DE69509628T2

DE69509628T2 - N-terminal chemisch modifizierte protein-zusammensetzungen und methoden

Info

Publication number: DE69509628T2
Application number: DE69509628T
Authority: DE
Inventors: Randolph B. Deprince; Christine E. Farrar; Nancy E. Gabriel; Olaf B. Kinstler
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1994-10-12
Filing date: 1995-02-08
Publication date: 1999-09-16
Anticipated expiration: 2015-02-09
Also published as: IL112585A0; KR100261030B1; NL300106I1; JPH0925298A; US7662933B2; KR100248111B1; CA2178752C; JPH09506116A; JP3177449B2; NL300106I2; GR3030526T3; PT822199E; JP5350330B2; JPH11310600A; CN1139932A; CN1229388C; EP0822199A3; JP2010215657A; US7090835B2; IL112585A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue N-terminal monopegylierte G-CSF-Zusammensetzungen.
Proteine für eine therapeutische Verwendung sind gegenwärtig in geeigneten Formen und ausreichenden Mengen erhältlich, größtenteils aufgrund der Fortschritte rekombinanter DNA- Technologien. Die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen erzeugte Fortschritte in der Formulierung und chemischen Modifizierung der Proteine. Ein Ziel einer derartigen Modifizierung ist der Schutz des Proteins. Eine chemische Anbindung kann effizient den physikalischen Kontakt eines protolytischen Enzyms mit dem Protein-Rückgrat selbst verhindern und so den Abbau verhindern. Zusätzliche Vorteile sind unter bestimmten Bedingungen eine Erhöhung der Stabilität und der Zirkulationsdauer des therapeutischen Proteins und eine Erniedrigung der immunisierenden Wirkung. Francis, Focus on Growth Factors 3, 4-10 (Mai 1992) (veröffentlicht von Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London, N20, OLD, UK) ist ein Übersichtsartikel, der Proteinmodifizierung und Fusionsproteine beschreibt.
Polyethylenglykol ("PEG") ist eine derartige chemische Substanz, die zur Zubereitung von therapeutischen Proteinprodukten verwendet wurde (das Verb "pegylieren" meint das Anheften von wenigstens einem PEG-Molekül). Zum Beispiel ist Adagen eine pegylierte Form von Adenosin-Deaminase, die für die Behandlung ernsthafter kombinierter Immunodefizienz zugelassen ist; pegylierte Superoxid-Dismutase wurde in klinischen Studien zur Behandlung von Kopfverletzungen eingesetzt; pegyliertes alpha-Interferon wurde in klinischen Studien der Phase I zur Hepatitisbehandlung getestet; pegylierte Glucocerebrosidase und pegyliertes Hämoglobin waren in vorklinischen Versuchen. Es wurde gezeigt, daß die Anheftung von Polyethylenglykol vor proteolytischen Abbau schützt, Sada et al., J. Fermentation Bio engineering 71, 137-139 (1991), und Verfahren zur Anheftung von bestimmten Polyethylenglykolverbindungen sind verfügbar. Siehe US-Patent Nr. 4,179,337, Davis et al., "Non- Immunogenic Polypeptides", veröffentlicht am 18. Dezember 1979; und US-Patent Nr. 4,002,531, Royer, "Modifying enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby", veröffentlicht am 11. Januar 1977. Zum Überblick wird verwiesen auf Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs, J.S. Holcerberg und J. Roberts, Herausgeber, Seiten 367-383 (1981).
Andere wasserlösliche Polymere wurden verwendet, wie Copolymere von Ethylenglykol/Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-Dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymere, Polyaminosäuren (entweder Homopolymere oder statistische Copolymere).
Für Polyethylenglykol wurden eine Reihe von Verfahren verwendet, um die Polyethylenglykolmoleküle an das Protein anzuheften. Im allgemeinen werden Polyethylenglykolmoleküle mit dem Protein über eine reaktive Gruppe auf dem Protein verbunden. Aminogruppen, wie die der Lysinreste oder des N-Terminus sind für eine derartige Anbindung geeignet. Zum Beispiel beschreibt Royer (US-PS 4,002,531, supra) eine reduktive Alkylierung für die Anbindung von Polyethylenglykolmolekülen an ein Enzym. EP 0 539 167, veröffentlicht am 28. April 1993, Wright, "Peg Imidates and Protein Derivates Thereof" beschreibt, daß Peptide und organische Verbindungen mit (einer) freien Aminogruppe(n) durch ein unmittelbares Derivat von PEG oder verwandten wasserlöslichen organischen Polymeren modifiziert werden können. US-PS 4,904,584, Shaw, veröffentlicht am 27. Februar 1990, betrifft die Modifizierung von Lysinresten in Proteinen zur Anbindung von Polyethylenglykolmolekülen über reaktive Aminogruppen.
Ein spezielles Beispiel für ein therapeutisches Protein, das chemisch modifiziert wurde, ist der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor, "G-CSF". G-CSF induziert die rasche Vermehrung und Freisetzung von neutrophilen Granulozyten in das Blut und sorgt so für eine therapeutische Wirkung zur Bekämpfung einer Infektion.
Die EP-A-0 401 384, publiziert am 12. Dezember 1990, mit dem Titel "Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor" beschreibt die Materialien und Verfahren zur Herstellung von G-CSF mit angebundenen Polyethylenglykolmolekülen.
Modifiziertes G-CSF und Analoga davon werden ebenfalls in EP 0 473 268, publiziert am 4. März 1992, mit dem Titel "Continuous Release Pharmaceutical Compositions Comprising a Polypeptide Covalently Conjugated to a Water Soluble Polymer" beschrieben. Hier ist die Verwendung von verschiedenen G-CSF und kovalent an ein wasserlösliches Polymerpartikel, wie Polyethylenglykol, gebundenen Derivaten beschrieben.
Ein modifiziertes Polypeptid mit der Aktivität des menschlichen Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktors wird in EP 0 335 423, publiziert am 4. Oktober 1989, beschrieben.
Ein weiteres Beispiel ist pegyliertes IL-6. In EP-A-0 442 724 mit dem Titel "Modified hIL-6" ist mit Polyethylenglykolmolekülen pegyliertes IL-6 beschrieben.
EP 0 154 316, veröffentlicht am 11. September 1985, beschreibt eine Reaktion eines Lymphokins mit einem Aldehyd von Polyethylenglykol.
Viele Verfahren zur Anbindung eines Polymers an ein Protein verwenden eine als Verbindungsgruppe fungierende Verbindung. Derartige Verbindungen können jedoch antigene Wirkung besitzen. Eine Tresylchlorid-Methode, die keine Verbindungsgruppe verwendet, ist verfügbar, jedoch kann dieses Verfahren schwierig zur Herstellung von therapeutischen Produkten sein, z. B. kann die Verwendung von Tresylchlorid giftige Nebenprodukte freisetzen. Siehe Francis et al., in: Stability of protein pharmaceuticals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Herausgeber Ahern., T. und Manning, M.C.), Plenum, New York, 1991. Siehe auch Degado et al., "Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chloride, Applications In Immunoaffinity Cell Preparation", in: Fisher et al., Herausgeber, Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y.N.Y., 1989, Seiten 211-213.
Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5, 133-140 (1994) beschreiben die Modifizierung von CD4 Immunoadhäsin mit Monomethoxypoly(ethylenglykol)-aldehyd durch reduktive Alky lierung. Die Autoren beschreiben, daß 50% des CD4-Ig unter Bedingungen, die eine Steuerung des Ausmaßes der Pegylierung erlauben, mit MePEG modifiziert wurde. Id. auf Seite 137. Die Autoren beschreiben auch, daß die in vitro-Bindefähigkeit des modifizierten CD4-Ig (an das Protein gp 120) in Übereinstimmung mit der Stärke der MePEGylierung abnahm. Siehe auch Rose et al., Bioconjugate Chemistry 2, 154-I59 (1991), was die selektive Anbindung der Linkergruppe Carbohydrazid an die C-terminale Carboxylgruppe eines Proteinsubstrats (Insulin) beschreibt.
Keines der allgemeinen oder Protein-spezifischen Verfahren erlaubt jedoch die selektive Anbindung eines wasserlöslichen Polymers an den N-Terminus eines Proteins, wie G-CSF. Die momentan verwendeten Verfahren erlauben vielmehr eine nicht-selektive Anbindung an jeder reaktiven Gruppe, entweder im Protein gelegen, wie eine Lysin-Seitengruppe oder am N-Terminus. Dies führt zu einer heterogenen Population an pegylierten Proteinen. Zum Beispiel haben manche pegylierte G-CSF-Moleküle eine andere Zahl an Polyethylenglykolresten als andere. Zum Beispiel können die nach vorstehender Methode umgesetzten Proteinmoleküle mit 5 Lysinresten zu einer heterogenen Mischung führen, in der manche 6 Polyethylenglykolreste besitzen, manche S. manche 4, manche 3, manche 2, manche 1 und manche keinen. Unter den Molekülen mit mehreren Resten könnten die Polyethylenglykolreste an verschiedenen Stellen auf den verschiedenen Molekülen angebunden werden.
