DE69132391T2

DE69132391T2 - Enzymatische hydrolyse von stärke zu glukose mit einem gentechnologisch hergestellten enzym

Info

Publication number: DE69132391T2
Application number: DE69132391T
Authority: DE
Inventors: Richard Sierks; Birte Svensson
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1990-06-29
Filing date: 1991-06-28
Publication date: 2001-02-15
Anticipated expiration: 2011-06-29
Also published as: US5162210A; FI925901A0; FI925901L; DE69132391D1; FI107807B; DK0536270T3; WO1992000381A1; EP0536270A1; JP3249514B2; ES2150905T3; EP0536270B1; JPH05507852A; ATE195972T1; GR3034781T3

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Enzyme und ein Verfahren zur Verwendung der Enzyme zur Herstellung von Glucose aus Stärke. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung Glucoamylase-Enzymvarianten und die Verwendung derartiger verschiedener Enzyme zur Erhöhung der Ausbeute an Glucose, die aus einer Einheit Stärke oder teilweise hydrolysierter Stärke hergestellt wird.

Stand der Technik

Die Glucoamylase (1,4-α-D-Glucan-Glucohydrolase, EC 3.2.1.3) ist ein Enzym, das die Freisetzung von D-Glucose von den nichtreduzierenden Enden von Stärke- oder verwandten Oligo- und Polysaccharidmolekülen katalysiert. Glucoamylasen werden von mehreren filamentösen Pilzen und Hefen erzeugt, wobei die von Asergillus industriell die wichtigsten sind.
Das Glucoamylase-Enzym wird industriell verwendet, um Maisstärke, die bereits teilweise durch eine α-Amylase hydrolysiert ist, zu Glucose umzusetzen. Die Glucose wird durch die Glucose-Isomerase weiter zu einem Gemisch umgesetzt, das fast gleichermaßen aus Glucose und Fructose besteht. Dieses Gemisch oder das Gemisch, das weiter mit Fructose angereichert ist, ist der allgemein verwendete Stärkezuckersirup aus Mais mit hohem Fructosegehalt, der überall auf der Welt im Handel vertrieben wird. Dieser Sirup ist das größte Tonnageerzeugnis der Welt, das durch ein enzymatisches Verfahren erzeugt wird. Die drei Enzyme, die an der Umsetzung von Stärke zu Fructose beteiligt sind, gehören zu den wichtigsten industriellen Enzymen, die erzeugt werden, sogar obwohl zwei von ihnen, α- Amylase und Glucoamylase, auf der Basis des Gewichts oder der Aktivität relativ preisgünstig sind.
Es bestehen zwei Hauptprobleme in Hinsicht auf eine industrielle Verwendung von Glucoamylase bei der Herstellung von Stärkezuckersirup aus Mais mit hohem Fructosegehalt. Das erste Problem besteht hinsichtlich der thermischen Stabilität von Glucoamylase. Die Glucoamylase ist thermisch nicht so stabil wie die α- Amylase oder Glucose-Isomerase, und sie ist am aktivsten und stabilsten bei niedrigeren pH-Werten als entweder die α-Amylase oder die Glucose-Isomerase. Demgemäß muß sie in einem getrennten Gefäß bei einer niedrigeren Temperatur und pH-Wert verwendet werden. Zweitens synthetisiert die Glucoamylase bei hohen Feststoffkonzentrationen, die technisch für die Herstellung von Getreidesirup mit hohem Fructosegehalt verwendet werden, Di-, Tri- und Tetrasaccharide von der Glucose, die erzeugt wird. Demgemäß überschreitet die Glucoseausbeute nicht 95% des theoretischen Werts. In bezug auf die Quantität ist das gebildete Hauptnebenprodukt die Isomaltose, ein Disaccharid, das zwei Glycosylreste enthält, die durch eine α-(1→6)-Bindung verknüpft sind. Eine Glucoamylase, die Glucose ohne Nebenprodukte erzeugen kann, würde von großem technischen/kommerziellen Potential sein, wenn ihre Kosten nicht signifikant höher wären als die des gegenwärtig erzeugten Enzyms, das hauptsächlich durch die zwei sehr eng verwandten Pilzspezies Aspergillus niger und Aspergillus awamori erzeugt wird. Die Glucoamylasen dieser beiden Quellen sind identisch.
Es sind Glucoamylasen von einer Vielzahl von pilzlichen Quellen sequenziert worden und sie haben eine hohe Homologie (Ref. 1, 2). Die hohe Homologie zwischen der Vielzahl von pilzlichen Quellen legt nahe, daß die Enzyme alle strukturell und funktionell ähnlich sind. Darüber hinaus haben kinetische Messungen anhand einer Anzahl von Glucoamylasen gezeigt, daß ihre Subsite- Bindungsenergien fast identisch sind (Ref. 3,4,5,6,7).
Die Anmelderin hat Studien zur Homologie von Aminosäuren der identischen Glucoamylasen von A. niger und A. awamori durchgeführt, sowohl mit anderen Glucoamylasen als auch mit anderen Enzymen, die Stärke und verwandte Substanzen hydrolysieren (Ref. 8). Dies wurde getan, um Aminosäuren, die Enzymen gemein sind, die nicht α-(1→6)-glucosidische Bindungen spalten können (hauptsächlich α-Amylasen) von solchen zu unterscheiden, die α-(1→6)-glucosidische Bindungen hydrolysieren können (Glucoamylasen und Isomaltase).
