A. Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Technologie der
rekombinanten DNA und fusst auf der Identifizierung von in
Pflanzen vorkommenden GRP-(glycinreiches Protein) Genen mit
einem salicylatinduzierbaren Promotor. Insbesondere bezieht
sich die Erfindung auf die Verwendung eines solchen
salicylatinduzierbaren Promotors.
B. Stand der Technik
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Pflanzen sind ständig Einflüssen aus ihrer Umgebung
unterworfen, die eine Bedrohung beinhalten können. Diese
Einflüsse können sich auf Faktoren wie Temperatur, Licht,
Feuchtigkeit, Salz und Verletzungen beziehen, aber auch auf
Befall durch Pathogene wie Viren, Pilze, Bakterien,
Insekten und Ähnlichem. Zum Überleben hat die Pflanze ein
breites Spektrum von Abwehrmechanismen zur Verfügung, die
aktiviert werden, wenn die Pflanze den erwähnten
"Stress"-Bedingungen unterworfen wird. Diese Aktivierung ist im
Allgemeinen von einer Induktion der Expression spezifischer
Pflanzengene begleitet. Diese Induktion wird durch
Steuerelemente gesteuert, die sich oft im stromaufwärts vom
fraglichen Gen liegenden Promotorgebiet befinden. Ein gegebener
Stressfaktor kann entweder einen hochspezifischen Satz von
Pflanzengenen aktivieren oder eine breite Antwort von
vielen Abwehrgenen bewirken. Eine Erhöhung der Temperatur für
eine kurze Zeit kann etwa zu einer Expression von
sogenannten "Hitzeschock"- (HS-)Proteingenen führen; die Pflanze
ist anschliessend resistent gegen Temperaturen, gegen die
unbehandelte Pflanzen nicht resistent sind. Eine
konservierte Sequenz von ungefähr 14 Basenpaaren, die mehrere
Male im Promotorgebiet von HS-Proteingenen vorkommt, wurde
als Ursache für die Induktion dieser Gene festgestellt
(siehe z. B. Pelham und Bienz, 1982; Bienz, 1985).
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Verschiedene lichtinduzierbare Gene wurden mittlerweile
geklont. Wird eine Sequenz von mehreren hundert Basenpaaren,
die stromaufwärts dieser Gene liegt, mit einem
"Reportergen" fusioniert, zum Beispiel dem Chloramphenicol-
Acetyltransferase- (CAT-)Gen, wird dieses Gen in transgenen
Pflanzen lichtinduzierbar. (siehe z. B. Kuhlemeier et al.,
1987; Green et al., 1987; Stockhous et al., 1987). In den
Promotorgebieten einer Reihe von lichtinduzierbaren Genen
kann ein gemeinsames Element von 9 Basenpaaren beobachtet
werden, das wahrscheinlich mit der Lichtinduzierbarkeit zu
tun hat (Grob und Stüber, 1987).
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Werden Pflanzen verletzt, entweder mechanisch oder durch
Insektenfrass, werden unter anderem Pflanzengene aktiviert,
die für Proteinaseinhibitoren codieren. Diese Proteine, die
in Tomate und Kartoffel am besten untersucht sind, weisen
praktisch keine Wirkung auf proteolytische Enzyme der
Pflanze, inhibieren aber spezifisch Verdauungsenzyme von
Tieren, insbesondere diejenigen von Insekten. Wird ein
Proteaseinhibitorgen der Kartoffel durch Verletzung induziert,
wird gefunden, dass unter anderem Basensequenzen involviert
sind, die stromabwärts des Gens liegen (Thornburg et al.,
1987). Wird ein Proteinaseinhibitorgen unter die Steuerung
eines konstitutiven Promotors (des CaMV-35S-Promotors)
gestellt und in transgenen Pflanzen exprimiert, wird
gefunden, dass die Pflanze sehr resistent gegen Schädigung durch
Insekten wird (Hilder et al., 1987).
