、インテグリン関連遺伝子が低発現もしくは高発現であればよい。
　インテグリン関連遺伝子が低発現であるとは、好ましくは従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べ９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下、特に好ましくは６０％以下発現している。具体的には、ＩＴＧＡ１が低発現であるとは、好ましくは従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べ５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、特に好ましくは２０％以下発現している。ＩＴＧＡ１１が低発現であるとは、好ましくは従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べ１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは１％以下、特に好ましくは０．５％以下発現している。ＩＴＧＢ５が低発現であるとは、好ましくは従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べ７０％以下、より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、特に好ましくは４０％以下発現している。ＩＴＧＢ１が低発現であるとは、好ましくは従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べ９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７５％以下、特に好ましくは７０％以下発現している。ＩＴＧＢＬ１が低発現であるとは、好ましくは従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べ７０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、特に好ましくは２５％以下発現している。ＩＴＧＡＶが低発現であるとは、好ましくは従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べ８０％以下、より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは６０％以下、特に好ましくは３５％以下発現している。また、本発明の間葉系幹細胞は、従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べて、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡМ、ＩＴＧＢ７もしくはＩＴＧＡ５が低発現であってもよい。
　インテグリン関連遺伝子が高発現であるとは、好ましくは従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べ１１０％以上、より好ましくは１２０％以上、さらに好ましくは１３０％以上、特に好ましくは１５０％以上発現している。具体的には、ＩＴＧＡ１０が高発現であるとは、好ましくは従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べ２００％以上、より好ましくは５００％以上、さらに好ましくは７５０％以上、特に好ましくは９００％以上発現している。ＩＴＧＡ７が高発現であるとは、好ましくは従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べ１５０％以上、より好ましくは２００％以上、さらに好ましくは３００％以上、特に好ましくは４００％以上発現している。ＩＴＧＡ９が高発現であるとは、好ましくは従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べ１３０％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは２００％以上、特に好ましくは２５０％以上発現している。ＩＴＧＡ４が高発現であるとは、好ましくは従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べ１２０％以上、より好ましくは１５０％以上、さらに好ましくは１８０％以上、特に好ましくは２００％以上発現している。また、本発明の間葉系幹細胞は、従来の培養条件下で得られる間葉系幹細胞に比べて、ＩＴＧＡ３もしくはＩＴＧＢ３が高発現であってもよい。
　本発明において間葉系幹細胞とは、間葉系に属する一種以上の細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）、好ましくは二種以上の細胞、より好ましくは三種以上の細胞への分化能を有し、当該能力を維持したまま増殖できる細胞を意味する。本発明において用いる間葉系幹細胞なる用語は、間質細胞と同じ細胞を意味し、両者を特に区別するものではない。また、単に間葉系細胞と表記される場合もある。間葉系幹細胞を含む組織としては、例えば、脂肪組織、臍帯、骨髄、臍帯血、子宮内膜、胎盤、羊膜、絨毛膜、脱落膜、真皮、骨格筋、骨膜、歯小嚢、歯根膜、歯髄、歯胚等が挙げられる。例えば脂肪組織由来間葉系幹細胞とは、脂肪組織に含有される間葉系幹細胞を意味し、脂肪組織由来間質細胞と称してもよい。これらのうち、各種疾患の治療に対する有効性の観点、入手容易性の観点等から、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞が好ましく、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞がより好ましく、脂肪組織由来間葉系幹細胞がさらに好ましい。
　本発明における間葉系幹細胞は、処置される対象（被検体）と同種由来であってもよいし、異種由来であってもよい。本発明における間葉系幹細胞の種として、ヒト、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラビット、マウス、ラットが挙げられ、好ましくは処置される対象（被検体）と同種由来細胞である。本発明における間葉系幹細胞は、処置される対象（被検体）に由来、すなわち自家細胞（同種同系）であってもよいし、同種の別の対象に由来、すなわち他家細胞（同種異系）であってもよい。好ましくは他家細胞（同種異系）である。
　間葉系幹細胞は同種異系の被験体に対しても拒絶反応を起こしにくいため、あらかじめ調製されたドナーの細胞を拡大培養して凍結保存したものを、本発明の医薬組成物における間葉系幹細胞として使用することができる。そのため、自己の間葉系幹細胞を調製して用いる場合と比較して、商品化も容易であり、かつ安定して一定の効果を得られ易いという観点から、本発明における間葉系幹細胞は、同種異系であることがより好ましい。
　本発明において間葉系幹細胞とは、間葉系幹細胞を含む任意の細胞集団を意味する。当該細胞集団は、少なくとも２０％以上、好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９６％、９７％、９８％又は９９％が間葉系幹細胞である。
　本発明において脂肪組織とは、脂肪細胞、及び微小血管細胞等を含む間質細胞を含有する組織を意味し、例えば、哺乳動物の皮下脂肪を外科的切除又は吸引して得られる組織である。脂肪組織は、皮下脂肪より入手され得る。後述する脂肪組織由来間葉系幹細胞の投与対象と同種動物から入手されることが好ましく、ヒトへ投与することを考慮すると、より好ましくは、ヒトの皮下脂肪である。皮下脂肪の供給個体は、生存していても死亡していてもよいが、本発明において用いる脂肪組織は、好ましくは、生存個体から採取された組織である。個体から採取する場合、脂肪吸引は、例えば、ＰＡＬ（パワーアシスト）脂肪吸引、エルコーニアレーザー脂肪吸引、又は、ボディジェット脂肪吸引などが例示され、細胞の状態を維持するという観点から、超音波を用いないことが好ましい。
　本発明において臍帯とは、胎児と胎盤を結ぶ白い管状の組織であり、臍帯静脈、臍帯動脈、膠様組織（ウォートンジェリー；Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ　Ｊｅｌｌｙ）、臍帯基質自体等から構成され、間葉系幹細胞を多く含む。臍帯は、本発明の間葉系幹細胞を使用する被験体（投与対象）と同種動物から入手されることが好ましく、本発明の間葉系幹細胞をヒトへ投与することを考慮すると、より好ましくは、ヒトの臍帯である。
　本発明において骨髄とは、骨の内腔を満たしている柔組織のことをいい、造血器官である。骨髄中には骨髄液が存在し、その中に存在する細胞を骨髄細胞と呼ぶ。骨髄細胞には、赤血球、顆粒球、巨核球、リンパ球、脂肪細胞等の他、間葉系幹細胞、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞等が含まれている。骨髄細胞は、例えば、ヒト腸骨、長管骨、又はその他の骨から採取することができる。
　本発明において、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞といった各組織由来間葉系幹細胞とは、それぞれ脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞といった各組織由来間葉系幹細胞を含む任意の細胞集団を意味する。当該細胞集団は、少なくとも２０％以上、好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９６％、９７％、９８％又は９９％が、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞といった各組織由来間葉系幹細胞である。