Die Anmelderin hat festgestellt, daß die Glucoamylase in drei der sechs Regionen der Sequenzähnlichkeit unter den verschiedenen Stärkehydrolasen repräsentiert ist (Ref. 8). Es ist bestimmt worden, daß Region 1 von den Resten 109-122 der A. niger-Glucoamylase, Region 4 von den Resten 172-184 der Glucoamylase und Region 6 von den Resten 382-398 diese Sequenzähnlichkeiten enthalten. Diese Regionen stellen Sequenzähnlichkeiten unter den Enzymen dar, die nur α-(1→4)- Bindungen spalten, Enzymen, die nur α-(1→6)-Bindungen spalten, und der Glucoamylase, die beide spaltet. Die Aminosäuren an Positionen 178, 182, 183 und 184 unterschieden sich zwischen den Gruppen, was nahelegte, die Aminosäuren an diesen Positionen auszutauschen. Die Anmelderin hat ebenfalls eine Homologie an Position 119 festgestellt. Durch Verwenden der Kassettenmutagenese hat die Anmelderin Aminosäuresubstitutionen an diesen verschiedenen Positionen vorgenommen, die mit den Homologiestudien in Übereinstimmung sind (Ref. 8).
Im Zusammenhang mit dem vierzehnten ICS-Treffen in Stockholm im Jahre 1988 hat die Anmelderin ein Poster vorgestellt, das offenbart, daß eine stellengerichtete Mutagenese die Beteiligung von Tyr116 und Trp120 bei der Bindung des Substrates und von Glu180 bei der Katalyse unterstützt. Darüber hinaus wurde eine Rolle von Trp170 bei der Bindung von Isomaltose vorgeschlagen, aber dieser Aspekt ist noch durch stellengerichtete Mutagenese zu untersuchen. Das Poster offenbarte ebenfalls, daß die Mutation von Asn182 zu A1a ein aktives Enzym bereitstellte, aber es wurden keine Ergebnisse offenbart oder nahegelegt in Hinsicht auf die relative Spezifität des Enzyms.
Wie vorstehend festgestellt, ist ein Nachteil der technischen Verwendung von Glucoamylase, daß die D-Glucoseausbeuten auf ungefähr 95% in konzentrierten Stärkelösungen begrenzt sind. Dies geschieht wegen der langsamen Hydrolyse von α-(1→6)-D-glucosidischen Bindungen in der Stärke und der Bildung von verschiedenen akkumulierenden Kondensationsprodukten, hauptsächlich α- (1→6)-verknüpften Isomaltooligosacchariden, auf eine stufenartige Art und Weise aus D-Glucose (Ref 9). Eine Herabsetzung der Rate, mit der die Glucoamylase spaltet und daher α-(1→6)-Bindungen bildet, im Verhältnis zu der Rate, mit der sie α-(1→4)-Bindungen spaltet, besitzt praktische Bedeutung. Mutationen an Trp120, Asp176, Glu179 und Glu180 in der Glucoamylase von A. awamori waren alle für die Enzymaktivität kritisch (Ref. 10, 11).
Die Anmelderin fuhr fort, weitere Aminosäuremutationen zu untersuchen, um die Selektivität der Glucoamylase für eine Hydrolyse von Maltose gegenüber Isomaltose zu erhöhen. Diese Experimente sind problematisch, da die dreidimensionale Struktur der Glucoamylase nicht bestimmt worden ist. Statt dessen wurde primär von den regionalen Sequenzähnlichkeiten mit anderen Glucoamylasen als denen, die durch A. awamori und A. niger erzeugt werden, sowie mit anderen Enzymen Gebrauch gemacht, die auf α-(1→4)- und α-(1→6)-verknüpfte D- Glycosyl-Oligo- und Polysaccharide aktiv sind (Fig. 1).
Die Anmelderin hat somit Tests durchgeführt, beispielsweise unter Beteiligung von Mutationen von Ser119, Leu177, Trp178, Asn182, Gly183 und Ser184.
In Region 1 (Fig. 1) besitzt die Glucoamylase in Positionen, die A. niger 119 entsprechen, entweder Ser, A1a oder Pro, wo die α-Amylasen und die Cyclodextrin- Glucanotransferasen (CGTase) alle Tyr besitzen. Deshalb wurde Ser119 der Glucoamylase von A. niger zu Tyr mutiert, so daß es den α-Amylasen und CGTasen ähneln würde.
In Region 4 wurde Leu177 zu His mutiert, da Enzyme, die auf α-(1→6)- glucosidische Bindungen aktiv sind, auf charakteristische Weise Aminosäurereste mit kleineren aliphatischen Seitenketten an dieser homologen Position besitzen, während Enzyme, die nur an α-(1→4)-D-glucosidischen Bindungen aktiv sind, primär Phe oder Trp enthalten, die große aromatische Seitenketten besitzen. Ile, Val und Leu treten ebenfalls an dieser Position auf.
Am Rest 178 in der Glucoamylase von A. niger wurde Trp zu Arg mutiert, weil Trp in den Glucoamylasen und Isomaltase, die α-(1→6)-Bindungen spalten, konserviert ist, aber Arg wird in all den α-Amylasen, Maltasen, CGTase, Amylomaltase und dem Verzweigungsenzym gefunden, die dies nicht tun.
Asn 182 wurde basierend auf ähnlichen Vergleichen zu A1a mutiert, weil Asn in allen Glucoamylasen und Isomaltase konserviert war, aber es wurde mit Resten, die kurze aliphatische Seitenketten enthalten, wie A1a, Val und Ser, üblicherweise A1a, in den meisten der α-Amylasen ersetzt.
An Position 183 der Glucoamylase von A. niger besitzen sämtliche Glucoamylasen Gly, Isomaltase besitzt Glu mit einer sauren Seitenkette, während die Enzyme, die nur α-(1→4)-glucosidische Bindungen spalten, eine basische Seitenkette besitzen, hauptsächlich Lys, obwohl Arg ebenfalls auftritt. Das Verzweigungsenzym ist das einzige auf α-(1→4) wirkende Enzym, das nicht eine basische Gruppe an dieser Position besitzt, sondern statt dessen hat es A1a dort. Deshalb wurde Gly183 zu Lys ausgetauscht.
An Position 184 besitzen die Glucoamylasen Ser, Val und Met, während Isomaltase ebenfalls Val besitzt. Jedoch enthalten die Enzyme, die α-(1→4)-Bindungen spalten, hauptsächlich His an dieser Position, obwohl Gly, Leu, Gln und Ser ebenfalls auftreten. Deswegen wurde Ser184 durch His ausgetauscht.

ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Umsetzen von Stärke zu einem Sirup bereitgestellt, der Dextrose enthält, wobei der Prozeß die Schritte des Verzuckerns eines Stärkehydrolysats in Gegenwart einer Mutante einer Glucoamylase umfaßt, die von einem Stamm von Aspergillus erhältlich ist, die, in bezug auf die Glucoamylase von Aspergillus niger, eine erhöhte Selektivität für α- (1→4)-glucosidische Bindungen aufweist und die eine der folgenden Mutationen umfaßt:
Substitution der Aminosäure in der Position, die Ser119 der Glucoamylase von A. niger entspricht, mit einer anderen Aminosäure als Ser, vorzugsweise Tyr;
Substitution der Aminosäure in der Position, die Asn182 in der Glucoamylase von A. niger entspricht, mit einer anderen Aminosäure als Asn, vorzugsweise A1a;
Substitution der Aminosäure in der Position, die Gly183 in der Glucoamylase von A. niger entspricht, mit einer anderen Aminosäure als Gly, vorzugsweise Lys;
Substitution der Aminosäure in der Position, die Ser184 der Glucoamylase von A. niger entspricht, mit einer anderen Aminosäure als Ser, vorzugsweise His.
Demgemäß stellt die Erfindung ebenfalls eine Mutante einer Glucoamylase bereit, die von einem Stamm von Aspergillus erhältlich ist, die, in bezug auf die Glucoamylase von Aspergillus niger, eine erhöhte Selektivität für α-(1→4)- glucosidische Bindungen aufweist und die eine der folgenden Mutationen umfaßt:
Substitution der Aminosäure in der Position, die Ser119 der Glucoamylase von A. niger entspricht, mit einer anderen Aminosäure als Ser, vorzugsweise Tyr;
Substitution der Aminosäure in der Position, die Asn182 in der Glucoamylase von A. niger entspricht, mit einer anderen Aminosäure als Asn, vorzugsweise A1a;
Substitution der Aminosäure in der Position, die Gly 183 in der Glucoamylase von A. niger entspricht, mit einer anderen Aminosäure als Gly, vorzugsweise Lys;
Substitution der Aminosäure in der Position, die Ser184 der Glucoamylase von A. niger entspricht, mit einer anderen Aminosäure als Ser, vorzugsweise His;
mit der Maßgabe, daß wenn das mutierte Enzym von einer Glucoamylase von A. niger abgeleitet ist, die Substitution von A1a für Asn in der Aminosäureposition Asn182 nicht die einzige Mutation ist.