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Die Pflanze weist, um zur Abwehr von Infektion durch
Pathogene befähigt zu sein, einen Mechanismus auf, der unter dem
Namen "hypersensible Antwort" bekannt ist. Wird, als Folge
der Infektion, dieser Mechanismus aktiviert, sterben die
infizierten Pflanzenzellen ab, und es wird eine Ligninwand
rund um den Infektionsherd gebildet, durch die das Pathogen
nicht hindurchtreten kann. Das bedeutet, dass die Infektion
nekrotische Läsionen an den Infektionsherden bewirkt, aber
die übrigen Teile der Pflanze bleiben nahezu pathogenfrei.
Pathogene, die die hypersensible Antwort nicht auslösen,
können sich in der ganzen Pflanze ausbreiten und auf hohe
Konzentrationen angereichert werden.
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Es wurde gefunden, dass in Falle einer nekrotischen
Infektion die pathogenfreien Teile der Pflanze unabhängig von
der Art des Pathogens, das die erste Infektion bewirkte,
eine Resistenz gegen eine zweite Infektion durch ein
breites Spektrum von Pathogenen wie Viren, Pilze und Bakterien
entwickeln ("erworbene Resistenz"). Auf diese Weise führt
eine nekrotische Virusinfektion zur Resistenz gegen Pilze
und umgekehrt. Aufgrund der nekrotischen Infektion wird in
den pathogenfreien Teilen der Pflanze eine grosse Zahl von
20 Genen induziert (für eine Übersicht siehe Van Loon, 1982;
Van Loon, 1985; Collinge und Slusarenko, 1987; Bol und Van
Kan, 1988 Van Loon, 1998). Es wird angenommen, dass
Produkte, die durch die induzierten Gene codiert werden, eine
Rolle in der erworbenen Resistenz spielen. Ein Teil der
induzierten Gene codiert für Enzyme, die, ausgehend von der
Aminosäure Phenylalanin, eine Reihe von aromatischen
Verbindungen synthetisieren. Diese schliessen Verbindungen
ein, die das Wachstum von Pilzen hemmen und die
Phytoalexine genannt werden. Sie schliessen auch Vorstufen des
Lignins ein, das zur Verstärkung der Zellwände und zur
Bildung einer Barriere rund um einen Infektionsherd verwendet
wird. Ein anderer Teil der induzierten Gene codiert für
hydroxyprolinreiche Glycoproteine (HRGP, Extensin) die in
die Zellwand eingebaut werden und als Matrix zur Anbindung
von aromatischer Verbindungen wie Lignin dienen. Eine
dritte Gruppe induzierter Gene schliesslich codiert für
Proteine, die sich in der Vakuole in der Pflanzenzelle
anreichern oder die in den interzellulären Raum des Blattes
abgeschieden werden. Dieses sogenannten PR-Proteine
("pathogenesis-related proteins") sind im Tabak am besten
untersucht, kommen aber im Pflanzenreich in
hochkonservierter Form vor. Einerseits stellen sie sich als hydrolytische
Enzyme wie etwa Chinitasen und Glucanasen heraus, die in
Kombination das Wachstum von Pilzen auf künstlichen Medien
effizient hemmen. Von einem anderen PR-Protein wird
angenommen, dass es die Verdauungsenzyme von Insekten hemmt.
Die Funktion der anderen PR-Proteine ist unbekannt.
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White (1979) hat gefunden, dass die Behandlung von Tabak
mit gewissen aromatischen Verbindungen wie etwa
Salicylsäure (in neutralisierter Form) zur Induktion einer
Untergruppe der PR-Proteine, d. h. der PR-1-Proteine, und zu
einer Resistenz gegen Virusbefall führt. Das wurde als
Hinweis gedeutet, dass diese Untergruppe von PR-Proteinen mit
der Resistenz gegen Virusbefall zu tun hat. Fraser (1983)
hielt dem entgegen, dass es Bedingungen gibt, die
PR-1-Proteine induzieren, aber keine antivirale Antwort erzeugen.