　本発明における間葉系幹細胞は、上記ＴＦが低発現であることに加えて、例えば、成長特徴（例えば、継代から老化までの集団倍加能力、倍加時間）、核型分析（例えば、正常な核型、母体系統又は新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）による表面マーカー発現、免疫組織化学及び／又は免疫細胞化学（例えば、エピトープ検出）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、従来型ＰＣＲ等のポリメラーゼ連鎖反応）、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング、タンパク質アレイ、サイトカイン等のタンパク質分泌（例えば、血漿凝固解析、ＥＬＩＳＡ、サイトカインアレイ）、代謝産物（メタボローム解析）、本分野で知られている他の方法等によって、特徴付けられてもよい。
（間葉系幹細胞の調製方法）
　ＴＦ低発現の間葉系幹細胞の調製方法は特に限定されないが、例えば以下のようにして調製することができる。すなわち、脂肪組織、臍帯、骨髄等の組織から、当業者に公知の方法に従って、間葉系幹細胞を分離、培養し、ＴＦに特異的に結合する抗ＴＦ抗体を用いて、ＴＦ低発現細胞をセルソーターで分離したり、磁気ビーズ等でＴＦ高発現細胞を除去すること等により取得することができる。また、特定の培地を用いた培養により、ＴＦ発現の低い間葉系幹細胞を誘導することで、ＴＦ低発現の間葉系幹細胞を取得することもできる。この誘導によって得られる細胞集団において、細胞集団の５０％以上がＴＦ低発現であることが好ましく、７０％以上がＴＦ低発現であることがより好ましく、８０％以上がＴＦ低発現であることがさらに好ましく、９０％以上がＴＦ低発現であることが特に好ましく、実質的にＴＦ低発現の均一な細胞集団であることが最も好ましい。
　各インテグリン関連遺伝子（タンパク）低発現又は高発現の間葉系幹細胞の調製方法は特に限定されないが、例えば以下のようにして調製することができる。すなわち、インテグリン関連遺伝子（タンパク）低発現細胞は、脂肪組織、臍帯、骨髄等の組織から、当業者に公知の方法に従って、間葉系幹細胞を分離、培養し、インテグリン関連タンパクに特異的に結合する抗体を用いて、セルソーターで分離したり、磁気ビーズ等でインテグリン関連タンパク高発現細胞を除去すること等により取得することができる。また、インテグリン関連遺伝子（タンパク）高発現細胞は、脂肪組織、臍帯、骨髄等の組織から、当業者に公知の方法に従って、間葉系幹細胞を分離、培養し、インテグリン関連タンパクに特異的に結合する抗体を用いて、セルソーターで分離することにより取得することができる。また、特定の培地を用いた培養により、インテグリン関連遺伝子（タンパク）低発現又は高発現の間葉系幹細胞を誘導することで、インテグリン関連遺伝子（タンパク）低発現又は高発現の間葉系幹細胞を取得することもできる。この誘導によって得られる細胞集団において、細胞集団の５０％以上がそれぞれの特徴（インテグリン関連遺伝子（タンパク）低発現又は高発現）を示す細胞であることが好ましく、７０％以上がそれぞれの特徴を示す細胞であることがより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、９０％以上が特に好ましく、実質的にそれぞれの特徴を示す均一な細胞集団であることが最も好ましい。以下に、ＴＦ低発現の間葉系幹細胞の調製方法を具体的に説明する。
　間葉系幹細胞は、当業者に周知の方法により調製することができる。以下に、一つの例として、脂肪組織由来間葉系幹細胞の調製方法を説明する。脂肪組織由来間葉系幹細胞は、例えば米国特許第６，７７７，２３１号に記載の製造方法によって得られて良く、例えば、以下の工程（i）～（iii）を含む方法で製造することができる：
（i）　脂肪組織を酵素による消化により細胞懸濁物を得る工程；
（ii）　細胞を沈降させ、細胞を適切な培地に再懸濁する工程；ならびに
（iii）　細胞を固体表面で培養し、固体表面への結合を示さない細胞を除去する工程。
　工程（i）において用いる脂肪組織は、洗浄されたものを用いることが好ましい。洗浄は、生理学的に適合する生理食塩水溶液（例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））を用いて、激しく攪拌して沈降させることによって行い得る。これは、脂肪組織に含まれる夾雑物　（デブリとも言い、例えば損傷組織、血液、赤血球など）を組織から除去するためである。したがって、洗浄及び沈降は一般に、上清からデブリが総体的に除去されるまで繰り返される。残存する細胞は、さまざまなサイズの塊として存在するので、細胞そのものの損傷を最小限に抑えながら解離させるため、洗浄後の細胞塊を、細胞間結合を弱めるか、又は破壊する酵素（例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ又はトリプシンなど）で処理することが好ましい。このような酵素の量及び処理期間は、使用される条件に依存して変わるが、当技術分野で既知である。このような酵素処理に代えて、又は併用して、細胞塊を、機械的な攪拌、超音波エネルギー、熱エネルギーなどの他の処理法で分解することができるが、細胞の損傷を最小限に抑えるため、酵素処理のみで行うことが好ましい。酵素を用いた場合、細胞に対する有害な作用を最小限に抑えるために、適切な期間をおいた後に培地等を用いて酵素を失活させることが望ましい。
　工程（i）により得られる細胞懸濁物は、凝集状の細胞のスラリー又は懸濁物、ならびに各種夾雑細胞、例えば赤血球、平滑筋細胞、内皮細胞、及び線維芽細胞を含む。従って、続いて凝集状態の細胞とこれらの夾雑細胞を分離、除去してもよいが、後述する工程（iii）での接着及び洗浄により、除去可能であることから、当該分離、除去は割愛してもよい。夾雑細胞を分離、除去する場合、細胞を上清と沈殿に強制的に分ける遠心分離によって達成しえる。得られた夾雑細胞を含む沈殿は、生理学的に適合する溶媒に懸濁させる。懸濁状の細胞には、赤血球を含む恐れがあるが、後述する個体表面への接着による選択により、赤血球は除外されるため、溶解する工程は必ずしも必要ではない。赤血球を選択的に溶解する方法として、例えば、塩化アンモニウムによる溶解による高張培地又は低張培地中でのインキュベーションなど、当技術分野で周知の方法を使用することができる。溶解後、例えば濾過、遠心沈降、又は密度分画によって溶解物を所望の細胞から分離してもよい。
　工程（ii）において、懸濁状の細胞において、間葉系幹細胞の純度を高めるために、１回もしくは連続して複数回洗浄し、遠心分離し、培地に再懸濁してもよい。この他にも、細胞を、細胞表面マーカープロファイルを基に、又は細胞のサイズ及び顆粒性を基に分離してもよい。
　再懸濁において用いる培地は、間葉系幹細胞を培養できる培地であれば、特に限定されないが、このような培地は、基礎培地に、血清を添加する、及び／又は、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コレステロール、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物を添加して作製してもよい。これらの培地には、必要に応じて、さらに脂質、アミノ酸、タンパク質、多糖、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の物質を添加してもよい。
　上記基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）、ＭＥＭ、ＭＥＭα、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭＣＤＢ２０１培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。
　上記血清としては、例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清、仔ウシ血清、ヤギ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清等が挙げられるがこれらに限定されない。血清を用いる場合、基礎培地に対して、５ｖ／ｖ％から１５ｖ／ｖ％、好ましくは、１０ｖ／ｖ％を添加してもよい。
　上記脂肪酸としては、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸等が例示されるが、これらに限定されない。脂質は、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン等が例示されるが、これらに限定されない。アミノ酸は、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシンなどを含むがこれらに限定されない。タンパク質は、例えば、エコチン、還元型グルタチオン、フィブロネクチン及びβ２－ミクログロブリン等が例示されるが、これらに限定されない。多糖は、グリコサミノグリカンが例示され、グリコサミノグリカンのうち特に、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸等が例示されるが、これらに限定されない。増殖因子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が例示されるが、これらに限定されない。
　本発明において得られる脂肪由来間葉系幹細胞を細胞移植に用いるという観点から、血清等の異種由来成分を含まない（ゼノフリー）培地を用いることが好ましい。また、間葉系幹細胞をＴＦ低発現とするため、このような培地としては、例えば、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、Ｌｏｎｚａ社、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｖｅｒｉｔａｓ社、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社及びＲｏｈｔｏ社などから間葉系幹細胞（間質細胞）用として予め調製された培地として提供されている培地を用いてもよい。