Das ist für die Entwicklung eines für therapeutische Zwecke pegylierten Proteinprodukts nachteilig. In einer derartigen Entwicklung ist die Vorhersagbarkeit einer biologischen Aktivität entscheidend. Zum Beispiel wurde für die nicht-selektive Anbindung von Polyethylenglykol an Superoxidmutase gezeigt, daß einige Fraktionen des modifizierten Enzyms vollkommen inaktiv waren (P. McGoff et al., Chem. Pharm., Bull. 36, 3079-3091 (1988)). Eine derartige Voraussage ist unmöglich, falls das therapeutische Protein in seiner Zusammensetzung von Ansatz zu Ansatz verschieden ist. Einige der Polyethylenglykolreste könnten an manchen Orten nicht so stabil gebunden werden wie an anderen und dies könnte zu einer Ablösung dieser Reste vom Protein führen. Natürlich können die Pharmakokinetiken des therapeutischen Proteins nicht genau vorhersagbar sein, falls derartige Reste zufällig angebunden werden und daher sich zufälligerweise ablösen. Aus dem Blick des Verbrauchers könnte die Zirkulationsdauer von Ansatz zu Ansatz verschieden sein und somit wäre die Dosierung ungenau. Aus Sicht des Produzenten wäre eine vorschriftsmäßige Genehmigung zum Verkauf des therapeutischen Proteins komplexer. Zusätzlich ermöglicht keines der vorstehenden Verfahren eine selektive N-terminale Pegylierung ohne einen Linker-Rest (zwischen dem Protein und dem Polymer). Falls ein Linker-Rest verwendet wird, könnte es aufgrund der möglichen antigenen Wirkung nachteilig sein.
Daher besteht ein Bedarf für Verfahren zur Herstellung von N-terminalem monopegylierten G-CSF und Analoga davon. Die vorliegende Erfindung kommt diesem Bedürfnis in einer Reihe von Aspekten nach.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine im wesentlichen homogene Zubereitung von N-terminal monopegyliertem G-CSF oder Analoga hiervon und Verfahren dafür. Unerwarteterweise zeigte diese chemische Modifizierung am N-Terminus von G-CSF Vorteile in der Stabilität, die nicht in anderen G-CSF-Spezies mit einer chemischen Modifikation an anderen Orten im Molekül erkennbar ist. Ebenso unerwartet wurde durch das vorliegende Verfahren zur Herstellung von N-terminal monopegyliertem G-CSF festgestellt, daß man durch die Verwendung von reduktiver Alkylierung Bedingungen für eine selektive Modifizierung des N-Terminus bereitstellen kann und daß dieses Verfahren breit für andere Proteine anwendbar ist (oder Analoga davon), genauso wie für G-CSF. Ebenso stellte sich unerwarteterweise heraus, daß mittels reduktiver Alkylierung das Endprodukt, G-CSF mit einer Aminbindung an das wasserlösliche Polymer, viel stabiler war als ein identisches Polymer/Protein-Konjugat mit einer Amidbindung.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine im wesentlichen homogene Zubereitung von N-terminal monopegyliertem G-CSF oder einem Analogon hiervon. Ein nachstehendes Beispiel zeigt, daß N-terminal monopegyliertes G-CSF stabiler als andere Formen von monopegyliertem G-CSF ist. Zusätzlich ist ein größerer Teil der N-Termini pegyliert, da der N-Terminus des G-CSF-Moleküls besser für eine Reaktion mit Polyethylenglykol zur Verfügung steht. Daher bietet diese Spezies Verarbeitungsvorteile.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Art reduktiver Alkylierung, die selektiv die α- Aminogruppe des N-Terminus von G-CSF oder einem Analogon hiervon aktiviert und daher für eine selektive Anbindung eines wasserlöslichen PEG-Restes an den N-Terminus sorgt. Das ermöglicht eine im wesentlichen homogene Zubereitung von Polymer/Protein-Konjuga ten, genauso wie eine Präparation von pegylierten G-CSF-Molekülen mit direkt an den Proteinteil gekoppeltem Polyethylenglykol. Das Verfahren wird nachstehend für G-CSF beschrieben und dies ermöglicht zusätzliche Aspekte der vorliegenden Erfindung.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A ist eine Nachbildung des Chromatogramms der Ionenaustauschchromatographie von pegyliertem G-CSF.
Fig. 1B ist ein SDS-PAGE verschiedener Spezies von monopegyliertem G-CSF.
Fig. 2 ist ein SEC-HPLC-Profil von (Spur A) rekombinantem menschlichen Methionyl G- CSF-Standard; (Spur B) SCM-PEG-G-CSF-Reaktionsmix; (Spur C) N-terminal pegyliertem G-CSF; (Spur D) an Lysin 35 monopegyliertem G-CSF; (Spur E) an Lysin 41 monopegyliertem G-CSF.
Fig. 3A, 3B und 3C sind HPLC-Endoproteinase SV8-Peptid-Mapping-Aufzeichnungen von N-terminal pegyliertem G-CSF (3A); an Lysin 35 monopegyliertem G-CSF (3B); an Lysin 41 monopegyliertem G-CSF (3C).
Fig. 4 ist ein Säulendiagramm, das einen Vergleich einer in vifro-Bioaktivität von monopegylierten G-CSF-Spezies im Vergleich zu einem unpegylierten Standard veranschaulicht.
Fig. 5A und 5B sind Diagramme, die die Resultate der in vivo-Bioaktivitätstests von monopegylierten G-CSF-Derivaten veranschaulichen, wobei 5A die durchschnittliche Zahl an weißen Blutkörperchen eines Hamsters nach einer einzigen subkutanen Injektion von N-terminal pegyliertem G-CSF, an Lysin 35 monopegyliertem G-CSF oder an Lysin 41 monopegyliertem G-CSF zeigt und 5B den Nettodurchschnitt der Fläche der Zahl an weißen Blutkörperchen unter der Kurve nach einer einzigen subkutanen Injektion der verschiedenen vorstehend erwähnten monopegylierten G-CSF-Derivate zeigt.
Fig. 6A, 6B und 6C sind SEC-HPLC-Profile für Stabilitätsuntersuchungen von N-terminal pegyliertem G-CSF oder an Lysin 35 monopegyliertem G-CSF. Fig. 6A und 6B sind die Profile für Stabilitätsuntersuchungen, die bei pH 6,0 und 4ºC für N-terminal monopegyliertes G-CSF (6A) oder an Lysin 35 monopegyliertes G-CSF (6B) durchgeführt wurden. Fig. 6C zeigt die Profile für weitere Stabilitätsuntersuchungen bei pH 6,0 und 4ºC für an Lysin 35 monopegyliertes G-CSF. Zeit ("T") bedeutet Tage.
Fig. 7 zeigt eine Größenausschluß-HPLC-Analyse der Reaktionsmischung in dem Verfahren einer reduktiven Alkylierung von rhG-CSF mit Methoxypolyethylenglykolaldehyd (MW 6 kDa).
Fig. 8 zeigt eine Größenausschluß-HPLC-Analyse der Reaktionsmischung unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimidylester des MPEG, ebenso bei MW=6 kDa.
Fig. 9 zeigt die Reaktion der gesamten weißen Blutkörperchen nach einer einzigen subkutanen Dosis von Mono-N-terminal MPEG-G-CSF-Konjugaten, hergestellt durch reduktive Alkylierung von rh-G-CSF mit MPEG-Aldehyden verschiedenen Molekulargewichts (6 kDa, 12 kDa und 20 kDa).
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung N-terminal monopegylierte G-CSF- Zusammensetzungen und Verfahren dafür.
Die vorliegenden Verfahren (für sowohl N-terminal modifiziertes G-CSF als auch das vorliegende Verfahren der reduktiven Alkylierung) ermöglichen eine im wesentlichen homogene Mischung eines Monopolymer/Protein-Konjugats. "Im wesentlichen homogen", wie hier verwendet, bedeutet, daß alle Polymer/Protein-Konjugate nur einen Polymerteil besitzen. Die Zubereitung kann nicht reagiertes Protein enthalten (d. h. ohne einen Polymerteil). Wie durch Peptid-Mapping und N-terminale Sequenzierung überprüft, stellt ein nachstehendes Beispiel eine Präparation bereit, die wenigstens 90% Monopolymer/Protein-Konjugat enthält und maximal 10% nicht reagiertes Protein. Bevorzugt beträgt das N-terminal monopegylierte Material wenigstens 95% der Zubereitung (wie in dem nachstehenden Beispiel) und insbesondere beträgt das N-terminal monopegylierte Material 99% der Zubereitung oder mehr. Das Monopolymer/Protein-Konjugat besitzt biologische Aktivität. Die vorliegenden "im wesentlichen homogenen" N-terminal pegylierten G-CSF-Zubereitungen, die hier bereitgestellt werden, sind ausreichend homogen, um die Vorteile einer homogenen Zubereitung zu zeigen, wie Eignung für eine klinische Anwendung durch die Vorhersagbarkeit der Pharmakokinetiken von Probe zu Probe.
Man könnte eine Mischung von Polymer/Protein-Konjugaten herstellen und der Vorteil der hier ermöglicht wird ist, daß man den Anteil des Monopolymer/Protein-Konjugats in der Mischung wählen kann. So kann man, falls gewünscht, eine Mischung von verschiedenen Proteinen mit einer verschiedenen Zahl an gebundenen Polymergruppen (d. h. Di-, Tri-, Tetra-, usw.) herstellen und diese Mischung mit dem unter Verwendung der vorliegenden Verfahren hergestellten Monopolymer/Protein-Konjugat vereinigen und so eine Mischung mit einem vorgegebenen Anteil an Monopolymer/Protein-Konjugat erhalten.
Nachstehend ist ein Beispiel mit G-CSF als ein therapeutisches Protein zur Behandlung hämatopoetischer Krankheiten gegeben. Im allgemeinen kann das G-CSF, das zur Durchführung dieser Erfindung verwendet wird, aus einem Säugerorganismus isoliert werden oder kann alternativ dazu ein Produkt von chemischen Syntheseverfahren oder prokaryotischer oder eukaryotischer Wirtsexpression von exogenen DNA-Sequenzen, erhalten durch die Klonierung von genomischer oder cDNA oder durch DNA-Synthese, sein. Geeignete prokaryotische Wirte beinhalten verschiedene Bakterien (z. B. E. coli); geeignete eukaryotische Wirte beinhalten Hefe (z. B. S. cerevisiae) und Säugerzellen (z. B. Chinese hamster ovary cells, Affenzellen). In Abhängigkeit von dem verwendeten Wirt kann das G-CSF-Expressionsprodukt mit Säuger- oder anderen eukaryotischen Kohlenhydraten glykosyliert sein oder es kann nicht glykosyliert sein. Das G-CSF-Expressionsprodukt kann auch einen Methioninrest am Anfang tragen (an der Position -1). Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung von jedem und allen diesen G-CSF-Molekülen, obwohl rekombinantes G-CSF, vor allem aus E. coli, aufgrund unter anderem der größten kommerziellen Praktikabilität bevorzugt ist.