Hooft von Huijsduijnen et al. (1986) klonierten DNA-Kopien
von sechs Klassen von messenger-RNA (mRNA), die im Tabak
Samsun NN durch einen Befall mit dem Tabakmosaikvirus
induziert werden. Zwei dieser Klassen von mRNA werden auch
durch Salicylat induziert. Eine von diesen stellte sich als
den PR-1-Proteinen entsprechend heraus. Die andere
entspricht nicht bekannten PR-Proteinen und wurde anfänglich
"Cluster C" genannt. In der Zwischenzeit wurde der Name zu
GRP-mRNA geändert, da gefunden wurde, das sie für ein
glycinreiches Protein codiert. Letzteres deutet darauf hin,
dass das Protein ein Bestandteil der Zellwand sein könnte,
der in seiner Funktion dem HGRP vergleichbar ist (Varner
und Cassab, 1986). Die DNA-Kopien (cDNA's) der PR-1-mRNA
sind als Sonde verwendet worden, um Klone von PR-1-Genen
mit einer genomischen Bibliothek des Tabaks zu isolieren;
deren Basensequenz ist aufgeklärt worden (Cornelissen et
al., 1987). Bol et al. (J. Cell. Biochem. Suppl. 12C,
p.244, 1998) beschreiben, dass ein genomischer Klone dieses
C-Proteins erhalten wurde und dass das Promotorgebiet
dieses Gens zur Verwendung in einer Pflanzentransformation an
ein Reportergen geknüpft wird. EP 0 307 841, die nur gemäss
Artikel 54(3) EPÜ entgegengehalten wird, offenbart
Sequenzen von induzierbaren PR-1-Promotoren.
C. Beschreibung der Erfindung
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Die Erfindung besteht in einer rekombinanten DNA-Sequenz
mit salicylatinduzierbarer Promotoraktivität, die in Fig. 1
als das Gebiet gezeigt ist, das Nucleotide -645 bis +8
einschliesst, oder einer Portion davon, wobei das besagte
Gebiet oder die Portion davon von ihren natürlichen
flankierenden Sequenzen isoliert sind. Insbesondere ist es das
Gebiet, das die Nucleotide -114 bis +8 aus Fig. 1
einschliesst.
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Durch Hybridisieren von GRP-cDNA mit einem Southern Blot
von DNA aus Nicotiana tabacum cv. Samsun NN wurde gefunden,
dass das Genom des Tabaks ungefähr acht GRP-Gene enthält.
Aus einer genomischen Bibliothek von Nicotiana tabacum cv.
Samsun NN wurden vier GRP-Gene kloniert. Die Basensequenz
so von zwei der klonierten GRP-Gene wurde geklärt. Es wurde
gefunden, dass beide aus zwei Exons bestehen, die für ein
Protein von 109 Aminosäuren codieren. Nach Abspaltung eines
mutmasslichen Signalpeptids besteht das reife Protein zu
etwa 25% aus Glycin und zu ungefähr 30% aus geladenen
Aminosäuren. Durch S1-Nucleasekartierung wurde gefunden, dass
eines der zwei analysierten Gene exprimiert wird. Die
Sequenz dieses Gens (Klon gGRP-8) und der flankierenden DNA-
Gebiete ist in Fig. 1 gezeigt. Das andere Gen wird
wahrscheinlich im Anschluss an einen Virusbefall nicht
exprimiert. Daraus und aus einer Analyse der Basensequenz von
klonierten GRP-cDNA's kann geschlossen werden, dass
mindestens drei der acht GRP-Gene nach einer Virusinfektion
exprimiert werden. Die erhaltenen Daten zeigen, dass über 80%
Homologie zwischen den verschiedenen codierenden Sequenzen
der verschiedenen GRP-Gene und auch zwischen den
stromaufwärts liegenden DNA-Gebieten besteht.