　続いて、工程（iii）では、工程（ii）で得られた細胞懸濁液中の細胞を分化させずに固体表面上で、上述の適切な細胞培地を使用して、適切な細胞密度及び培養条件で培養する。本発明において、「固体表面」とは、本発明における脂肪組織由来間葉系幹細胞の結合・接着を可能とする任意の材料を意味する。特定の態様では、このような材料は、その表面への哺乳類細胞の結合・接着を促すように処理されたプラスチック材料である。固体表面を有する培養容器の形状は特に限定されないが、シャーレやフラスコなどが好適に用いられる。非結合状態の細胞及び細胞の破片を除去するために、インキュベーション後に細胞を洗浄する。
　本発明では、最終的に固体表面に結合・接着した状態で留まる細胞を、脂肪組織由来間葉系幹細胞の細胞集団として選択することができる。
　選択された細胞について、本発明における脂肪組織由来間葉系幹細胞であることを確認するために、表面抗原についてフローサイトメトリー等を用いて従来の方法で解析してもよい。さらに、各細胞系列に分化する能力について検査してもよく、このような分化は、従来の方法で行うことができる。
　本発明における間葉系幹細胞は、上述の通り調製することができるが、ＴＦを低発現すること、また、ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢＬ１、ＩＴＧＢ１及びＩＴＧＡＶからなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が低発現であること、さらに、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ７及びＩＴＧＡ１０からなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が高発現であること以外に、次の特性を持つ細胞として定義してもよい；
（１）標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す、
（２）表面抗原ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ４５が陰性であり、
（３）培養条件にて骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化可能である。
　上記工程（iii）によって得られた間葉系幹細胞から、ＴＦタンパクを低発現している細胞を、セルソータ―、磁気ビーズ等を用いた免疫学的手法により選択的に分離することで、ＴＦタンパクを低発現している間葉系幹細胞を取得することができる。また、ＴＦの低発現を誘導できる特定の培地による培養を行うことにより、間葉系幹細胞におけるＴＦ低発現を誘導し、効率的にＴＦ低発現の間葉系幹細胞を取得することもできる。さらに、上記工程（iii）によって得られた間葉系幹細胞から、インテグリン関連タンパクに特異的に結合する抗体を用いて、セルソーターで分離したり、磁気ビーズ等でインテグリン関連タンパク高発現細胞を除去すること等により、インテグリン関連遺伝子（タンパク）低発現細胞を取得することができる。また、インテグリン関連遺伝子（タンパク）高発現細胞は、上記工程（iii）によって得られた間葉系幹細胞から、インテグリン関連タンパクに特異的に結合する抗体を用いて、セルソーターで分離することにより取得することができる。また、特定の培地を用いた培養により、インテグリン関連遺伝子（タンパク）低発現又は高発現の間葉系幹細胞を誘導することで、インテグリン関連遺伝子（タンパク）低発現又は高発現の間葉系幹細胞を取得することもできる。一例として、セルソータ―を用いた免疫学的手法によるＴＦ低発現細胞の選択的分離の具体的方法を以下に説明する。
　上記調製した間葉系幹細胞をトリプシン・ＥＤＴＡ溶液等により処理して得られた細胞懸濁液を遠心（室温、４００Ｇ、５分）して上清を除去する。細胞にＳｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ－ＰＢＳ）を加え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／５００ｕＬとなるように調製する。ピペッティングにより細胞懸濁液濃度を均一にした後、新しい１．５ｍＬマイクロチューブに５０ｕＬずつ分注する。分注した細胞懸濁液に抗体（ＰＥ　Ｍｏｕｓｅ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ１４２　Ｃｌｏｎｅ　ＨＴＦ－１、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、５５０３１２）を添加し、遮光・冷蔵下で３０分間～１時間反応させる。Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　１ｍＬで３回洗浄を行った後に、ＰＩ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒにＰｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｐ４８６４）を最終濃度５～２０ｕｇ／ｍＬとなるように添加して調製）３００ｕＬを加えてよく懸濁する。セルストレーナ付チューブに通した後に、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）解析を行い、ソーティングによりＴＦ低発現の間葉系幹細胞を分離することができる。
（間葉系幹細胞の凍結保存）
　本発明における間葉系幹細胞は、疾患治療効果を備えていれば、適宜、凍結保存及び融解を繰り返した細胞であってもよい。本発明において、凍結保存は、当業者に周知の凍結保存液へ間葉系幹細胞を懸濁し、冷却することによって行い得る。懸濁は、細胞をトリプシンなどの剥離剤によって剥離し、凍結保存容器に移し、適宜、処理した後、凍結保存液を加えることによって行い得る。
　凍結保存液は、凍害防御剤として、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を含有していてもよいが、ＤＭＳＯは、細胞毒性に加えて、間葉系幹細胞を分化誘導する特性を有することから、ＤＭＳＯ含有量を減らすことが好ましい。ＤＭＳＯの代替物として、グリセロール、プロピレングリコール、多糖類及び糖アルコールが例示される。ＤＭＳＯを用いる場合、５％～２０％の濃度、好ましくは５％～１０％の濃度、より好ましくは１０％の濃度を含有する。この他にも、ＷＯ２００７／０５８３０８に記載の添加剤を含んでもよい。このような凍結保存液として、例えば、バイオベルデ社、日本ジェネティクス株式会社、リプロセル社、ゼノアック社、コスモ・バイオ社、コージンバイオ株式会社、サーモフィッシャーサイエンティフィック社などから提供されている凍結保存液を用いてもよい。
　上述の懸濁した細胞を凍結保存する場合、－８０℃～－１００℃の間の温度（例えば、－８０℃）で保管することで良く、当該温度に達成しえる任意のフリーザーを用いて行い得る。特に限定されないが、急激な温度変化を回避するため、プログラムフリーザーを用いて、冷却速度を適宜制御してもよい。冷却速度は、凍結保存液の成分によって適宜選択しても良く、凍結保存液の製造者指示に従って行われ得る。
　保存期間は、上記条件で凍結保存した細胞が融解した後、凍結前と同等の性質を保持している限り、特に上限は限定されないが、例えば、１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、２か月以上、３か月以上、４か月以上、５か月以上、６か月以上、１年以上、又はそれ以上が挙げられる。より低い温度で保存することで細胞障害を抑制することができるため、液体窒素上の気相（約－１５０℃以下から－１８０℃以下）へ移して保存してもよい。液体窒素上の気相で保存する場合、当業者に周知の保存容器を用いて行うことができる。特に限定されないが、例えば、２週間以上保存する場合、液体窒素上の気相で保存することが好ましい。
　融解した間葉系幹細胞は、次の凍結保存までに適宜、培養してもよい。間葉系幹細胞の培養は、上述した間葉系幹細胞を培養できる培地を用いて行われ、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃の培養温度で、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われてもよい。ＣＯ２濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。培養において、培養容器に対して適切なコンフルエンシー（例えば、培養容器に対して、５０％から８０％を細胞が占有することが挙げられる）に達した後に、細胞をトリプシンなどの剥離剤によって剥離し、別途用意した培養容器に適切な細胞密度で播種して培養を継続してもよい。細胞を播種する際において、典型的な細胞密度として、１００細胞／ｃｍ２～１００，０００細胞／ｃｍ２、５００細胞／ｃｍ２～５０，０００細胞／ｃｍ２、１，０００～１０，０００細胞／ｃｍ２、２，０００～１０，０００細胞／ｃｍ２などが例示される。特定の態様では、細胞密度は２，０００～１０，０００細胞／ｃｍ２である。適切なコンフルエンシーに達するまでの期間が、３日間から７日間となるように調整することが好ましい。培養中、必要に応じて、適宜、培地を交換してもよい。
　凍結保存した細胞の融解は、当業者に周知の方法によって行い得る。例えば、３７℃の恒温槽内又は湯浴中にて静置又は振とうすることによって行う方法が例示される。
　本発明の間葉系幹細胞は、いずれの状態の細胞であってもよいが、例えば培養中の細胞を剥離して回収された細胞でもよいし、凍結保存液中に凍結された状態の細胞でもよい。拡大培養して得られる同ロットの細胞を小分けして凍結保存したものを使用すると、安定して同様の作用効果が得られる点、取扱い性に優れる点等において好ましい。凍結保存状態の間葉系幹細胞は、使用直前に融解し、凍結保存液に懸濁したまま輸液もしくは培地等の溶液に直接混合してもよい。また、遠心分離等の方法により凍結保存液を除去してから輸液もしくは培地等の溶液に懸濁してもよい。ここで、本発明における「輸液」とは、ヒトの治療の際に用いられる溶液のことをいい、特に限定されないが、例えば、生理食塩水、日局生理食塩液、５％ブドウ糖液、日局ブドウ糖注射液、リンゲル液、日局リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、１号液（開始液）、２号液（脱水補給液）、３号液（維持液）、４号液（術後回復液）等が挙げられる。