Fig. IN DEN ZEICHNUNGEN

Andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden leicht verständlich sein, da sie durch Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung besser verstanden werden, wenn sie im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet werden, wobei:
Fig. 1 einen Vergleich von Region 1 (a), Region 4 (b) und Region 6 (c), der Glucoamylase von A. niger mit anderen Glucoamylasen, α-Amylasen, Isomaltase, Maltase und Cyclodextrin-Glucanotransferasen zeigt (Ref. 8) (die Glucoamylasen sind angegeben als: An: A niger, Ro: Rhizopus oryzae, Sd: Saccharomyces diastaticus und Sf: Saccharomycopis fibuliera; die α-Amylasen sind angegeben als: Ao: Aspergillus oryzae, Pp: porciner Pankreas, Bs: Bacillus subtilis und Ba: Weizen-Isozym 1; RI: Isomaltase aus dem Darm von Kaninchen; die Maltase ist angegeben als: Sc: Saccharomyces cerevisiae; die Cyclodextrin-Glucanotransferasen sind angegeben als: aß: alkalophiler Bacillus sp.-Stamm 1011 und Kp: Klebsiella pneumoniae, wobei schattierte Flächen die Sequenzvergleiche an den sechs Positionen wiedergeben, die in GA mutiert sind; die Unstreichungen zeigen identifizierte funktionell wichtige Reste an; * zeigt GA-katalytische Gruppen an);
Fig. 2 ein Diagramm ist, das Mutationen von Ser119, Leu177, Trp178, Asn182, Gly183 und Ser184 der Glucoamylase von A. awamori zeigt, wobei Nukleotidaustausche in kleinen Buchstaben über der Wildtyp- Sequenz gezeigt sind.
Fig. 3 ein Diagramm eines Plasmids pGAC9 (Ref. 20) mit angegebenen Restriktionsschnittstellen zeigt, und
Fig. 4 Daten von Kondensationsreaktionsstudien für Asn182→A1a- und Wildtyp-Glucoamylasen zeigt. Die Bedingungen fix die Reaktionen waren 30% (w/w) anfängliche Glucose in 0,1 M Natriumacetatpuffer in Deuteriumoxid bei pH 4,5 und 35ºC. Die Asn182→A1a- und Wildtyp- Enzymkonzentrationen waren 10 bzw. 5 mg/ml. Die Rate an Produktbildung stellt die Summe von Isomaltose und Isomaltotriose dar, wie sie durch ¹H-NMR-Spektrometrie (Ref. 22) bei 500 MHz, gemessen bei 4,94 ppm auf einem Spektrometer Typ Bruker AM-500, verfolgt wurde. o stellt Asn182→A1a und + das Wildtyp-Enzym dar. Das anfängliche Verhältnis der Bildungsraten von α-(1→6)- zu α-(1→4)- Bindungen für Asn182→A1a beträgt 22% der von Wildtyp- Glucoamylase.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt neue Enzymvarianten bereit und ein Verfahren zur Verwendung des Enzyms zur Herstellung von Glucose aus Stärke. Allgemein gesprochen umfaßt dieses Verfahren die Schritte des teilweise Hydrolysierens von Vorläuferstärke in Gegenwart einer α-Amylase und dann das weitere Hydrolysieren der Freisetzung von D-Glucose von den nicht-reduzierenden Enden der Stärke- oder verwandter Oligo- und Polysaccharid-Moleküle in Gegenwart einer Glucoamylase durch Spalten von α-(1→4)- und α-(1→6)-glucosidischen Bindungen.
Genauer gesagt stellt die teilweise Hydrolyse der Vorläuferstärke unter Verwendung von α-Amylase einen anfänglichen Abbau der Stärkemoleküle durch Hydrolysieren der internen α-(1→4)-Verknüpfungen bereit. In industriellen Anwendungen wird die anfängliche Hydrolyse unter Verwendung von α-Amylase bei einer Temperatur von ungefähr 105ºC durchgeführt. Es wird eine sehr hohe Stärkekonzentration prozessiert, üblicherweise 30% bis 40% Feststoffe. Die anfängliche Hydrolyse wird gewöhnlicherweise für fünf Minuten bei dieser erhöhten Temperatur durchgeführt. Die teilweise hydrolysierte Stärke kann dann in einen zweiten Behälter überführt und dann für ungefähr eine Stunde bei einer Temperatur von 85º bis 90ºC inkubiert werden, um ein Dextroseäquivalent (D.E.) von 10 bis 15 abzuleiten.
Der Schritt des weiteren Hydrolysierens der Freisetzung von D-Glucose aus den nicht-reduzierenden Enden der Stärke- oder verwandter Oligo- und Polysaccharid- Moleküle in Gegenwart einer Glucoamylase wird im allgemeinen in einem getrennten Behälter bei einer herabgesetzten Temperatur zwischen 30º und 60ºC durchgeführt. Der pH der Lösung wird von 6 bis 6,5 auf einen Bereich zwischen 3 und 5,5 abfallen gelassen. Vorzugsweise beträgt der pH der Lösung 4 bis 4,5. Die Glucoamylase wird der Lösung zugegeben und die Reaktion wird für 48 bis 72 Stunden durchgeführt.
Wie vorstehend erwähnt, werden Kondensationsprodukte gebildet einschließlich von α-(1→6)-verknüpften Isomaltooligosacchariden. Die Kinetiken der Reversion werden ausführlich durch Nikolov et al., 1988 (Ref. 9) ausgeführt. Die Bedeutung dieser Reversionsreaktion ist, daß obwohl die Glucoamylase sämtliche D- glucosidische Bindungen, die in Stärke gefunden werden, hydrolysieren kann, D- Glucose-Ausbeuten höher als 95% der theoretischen Werte in konzentrierten Stärke-Dextrin-Lösungen wegen des Auftretens von Kondensationsreaktionen, die D- Glucose beinhalten, nicht erzielt werden, wobei diese gemeinhin als Reversionsreaktionen bezeichnet werden (Ref. 12-16).