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Fragmente des Promotorgebiets des GRP-Gens im Klon gGRP-8
wurden mit dem CAT-Reportergen fusioniert. Mittels des
Agrobacterium tumefaciens-Verfahrens wurden diese
Konstrukte in das Genom von Tabak integriert, und die
transgenen Pflanzen wurden auf Induzierbarkeit des CAT-Gens durch
Salicylat getestet. In reproduzierbarer Weise wurde
gefunden, dass die ersten 114 Nucleotide stromaufwärts der
Transkriptions-Initiation eines oder mehrere Elemente
enthalten, die bewirken, dass der Promotor durch Salicylat
induzierbar wird. Es wurde gefunden, dass dieser Promotor
auch durch verschiedene andere Substanzen einschliesslich
Acrylsäure, Ethylen und Ethephon induziert wird. Zwischen
den Nucleotiden -400 und -645 von Fig. 1 liegen eines oder
mehrere Elemente, die die salicylatinduzierbare Aktivität
des Promotors stark erhöhen. Wird also ein DNA-Fragment,
das die Sequenz von Nucleotid -645 bis +8 trägt, an irgend
ein gegebenes Gen geknüpft, wird es für dieses Gen nach
Transformation von Pflanzen mit diesem Konstrukt möglich
sein, durch Salicylat und mehrere andere spezifische
Aromaten in einer gesteuerten Weise induziert zu werden. Zu
diesem Zeitpunkt sind keine anderen Pflanzenpromotoren bekannt
geworden, die mit einem chemischen Effektor auf eine so
einfache Weise reguliert werden können.
D. Weitere Erläuterung der Erfindung
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Die Erfindung stellt rekombinante DNA, die Vektor-DNA und
eine rekombinante DNA-Sequenz mit salicylatinduzierbarer
Promotoraktivität umfasst, zur Verfügung, die dadurch
gekennzeichnet ist, dass sie das Gebiet umfasst, das
Nucleotide -645 bis +8 aus Fig. 1 oder eine Portion davon mit
salicylatinduzierbarer Promotoraktivität einschliesst,
wobei das besagte Gebiet oder die Portion von ihren
natürlichen flankierenden Sequenzen isoliert sind.
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Die Vektor-DNA-Portion der rekombinanten erfindungsgemässen
DNA ist an sich nicht kritisch und wird durch die in
Betracht gezogene Verwendung der rekombinanten DNA bestimmt,
insbesondere durch den zu transformierenden Wirt. Der
Fachmann kennt die für einen gegebenen Wirt geeigneten
Vektoren. Bekannte Vektoren, die im Agrobacterium tumefaciens-
Verfahren zur Transformation von Pflanzen und
Pflanzenzellen verwendet werden können, sind zum Beispiel pAGS127 (von
der Elzen et al., 1985) und pROK1 (Baulcombe et al., 1986).
Bekannte Vektoren, die zur Klonierung in Bakterien wie etwa
Escherichia coli verwendet werden können, sind zum Beispiel
die verschiedenen pUC-Plasmide.
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Es ist dem Fachmann ebenfalls bekannt, dass die Vektor-DNA
in der Regel zusätzlich zu einem für den Wirt geeigneten
Replikationsursprung auch eines oder mehrere Markergene
enthält, z. B. gewisse Gene für Antibiotikaresistenz, damit
leicht nach transformierten Wirten selektioniert werden
kann.