　本発明の間葉系幹細胞を医薬組成物に用いる場合、本発明の効果を損なわない範囲であれば、上記間葉系幹細胞以外に、その用途や形態に応じて、常法に従い、薬学的に許容される担体や添加物を含有させてもよい。このような担体や添加物としては、例えば、等張化剤、増粘剤、糖類、糖アルコール類、防腐剤（保存剤）、殺菌剤又は抗菌剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、キレート剤、油性基剤、ゲル基剤、界面活性剤、懸濁化剤、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、発泡剤、流動化剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、溶解補助剤、抗酸化剤、甘味剤、酸味剤、着色剤、呈味剤、香料又は清涼化剤等が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な成分として例えば次の担体、添加物等が挙げられる。
　担体としては、例えば、水、含水エタノール等の水性担体が；等張化剤（無機塩）としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等が；多価アルコールとしては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等が；増粘剤としては、例えば、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、アルギン酸、ポリビニルアルコール（完全、又は部分ケン化物）、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が；糖類としては、例えば、シクロデキストリン、ブドウ糖等が；糖アルコール類としては、例えば、キシリトール、ソルビトール、マンニトール等（これらはｄ体、ｌ体又はｄｌ体のいずれでもよい）が；防腐剤、殺菌剤又は抗菌剤としては、例えば、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン、安息香酸ナトリウム、エタノール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、トロメタモール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、硫酸オキシキノリン、フェネチルアルコール、ベンジルアルコール、ビグアニド化合物（具体的には、塩酸ポリヘキサニド（ポリヘキサメチレンビグアニド）等）、グローキル（ローディア社製商品名）等が；ｐＨ調節剤としては、例えば、塩酸、ホウ酸、アミノエチルスルホン酸、イプシロン－アミノカプロン酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、ホウ砂、トリエタノールアミン、モノエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、硫酸、硫酸マグネシウム、リン酸、ポリリン酸、プロピオン酸、シュウ酸、グルコン酸、フマル酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、グルコノラクトン、酢酸アンモニウム等が；安定化剤としては、例えば、ジブチルヒドロキシトルエン、トロメタモール、ナトリウムホルムアルデヒドスルホキシレート（ロンガリット）、トコフェロール、ピロ亜硫酸ナトリウム、モノエタノールアミン、モノステアリン酸アルミニウム、モノステアリン酸グリセリン、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等が；油性基剤としては、例えば、オリーブ油、トウモロコシ油、大豆油、ゴマ油、綿実油等の植物油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等が；水性基剤としては、例えば、マクロゴール４００等が；ゲル基剤としては、例えば、カルボキシビニルポリマー、ガム質等が；界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート８０、硬化ヒマシ油、グリセリン脂肪酸エステル、セスキオレイン酸ソルビタン等が；懸濁化剤としては、例えば、サラシミツロウや各種界面活性剤、アラビアゴム、アラビアゴム末、キサンタンガム、大豆レシチン等が；結合剤としては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が；賦形剤としては、例えば、ショ糖、乳糖、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が；滑沢剤としては、例えば、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、タルク等が；崩壊剤としては、例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム等が；発泡剤としては、例えば、炭酸水素ナトリウム等が；流動化剤としては、例えば、メタケイ酸アルミン酸ナトリウム、軽質無水ケイ酸等が、それぞれ挙げられる。
　本発明の間葉系幹細胞は、目的に応じて種々の形態、例えば、固形剤、半固形剤、液剤等の様々な剤形で提供することができる。例えば、固形剤（錠剤、粉末、散剤、顆粒剤、カプセル剤等）、半固形剤［軟膏剤（硬軟膏剤、軟軟膏剤等）、クリーム剤等］、液剤［ローション剤、エキス剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤（輸液剤、埋め込み注射剤、持続性注射、用時調製型の注射剤を含む）、透析用剤、エアゾール剤、軟カプセル剤、ドリンク剤等］、貼付剤、パップ剤等の形態で利用できる。また、本発明の間葉系幹細胞は、油性又は水性のビヒクル中の溶液又は乳液等の形態にも利用できる。さらに、本発明の間葉系幹細胞は噴霧により、患部に適用することもでき、本発明の間葉系幹細胞は噴霧した後に患部でゲル化もしくはシート化される形態にも利用できる。本発明の間葉系幹細胞は上記間葉系幹細胞をシート状または立体構造体とした後に、患部に適用することもできる。
　本発明の間葉系幹細胞は、生理食塩水、日局生理食塩液、５％ブドウ糖液、日局ブドウ糖注射液、リンゲル液、日局リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液、１号液（開始液）、２号液（脱水補給液）、３号液（維持液）、４号液（術後回復液）等の輸液、又は、ＤＭＥＭ等の細胞培養培地を用いて、懸濁もしくは希釈して用いることができ、好ましくは生理食塩液、５％ブドウ糖液、１号液（開始液）で、より好ましくは５％ブドウ糖液、１号液（開始液）で懸濁もしくは希釈して用いることができる。
　本発明の間葉系幹細胞を液剤に用いる場合、液剤のｐＨは、医薬上、薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容される範囲内であれば特に限定されるものではないが、一例として、２．５～９．０、好ましくは３．０～８．５、より好ましくは３．５～８．０となる範囲が挙げられる。
　本発明の間葉系幹細胞を液剤に用いる場合、液剤の浸透圧については、生体に許容される範囲内であれば、特に制限されない。液剤の浸透圧比の一例として、好ましくは０．７～５．０、より好ましくは０．８～３．０、さらに好ましくは０．９～１．４となる範囲が挙げられる。浸透圧の調整は無機塩、多価アルコール、糖アルコール、糖類等を用いて、当該技術分野で既知の方法で行うことができる。浸透圧比は、第十五改正日本薬局方に基づき２８６ｍＯｓｍ（０．９ｗ／ｖ％塩化ナトリウム水溶液）の浸透圧に対する試料の浸透圧の比とし、浸透圧は日本薬局方記載の浸透圧測定法（氷点降下法）を参考にして測定する。なお、浸透圧比測定用標準液（０．９ｗ／ｖ％塩化ナトリウム水溶液）は、塩化ナトリウム（日本薬局方標準試薬）を５００～６５０℃で４０～５０分間乾燥した後、デシケーター（シリカゲル）中で放冷し、その０．９００ｇを正確に量り、精製水に溶かし正確に１００ｍＬとして調製するか、市販の浸透圧比測定用標準液（０．９ｗ／ｖ％塩化ナトリウム水溶液）を用いる。
　本発明の間葉系幹細胞の対象への投与経路は、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、舌下投与、経直腸投与、経腟投与、眼内投与、経鼻投与、吸入、経皮投与、インプラント、肝表面への噴霧及びシート等の貼付による直接投与等が挙げられるが、本発明の間葉系幹細胞は静脈内投与においても高い安全性が認められていることより、静脈内投与、動脈内投与等の血管内投与が好ましく、静脈内投与が最も好ましい。
　本発明の間葉系幹細胞の用量（投与量）は、患者の状態（体重、年齢、症状、体調等）、及び本発明の医薬組成物の剤形等によって異なりうるが、十分な治療効果を奏する観点からは、その量は多い方が好ましい傾向にあり、一方、副作用の発現を抑制する観点からはその量は少ない方が好ましい傾向にある。通常、成人に投与する場合には、細胞数として、１ｘ１０３～１ｘ１０１２個／回、好ましくは１ｘ１０４～１ｘ１０１１個／回、より好ましくは１ｘ１０５～１ｘ１０１０個／回、さらに好ましくは５ｘ１０６～１ｘ１０９個／回である。また、患者の体重あたりの投与量としては、１ｘ１０～５ｘ１０１０個／ｋｇ、好ましくは１ｘ１０２～５ｘ１０９個／ｋｇ、より好ましくは１ｘ１０３～５ｘ１０８個／ｋｇ、さらに好ましくは１ｘ１０４～５ｘ１０７個／ｋｇである。なお、本用量を１回量として、複数回投与してもよく、本用量を複数回に分けて投与してもよい。
　本発明の間葉系幹細胞は、１又は２以上の他の薬剤と共に投与してもよい。他の薬剤としては、肝臓の治療薬、心臓疾患の治療薬、炎症性腸疾患治療薬、呼吸器用薬、神経系用薬、循環器用薬、脳循環改善薬、免疫抑制薬として用いることができる任意の薬剤が挙げられる。