Bestimmte G-CSF-Analoga wurden als biologisch funktionell beschrieben und diese können ebenfalls in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung N-terminal monopegyliert sein. G-CSF-Analoga werden in US-PS 4,810,643 beschrieben. Beispiele von anderen G-CSF- Analoga, von denen eine biologische Aktivität beschrieben wurde, sind in AU-A-786380/91, EP 0 459 630, EP 0 272 703, EP 0 473 268 und EP 0 335 423 beschrieben, obwohl nicht die Aktivität von jedem beschriebenen Analoga dargestellt wird. Vgl. auch AU-A-10948/92, PCT/US94/00913 und EP 0 243 153.
Im allgemeinen können die für die vorliegende Erfindung geeigneten G-CSFs und Analoga davon mittels Durchführung der chemischen Modifizierungsverfahren bestimmt werden, und, um wie hier beschrieben, selektiv die N-terminale alpha-Aminogruppe chemisch zu modifizieren und das resultierende Produkt auf die gewünschten biologischen Charakteristika zu testen, wie durch die hier beschriebenen biologischen Aktivitätstests. Natürlich kann man, falls man dies bei einer Behandlung von nicht-menschlichen Säugern wünscht, rekombinante, nicht-menschliche G-CSFs verwenden, wie rekombinantes G-CSF aus Maus, Rind, Hund, usw.; vgl. z. B. PCT WO 91 05798 und PCT WO 89 10932.
So beinhaltet ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt Zusammensetzungen mit N-terminal monopegylierten G-CSF-Analoga. Wie vorstehend beschrieben, können G-CSF-Analoga Proteine mit zusätzlichen Aminosäuren, mit Deletionen und/oder Substitutionen beinhalten (im Vergleich zu der in nachstehendem Beispiel 1 beschriebenen Aminosäuresequenz von G- CSF). Die G-CSF-Analoga, die erwartungsgemäß in einem N-terminal pegylierten Zustand selektiv die Produktion von Neutrophilen stimulieren sind die mit einem N-Terminus, der nicht für die Bindung an einen G-CSF-Rezeptor erforderlich ist. Vgl. Hill et al., PNAS-USA 90, 5167-5171 (1993); vgl. auch PCT/I. J594/00913.
Die verwendeten Polyethylenglykole können aus wasserlöslichen Polymeren ausgewählt werden, so daß das Protein, an das angebunden wird, nicht in einem wäßrigen Medium ausfällt, wie einem physiologischen Medium. Für eine reduktive Alkylierung sollte das gewählte Polymer eine einzige reaktive Aldehydgruppe besitzen, so daß der Grad der Polymerisation wie durch die vorliegenden Verfahren ermöglicht gesteuert werden kann. Das Polymer kann verzweigt oder unverzweigt sein. Bevorzugt soll für eine therapeutische Verwendung des Endprodukts das Polymer pharmazeutisch verträglich sein. Ein Fachmann wird aufgrund von Überlegungen fähig sein, das gewünschte Polymer auszuwählen, wie z. B., ob das Polymer/Protein-Konjugat therapeutisch verwendet werden soll, und falls dies der Fall ist, aufgrund der gewünschten Dosierung, Zirkulationsdauer, Proteolyseresistenz und anderen Überlegungen. Für G-CSF könnten diese Punkte unter Verwendung der hier beschriebenen Tests ermittelt werden und ein Fachmann sollte die geeigneten Tests für andere therapeutische Proteine auswerten.
In den Überlegungen zur Optimierung, wie nachstehend ausgeführt, kann das Polymer irgendeinem Molekulargewicht entsprechen und kann verzweigt oder unverzweigt sein. Für Polyethylenglykol beträgt das bevorzugte Molekulargewicht zwischen etwa 2 kDa und etwa 100 kDa, bevorzugt zwischen etwa 2 und 25 kDa (die Bezeichnung "etwa" weist darauf hin, daß einige Moleküle in den Polyethylenglykol-Präparationen mehr wiegen werden und manche weniger als das festgelegte Molekulargewicht). Nachstehende Beispiele 1 und 2 beinhalten die Verwendung von PEG 6000, das zur Erleichterung der Reinigung und zur Bereitstellung eines geeigneten Modellsystems gewählt wurde. PEG eines anderen Molekulargewichts kann verwendet werden, abhängig von den gewünschten therapeutischen Merkmalen (z. B. die Dauer der gewünschten verzögerten Freisetzung, die Wirkungen hinsichtlich biologischer Aktivität, die Handhabung, das Ausmaß oder das Fehlen einer antigenen Wirkung und weitere bekannte Wirkungen des Polyethylenglykols auf ein therapeutisches Protein oder ein Analogon).
Ein spezifischer erfindungsgemäßer Aspekt ist N-terminal monopegyliertes G-CSF, umfassend einen Polyethylenglykolteil und einen G-CSF-Teil. Für die beschriebenen Zusammensetzungen kann man aus einer Reihe von Polyethylenglykolmolekülen auswählen (aufgrund des Molekulargewichts, der Verzweigung, usw.), der Menge an Polytethylenglykolmolekülen im Vergleich zu G-CSF-Proteinmolekülen in der Reaktionsmischung, die Art der durchzuführenden Pegylierungsreaktion, das Verfahren zum Erhalt des gewünschten N-terminal pegylierten G-CSF und die Art des zu verwendenden G-CSF. Weiterhin beinhalten die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren eine Formulierung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, Verfahren zur Behandlung und Herstellung von Medikamenten.
Das Verhältnis von Polyethylenglykolmolekülen zu Proteinmolekülen wird variieren, genauso wie deren Konzentrationen in der Reaktionsmischung. Im allgemeinen wird das optimale Verhältnis (in Bezug auf die Reaktionseffizienz, damit kein Überschuß an unreagiertem Protein oder Polymer besteht) durch das Molekulargewicht des gewählten Polyethylenglykols bestimmt. Zusätzlich kann das Verhältnis von der Zahl der möglichen reaktiven Gruppen (typischerweise alpha- oder epsilon-Aminogruppen) abhängen, da ein Beispiel der vorliegenden Verfahren nicht-spezifische Pegylierung und spätere Reinigung von N-terminal monopegylierten Spezies verwendet. Ein Ausführungsbeispiel verwendete ein ziemlich niedriges Verhältnis von Protein:PEG-Molekülen in der Reaktion zur Herstellung von im allgemeinen monopegyliertem Material (1,5 PEG-Moleküle pro Proteinmolekül).
Zur Herstellung von N-terminal monopegyliertem G-CSF kann das Pegylierungsverfahren aus verschiedenen Verfahren gewählt werden, wie vorstehend beschrieben, oder das Verfahren kann die vorliegende reduktive Alkylierung, wie in nachstehendem Beispiel 2 beschrieben, verwenden. Ein Verfahren, das keine Linker-Gruppe zwischen dem Polyethylenglykolteil und dem Proteinteil verwendet, wird in Francis et al., in: Stability of protein pharmaceuticals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Herausgeber Ahem, T. und Manning, M.C.), Plenum, New York, 1991) beschrieben. Delgado et al., "Coupling of PEG to Protein by Activation With Tresyl Chloride, Applications in Immunoaffinity Cell Preparation", in: Fisher et al., Herausgeber, Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications in Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y.N.Y., 1989, Seiten 211-213, beinhaltet ebenfalls die Verwendung von Tresylchlorid, was zu keiner Linker-Gruppe zwischen dem Polyethylenglykolteil und dem Proteinteil führt. Dieses Verfahren kann für die Herstellung von therapeutischen Produkten schwierig sein, da die Verwendung von Tresylchlorid giftige Nebenprodukte produzieren kann. Eines der vorliegenden Beispiele beinhaltet die Verwendung von N-Hydroxysuccinimidyl (NHS)-estern von Carboxymethylmethoxypolyethylenglykol. Wie nachstehend genauer ausgeführt, beinhaltet ein zweites Beispiel die Verwendung des vorliegenden Verfahrens der reduktiven Alkylierung.
Das Verfahren zum Erhalt der N-terminal monopegylierten G-CSF-Zubereitung (d. h. Abtrennung dieses Moleküls von anderen monopegylierten Molekülen, falls nötig) kann mittels Reinigung des N-terminal pegylierten Materials aus einer Gruppe von pegylierten G-CSF-Molekülen erfolgen. Zum Beispiel wird nachstehend ein Beispiel gezeigt, wo pegyliertes G-CSF zuerst durch Ionenaustauschchromatographie aufgetrennt wird, um Material mit einer für monopegyliertes Material charakteristischen Ladung zu erhalten (weiteres multi-pegyliertes Material mit scheinbar derselben Ladung kann vorhanden sein) und die monopegylierten Materialien werden dann mittels Größenausschlußchromatographie aufgetrennt. So wurde Nterminal monopegyliertes G-CSF von anderen monopegylierten Spezies abgetrennt, genauso wie von anderen multi-pegylierten Spezies. Weitere Verfahren sind beschrieben. Zum Beispiel beschreibt PCT WO90/04606, veröffentlicht am 3. Mai 1990, ein Verfahren zur Fraktio nierung einer Mischung von PEG-Proteinen, umfassend Auftrennung der PEG/Protein- Addukte in einem PEG-enthaltenden, wäßrigen biphasischen System.
In einem weiteren Aspekt ermöglicht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur selektiven Gewinnung eines N-terminal monopegylierten G-CSF oder einem Analogon hiervon. Nachstehend ist ein Verfahren zur Proteinmodifikation durch reduktive Alkylierung beschrieben, was die verschiedene Reaktivität von verschiedenen primären Aminogruppen nutzt (Lysin gegenüber dem N-Terminus), die für eine Derivatisierung in einem bestimmten Protein verfügbar sind. Unter geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine im wesentlichen selektive Derivatisierung des Proteins am N-Terminus mit einem Carbonylgruppen enthaltenden Polymer erreicht. Die Reaktion wird bei einem pH durchgeführt, der die Nutzung eines Vorteils aufgrund des pKa-Unterschieds zwischen den epsilon-Aminogruppen der Lysinreste und der alpha-Aminogruppe des N-terminalen Restes des Proteins erlaubt. Durch eine derartige selektive Derivatisierung wird die Anheftung eines wasserlöslichen PEGs an das Protein gesteuert: die Anbindung des Polymers findet vor allem am N-Terminus des Proteins statt und es findet keine merkliche Modifikation von anderen reaktiven Gruppen, wie den Aminogruppen der Lysin-Seitenkette, statt.