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Das neue und erfinderische Element in der
erfindungsgemässen rekombinanten DNA ist in der DNA-Sequenz enthalten,
die einem salicylatinduzierbaren Promotor eines GRP-Gens
aus Pflanzen entspricht oder mit diesem zu tun hat. Fig. 1
veranschaulicht ein konkretes Beispiel eines solchen GRP-
Gens, umfassend ein strukturales GRP-Gen und flankierende
Reguliersequenzen. Nur gewisse Portionen der flankierenden
DNA-Sequenzen sind für die Promotorfunktion, die
Induzierbarkeit des Promotors durch Salicylat und die Stärke
entweder des Promotors oder seiner Induzierbarkeit durch
Salicylat verantwortlich. Insbesondere sind in den übrigen
Portionen der flankierenden Gebiete beträchtliche Variationen
zulässig. Hinsichtlich der Nucleotidsequenz des allfälligen
Gens, das unter die Steuerung der Promotorsequenz gestellt
ist, sind Änderungen, die die schlussendliche Sequenz der
Aminosäuren nicht beeinflussen, oft zulässig. Änderungen,
die zu kleineren Abweichungen in der Aminosäuresequenz
führen, haben in vielen Fällen trotzdem keine Auswirkungen auf
die Expression und Funktion des Proteins. Der Ort, die
Länge und Nucleotidsequenz der Introns kann in der Regel
ebenfalls variiert werden, vorausgesetzt, sie können durch
den Wirt verarbeitet werden.
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Es sollte angemerkt werden, dass der Begriff "GRP-Gen", wie
so er hier verwendet wird, nicht nur die für GRP codierende
DNA bedeutet, sondern auch in einem breiteren Sinn die DNA,
die mit der Expression von GRP zu tun hat, einschliesslich
der DNA, die für GRP codiert (hier als strukturelles GRP-
Gen bezeichnet), sowie die flankierenden DNA-Gebiete mit
regulierender Funktion einschliesslich des GRP-Promotors.
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Bevorzugte Ausführungsformen der hier beschriebenen
Erfindung bestehen in der Verwendung des erfindungsgemässen
Promotors für die folgenden Zwecke.
1. Gesteuerte Herstellung kommerziell in ressierender
proteine in Pflanzen
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Für die Herstellung über Verfahren mit rekombinanter DNA
von Proteinen, die einer posttranslationalen Modifikation,
z. B. einer Glykosylierung, unterzogen werden müssen,
empfiehlt es sich, eukaryotische Organismen zu verwenden. Es
ist absehbar, dass für diese Herstellung in Zukunft neben
Hefe- oder Tierzellen Pflanzen verwendet werden können.
Mittels des GRP-Promotors kann die Herstellung des
gewünschten Proteins zu einem gesteuerten Zeitpunkt ausgelöst
werden, indem die Pflanzen mit einer Lösung, die
millimolare Mengen an Salicylat enthält, besprüht oder bewässert
werden. Das ist insbesondere von Bedeutung, wenn das
herzustellende Protein für die Pflanze giftig ist oder
beispielsweise aufgrund einer einseitigen
Aminosäurezusammensetzung den Metabolismus der Pflanze belastet. Das
Salicylat kann auch über das Grundwasser zugeführt werden, wenn
ein lediglich lokaler Effekt nicht gewünscht wird.
Zusätzlich kann in dem Fall auf einen zusätzlichen Schritt des
Abwaschens des Salicylates, das in eingetrocknetem Zustand
auf den Blättern Nekrosen bilden kann, verzichtet werden.
Werden der GRP-Promotor oder Derivate davon mit dem Code
so für ein geeignetes Signalprotein fusioniert, besteht die
Möglichkeit, zu bewirken, dass das gewünschte Protein durch
die Pflanze in den interzellulären Raum des Blattes
abgesondert wird, von wo es in einfacher Weise in relativ
reiner Form isoliert werden kann.