　肝臓の治療薬としては、例えば、Ｂ型肝炎治療薬（ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テノホビル等）、インターフェロン製剤（インターフェロンα、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンβ、ペグインターフェロンα－２ａ、ペグインターフェロンα－２ｂ等）、Ｃ型肝炎治療薬（リバビリン、テラピレビル、シメプレビル、バニプレビル、ダクラタスビル、アスナプレビル、ソホスブビル等）、副腎皮質ステロイド（プレドニゾロン、メチルプレドニゾロンコハク酸エステルナトリウム等）、抗凝固剤（乾燥濃縮人アンチトロンビンIII、ガベキサートメシル酸塩、トロンボモデュリンα等）、解毒剤（エデト酸カルシウム二ナトリウム水和物、グルタチオン、ジメチカプロール、チオ硫酸ナトリウム水和物、スガマデスクナトリウム等）、人血清アルブミン、肝臓抽出エキス、ウルソデオキシコール酸、グリチルリチン酸、アザチオプリン、ベザフィーブラート、アミノ酸（グリシン、Ｌ－システイン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－バリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－リシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－アルギニン及びこれらの塩等）、ビタミン（トコフェロール、フラビンアデニンジヌクレオチド、リン酸チアミンジスルフィド、ピリドキシン、シアノコバラミン及びこれらの塩等）、抗生物質（スルバクタムナトリウム、セフォペラゾンナトリウム、メロペネム水和物、塩酸バンコマイシン等）等が挙げられる。
　心臓疾患の治療薬としては、例えば、ＡＣＥ阻害薬、アンギオテンシンII受容体拮抗薬、β遮断薬、抗血小板薬、ワーファリン、カルシウム拮抗薬、硝酸薬、利尿剤、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害薬、アンカロン等が挙げられる。
　炎症性腸疾患治療薬としては、例えば、サラゾスルファピリジン、メサラジン等が挙げられる。
　呼吸器用薬としては、例えば、ジモルホラミン、ドキサプラム塩酸塩水和物、シベレスタットナトリウム水和物、ピルフェニドン、肺サーファクタント、ドルナーゼ　アルファ等が挙げられる。
　神経系用薬としては、例えば、エダラボン、インターフェロンベータ－１ａ、インターフェロンベータ－１ｂ、フィンゴリモド塩酸塩、リルゾール、タルチレリン水和物等が挙げられる。
　循環器用薬としては、例えば、ヘプロニカート、ミドドリン塩酸塩、アメジニウムメチルメチル硫酸塩、エチレフリン塩酸塩、フェニレフリン塩酸塩等が挙げられる。
　脳循環改善薬としては、例えば、イフェンプロジル酒石酸塩、ニセルゴリン、イプジラスト、ジヒドロエルゴトキシンメシル酸塩、ニゾフェノンフマル酸塩、ファスジル塩酸塩水和物等が挙げられる。
　免疫抑制薬としては、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、ミゾリビン、バシリキシマブ、タクロリムス水和物、グスペリムス塩酸塩、ミコフェノール酸モフェチル、エベロリムス等が挙げられる。
　上記他の薬剤を本発明の間葉系幹細胞と共に投与する場合、保存時には、間葉系幹細胞と、他の薬剤とは同一の容器内に保存されてもよいし、別の容器中に保存されていてもよい。疾患の種類、治療方法、患者の状態等により、他の薬剤と、間葉系幹細胞とを同時に投与してもよいし、一定の間隔をあけて投与してもよい。
　本発明の間葉系幹細胞は、種々の疾患の治療に好適に用いることができる。例えば、内臓疾患、具体的には、心疾患、胃・十二指腸疾患、小腸・大腸疾患、肝疾患、胆道疾患、膵疾患、腎疾患、肺疾患、縦隔膜疾患、横隔膜疾患、胸膜疾患、腹膜疾患、神経疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）障害、末梢動脈疾患、末梢静脈疾患に対して用いることが好ましい。
　具体的疾患としては、例えば、自己免疫性肝炎、劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｆａｔｔｙ　ｌｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ（ＮＡＦＬＤ））、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ（ＮＡＳＨ））、非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｆａｔｔｙ　ｌｉｖｅｒ　（ＮＡＦＬ））、肝線維症、肝硬変、肝癌、脂肪肝、薬剤アレルギー性肝障害、ヘモクロマトーシス、ヘモジデローシス、ウィルソン病、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、胆道閉鎖、肝膿瘍、慢性活動性肝炎、慢性持続性肝炎等の肝疾患；心筋梗塞、心不全、不整脈、動悸、心筋症、虚血性心筋症、狭心症、先天性心疾患、心臓弁膜症、心筋炎、家族性肥大型心筋症、拡張型心筋症、急性冠症候群、アテローム血栓症、再狭窄等の心疾患；急性胃炎、慢性胃炎、胃・十二指腸潰瘍、胃癌、十二指腸癌等の胃・十二指腸疾患；虚血性腸炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、Ｃｒｏｈｎ病、単純性潰瘍、腸管ベーチェット病、小腸癌、大腸癌等の小腸・大腸疾患；急性胆嚢炎、急性胆管炎、慢性胆嚢炎、胆管癌、胆嚢癌等の胆道疾患；急性膵炎、慢性膵炎、膵癌等の膵疾患；急性腎炎、慢性腎炎、急性腎不全、慢性腎不全等の腎疾患；肺炎、肺気腫、肺線維症、間質性肺炎、特発性間質性肺炎、剥離性間質性肺炎、急性間質性肺炎、非特異的間質性肺炎、薬物誘発性肺疾患、好酸球性肺疾患、肺高血圧症、肺結核、肺結核後遺症、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、肺塞栓症、肺膿症、塵肺、嚥下性肺炎肺線維症、急性上気道感染症、慢性下気道感染症、気胸、肺胞上皮に傷害が見られる疾患、リンパ管平滑筋種、リンパ性間質性肺炎、肺胞蛋白症、肺ランゲルハンス細胞肉芽腫症等の肺疾患；縦隔腫瘍、縦隔の嚢胞性疾患、縦隔炎等の縦隔膜疾患；横隔膜ヘルニア等の横隔膜疾患；胸膜炎、膿胸、胸膜腫瘍、がん性胸膜炎、胸膜中皮腫等の胸膜疾患；腹膜炎、腹膜腫瘍等の腹膜疾患；小児脳性麻痺を含む脳性麻痺症候群、無菌性髄膜炎、ギランーバレー症候群、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、重症筋無力症、モノニューロパシー、多発ニューロパシー、脊髄性筋萎縮症、脊椎障害、急性横断性脊髄炎、脊髄梗塞（虚血性脊髄障害）、頭蓋内腫瘍、脊椎腫瘍等の神経疾患；Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病、認知障害、脳卒中、多発性硬化症、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ病等のＣＮＳ障害；線維筋性異形成、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、閉塞性血栓血管炎（ビュルガー病）、川崎病（ＫＤ）等の末梢動脈疾患；深部静脈血栓症、慢性静脈不全、静脈炎後症候群、表在性静脈血栓症等の末梢静脈疾患；移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、続発性免疫不全症、原発性免疫不全疾患、Ｂ細胞の欠損、Ｔ細胞不全、Ｂ及びＴ細胞複合欠損、食細胞欠損、古典経路における補体欠損、ＭＢＬ経路における補体欠損、代替経路における補体欠損、補体調節蛋白欠損、補体レセプター欠損等の免疫不全疾患が挙げられる。
　これらのうち、間葉系幹細胞による治療効果が十分に得られることが確認されている肝疾患、心疾患、肺疾患、神経疾患、末梢動脈疾患、免疫不全疾患が好ましく、中でも、肝線維症、肝硬変、心筋梗塞、心不全、肺線維症、間質性肺炎、小児脳性麻痺、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療により好適に用いることができ、肝線維症、肝硬変、心筋梗塞、心不全、肺線維症、間質性肺炎にさらに好適に用いることができる。
［疾患の治療方法］
　本発明のさらに別の側面によれば、本発明は、組織因子（ＴＦ）が低発現である間葉系幹細胞、ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢＬ１、ＩＴＧＢ１及びＩＴＧＡＶからなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が低発現であることを特徴とする間葉系幹細胞、又はＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ７及びＩＴＧＡ１０からなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が高発現であることを特徴とする間葉系幹細胞を使用する、疾患の治療方法も含む。すなわち、本発明によると、上記本発明の間葉系幹細胞を各種疾患の患者に投与することにより、安全性が高く、各種疾患の治療効果を奏することが可能である。なお、本発明の治療方法に用いられる間葉系幹細胞については、上述の［間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物］の項における説明を適用できる。
［治療用間葉系幹細胞の判定方法］