Überraschenderweise bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer im wesentlichen homogenen Zubereitung von Molekülen eines Monopolymer/Protein-Konjugats ohne weitere extensive Reinigung, im Gegensatz zur Anwendung anderer chemischer Modifikationen. Zusätzlich ist das Produkt mit einer Aminbindung unerwartet stabiler als ein Produkt mit einer Amidbindung, und dies wird in den nachstehenden Aggregationsstudien gezeigt. Insbesondere bietet die vorliegende Erfindung auch N-terminal monopegyliertes G- CSF oder seine Analoga, falls Polyethylenglykol verwendet wird, denen möglicherweise antigene Verbindungsgruppen fehlen und bei denen der Polyethylenglykolteil direkt an den Proteinteil ohne Bildung giftiger Nebenprodukte gekoppelt wird.
Die Reaktion kann wie folgt dargestellt werden, was Natriumcyanoborhydrid als beispielhaftes Reduktionsmittel verwendet:
So ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polymer/G- CSF-Konjugats, umfassend (a) Reaktion des Proteins mit mehr als einer Aminogruppe mit einem wasserlöslichen Polymer unter Bedingungen einer reduzierenden Alkylierung und bei einem pH, der zur selektiven Aktivierung der α-Aminogruppe am Amino-Terminus des Proteinteils geeignet ist, so daß das wasserlösliche Polymer selektiv an die α-Aminogruppe bindet; und (b) Gewinnung des Reaktionsprodukts. Man kann gegebenenfalls, und bevorzugt für ein therapeutisches Produkt, die Reaktionsprodukte von nicht-umgesetzten Molekülen abtrennen.
Für eine im wesentlichen homogene Population an Monopolymer/G-CSF-Molekül-Konjugaten sind die Reaktionsbedingungen derart, daß sie die selektive Anbindung des wasserlöslichen Polymers an den N-Terminus des G-CSF erlauben. Derartige Reaktionsbedingungen werden im allgemeinen durch pKa Unterschiede zwischen den Lysin-Aminogruppen und der α-Aminogruppe am N-Terminus ermöglicht (wobei der pK der pH ist, an dem 50% der Aminogruppen protoniert sind und 50% nicht protoniert sind).
Der pH beeinflußt auch das zu verwendende Verhältnis an PEG zu G-CSF. Im allgemeinen, sofern der pH niedriger als der pK ist, wird ein größerer Überschuß des Polymers im Vergleich zum Protein erwünscht sein (d. h. je weniger reaktiv die N-terminale α-Aminogruppe ist, desto mehr Polymermoleküle sind nötig, um optimale Bedingungen zu erreichen). Falls der pH höher als der pK ist, muß das Polymer:Protein-Verhältnis nicht so hoch sein (d. h. mehr reaktive Gruppen sind verfügbar und somit sind weniger Polymermoleküle erforderlich).
Eine weitere wichtige Überlegung ist das Molekulargewicht des Polymers. Je höher im allgemeinen das Molekulargewicht des Polymers, desto weniger Polymermoleküle können an das Protein angebunden werden. Ähnlich sollte eine Verzweigung des Polymers in Betracht gezogen werden, falls diese Parameter optimiert werden. Je höher im allgemeinen das Molekulargewicht (oder je mehr Verzweigungen), desto höher das Polymer:Protein-Verhältnis.
Für die vorliegende reduktive Alkylierung sollte das reduzierende Agens in wäßriger Lösung stabil sein und sollte bevorzugt nur zur Reduktion der am Anfang der reduktiven Alkylierung gebildeten Schiffschen Base fähig sein. Bevorzugte reduzierende Agenzien können aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus Natriumborhydrid und Natriumcyanoborhydrid. Natriumcyanoborhydrid wurde in den nachfolgenden Beispielen verwendet.
Das wasserlösliche PEG-Polymer kann dem vorstehend beschriebenen entsprechen und sollte eine einzige reaktive Aldehydgruppe zur Kopplung an das Protein besitzen. Für Polyethylenglykol wird nachstehend die Verwendung von PEG 6000 zur Kopplung an G-CSF beschrieben. Es soll bemerkt werden, daß PEG 12000, 20000 und 25000 ebenfalls für G-CSF erfolgreich in dem vorliegenden Verfahren verwendet wurden. Polyethylenglykolpropionaldehyd (vgl. z. B. US-PS 5,252,714) ist aufgrund seiner Stabilität in Wasser von Vorteil.
So können für das vorliegende N-terminal chemisch modifizierte G-CSF alle G-CSFs oder hier beschriebenen Analoga verwendet werden (z. B. die vorstehend beschriebenen). Die nachstehenden Beispiele verwenden in Bakterien produziertes rekombinantes G-CSF mit 174 Aminosäuren und einem weiteren N-terminalen Methionylrest.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen des vorstehend erwähnten bereitgestellt. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können für eine Verabreichung mittels Injektion oder für eine orale, pulmonale, nasale oder andere Verabreichung verwendet werden. Im allgemeinen fallen pharmazeutische Zusammensetzungen unter die Erfindung, umfassend effektive Mengen des Monopoly mer/Protein-Konjugats der Erfindung zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsmitteln, Emulgatoren, Hilfsmitteln und/oder Trägerstoffen. Solche Zusammensetzungen beinhalten Verdünnungsmittel mit verschiedenem Puffergehalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH und Tonenstärke; Zusätze wie Detergenzien und solubilisierende Stoffe (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z. B. Thimersol, Benzylalkohol) und Füllstoffe (z. B. Lactose, Mannit); Einbau des Materials in Partikel polymerer Verbindungen, wie Polylactat, Polyglykolsäure, usw. oder in Liposomen. Derartige Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand beeinflussen, die Stabilität, die Rate der in vivo-Freisetzung und die Rate der in vivo-Ausscheidung des vorliegenden N-terminal chemisch modifizierten Proteins. Vgl. z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), Seiten 1435-1712.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt werden Verfahren zur Herstellung eines Medikaments bereitgestellt. Zustände, die durch eine Verabreichung der vorliegenden Polymer/G- CSF-Konjugate oder Analoga mit den hämatopoetischen biologischen Eigenschaften des natürlichen G-CSF gemildert oder moduliert wurden, sind typischerweise durch eine reduzierte Funktion des hämatopoetischen oder Immunsystems charakterisiert und insbesondere durch eine erniedrigte Zahl an Neutrophilen. Derartige Zustände können im Verlauf einer Therapie zu einem anderen Zweck auftreten, wie Chemotherapie oder Strahlentherapie. Solche Zustände können das Resultat einer Infektionskrankheit sein, wie einer bakteriellen, viralen, Pilz- oder anderen Infektion. Zum Beispiel entsteht Sepsis aus einer bakteriellen Infektion. Oder ein derartiger Zustand kann erblich sein oder durch die Umweltbedingungen hervorgerufen werden, wie schwere chronische Neutropenie oder Leukämien. Das Alter kann auch eine Rolle spielen. Zum Beispiel können Patienten in der Gematrie eine verminderte Zahl an Neutrophilen oder verringerte Mobilisierung von Neutrophilen besitzen. Einige dieser Zustände werden zusammengefaßt in Filgrastim (r-met Hu G-CSF) in Clinical Practice, Morstyn, G. und T.M. Dexter, Herausgeber, Marcel Dekker, Inc., N.Y., N.Y. (1993). Andere weniger gut untersuchte Zustände, die durch Verabreichung der vorliegenden Polymer/G- CSF-Konjugate gemildert oder moduliert werden können, können die Verminderung von Lipiden oder Cholesterin im Blut und bestimmte kardiovaskuläre Zustände beinhalten, da G- CSF die Produktion von Plasminogen-Aktivatoren induzieren kann. Die Wirkweise von G- CSF oder Analoga davon bei diesen Behandlungen ist momentan wenig verstanden. Die Zugabe eines wasserlöslichen Polymers, wie Polyethylenglykol, kann dem Patienten praktische Vorteile ermöglichen, dadurch daß eine anhaltende biologische Aktivität die Verabreichung von weniger G-CSF-Injektionen pro Krankheitsverlauf oder Behandlung erlaubt.
Für alle vorstehenden Moleküle wird sich die Information in Hinblick auf geeignete Dosierungsmengen zur Behandlung von verschiedenen Zuständen in verschiedenen Patienten erweitern, sobald weitere Untersuchungen durchgeführt werden und ein Fachmann wird unter Berücksichtigung des therapeutischen Zusammenhangs, des Alters und des allgemeinen Gesundheitszustands des Empfängers fähig sein, eine geeignete Dosierung festzustellen. Im allgemeinen wird die Dosis für eine Injektion oder Infusion zwischen 0,01 ug/kg und 100 ug/kg Körpergewicht (das Gewicht des Proteins ohne chemische Modifikation) betragen.
Die Beispiele erläutern die verschiedenen vorstehend diskutierten Aspekte. In Beispiel 1 werden die Vorteile von N-terminal monopegyliertem G-CSF im Vergleich zu an Lysin 35 oder Lysin 41 monopegyliertem G-CSF (der G-CSF met + 174 Aminosäuren-Version) verdeutlicht. Beispiel 2 erläutert die erfindungsgemäße reduktive Alkylierung zur Herstellung von N- terminal monopegyliertem G-CSF. Das Verfahren liefert eine im wesentlichen homogene Zubereitung von N-terminal monopegyliertem G-CSF.