2. Gesteuerte Expression von Genen in Pflanzen
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Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass die Expression
von Genen von ausserhalb gesteuert wird, mit der Absicht,
in der Pflanze gewisse Prozesse, die von
landwirtschaftlichem Interesse sind, zu steuern. Es könnten etwa Gene, die
mit der Resistenz gegen Krankheit zu tun haben, in
gesteuerter Weise exprimiert werden. Dieser Promotor reagiert
auch in Kombination mit geeigneten Genen, die mit der
Resistenz gegen Krankheit zu tun haben, sowohl schnell wie auch
mit grosser Effizienz als Folge einer Infektion durch eine
Vielzahl von Pathogenen, was eine effizientere
Abwehrreaktion ergibt. Der Grund dafür ist, dass das ursprüngliche
GRP-Gen nach einer Infektion durch beispielsweise TMV eines
der am schnellsten und am effizientesten reagierenden Gene
ist. Die fraglichen Gene, die durch den GRP-Promotor
gesteuert werden, können von der Pflanze selber stammen oder
von ausser zugeführt worden sein und entweder von anderen
Pflanzen oder anderen Organismen stammen (nachdem sie zur
Expression und zum Funktionieren des Genproduktes befähigt
worden sind.)
3. Gesteuerte Herstellung von kommerziell interessierenden
Proteinen in Kulturen von Pflanzenzellen
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Verschiedene biotechnologisch ausgerichtete Firmen und
Institutionen untersuchen gegenwärtig die Möglichkeit der
Verwendung von Kulturen von genetisch veränderten
Pflanzen
zellen im Grossmasstab zur Herstellung von Proteinen oder
sekundären Metaboliten. Im Prinzip besteht die Möglichkeit,
die Expression eines ökonomisch interessierenden Gens unter
die Steuerung des GRP-Promotors oder von Derivaten davon zu
bringen. Mittels üblicher Verfahren können Zellkulturen
oder Wurzelkulturen aus Pflanzenmaterial erhalten werden,
das durch das fragliche Promotor/Genfusionskonstrukt über
die Agrobacterium tumefaciens-Technik transformiert wurde.
In solchen Zellkulturen kann das betroffene Gen zum
gewünschten Zeitpunkt durch Zugabe von Natriumsalicylat in
millimolaren Mengen zu dem Kulturmedium induziert werden.
E. Beispiele
I. Klonierung von GRP-cDNA
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Polyadenylierte RNA wurde aus mit dem Tabakmosaikvirus
befallenem Tabak isoliert und über Gradientenzentrifugation
an Molekülen mit 650 Nucleotiden angereichert (Hoofd von
Huijsduijnen et al., 1986). Unter Verwendung von üblichen
Verfahren, die den Forschern auf diesem Gebiet gut bekannt
sind, konnte die RNA mittels eines Oligo-(dT)primers,
reverser Transkriptase und Desoxyribonucleotidtriphosphaten
zu einer minus-strängigen DNA kopiert werden. Anschliessend
wurde unter Verwendung von RNAse H und DNA-Polymerase
mittels des Verfahrens von Gubler und Hoffmann (1983) auf
dieser DNA eine komplementäre DNA-Kette synthetisiert. Die
doppelsträngige DNA wurde mit C-Enden versehen, die mit G-
Enden hybridisiert wurden, und wurde an das Plasmid pUC9
nach dessen Spaltung mit PstI (Maniatis et al., 1982)
geformt. Dieses Konstrukt wurde zur Transformation von E.
coli MH-1 verwendet. Die Transformanten wurden im Doppel
auf Nitrocellulosefilter gestrichen. Einer der Filter wurde
mit cDNA von Poly(A)-RNA aus TMV-infiziertem Tabak
hybridisiert, der andere Filter wurde mit cDNA gegen Poly(A)-RNA
aus gesundem Tabak hybridisiert (Maniatis et al., 1982).
Transformanten, die mit der ersten Sonde besser
hybridisierten als mit zweiten, enthielten cDNA von mRNA's, die
durch die TMV-Infektion induziert wurden. Aus diesen
Transformanten wurde das Plasmid isoliert, der Einschub wurde in
M13-Vektoren subkloniert und die Sequenz des Einschubs mit
dem Verfahren von Sanger et al. (1977) bestimmt. Klone, die
Sequenzen enthalten, die zu der Nucleotidsequenz von Fig.