　本発明のさらに別の側面によれば、本発明は、間葉系幹細胞が疾患の治療に適しているか否かを判定する方法も含まれる。すなわち、本発明の判定方法は、間葉系幹細胞の組織因子（ＴＦ）の発現を測定する工程、ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢＬ１、ＩＴＧＢ１及びＩＴＧＡＶからなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子の発現を測定する工程、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ７及びＩＴＧＡ１０からなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子の発現を測定する工程を含む。上記工程において、間葉系幹細胞の組織因子（ＴＦ）の発現が低発現であること、ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢＬ１、ＩＴＧＢ１及びＩＴＧＡＶからなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子の発現が低発現であること、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ７及びＩＴＧＡ１０からなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子の発現が高発現であることを確認できた細胞は、疾患治療において安全性が高いと判定できる。なお、上記組織因子（ＴＦ）、各種インテグリンの発現についての詳細は、上述の［間葉系幹細胞及びそれを含む医薬組成物］の項における説明を適用できる。
　以下に、実施例及び試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。
［脂肪由来間葉系幹細胞の継代培養］
　脂肪組織由来間葉系幹細胞（以下「ＡＤＳＣ」）（ロンザ社製、品番ＰＴ－５００６）をＰ２からＰ４まで間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）を用いて培養した。Ｐ４からＰ５では、間葉系幹細胞用無血清培地、又は１０％ＦＢＳ血清培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　ａｌｐｈａ（ＭＥＭα））を用いて３日間培養した。フラスコに付着したＡＤＳＣを、トリプシンを用いて剥離し、遠沈管に移し、４００×ｇで５分間、遠心分離し細胞の沈殿を得た。上清を除去した後、細胞凍結保存液（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（ゼノアック社））を適量加え懸濁した。当該細胞懸濁溶液を、クライオチューブに分注した後、フリーザー内で－８０℃にて保存後、液体窒素上の気相に移し、保存を継続し凍結ストックとした。
［自己免疫性肝炎モデルマウスを用いた治療効果の確認］（実施例１）
　マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア、７週齢、雄）に２０ｍｇ／ｋｇのコンカナバリンＡ（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製）を単回投与する事で、肝炎を誘発した。この肝炎を誘発したマウスに、上記凍結ストックの細胞（間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）で培養した脂肪由来間葉系幹細胞、又は１０％ＦＢＳ血清培地（ＭＥＭ）で培養した脂肪由来間葉系幹細胞）を、５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇにて、単回静脈内投与した。細胞は融解後、ＭＥＭα（血清無添加）で洗浄した後、ＨＢＳＳに懸濁して投与に用いた。細胞無投与群にはＨＢＳＳのみを投与した。細胞無投与群及び、間葉系幹細胞用無血清培地群（間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）で培養した脂肪由来間葉系幹細胞投与群）では、全数が生存したのに対して、１０％ＦＢＳ血清培地群（１０％ＦＢＳ血清培地（ＭＥＭα）で培養した脂肪由来間葉系幹細胞）では全数が死亡した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以上の結果により、１０％ＦＢＳ血清培地群（１０％ＦＢＳ血清培地（ＭＥＭα）で培養した脂肪由来間葉系幹細胞）は安全性に問題があるのに対して、間葉系幹細胞用無血清培地群（間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）で培養して得られた本発明の間葉系幹細胞）は、安全性が高いことが示された。
［脂肪組織由来間葉系幹細胞の細胞サイズの測定］（実施例２）
　上記と同様に調整を行った脂肪由来間葉系幹細胞の細胞サイズを、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈ　ＣＸ５　Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　（ＨＣＳ）　Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）用いて、測定した。間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）で培養を行った細胞は平均粒子径が１１．９９μｍであったのに対して、１０％ＦＢＳ血清培地（ＭＥＭα）で培養を行った細胞の平均粒子径が１３．０３μｍであった。間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）で培養を行った細胞の平均粒子径は、１０％ＦＢＳ血清培地で培養を行った細胞の平均粒子径より１０％程度小さいことがわかった（図１）。
［１０％ＦＢＳ血清培地培養細胞投与の、マウス生存率への影響］（試験例１）
　ＡＤＳＣ（ロンザ社製、品番ＰＴ－５００６）をＰ２からＰ４まで間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）を用いて培養した。Ｐ４からＰ５は、１０％ＦＢＳ血清培地（ＭＥＭα）を用いて３日間培養し、上記と同様に凍結ストックを作製した。この細胞を正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、日本クレア、９週齢、雄）に、単回静脈内投与（５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ）したところ、６例中全例で投与後２０時間以内に死亡が認められた。なお、細胞は融解後、ＭＥＭα（血清無添加）で洗浄した後、ＨＢＳＳに懸濁して投与に用いた。これにより、コンカナバリンＡ誘発肝炎との相互作用ではなく、１０％ＦＢＳ血清培地（ＭＥＭα）で培養された細胞によってマウスが死亡している可能性が示唆された。
［脂肪由来間葉系幹細胞のＴＦ発現］（実施例３）
　ＡＤＳＣ（ロンザ社、品番ＰＴ－５００６）をＰ２からＰ４まで間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）を用いて培養した。Ｐ４からＰ５では、間葉系幹細胞用無血清培地（無血清培地群）又は１０％ＦＢＳ血清培地（ＭＥＭα、血清培地群）を用いて３日間培養し、上記と同様に凍結ストックを作製した。それぞれのＰ５細胞を起眠し、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを回収した。ＴＦのｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した（図２）。また、タンパク質レベルでの発現はフローサイトメトリーにより検出した（図３）。
　血清培地群に比べ、無血清培地群では、ＴＦのｍＲＮＡ及びＴＦ蛋白の発現量が低いことがわかった。
［脂肪由来間葉系幹細胞のインテグリン関連遺伝子の発現１］（実施例４）
　ＡＤＳＣ（ロンザ社製、品番ＰＴ－５００６）をＰ２からＰ４までそれぞれ間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社、無血清培地群）又は１０％ＦＢＳ血清培地（血清培地群）で培養し、上記と同様に凍結ストックを作製した。それぞれのＰ４細胞を起眠し、６ウェルプレートに５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、２種類それぞれの培地で３日間培養した後、マイクロアレイ解析により遺伝子発現を解析した。結果を表２に示す。
　血清培地群に比べ無血清培地群では、有意にＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢＬ１、ＩＴＧＢ１及びＩＴＧＡＶの発現量が低く、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ７及びＩＴＧＡ１０の発現量が高いことがわかった（表２）。表２中の数値は、各遺伝子（ｍＲＮＡ）の相対発現強度を、底が２の対数で表したものである。また、ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅは、血清培地群／無血清培地群の値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［脂肪由来間葉系幹細胞のインテグリン関連遺伝子の発現２］（実施例５）
　ＡＤＳＣ（ロンザ社製、品番ＰＴ－５００６）をＰ２からＰ４までそれぞれ間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社、無血清培地群）又は１０％ＦＢＳ血清培地（血清培地群）で培養し、上記と同様に凍結ストックを作製した。それぞれのＰ４細胞を起眠し、６ウェルプレートに５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、２種類それぞれの培地で３日間培養した後、ＡＤＳＣのｔｏｔａｌ　ＲＮＡを回収し、インテグリン関連遺伝子であるＩＴＧＢ５及びＩＴＧＢ１のｍＲＮＡ発現量を定量ＰＣＲで測定した。結果を図４及び５に示す。
　図４及び図５に示すとおり、血清培地群に比べ、無血清培地群では、ＩＴＧＢ５及びＩＴＧＢ１の発現量が低いことがわかった。
［脂肪由来間葉系幹細胞のインテグリン関連遺伝子の発現３］（実施例６）