BEISPIEL 1

A. Herstellung von rekombinantem menschlichen met-G-CSF

Rekombinantes menschliches met-G-CSF (als "rhG-CSF" oder "r-met-hu-G-CSF" hier bezeichnet) wurde nach dem in der US-PS 4,810,643, Souza, beschriebenen Verfahren hergestellt. Das verwendete rhG-CSF war ein rekombinantes Expressionsprodukt aus E. coli mit der durch die nachfolgend gezeigte DNA-Sequenz kodierten Aminosäuresequenz (SEQ ID NOs:1 und 2):
Dies war auch die nicht-pegylierte Zusammensetzung, die für die Kontrolltiere verwendet wurde. Alternativ kann man gekauftes Neupogen® für die nachstehenden Pegylierungsverfahren verwenden.

8. Herstellung von pegyliertem G-CSF

Eine Lösung mit 10 mg/ml des vorstehenden rhG-CSF in 100 mM Bicine, pH 8,0, wurde zu festem SCM-MPEG (N-Hydroxysuccinimidylester von Carboxymethylmethoxypolyethylenglykol) (Union Carbide) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 6000 Dalton gegeben. Dies ergab einen 1,5 molaren Überschuß an SCM-MPEG zu rhG-CSF. Nach einstündigem vorsichtigen Rühren wurde die Mischung mit sterilem Wasser auf 2 mg/ml verdünnt und der pH wurde auf 4,0 mit verdünnter HCl eingestellt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. In diesem Stadium bestand die Reaktionsmischung hauptsäch lich aus drei Formen an monopegyliertem rhG-CSF, etwas dipegyliertem rhG-CSF, nichtmodifiziertem rhG-CSF und Reaktionsnebenprodukt (N-Hydroxysuccinimid).

C. Herstellung von N-terminal pegyliertem rhG-CSF

Die drei Formen an monopegyliertem rhG-CSF wurden voneinander mittels Ionenaustauschchromatographie getrennt. Die Reaktionsmischung wurde auf eine mit Puffer A (20 mM Natriumacetat, pH 4,0) equilibrierte Pharmacia S Sepharose FF-Säule (Pharmacia XK50/30- Behälter mit einem Bettvolumen von 440 ml) (1 mg Protein/ml Säulenmaterial) geladen. Die Säule wurde mit 3 Säulenvolumina Puffer A gewaschen. Das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 0-23% Puffer B (20 mM Natriumacetat, pH 4,0, 1 M NaCl) in 15 Säulenvolumina eluiert. Die Säule wurde dann mit 1 Säulenvolumen an 100% Puffer B gewaschen und mit 3 Säulenvolumina Puffer A rückequilibriert. Die Flußrate für den gesamten Lauf wurde bei 8 ml/min gehalten. Das Eluat wurde bei 280 nm überwacht und 5 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die die einzelnen monopegylierten Spezies enthaltenden Fraktionen wurden gemäß Fig. 1A vereinigt. Die Proben wurden mit einer gerührten 350 ml Amicon-Säule mit einer YM10 76 mm-Membran einkonzentriert.
Vereinigte Fraktionen der Ionenaustauschchromatographie wurden einer Größenausschlußchromatographie unterzogen, um dipegylierte Spezies von monopegylierten Spezies abzutrennen. Typischerweise wurden 5-10 mg in 2-5 ml Lösung auf eine 120 ml Pharmacia Superdex 75 HR 16/60-Säule geladen, die mit 20 mM Natriumacetat, pH 4,0, equilibriert worden war. Die Säule wurde 100 Minuten bei 1,5 ml/min gefahren. Zwei ml-Fraktionen wurden gesammelt. Der Proteingehalt des Eluats wurde bei 280 nm überwacht. Fraktionen von getrennten Ausschlägen wurden vereinigt und einer Analyse unterzogen. Die nachstehende Tabelle vergleicht die verhältnismäßigen Ausbeuten für jeden Ausschlag. TABELLE 1 Relative Ausbeuten und Ort der Modifikation
Unter diesen Bedingungen waren die Lysine an den Positionen 17 und 24 wahrscheinlich nicht signifikant pegyliert.

D. Charakterisierung

Fünf Analysen wurden durchgeführt, um jede Probe zu charakterisieren: (1) SDS-PAGE (Fig. 1B), (2) Größenausschlußchromatographie mittels HPLC ("SEC-HPLC") (Fig. 2), (3) Peptid-Mapping-Analyse (Fig. 3A, 3B und 3C), (4) in vitro-G-CSF-Biotest (Fig. 4) und (5) in vivo-Test in Hamster (Fig. 5A und 5B).
Im Hinblick auf die Zusammensetzung jeder Probe zeigen die Resultate, daß im Falle des N- terminal monopegylierten G-CSF die Proben eine mehr als 95% N-terminal pegylierte Zusammensetzung aufwiesen, wobei der Rest wahrscheinlich unpegyliertes Material ist (obwohl der Rest der Proben niedriger als die Detektionsgrenze des Tests ist). Im Hinblick auf die prozentuelle Ausbeute an monopegylierter Substanz für jede der drei Formen des monopegylierten Materials (N-terminal, pegyliert an Lysin 35 und pegyliert an Lysin 41), zeigte die N-terminale und Lysin41-Fraktion mehr als 97% monopegyliertes, und die Lysin 35-Fraktion etwas weniger pegyliertes Material, möglicherweise aufgrund der Instabilität des Moleküls unter den Testbedingungen. Zusammenfassend wurden die nachstehenden Resultate erhalten: TABELLE 2 Prozentuale Zusammensetzung des N-terminal pegylierten G-CSF
* Die N-terminale Sequenzierung, wie infra diskutiert, wird hier nicht als quantitativ betrachtet, da das Polyethylenglykolmolekül vom N-Terminus des Proteins während der Sequenzierung abgespalten worden sein könnte. TABELLE 3 Prozent monopegyliertes Material der drei Spezies
* RI/UV ist das Verhältnis von Brechungsindex/Ultraviolett-Lichtabsorption und wird für eine Bewertung der Anzahl an Polyethylenglykolmolekülen pro Proteinmolekül verwendet. Er wird aus den SEC-HPLC-Daten errechnet mittels einem Brechungsindex für Polyethylenglykol und einer Ultraviolettabsorption für Protein.
* * Diese Spezies ist unter den verwendeten Testbedingungen instabil.

METHODEN

1. SDS-PAGE. SDS-PAGE wurde in einem nicht-reduzierenden 4-20% ISS Daiichi Pure Chemicals, Co., Tokyo, Japan, Minigel durchgeführt, unter Verwendung von Coomassie Brillant Blue R-250 als Färbemittel. Das Gel wurde mittels eines Molekular Dynamics Densitometer mit Image Quant eingelesen.
Resultate: Resultate sind in Fig. 1 B gezeigt. Spur Nr. 1 (von links) beinhaltete Molekulargewichts-Proteinstandards (Novex Mark 12 Molecular Weight Standards). Spur 2 enthält 3 ug rhG-CSF Standard. Spur 3 enthält die SCM-PEG-G-CSF-Reaktionsmischung, wobei 10 ug geladen wurden. Spur 4 enthält N-terminal monopegyliertes G-CSF, wobei 10 ug geladen wurden. Spur 5 enthält 10 ug monopegyliertes G-CSF, wobei sich die Pegylierungsstelle am Lysin des 35. Restes ausgehend vom N-terminalen Methionin befindet. Spur 6 enthält 10 ug monopegyliertes G-CSF, wobei sich die Pegylierungsstelle am Lysin des 41. Restes ausgehend vom N-terminalen Methionin befindet. Man erkennt in Spur 3, die das N-terminal monopegylierte Material enthält, eine einzige Bande.