1 homolog sind, enthalten die GRP-cDNA. Als Alternative zu
der differentiellen Hybridisierungsmethode kann die cDNA-
Bibliothek mit einer Sonde abgesucht werden, die aus einem
Desoxyoligonucleotid besteht, das ausgehend von der Sequenz
der in Fig. 1 gezeigten GRP-Exons synthetisiert wurde.
II. Klonierung von GRP-Genen
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Aus den Kernen von Samsun NN-Tabak isolierte DNA wurde
teilweise mit Sau3A I abgebaut und in den Vektor Charon 35
kloniert (für Literaturhinweise siehe Cornelissen et al.,
1987). Die genomische Bibliothek wurde mittels der Plaque-
Hybridisierungstechnik von Benton und Davis (1977)
abgesucht, wobei die in Beispiel 1 isolierte cDNA als Sonde
verwendet wurde. Der Einschub in positiv hybridisierenden
Phagen enthielt das GRP-Gen und konnte über übliche
Verfahren in Teilen in pUC9-Plasmide subkloniert werden.
III. Bestimmung der GRP-Promotoraktivität
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Die Konstruktion von GRP-Promotor/CAT-Gen-Fusionen ist
schematisch in Fig. 2 gezeigt. Ein VIII-Fragment von
gGRP-8, das die Sequenz der Nucleotide -645 bis +155
ent
hielt, wurde subkloniert. Ab Position +155 wurden mit Bal31
Deletionen vorgenommen, wonach die Enden über übliche
Verfahren mit ClaI-Linker versehen wurden.
HindIII-ClaI-Fragmente wurden in den Vektor pUCC subkloniert und mittels der
Sequenzanalyse charakterisiert. Eine Deletionsmutante
(pDEL+8) enthielt die Sequenz von -645 bis +8 und
entsprechend fehlt ihr der ATG-Initiationscodon des GRP-Gens.
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Das Polyadenylationssignal des Nopalinsynthasegens (Tnos)
wurde aus Plasmid pDH52 als BamHI-Fragment mit 2 kb
isoliert (Van Dun et al., 1987) und in pICl9H kloniert (Marsh
et al., 1984), was pICl9H-Tnos ergab. Aus diesem Plasmid
kann Tnos als EcoRI-Fragment von 260 bp ausgeschnitten
werden, und dieses wurde in pUC8 subkloniert, was pUC8-Tnos
ergab. Dieses Tnos-Fragment von 260 bp wurde auch in pDEL+8
stromabwärts de GRP-Promotors subkloniert. Schlussendlich
wurde das CAT-Gen von Transposon Tn9 (Alton und Vapnek,
1979) als TagI-Fragment von 773 pb aus dem
pCaMV-CAT-Plasmid isoliert (Fromm et al., 1985) und in den ClaI-Ort des
Konstrukts pPR645 kloniert, was das Plasmid pPRC645 ergab.
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Fragmente von pDEL+8 wurden als stumpfe ClaI-Fragmente in
pUC8-Tnos subkloniert. Anschliessend wurde das
TaqI-Fragment von 733 bp in diese Konstrukte mit dem CAT-Gen
integriert. Die Promotorfragmente von pDEL+8, die über diesen
Weg mit dem CAT-Gen fusioniert waren, wurden am 3'-Ort mit
ClaI bei Position +8 und am 5'-Ort mit den Enzymen EcoRV
(bei Position -400), HaeIII (bei Position -135) oder AvaII
(bei Position -114) geschnitten. Die entsprechenden
Plasmide wurden pPRC400, pPRC135 und pPRC114 genannt. Diese
drei Plasmide und das pPRC645-Plasmid wurden mit HindIII
so linearisiert und in den HindIII-Ort des binären
Transformationsvektors pAGS127 kloniert. Das CaMVCAT-Plasmid wurde
als ein XbaI-Fragment in pAGS127 kloniert. Die erhaltenen
Konstrukte wurden auf Agrobacterium tumefaciens Stamm
LBA4404 transferiert (Ooms et al., 1982) und die
Transkonjuganten wurden verwendet, um Samsun NN mit der
Blattscheibenmethode mittels üblicher Verfahren zu transformieren.