Die Kondensationsreaktion ist eine bimolekulare Reaktion, während die Hydrolysereaktion eine unimolekulare Reaktion ist. Deshalb führt die Verwendung von hohen Konzentrationen an Feststoffen, wie sie gemeinhin in industriellen Anwendungen eingesetzt werden, zu der Bildung bedeutender Mengen an Kondensationsprodukten. Obwohl das Prozessieren der Stärke bei geringeren Konzentrationen die Kondensationsprodukte herabsetzen würde, ist eine derartige Veränderung technisch nicht erwünscht. Dies rührt aus der Tatsache, daß es sehr teuer ist, entweder die unkonzentrierte Glucoseprodukt-Lösung (die ein hohes Gewicht im Verhältnis zu konzentriertem Produkt-Sirup besitzt) zu verschiffen oder die Flüssigkeit unter Konzentration des Glucoseprodukts abzukochen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Verbesserung bereitgestellt durch Inkubieren der teilweise hydrolysierten Stärke- oder verwandter Oligo- und Polysaccharid-Moleküle in Gegenwart der Glucoamylase oder verwandter Enzyme, wobei diese mindestens eine Mutation enthalten, die eine Aminosäure austauscht, die ausgewählt wurde durch Vergleich mit strukturell verwandten Regionen anderer Enzyme, die ausschließlich nur α-(1→4)-glucosidische Bindungen hydrolysieren. Diese Idee wird angewendet, um die Selektivität der Enzyme für α-(1→4)- glucosidische Bindungen zu erhöhen. Wie in dem Abschnitt mit der Überschrift Stand der Technik ausgeführt wurde, wurden diese Mutationen von der Anmelderin aus Segmentvergleichsstudien von identischen Glucoamylasen von A. niger und A. awamori abgeleitet. Wie vorangehend festgestellt, wurden durch diese Studien Aminosäuren identifiziert, die den verwandten Enzymen gemein waren, die nicht α-(1→6)-glucosidische Bindungen hydrolysieren können, von solchen, die α-(1→6)-glucosidische Bindungen spalten können.
Genauer gesagt, die Mutation der Aminosäuren wurde durchgeführt an Positionen, die A. niger entsprechen in den Resten 109-122 in Region 1, Resten 172-184 in Region 4 und Resten 382-398 in Region 6, mutiert zu den Aminosäuren der homologen Position in den Enzymen, die selektiv nur α-(1→4)-glucosidische Bindungen hydrolysieren können. Spezifische Mutationen, die eine erhöhte Selektivität für eine Hydrolyse von Maltose zeigen, werden an Positionen 119, 182, 183 und 184 vorgenommen. Die Anmelderin zeigt ferner eine bedeutende Zunahme in der Ausbeute von Glucose pro Einheit der Menge an Stärke, die durch die mutierte Glucoamylase mit A1a182 hydrolysiert wurde, im Vergleich zu der relativen Ausbeute durch die Wildtyp-Glucoamylase mit Asn182.
Es ist festgestellt worden, daß die mutierte Glucoamylase mit A1a182 eine signifikant höhere Maltose/Isomaltose-Selektivität (Selektivität für eine Hydrolyse einer α-(1→4)-glucosidischen Bindung im Vergleich zu einer Hydrolyse einer α- (1→6)-glucosidischen Bindung) bereitstellt, während sie nur eine kleine Aktivitätsabnahme besitzt. Darüber hinaus betrug die Isomaltosebildung aus 30% Glucose durch die mutierte Asn182→A1a-Glucoamylase nur 20% der von Wildtyp- Glucoamylase, wie durch NMR gemessen wurde, was zeigte, daß Asn182→A1a die anfängliche Rate im Vergleich zum Wildtyp-Enzym um 80% herabsetzt. Nach 33 1/3 Stunden Inkubation wurde geschätzt, daß der Isomaltosegehalt, der in Anwesenheit des mutanten Enzyms erreicht wurde, ungefähr ein Drittel dessen war, der in Anwesenheit einer äquivalenten Menge an Wildtyp-Enzym erreicht wurde. Darüber hinaus wird eine statistisch bedeutende Zunahme in der Glucoseausbeute durch die mutierte Glucoamylase Asn182→A1a im Vergleich zu der Wildtyp- Glucoamylase erzeugt. Die Anmelderin hat einen ungefähr 1%-igen Anstieg in der Glucoseausbeute (1% der verbleibenden 5% des potentiellen Ausbeutegewinns; d. h. von 95% auf 96%) festgestellt. Die Anmelderin hat ein Enzym geschaffen, das die Glucoseausbeute um mindestens 20% der verbleibenden zur Verfügung stehenden Ausbeute erhöht. Dies wird durch die Glucoamylasemutation erzielt, die eine erhöhte Spezifität für das Hydrolysieren von α-(1→4)-glucosidischen Bindungen auf bevorzugte Weise gegenüber α-(1→6)-glucosidischen Bindungen besitzt, während sie mindestens 75% der Aktivität des Enzyms, basierend auf der Hydrolyse des Disaccharids Maltose, beibehält.
Die mutierte Glucoamylase kann in dem vorliegenden erfinderischen Verfahren in Kombination mit einem Enzym verwendet werden, das nur α-(1→6)- glucosidische Bindungen in Molekülen mit mindestens vier Glucosylresten hydrolysiert. Vorzugsweise kann die mutierte Glucoamylase in Kombination mit einer Pullulanase oder einer Isoamylase eingesetzt werden. Die Verwendung einer Isoamylase und einer Pullulanase zur Spaltung von Verzweigungen, die molekularen Eigenschaften der Enzyme und die potentielle Verwendung der Enzyme mit Glucoamylase wird in G.M.A. von Beynum et al., Starch Conversion Technology, Marcel Dekker, New York, 1985, 101-142 ausgeführt.