　ＡＤＳＣ（ロンザ社製、品番ＰＴ－５００６）をＰ２からＰ４までそれぞれ間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社、Ｒｏｈｔｏ培地群）、間葉系幹細胞用無血清培地（Ｌｏｎｚａ社、Ｌｏｎｚａ培地群）又は１０％ＦＢＳ血清培地（血清培地群）で培養し、凍結ストックを作製した。それぞれのＰ４細胞を起眠し、６ウェルプレートに５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３種類それぞれの培地で３日間培養した後、ＡＤＳＣのｔｏｔａｌ　ＲＮＡを回収し、インテグリン関連遺伝子であるＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡＶ及びＩＴＧＡ４のｍＲＮＡ発現量を定量ＰＣＲで測定した。結果を図６～９に示す。
　図６～９に示すとおり、血清培地群に比べ、無血清培地群では、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ１１及びＩＴＧＡＶの発現量が低く、Ｒｏｈｔｏ社培地群はＬｏｎｚａ社培地群よりもさらにＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ１１及びＩＴＧＡＶの発現量が低いことがわかった。また、血清培地群に比べ、無血清培地群では、ＩＴＧＡ４の発現量が高く、Ｒｏｈｔｏ社培地群はＬｏｎｚａ社培地群よりもさらにＩＴＧＡ１４の発現量が高いことがわかった。
［脂肪由来間葉系幹細胞及び臍帯由来間葉系幹細胞のインテグリン関連遺伝子の発現］（実施例７）
　脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ、ロンザ社製、品番ＰＴ－５００６）及び臍帯由来間葉系幹細胞の各細胞をＰ２からＰ４までそれぞれ間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社、無血清培地群）又は１０％ＦＢＳ血清培地（血清培地群）で培養し、上記と同様に凍結ストックを作製した。それぞれのＰ４細胞を起眠し、６ウェルプレートに５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３種類それぞれの培地で３日間培養した後、脂肪由来間葉系幹細胞及び臍帯由来間葉系幹細胞のｔｏｔａｌ　ＲＮＡを回収し、インテグリン関連遺伝子であるＩＴＧＢ１のｍＲＮＡ発現量を定量ＰＣＲで測定した。結果を図１０に示す。
　図１０に示すとおり、脂肪由来間葉系幹細胞と同様、臍帯由来間葉系幹細胞についても血清培地群に比べ、無血清培地群では、ＩＴＧＢ１の発現量が低いことがわかった。
［脂肪由来間葉系幹細胞及び骨髄由来間葉系幹細胞のインテグリン関連遺伝子の発現］（実施例８）
　脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ、ロンザ社製、品番ＰＴ－５００６）及び骨髄由来間葉系幹細胞（ロンザ社製、型番：ＰＴ－２５０１）の各細胞をＰ２からＰ４までそれぞれ間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社、無血清培地群）又は１０％ＦＢＳ血清培地（血清培地群）で培養し、上記と同様に凍結ストックを作製した。それぞれのＰ４細胞を起眠し、６ウェルプレートに５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３種類それぞれの培地で３日間培養した後、脂肪由来間葉系幹細胞及び骨髄由来間葉系幹細胞のｔｏｔａｌ　ＲＮＡを回収し、インテグリン関連遺伝子であるＩＴＧＡ１及びＩＴＧＡ４のｍＲＮＡ発現量を定量ＰＣＲで測定した。結果を図１１及び１２に示す。
　図１１及び図１２に示すとおり、脂肪由来間葉系幹細胞と同様、骨髄由来間葉系幹細胞についても血清培地群に比べ、無血清培地群では、ＩＴＧＡ１の発現量が低く、ＩＴＧＡ４の発現量が高いことがわかった。
［脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞及び骨髄由来間葉系幹細胞のインテグリン関連遺伝子の発現］（実施例９）
　脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ、ロンザ社製、品番ＰＴ－５００６）、臍帯由来間葉系幹細胞及び骨髄由来間葉系幹細胞（ロンザ社製、型番：ＰＴ－２５０１）の各細胞をＰ２からＰ４までそれぞれ間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社、無血清培地群）又は１０％ＦＢＳ血清培地（血清培地群）で培養し、上記と同様に凍結ストックを作製した。それぞれのＰ４細胞を起眠し、６ウェルプレートに５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３種類それぞれの培地で３日間培養した後、各間葉系幹細胞のｔｏｔａｌ　ＲＮＡを回収し、インテグリン関連遺伝子であるＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡＶ及びＩＴＧＢ５のｍＲＮＡ発現量を定量ＰＣＲで測定した。結果を図１３～１５に示す。
　図１３～１５に示すとおり、脂肪由来間葉系幹細胞と同様、臍帯由来間葉系幹細胞及び骨髄由来間葉系幹細胞についても血清培地群に比べ、無血清培地群では、ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡＶ及びＩＴＧＢ５の発現量が低いことがわかった。
　本発明により、間葉系幹細胞及びそれを含有する医薬組成物が提供される。また、本発明によると、医薬品として用いる際に安全性の高い間葉系幹細胞を提供することができる。

Claims (6)

  1. 　組織因子（ＴＦ）が低発現であることを特徴とする、間葉系幹細胞。
  2. 　ＩＴＧＡ１１、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢＬ１、ＩＴＧＢ１及びＩＴＧＡＶからなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が低発現であることを特徴とする、間葉系幹細胞。
  3. 　ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ７及びＩＴＧＡ１０からなる群より選択される少なくとも一種のインテグリン遺伝子が高発現であることを特徴とする、間葉系幹細胞。
  4. 　他家由来である、請求項１から３のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞。
  5. 　脂肪組織由来である、請求項１から４のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞。
  6. 　請求項１から５のいずれか１項に記載の間葉系幹細胞を含有する医薬組成物。
PCT/JP2018/006364 2017-03-03 2018-02-22 間葉系幹細胞及び医薬組成物 Ceased WO2018159432A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019502921A JPWO2018159432A1 (ja) 2017-03-03 2018-02-22 間葉系幹細胞及び医薬組成物
EP18760998.7A EP3591038A4 (en) 2017-03-03 2018-02-22 MESENCHYMATIC STEM CELL, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION
US16/490,790 US20200016211A1 (en) 2017-03-03 2018-02-22 Mesenchymal stem cells and pharmaceutical composition
CN201880006900.3A CN110177872A (zh) 2017-03-03 2018-02-22 间充质干细胞和药物组合物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-040807 2017-03-03
JP2017040807 2017-03-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018159432A1 true WO2018159432A1 (ja) 2018-09-07

Family

ID=63370368

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/006364 Ceased WO2018159432A1 (ja) 2017-03-03 2018-02-22 間葉系幹細胞及び医薬組成物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20200016211A1 (ja)
EP (1) EP3591038A4 (ja)
JP (1) JPWO2018159432A1 (ja)
CN (1) CN110177872A (ja)
WO (1) WO2018159432A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019093481A1 (ja) * 2017-11-09 2019-05-16 北海道公立大学法人札幌医科大学 組織再生用医薬及びその製造方法
JP2021114995A (ja) * 2020-01-21 2021-08-10 東ソー株式会社 低組織因子活性細胞、およびその製法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018159431A1 (ja) * 2017-03-03 2018-09-07 ロート製薬株式会社 間葉系幹細胞及び肝疾患治療剤
JPWO2021210515A1 (ja) * 2020-04-13 2021-10-21
JP2024529495A (ja) 2021-07-29 2024-08-06 ツールゲン インコーポレイテッド 血液適合性を有する間葉系幹細胞、この製造方法および用途
CN118804976A (zh) * 2021-12-17 2024-10-18 雷杰纳荣制药公司 用整联蛋白亚基α1(ITGA1)抑制剂治疗肺部疾患