Aus Schösslingen regenerierte transgene Pflanzen wurden
getestet, indem Scheiben aus einem Blatt gestanzt wurden und
diese während 24 Stunden auf Wasser oder einer 1 mM Lösung
von Salicylsäure schwimmen gelassen wurden. Proteinextrakte
dieser Scheiben wurden auf CAT-Aktivität gemäss Gorman et
al. (1982) getestet. Fig. 3 zeigt die Resultate. In den
Spuren 1 und 2 wurden 400 ul Protein verwendet, in den
übrigen Spuren 100 ul. In den Spuren W bez. S wurde Protein
aus den Scheiben verwendet, die auf Wasser bez. auf
Salicylsäure schwammen. In Spur 3 wurde Protein verwendet,
das unmittelbar nach dem Ausstanzen der Blattscheiben
isoliert worden war. Die Spuren 6 bis und mit 11 zeigen, dass
die GRP-Promotorsequenzen von 400, 135 und 114 bp dasselbe
Ausmass an salicylsäureinduzierbarer CAT-Aktivität ergeben.
Obwohl diese Aktivität relativ niedrig ist, ist sie
signifikant, wie nach der Verstärkung des Signals in den Spuren
1 und 2 gesehen werden kann. Das Konstrukt mit dem
Promotorgebiet von 645 bp ergibt eine viel höhere Aktivität. Die
CAT-Aktivität in den Blattscheiben, die auf Wasser
schwammen (Spur 4) wurde wahrscheinlich durch die Verletzung des
Blattes während des Stanzens induziert. Hier ist die CAT-
Aktivität wiederum durch Salicylsäure beträchtlich
angeregt. Es kann der Schluss gezogen werden, dass die
Elemente, die für die Salicylsäure-Induzierbarkeit
verantwortlich sind, in dem Gebiet zwischen den Nucleotiden -114 und
+8 liegen, während eines oder mehrere Verstärkerelemente
zwischen den Nucleotiden -645 und -400 liegen.
F. Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt die Sequenz der Nucleotide des strukturellen
GRP-Gens und der flankierenden DNA-Gebiete im gGRP-8-Klon.
Das GRP-Leseraster ist auf die zugehörigen Sequenz der
Aminosäuren ausgerichtet. Der fett gedruckte senkrechte Pfeil
nach den ersten 26 Aminosäuren zeigt den mutmasslichen
Spaltungsort eines Signalpeptids. Die Initiations- und
Terminationssignale, die mit den Vorgängen der Transkription
und Translation zu tun haben, sind unterstrichen. Die Orte
direkter Repeats mit Längen von 17 und 18 Basenpaaren und
invertierter Repeats mit Längen von 9 und 64 Basenpaaren
sind durch horizontale Pfeile angegeben. Mutmassliche
Aktivatorelemente sind eingerahmt oder durch eine Wellenlinie
angegeben.
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Fig. 2 zeigt schematisch die Konstruktion der
GRP-Promotor/CAT-Gen-Fusionen. Dabei wurde von dem bekannten pDH52-
Plasmid Gebrauch gemacht, das das Polyadenylationssignal
des Nopalinsynthasegens (Tnos) enthält, von den bekannten
pICl9H- und pUC8-Plasmiden, von dem bekannten pCaMV-CAT-
Plasmid, das das CAT-Gen von Transposon Tn9 enthält, und
von Plasmid PDEL+8, dessen Konstruktion hier beschrieben
wird.
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Fig. 3 zeigt die Resultate der Tests, bei denen die CAT-
Aktivität in Proteinextrakten von Blattscheiben transgener
Pflanzen bestimmt wurde. Die CAT-Aktivität wurde mit dem
Verfahren von Gorman et al. (1982) bestimmt. Für die
weitere Beschreibung siehe der Text.
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