Fig. 1 zeigt einen Vergleich der Regionen 1, 4 und 6 der Glucoamylase von A. niger, die strukturelle Ähnlichkeiten mit anderen Glucoamylasen, α-Amylasen, Isomaltase, Maltase und der CGTase besitzt. Wie vorstehend diskutiert, zeigt diese grafische Darstellung die Idee (die Gründe), die der ausgeübten Substitutionsstrategie zur Ableitung der neuen Enzyme der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt.
Fig. 2 zeigt ein Diagramm der Mutationen von Serl 19, Leu177, Trp178, Asn182, Gly183 und Ser184 der Glucoamylase von A. awamori. Die Nukleotidaustausche sind in kleinen Buchstaben oberhalb der Wildtyp-Sequenz gezeigt. Die Mutationen an Positionen 119, 182, 183 und 184 sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Herstellung der mutanten Gene, die Quelle der Wildtyp-Gene und die Verfahren zur Isolierung und Klonierung sind ausführlich in Sierks et al., 1989 (Ref. 10) ausgeführt. Enzymreagenzien sowie die Konstruktion der Mutationen unter Anwendung der Kassettenmutagenese wurden wie in der Druckschrift von Sierks et al., 1989 (Ref. 10) durchgeführt. Die Mutation Asn→A1a wurde in der HpaI-Apal- Kassette unter Verwendung der Nukleotide 5'-ATGGGCCCGGTGTTGCACATTCGTAAG-3' und 5'-GCTGGCTCGTCTTTCTTTACGATTGCTGT-3' als Kassetten- bzw. Mutagenese-Primer konstruiert, die eine Überlappung von 15 Basenpaaren enthalten. Die folgenden Oligonukleotide wurden zur Konstruktion der 119-, 183- und 184- Mutanten verwendet.
Ser→Tyr119 CGG CCG CCC CCA GTA ACC AGT GTA G
Gly→Lys 183 CGT AAA GAA AGA GCT CTT GTT AAC TTC TTC
Ser→His184 CGT AAA GAA AGA GTG GCC ATT AAC TTC TTC CCA
Die Konstruktion der Mutanten wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Die Erzeugung, Reinigung und kinetische Charakterisierung des mutierten Enzyms wurde wie durch Sierks et al., 1989 (Ref. 10, 11) offenbart durchgeführt.
Die Identifizierung des Plasmids und die Beschreibung des Verfahrens zum Einführen des Gens in ein Plasmid werden ausführlich in der Veröffentlichung von Sierks et al., 1989 (Ref. 10) offenbart. Diese Druckschrift offenbart die Plasmid- Reinigung, das Subklonieren und Sequenzieren sowie die Kassettenmutagenese. Ein Diagramm des Plasmids mit Restriktionsschnittstellen ist in Fig. 3 gezeigt. Die Druckschrift offenbart ferner die Expression des Gens und die Erzeugung und Reinigung des Glucoamylase-Enzyms.
Fig. 3 zeigt auf spezifische Weise das Plasmid pGAC9. Das Plasmid, das das Glucoamylase-Gen in einem Hefestamm, S. cerevisiae C486, enthält, wurde bei der American Type Culture Collection, als ATCC 20690 bezeichnet, am 17. November 1983 durch die Cetus Corporation hinterlegt. Auf das Wachstum und die Expression dieses Plasmids in der Hefe wird in der folgenden Veröffentlichung Bezug genommen: Innis, M.A. et al. (1985) Expression, Glycosylation, and secretion of an Aspergillus glucoamylase by Saccharomyces cerevisiae, Science 228: 21-26.
Ein Verfahren zur Entfernung von Plasmiden aus der Hefe zur Replikation in E. coli, von dem wir festgestellt haben, daß es für pGAC9 funktioniert, wird in der folgenden Veröffentlichung wiedergegeben: Hoffman, C.S. und F. Winston (1987). Eine zehnminütige DNA-Herstellung aus Hefe setzt auf wirksame Weise autonome Plasmide zur Transformation von Escherichia coli frei. Gene 57: 267- 272. Die pBR322-Sequenz erlaubt die autonome Replikation des Plasmids in E. coli und enthält das Ampicillin-Gen. Der Enol-Promoter und -Terminator sind zwei Regionen aus dem Enolase-Gen, das die Expression des Glucoamylase-Gens in der Hefe erlauben. Die Leu2-Sequenz erlaubt die Selektion von Hefetransformanten auf Leucin-defizienten Medien. Die 2u-Sequenz der Hefe erlaubt eine autonome Replikation des Plasmids in der Hefe. PstI, EcoRI, HindIII, BamHI und SaII sind die Restriktionsendonuklease-Schnittstellen.
Das Verfahren zur Herstellung von Glucoamylase von A. niger und A. awamori wird von Pazur et al. (Ref. 18) ausgeführt. Die Druckschrift von Pazur offenbart ausführlich die Herstellung und Isolierung des Glucoamylase-Enzyms, das weiterentwickelt worden ist durch Clarke und Svensson (Ref. 19) unter Verwendung von Affinitätschromatographie auf Acarbose-Sepharose.
Die Glucoamylase kann im Handel erhalten werden von Novo Nordisk A/S. Bagsvaerd, Dänemark; Cultor Ltd., Helsinki, Finnland und Gist-Brocades, Delft, Niederlande; die Pullulanase kann erhalten werden von Novo Nordisk A/S. Die Isoamylase kann erhalten werden von Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO, U.S.A..
Der folgende experimentelle Nachweis stellt beispielhaft die Selektivität und Aktivität der betreffenden mutierten Glucoamylase gemäß dem vorliegenden erfinderischen Verfahren zur enzymatischen Ableitung von Glucose aus Stärke dar.