CN114085812B (zh) * 2022-01-12 2022-04-19 铂生卓越生物科技（北京）有限公司 一种高表达cd106和/或cd142表达降低的间充质干细胞群、其制备方法及应用
CN116138250B (zh) * 2023-04-20 2023-07-14 深圳市森盈智能科技有限公司 一种穿刺细胞保存液、试剂盒、保存方法及应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6777231B1 (en) 1999-03-10 2004-08-17 The Regents Of The University Of California Adipose-derived stem cells and lattices
WO2007058308A1 (ja) 2005-11-17 2007-05-24 Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd. 細胞保存用水溶液
JP2012508733A (ja) 2008-11-14 2012-04-12 メディポスト カンパニー リミテッド 間葉幹細胞またはその培養液を含む神経疾患の予防または治療用の組成物
JP2012157263A (ja) 2011-01-31 2012-08-23 Seems Inc アルツハイマー病治療に向けたヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞
JP2016140346A (ja) * 2015-02-05 2016-08-08 国立大学法人名古屋大学 脂肪組織由来間葉系幹細胞の選別法
JP2016144439A (ja) * 2015-01-30 2016-08-12 ロート製薬株式会社 細胞の品質を評価する方法、及び細胞の品質判定キット

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8663987B2 (en) * 2008-05-28 2014-03-04 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Mesenchymal stem cells for the treatment of CNS diseases
SG11201600774TA (en) * 2013-08-01 2016-03-30 Agency Science Tech & Res Method of identifying adipose stem cells
CN106282103A (zh) * 2015-06-03 2017-01-04 周宇璠 动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液
CN106222134A (zh) * 2016-07-29 2016-12-14 中卫华医（北京）生物科技有限公司 高效获取脂肪间充质干细胞的培养方法
MX2019005127A (es) * 2016-11-03 2019-09-26 Exostem Biotec Ltd Poblaciones y productos de células madre mesenquimales y sus usos.

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6777231B1 (en) 1999-03-10 2004-08-17 The Regents Of The University Of California Adipose-derived stem cells and lattices
WO2007058308A1 (ja) 2005-11-17 2007-05-24 Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd. 細胞保存用水溶液
JP2012508733A (ja) 2008-11-14 2012-04-12 メディポスト カンパニー リミテッド 間葉幹細胞またはその培養液を含む神経疾患の予防または治療用の組成物
JP2012157263A (ja) 2011-01-31 2012-08-23 Seems Inc アルツハイマー病治療に向けたヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞
JP2016144439A (ja) * 2015-01-30 2016-08-12 ロート製薬株式会社 細胞の品質を評価する方法、及び細胞の品質判定キット
JP2016140346A (ja) * 2015-02-05 2016-08-08 国立大学法人名古屋大学 脂肪組織由来間葉系幹細胞の選別法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AL-SAQI S.H. ET AL.: "Defined serum-free media for in vitro expansion of adipose-derived mesenchymal stem cells", CYTOTHERAPY, vol. 16, no. 7, 13 April 2014 (2014-04-13), pages 915 - 926, XP055543112, Retrieved from the Internet <URL:https://doi.org/doi:10.1016/j.jcyt.2014.02.006> *
FURLANI D. ET AL., MICROVASC. RES., vol. 77, 2009, pages 370 - 376
PITTENGER F. M. ET AL., SCIENCE, vol. 284, 1999, pages 143 - 147
See also references of EP3591038A4
SHIRATSUKI S. ET AL., HEPATOLOGY RESEARCH, vol. 45, 2015, pages 1353 - 1359
TATSUMI K. ET AL., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 431, 2013, pages 203 - 209

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019093481A1 (ja) * 2017-11-09 2019-05-16 北海道公立大学法人札幌医科大学 組織再生用医薬及びその製造方法
JP2021114995A (ja) * 2020-01-21 2021-08-10 東ソー株式会社 低組織因子活性細胞、およびその製法
JP7647047B2 (ja) 2020-01-21 2025-03-18 東ソー株式会社 低組織因子活性細胞、およびその製法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3591038A4 (en) 2020-11-25
US20200016211A1 (en) 2020-01-16
EP3591038A1 (en) 2020-01-08
CN110177872A (zh) 2019-08-27
JPWO2018159432A1 (ja) 2019-12-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018159432A1 (ja) 間葉系幹細胞及び医薬組成物
JP7082372B2 (ja) 肺線維症治療剤、ｐｔｐｒｒ発現促進剤及び肺線維症治療用キット
JP2025071327A (ja) 間葉系幹細胞及び肝疾患治療剤
WO2017110425A1 (ja) 肝疾患治療剤及び肝疾患を治療する方法
JP7593580B2 (ja) 間葉系幹細胞、疾患治療剤及び微小粒子
JPWO2018116732A1 (ja) 非アルコール性脂肪肝炎治療剤及び非アルコール性脂肪肝炎治療用キット
US20200171092A1 (en) Therapeutic agent for dilated cardiomyopathy
JP7136700B2 (ja) 細胞医薬組成物、疾患治療用キット及び細胞懸濁用溶液
JP7644564B2 (ja) 細胞医薬組成物、疾患治療用キット及び細胞懸濁用溶液
JP7189659B2 (ja) 疾患治療用の細胞医薬組成物、疾患治療用キット、細胞医薬組成物の調製方法
HK40005858A (en) Mesenchymal stem cells and pharmaceutical composition
HK40005859A (en) Mesenchymal stem cells and therapeutic agent for liver disease
HK40005859B (en) Mesenchymal stem cells and therapeutic agent for liver disease
HK40003461A (en) Therapeutic agent for non-alcoholic steatohepatitis, and kit for treatment of non-alcoholic steatohepatitis
HK40005249A (en) Pulmonary fibrosis treatment agent, ptprr expression-promoting agent, and kit for pulmonary fibrosis treatment
HK40007430A (en) Cell pharmaceutical composition, disease treatment kit, and cell suspension solution

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18760998

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019502921

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2018760998

Country of ref document: EP