2. Größenausschlußchromatographie. hochauflösende Flüssigkeitschromatographie.

SEC-HPLC wurde mit einem Waters HPLC-System mit einer Biosep SEC 3000-Säule unter Verwendung von 100 mM Natriumphosphat, pH 6,9, und einer Flußrate von 1 ml/min 20 Minuten durchgeführt. Das Signal wurde bei 280 nm überwacht.
Resultate: Wie aus Fig. 2 erkennbar, enthält Spur "C" mit dem N-terminal monopegylierten rhG-CSF einen einzigen Ausschlag, genauso wie "D" (Lys-35 monopegyliertes Material) und "E" (Lys-41 monopegyliertes Material). Dies zeigt eine wesentliche Reinheit der aufgetrennten Fraktionen an monopegyliertem G-CSF.
3. Peptid-Mapping. Die nachstehenden Verfahren wurden verwendet. Drei Proben, bezeichnet als "Mono-PEG-1 ", "Mono-PEG-2" und "Mono-PEG-3" wurden analysiert. (a) Reduktive Alkylierung. 500 ug-Mengen des Mono-PEG-G-CSF wurden mit einer Speed Vac getrocknet und in einer Konzentration von 1 mg in 950 u1 in 0,3 M Tris-HCl mit 6 M Guanidinium HCl und 1 mM EDTA, pH 8,4, gelöst. Proben wurden dann durch Zugabe von Jodessigsäure S-carboxymethyliert und 20 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Proben wurden dann mittels Sephadex G-25 Quick Spin Protein Columns entsalzt und der Puffer ausgetauscht. Nach der Entsalzung und dem Puffertausch wurde die Probenkonzentration auf 0,5 mg/ml mittels zusätzlichen Puffer eingestellt. (b) Endoproteinase SV8-Verdau. Proben wurden mit SV8 (Enzym zu Substrat-Verhältnis von 1 : 25) 26 Stunden bei 25ºC verdaut. (c) HPLC-Peptid-Mapping. Protein-Verdaus wurden auf eine Vydak C4-Säule (4,6 · 250 mm, 5 u Teilchengröße, 300 Å Porengröße) injiziert und die Peptide wurden mittels HPLC unter Verwendung eines linearen Gradienten an Acetonitril in 0,1% TFA ausgewertet. Peptide wurden manuell gesammelt und in einer Speed Vac zur Sequenzanalyse getrocknet. Resultate: Im Vergleich zu einem Referenzstandard (i) (Fig. 3A) verschwand für "Mono-PEG-1" (das N-terminal monopegylierte Material) ein Ausschlag bei 57,3 Minuten und ein neuer Ausschlag bei 77,5 Minuten erschien; (ii) (Fig. 3B) für "Mono-PEG-2" (das an Lysin 35 pegylierte Material) nahm die Ausschlagshöhe für ein Peptid mit einer Verzögerungszeit von 30,3 Minuten ab und ein neuer Ausschlag erschien bei 66,3 Minuten; (iii) (Fig. 3C) für "Mono-PEG-3" (das an Lysin 41 pegylierte Material) war kein Ausschlag bei der Verzögerungszeit von 30,3 Minuten vorhanden und ein neuer Ausschlag erschien bei 66,4 Minuten. Diese Peptide waren die einzigen signifikanten Unterschiede in den Erfassungen der Proben. Es traten einige kleinere unvollständige Spaltungen auf, die auf beiden Seiten des Peptids bei 86,1 Minuten aufgrund der kleineren Verdauunterschiede erkennbar sind. (d) N-terminale Sequenzanalyse. Jedes der "neuen" Peptide der vorstehenden Erfassungen wurde zur Identifikation N-terminal sequenziert. Die getrockneten Peptide wurden in 0,1% TFA gelöst und auf einem ABI-Protein- Sequenzierer sequenziert. Für "Mono-PEG-1" (das N-terminal monopegylierte Material) wurden 60% des "neuen" Ausschlags (bei 77,5 Minuten) für 10 Zyklen sequenziert. Die anfängliche Ausbeute betrug weniger als 5%, was darauf hinweist, daß der N-terminale Methionylrest durch ein Polyethylenglykolmolekül blockiert ist. Es wird darauf hingewiesen, daß dieses anfängliche Peptid in überhaupt keiner anfänglichen Ausbeute resultieren sollte und die beobachtete < 5%-Ausbeute kann aus der Entfernung des Polyethylenglykols von der N-terminalen Methionylgruppe während der Sequenzanalyse stammen. Die bestimmte Sequenz war die des N-terminalen Peptids, M-T-P-L-G-P-A-S-S. Für "Mono-PEG-2" (das an Lysin 35 pegylierte Material) wurde 80% des gesamten Ausschlagvolumens für den Ausschlag bei 66,3 Minuten gesammelt und wurde für 9 Zyklen sequenziert. Die Ausbeute an Lysin 35 war signifikant niedrig und gibt einen Hinweis auf eine Pegylierung an Position 35. Die Ausbeute von Lysin 41 war mit dem anderen Rest in Übereinstimmung und weist auf keine Modifizierung an dieser Position hin. Die Ausschlaghöhe des Peptids bei 30,3 Minuten vermindert sich in der Ausschlaghöhe im Vergleich zu dem entsprechenden Ausschlag der Standardreferenz. Das Peptid bei 30,3 Minuten macht nur 57,5% der Ausschlagfläche des entsprechenden Peptids aus. Die für diese Spezies ermittelte Sequenz war K-L-C-A-T-Y-K-L. Für "Mono-PEG-3", das Lysin 41-Material, wurde 80% des gesamten Ausschlagvolumens des bei 66,4 Minuten eluierenden gesammelten Peptids für 9 Zyklen sequenziert. Die ermittelte Sequenz war K-L- C-A-T-Y-K-L und enthielt die Lysinreste 35 und 41. Die Ausbeute an Lysin 35 war in Übereinstimmung mit den Ausbeuten von anderen Resten. Die Ausbeute an Lysin 41 war signifikant niedriger und weist auf eine Pegylierung an Position 41 hin. Resultate: "Mono-PEG-1" ist ein N-terminal monopegyliertes Material; "Mono-PEG-2" ist ein Lysin 35 partiell pegyliertes Material; und "Mono-PEG-3" ist ein an Lysin 41 pegyliertes Material. Durch einen Vergleich des Referenzstandards (nicht-pegyliertes G-CSF) und den Erfassungen der Peptide 1, 2 und 3 des monopegylierten G-CSF wurde herausgefunden, daß sowohl die Erfassungen von "Mono-PEG-2" (Lysin 35) und "Mono-PEG-3" (Lysin 41) leicht erniedrigte Ausschlaghöhen für die N-terminalen Peptide zeigen. Dies weist darauf hin, daß das an Lysin 35 und Lysin 41 pegylierte Material einen kleinen Anteil an N-terminal pegyliertem Material enthält oder daß die N-terminale Methioningruppe zu einem kleinen Prozentsatz pegyliert ist.
4. In vitro-Aktivität. Das Material war aktiv. Fig. 4 zeigt die Resultate der in vitro- Tests. Wie man erkennen kann, besaß das N-terminal monopegylierte Material 68% der Aktivität von nicht modifiziertem rhG-CSF.
Methoden: Der G-CSF-in vitro-Biotest ist ein mitogener Test, der einen G-CSF-abhängigen Klon von 32D-Zellen der Maus verwendet. Zellen wurden in Iscoves-Medium mit 5% FBS und 20 ng/ml fhG-CSF gehalten. Vor der Zugabe der Probe wurden die Zellen durch zweimaliges Spülen mit Wachstumsmedium ohne rhG-CSF vorbereitet. Eine erweiterte Zwölf PunktrhG-CSF-Standardkurve wurde angefertigt, die sich von 48 bis 0,5 ng/ml (entsprechend mit 4800 bis 50 IU/ml) erstreckt. Vier Verdünnungen, die schätzungsweise in den linearen Bereich der Standardkurve fallen (1000 bis 3000 IU/ml) wurden für jede Probe angefertigt und dreimal getestet. Wegen ihrer erkennbar niedrigeren Aktivität in vitro wurden die pegylierten rhG-CSF-Proben etwa 4-10mal weniger verdünnt. Ein Volumen von 40 ul einer jeden Verdünnung der Probe oder des Standards wird zu den jeweiligen Vertiefungen auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, enthaltend 10.000 Zellen/Vertiefung, gegeben. Nach 48 Stunden bei 37ºC und 5,5% CO&sub2; wurden 0,5 umCi Methyl-³H-Thymidin zu jeder Vertiefung hinzugefügt. 18 Stunden später wurden die Platten geerntet und ausgezählt. Eine Dosis Reaktionskurve (10 g rhG-CSF-Konzentration gegen CPM-Hintergrund) wurde erstellt und eine lineare Regression der Punkte, die in den linearen Bereich der Standardkurve fallen, wurde durchgeführt. Konzentrationen von unbekannten Testgruppen wurden bestimmt unter Verwendung der resultierenden linearen Gleichung und der Korrektur für die Verdünnung. Resultate: Resultate sind in Fig. 4 gezeigt. Wie ersichtlich, zeigt N-terminal monopegyliertes G- CSF die höchste in vitro-biologische Aktivität der 3 monopegylierten Spezies.
5. In vivo-Aktivität. In vivo-Tests bestätigten die Aktivität des N-terminal pegylierten Materials. Die in vivo-Tests wurden durch Verabreichung von 0,1 mg/kg der Probe an männliche Goldhamster mittels einer einzigen subkutanen Injektion durchgeführt. Vier Tiere pro Gruppe und Zeitpunkt wurden ausgeblutet. Serumproben wurden durch eine vollständige Blutauszählung am gleichen Tag, an dem die Proben gesammelt wurden, ausgewertet. Die durchschnittliche Zahl an weißen Blutkörperchen wurde berechnet. Die Reaktion auf jedes Material an dem der einzigen subkutanen Injektion von 0,1 mg/kg darauffolgenden Tag wird in Fig. 5A und 5B gezeigt. Zwei der monopegylierten Materialien (N-terminal und Lys- 35) zeigten eine verlängerte Reaktion, während die Reaktion auf das an Lysin 41 pegylierte Material keine Erhöhung der in vivo-Aktivität im Vergleich zu nicht-modifziertem rhG-CSF zeigte (tatsächlich zeigte es weniger, Fig. 5B). Diese Resultate verdeutlichen, daß die Anbindung eines einzigen Polyethylenglykolmoleküls grundlegend das therapeutische Verhalten eines Proteins verändern kann und daß die Vorteile einer Protein-Pegylierung von der modifizierten Stelle abhängen können. Die durchschnittliche Netto-WBC-Fläche unter der Kurve nach der einzigen subkutanen Injektion (berechnet gemäß CRC-Standard Mathematical Tables, 26. Auflage (Beyer, W.H., Herausgeber), CRC-Press Inc., Boca Raton, FL, 1981, Seite 125) war ähnlich für Lys-35 und N-terminal monopegyliertes Material.