BESCHREIBUNG DER EXPERIMENTE

Beispiel 1

Kinetische Vergleichsparameter von mutierten Glucoamylasen, gemessen unter Verwendung von Maltose, Isomaltose und Maltoheptaose als Substrate.
Eine Vergleichsstudie wurde durchgeführt anhand von 6 mutanten Glucoamylasen, die in Saccharomyces cerevisiae exprimiert wurden (Ref. 10, 20). Vergleiche zwischen den kinetischen Parametern der sechs mutierten Glucoamylasen wurden unter Verwendung von Maltose, Isomaltose und Maltoheptaose als Substrate gemessen und mit jenen der Wildtyp-Glucoamylase verglichen. Die Wildtyp- Glucoamylase bezieht sich auf die unmutierte Glucoamylase, die in Saccharomyces cerevisiae exprimiert wurde. Das Experiment wurde durchgeführt, um die Selektivität für die Enzyme für eine Hydrolyse von α-(1→4)-Bindungen (Maltose) im Vergleich zu α-(1→6)-Bindungen (Isomaltose) zu zeigen.

Material und Methoden

Enzyme, Reagenzien und die Konstruktion von Mutationen unter Anwendung der Kassetten-Mutagenese wurden durchgeführt wie früher beschrieben (Ref. 10). Die Leu177→His- und Trp178→Arg-Mutationen wurden in der SnaBI-HpaI-Kassette wie vorstehend beschrieben konstruiert (Ref. 11), mit
5'-ATAGTTAACTTCTTCCC AGTGATCATATCCTGTCTG-3' bzw. 5'-ATAGTTAACTTCTTCGCGG-AGATCATATCCTGTCTG-3'. Die Asn182→ A1a-Mutation wurde in der HpaI-ApaI-Kassette unter Verwendung der Nukleotide 5'-ATGGGCCCGGTGTTGCACAGCAAT-CGTAAAG-3' und 5'-GCTGGCTCGTCTTTCTTTACGATTGCTCT-3' als Kassetten- bzw. Mutagenese-Primer konstruiert, die eine Überlappung von 15 Basenpaaren enthielten (Ref. 21). Die folgenden Oligonukleotide wurden für die Konstruktion der 119-, 183- und 184-Mutanten verwendet.
Ser→Tyr119 CGG CCG CCC CCA GTA ACC AGT GTA G
Gly→Lys183 CGT AAA GAA AGA GCT CTT GTT AAC TTC TTC
Ser→His184 CGT AAA GAA AGA GTG GCC ATT AAC TTC TTC CCA
Die Konstruktion dieser Mutanten wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Die Erzeugung, Reinigung und kinetische Charakterisierung der mutierten Enzyme wurde durchgeführt wie in Sierks et al., 1989 (Ref. 10) ausgeführt. Die in Tabelle V gezeigten Ergebnisse wurden mit den 119-, 183- und 184-Mutanten erhalten, wobei die Glucoamylaseaktivität wie vorstehend beschrieben, mit Ausnahme von 45ºC, bestimmt wurde.