E. Stabilitätsstudien

Zusätzlich wurden Stabilitätsstudien mit wie vorstehend präparierten N-terminalem und Lys- 35 monopegyliertem Material durchgeführt. Das Lys-41-Material wurde nicht verwendet, da es keine zusätzliche Aktivität gegenüber nicht-modifiziertem G-CSF zeigte. Diese Studien zeigen, daß das N-terminal pegylierte G-CSF unerwartet stabiler bei Lagerung ist als das an Lysin 35 monopegylierte G-CSF. Stabilität wurde in Bezug auf den Abbau des Produkts ermittelt, wie mittels SEC-HPLC dargestellt.
Methoden: N-terminal pegyliertes G-CSF und an Lysin 35 monopegyliertes G-CSF wurden bei zwei pH-Werten untersucht, pH 4,0 und pH 6,0 bei 4ºC, jeweils bei bis zu 16 Tagen. Eine Erhöhung des pHs auf 6,0 ermöglicht die Bedingungen für beschleunigte Stabilitätstests. Für die pH 6,0-Proben wurde wie vorstehend beschrieben hergestelltes N-terminal monopegyliertes G-CSF und an Lysin 35 monopegyliertes G-CSF in einen Puffer mit 20 mM Natriumphosphat, 5 mM Natriumacetat, 2,5% Mannit, 0,005% Tween 80, pH 6,0, bei einer Endproteinkonzentration von 0,25 mg/ml gegeben. Mengen von 1 ml wurden in sterilen 3 ml-Injektionsgefäßen aufbewahrt. Die Gefäße einer jeden Probe wurden bei 4ºC und 29ºC bis zu 16 Tage aufbewahrt. Stabilität wurde durch SEC-HPLC-Analyse bewertet. Falls spätere Messungen die gleichen Ergebnisse brachten (wie durch eine visuelle Untersuchung bestätigt) wie die anfänglichen Messungen (Zeit=0), wurde die Probe über diese Zeit als stabil betrachtet. Resultate: Resultate sind in Fig. 6A-6C gezeigt.
(a) Vergleich bei pH 6,0 und 4ºC. Fig. 6A zeigt die 4ºC SEC-HPLC-Profile für N-terminal monopegyliertes G-CSF bei pH 6 in Relation zur Zeit und Fig. 6B zeigt die 4ºC SEC- HPLC-Profile für an Lysin 35 monopegyliertes G-CSF bei pH 6 in Relation zur Zeit. Ein Resultat ist, daß das Lys-35-Material zu einem Material mit einem Molekulargewicht ähnlich zu dem von nicht modifiziertem G-CSF abgebaut wird.
(b) Erweiterte Dauer bei pH 4,0 und 4ºC. pH 4,0 und 4ºC ermöglicht gleichsam eine Kontrolle, die ziemlich stabile Voraussetzungen verdeutlicht, dadurch daß das N-terminal monopegylierte Material keinen Abbau zeigt. Abbau findet für das Lys-35-monopegylierte Material immer noch statt, jedoch bei einem langsameren Verlauf.
(c) Vergleich bei pH 6,0 und 4ºC. Fig. 6C zeigt die SEC-HPLC-Profile für die monopegylierten G-CSFs unter diesen Bedingungen und unter einer erweiterten Zeitdauer. Wie erkennbar, zeigt das an Lysin 35 monopegylierte Material bei pH 6,0 und 4ºC keine Erhöhung der Depegylierung am Tag 16 oder Tag 35 gegenüber der am Tag 6 (Fig. 6B). Dies weist darauf hin, daß sich die Depegylierung (Instabilität) unter diesen Bedingungen nach Tag 6 nicht ändert.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt ein Verfahren zur Herstellung einer im wesentlichen homogenen Population an monopegyliertem G-CSF mittels reduktiver Alkylierung und Charakterisierung dieser Population. Rekombinantes G-CSF wie in Beispiel 1 beschrieben wurde verwendet. Wie erkennbar, bieten die vorliegenden Verfahren nicht nur Vorteile im Hinblick auf die Ausbeute von N-terminal monopegyliertem Material, sondern die Aminbindungen des Verfahrens der reduktiven Alkylierung produzieren wesentlich mehr stabile Produkte, wie durch einen großen Unterschied in dem Grad der Aggregation während der Aufbewahrung gezeigt.

A. Herstellung des Mono-methoxypolyethylenglykol-G-CSF-Konjugats, wobei sich die Anbindungsstelle am N-terminalen α-Aminorest befindet.

Zu einer kalten (4ºC) gerührten Lösung von rhG-CSF (1 ml, 5 mg/ml, wie in Beispiel 1 beschrieben) in 100 mM Natriumphosphat, pH 5, mit 20 mM NaCNBH&sub3; wurde ein 5facher molarer Überschuß an Methoxypolyethylenglykolaldehyd (MPEG) (durchschnittliches Molekulargewicht, 6 kDa) gegeben. Das Rühren der Reaktionsmischung wurde bei der gleichen Temperatur fortgesetzt.
Das Ausmaß der Proteinmodifikation im Verlauf der Reaktion wurde durch SEC-HPLC überwacht, unter Verwendung einer Bio-Sil SEC 250-5-Säule (Bio-Rad), die mit 0,05 M NaH&sub2;PO&sub4;, 0,05 M Na&sub2;HPO&sub4;, 0,15 M NaCl, 0,01 M NaN&sub3;, pH 6,8, mit 1 ml/min eluiert wurde.
Nach 10 Stunden deutete die SEC-HPLC-Analyse an, daß 92% des Proteins zum Mono- MPEG-G-CSF-Derivat umgesetzt worden waren. Das ist aus Fig. 7 ersichtlich, die die Proteinkonzentration wiedergibt (wie durch die Absorption bei A&sub2;&sub8;&sub0; bestimmt) und die den Ausschlag bei 8,72 Minuten des monopegylierten G-CSF und einen kleineren Ausschlag von nicht reagiertem G-CSF bei 9,78 Minuten zeigt.
Im Vergleich zeigt Fig. 8 die Ausschläge bei der Verwendung von N-Hydroxysuccinimidylester von MPEG. Das Molekulargewicht betrug ebenfalls 6 kDa. Wie erkennbar, war die aus dieser Reaktion erhaltene Mischung: Tri-MPEG-G-CSF-Konjugat (Schulter bei etwa 7,25 Minuten), Di-MPEG-G-CSF-Konjugat (Ausschlag bei 7,62 Minuten), Mono-MPEG-G-CSF- Konjugat (Ausschlag bei 8,43 Minuten) und nicht reagiertes G-CSF (Ausschlag bei 9,87 Minuten).
Bei diesem 10 Stunden Zeitpunkt, wo 92% des Proteins zu monopegyliertem Material umgewandelt worden waren, wurde der pH der Reaktionsmischung auf pH 4 mit 100 mM HCl eingestellt und die Reaktionsmischung wurde 5fach mit 1 mM HCl verdünnt.
Das Mono-MPEG-G-CSF-Derivat wurde mittels Ionenaustauschchromatographie mit einer HiLoad 16/10 S Sepharose HP-Säule (Pharmacia), equilibriert mit 20 mM Natriumacetatpuffer, pH 4, gereinigt. Die Reaktionsmischung wurde auf die Säule bei einer Flußrate von 1 ml/min geladen und der nicht-reagierte MPEG-Aldehyd eluierte mit 3 Säulenvolumina desselben Puffers. Dann wurde ein linearer Gradient von 0% bis 45% 20 mM Natriumacetat, pH 4, mit 1 M NaCl über einen Zeitraum von 400 Minuten verwendet, um das Protein/Polymer- Konjugat bei 4ºC zu eluieren.
Fraktionen mit dem Mono-MPEG-G-CSF-Derivat wurden vereinigt, einkonzentriert und steril filtriert.
Verschiedene Mono-MPEG-G-CSF-Konjugate, erhalten durch Modifikation von rhG-CSF mit MPEG-Aldehyden mit unterschiedlichem durchschnittlichen Molekulargewicht (12, 20 und 25 kDa) wurden in einer ähnlichen Weise hergestellt.

8. Anal, von monopegyliertertem G-CSF

1. Molekulargewicht

Das Molekulargewicht der monopegylierten Konjugate wurde mittels SDS-PAGE, Gelfiltration, Matrix-unterstützter Laser-Desorptionsmassenspektrometrie und Gleichgewichtszentrifugation bestimmt. Diese Resultate sind in Tabelle 4, nachstehend, gezeigt. TABELLE 4 Molekulargewicht von N-terminal alkylierten Mono-MPEG-G-CSF-Konjugaten
ND: nicht bestimmt
Die Strukturen der hergestellten N-terminalen Mono-MPEG-G-CSF-Konjugate wurden mittels der Verfahren der N-terminalen Proteinsequenzierung und Peptid-Mapping bestätigt. Bromcyanspaltung des N-terminalen Methionylrestes führte zur Abspaltung des Polyethylenglykolteils.

2. Biologische Aktivität

Die in vitro-biologische Aktivität der monopegylierten MPEG-G-CSF-Konjugate wurde durch Messung der stimulierten Aufnahme von ³H-Thymidin in Knochenmarkszellen von Mäusen bestimmt.
Die in vivo-biologische Aktivität wurde an Hamstern durch subkutane Injektion von Mono- MPEG-G-CSF-Konjugaten oder rhG-CSF (zu 100 mg/kg) und Messung der Gesamtzahl an weißen Blutkörperchen bestimmt. Bioaktivität im Vergleich zu nicht-derivatisiertem G-CSF wurde als die Fläche unter der WBC/Zeitkurve nach Abzug der Kontrollkurve des Trägers berechnet. Relative Bioaktivität der Mono-MPEG-G-CSF-Derivate wurde als Prozent Bioaktivität im Vergleich zu nicht-modifziertem G-CSF ausgedrückt.
Dies ist in Fig. 9 gezeigt, deren Kurve eine Reaktion der Gesamtzahl an weißen Blutkörperchen auf Mono-N-terminale MPEG-G-CSF-Konjugate zeigt, die durch reduktive Alkylierung von rhG-CSF mit MPEG-Aldehyden verschiedenen Molekulargewichts (6 kDa, 12 kDa und 20 kDa) hergestellt wurden. Wie erkennbar, zeigten alle monopegylierten Moleküle eine Reaktion. Je höher das Molekulargewicht des verwendeten Polyethylenglykolrestes, desto höher die erreichte Zahl an weißen Blutkörperchen, mit der Ausnahme, daß die 12 kDa-Probe eine etwas höhere Zahl als die 20 kDa-Version am Tag 2 erreichte.

3. Stabilitätsuntersuchungen

N-terminal monopegylierte G-CSFs, hergestellt durch die zwei verschiedenen Verfahren der Beispiele 1 und 2, wurden im Hinblick auf den Grad der Aggregation verglichen. Unerwarteterweise fand man, daß N-terminal monopegyliertes G-CSF, erhalten durch reduktive Alkylierung, wesentlich stabiler ist als N-terminal pegyliertes G-CSF mit einer Amidbindung (NHS- Acylierung, wie in Beispiel 1 beschrieben).
Methoden: Beide N-terminal pegylierten G-CSF-Proben fanden sich in 10 mM NaOac, pH 4,0, mit 5% Sorbit bei einer Konzentration von 1 mg Protein/ml. Die G-CSFs wurden beide mit PEG 6000 pegyliert. Das Amid-gebundene Konjugat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und das Amin-gebundene Konjugat wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Jeweils 6 Proben wurden 8 Wochen bei 45ºC aufbewahrt. Nach dem Ende der 8 Wochen wurde der Grad an Aggregation mittels Größenausschlußchromatographie und Ionenaustauschchromatographie bestimmt.
Resultate: Die Resultate zeigen, daß das vorliegende Verfahren der reduktiven Alkylierung gegenüber dem Verfahren der Acylierung vorteilhaft ist, da es überraschenderweise ein Material mit bei weitem weniger Aggregaten nach 8 Wochen bei erhöhten Temperaturen bildet. Die nachstehende Tabelle zeigt den prozentualen Teil an nicht-aggregiertem Material (Material des "Hauptausschlags") für beide Materialien mittels Größenausschlußchromatographie (SEC) oder Ionenaustauschchromatographie (IE):

TABELLE 5

Proben: 8 Wochen, 45ºC %Hauptausschlag SEC/IE

Amin 82%/84%
Amid 37%/65%*
* Das ist relativ hoch, da Ionenaustausch keine vollständige Analyse der Aggregation erlaubt.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Amgen Inc.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: N-terminal monopegyliertes G-CSF oder dessen Analogon
(ü i) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) ADRESSAT: Amgen Inc. /Patent Operations
(B) STRASSE: One Amgen Center Drive
(C) STADT: Thousand Oaks
(D) BUNDESLAND: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 91320-1789
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version # 1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 531 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 175 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: G-CSF
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

Claims

1. Eine im wesentlichen homogene Zubereitung von N-Terminal monopegyliertem G- CSF oder einem Analogon hiervon, gegebenenfalls mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Hilfsstoff.

2. Eine Zubereitung gemäß Anspruch 1, wobei das Polyethylenglykol ein Molekulargewicht zwischen etwa 2 kDa und 100 kDa hat.

3. Eine Zubereitung gemäß Anspruch 2, wobei das Polyethylenglykol ein Molekulargewicht zwischen etwa 6 kDa und 25 kDa hat.

4. Eine Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zubereitung umfaßt mindestens 90% N-terminal monopegyliertes G-CSF oder ein Analogon hiervon und höchstens 10% unpegyliertes G-CSF oder ein Analogon hiervon.

5. Eine Zubereitung gemäß Anspruch 4, wobei die Zubereitung umfaßt mindestens 95% N-terminal monopegyliertes G-CSF oder ein Analogon hiervon und höchstens 5% unpegyliertes G-CSF oder ein Analogon hiervon.

6. Eine Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das G-CSF die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 hat.

7. Eine im wesentlichen homogene Zubereitung von N-terminal monopegyliertem G- CSF, wobei

(a) das G-CSF die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 hat;

(b) das G-CSF monopegyliert ist mit einem Polyethylenglykolrest mit einem Molekulargewicht von etwa 12 kDa.

8. Eine gemischte Zubereitung von G-CSF oder einem Analogon hiervon, umfassend eine Zubereitung eines N-terminal monopegylierten G-CSF oder einem Analogon hiervon, gemischt mit einer Zubereitung von multipeguliertem G-CSF oder einem Analogon hiervon, wobei der Teil der Zubereitung des monopegylierten G-CSF oder des Analogons hiervon festgelegt ist.

9. Eine gemischte Zubereitung gemäß Anspruch 8, wobei die Zubereitung des N-terminal monopegylierten G-CSF ausgewählt ist unter denen der Ansprüche 1 bis 7.

10. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge einer Zubereitung ausgewählt unter denen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Hilfsmittel oder Trägerstoff.

11. Verwendung einer Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Störung, charakterisiert durch eine reduzierte Hämatopoese oder Immunfunktion.

12. Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei die Störung das Ergebnis einer Chemotherapie, Bestrahlungstherapie, Infektionskrankheit, schweren chronischen Neutropenie oder Leukämie ist.

13. Ein Verfahren zur Herstellung von N-terminal monopegyliertem G-CSF oder einem Analogon hiervon, umfassend die Schritte:

a) das Umsetzen in einem wäßrigen Medium von G-CSF oder seinem Analogon mit einer alpha-Aminogruppe an seinem N-terminalen Ende mit einem wasserlöslichen Polyethylenglykol mit einer einzelnen Aldehydgruppe unter Bedingungen einer reduktiven Alkylierung und bei einem pH-Wert ausreichend sauer, um selektiv die alpha-Aminogruppe zu aktivieren und gegebenenfalls

b) Trennung des N-terminalen monopegylierten Produkts von dem Reaktionsgemisch.

14. Ein Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das verwendete Polyethylenglykol ein Molekulargewicht zwischen etwa 2 kDa und 100 kDa hat.

15. Ein Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das verwendete Polyethylenglykol ein Molekulargewicht zwischen etwa 6 kDa und 25 kDa hat.

16. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das verwendete Polyethylenglykol ein Methoxypolyethylenglykolaldehyd ist.

17. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei das verwendete reduzierende Mittel in der reduktiven Alkylierung Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid ist.

18. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei das verwendete G-CSF oder sein Analogon nicht glykosyliert ist.

19. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei das verwendete G-CSF oder sein Analogon einen Methioninrest an dem N-Terminus an Position -1 hat.

20. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 19, wobei der Trennungsschritt (b) die Reinigung umfaßt.

21. Ein Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei der Reinigungsschritt die Ionenaustauscherchromatographie des Reaktionsgemisches und die Größenausschlußchromatographie umfaßt.