Ergebnisse und Diskussion

Sechs Mutationen, Ser119→Tyr, Leu177→His, Trp178→Arg, Asn182→A1a, Gly183→Lys und Ser184→His wurden in dem klonierten Glucoamylase-Gen von A. awamori durch eine Kassetten-Mutagenese konstruiert und in S. cerevisiae exprimiert.
Die Ergebnisse der kinetischen Studien der sechs Mutationen unter Verwendung von Maltose, Maltoheptaose und Isomaltose als Substrate ist in Tabellen I und V wiedergegeben. Die vorstehenden Ergebnisse erzeugten Selektivitäten für die Mutanten in Position 119, 183 und 184, wie in Tabelle VI aufgeführt.
Die Werte für kcat für die Leu177→His-Mutation nahmen ebenfalls für alle drei Substrate im Vergleich zu der Wildtyp-Glucoamylase ab, die für Isomaltose mehr als zehnfach und die für Maltose und Maltoheptaose fünffach. Die KM-Werte stiegen um weniger als 50% für Maltoheptaose und Isomaltose an, aber dreifach für Maltose. Die Selektivität für eine Isomaltose- gegenüber einer Maltose-Hydrolyse war wiederum relativ unverändert gegenüber der des Wildtyp-Enzyms, während sich die für eine Maltoheptaose- gegenüber einer Maltose-Spaltung verdoppelte. Obwohl der Austausch des aliphatischen und hydrophoben Aminosäure Leu177 durch die aromatische und hydrophile Aminosäure His kaum die Selektivität von Maltose gegenüber Isomaltose beeinträchtigte, legte die Sequenzähnlichkeit nahe, daß ein hydrophober aromatischer Ring, der an dieser Position in sämtlichen der α-Amylasen, mit Ausnahme der Taka-Amylase A, gefunden wurde, sie erhöhen sollte.
Die kcat-Werte für die Trp178→Arg-Mutation nahmen fünf bis achtfach für die drei Substrate im Vergleich zu der Wildtyp-Glucoamylase ab. Die Km-Werte nahmen leicht für Maltose ab und erhöhten sich leicht für Maltoheptaose im Vergleich zu dem Wildtyp-Enzym. Der KM-Wert für Isomaltose jedoch war mehr als verdoppelt, was zu einer Verdoppelung der Selektivität für eine Maltose- gegenüber einer Isomaltose-Hydrolyse führte. Die Selektivität für eine Maltoheptaosegegenüber Maltose-Spaltung war unverändert.
Die kcat-Werte für die Asn182→A1a-Mutation für jedes der drei Substrate nahmen leicht im Vergleich zu der Wildtyp-Glucoamylase ab, aber nicht annähernd in dem Ausmaß der anderen Mutationen. Der KM-Wert für Maltose nahm leicht ab, der Wert für Maltoheptaose erhöhte sich leicht und der Wert für Isomaltose verdoppelte sich. Diese Veränderungen in der Bindung spiegeln sich in einem mehr als Verdoppeln der Selektivität für eine Maltose- gegenüber einer Isomaltose- Spaltung im Vergleich zu der Wildtyp-Glucoamylase wider, sowie in einem signifikanten Abfall der Selektivität für eine Maltoheptaose- gegenüber einer Maltose- Hydrolyse.
Die Trp178→Arg- und Asn182→A1a-Mutationen führten zu den gewünschten Zunahmen der Selektivität für eine Maltose- gegenüber einer Isomaltose- Hydrolyse, obwohl erstere von einem viel größeren Abfall in den Werten von kcat für diese drei Substrate als letztere begleitet war. Diese zwei Mutationen basierten auf Substitutionen, um das aktive Zentrum der Glucoamylase dem aktiven Zentrum von Amylasen ähnlicher zu machen, denen die Fähigkeit zum Hydrolysieren von α-(1→6)-D-glycosidischen Bindungen fehlen. Da das Binden von Maltose und Isomaltose auf unterschiedliche Weise durch die zwei Mutationen beeinträchtigt war, während die Werte für kcat um die gleichen relativen Mengen für alle drei Substrate herabgesetzt waren, beeinträchtigen Trp178 und Asn182 die Subsite 2 auf eine derartige Weise, daß sie stärker mit Maltose als mit Isomaltose interagieren.
Die kinetischen Parameter der Ser119→Tyr-Mutante zeigten einen leicht höheren k und einen niedrigeren KM für Maltose und einen leicht höheren kcat- und einen zweifach höheren KM-Wert für Isomaltose. Dies führte zu einer erhöhten Spezifität um mehr als das zweifache für Maltose gegenüber Isomaltose. Die Gly183→Lys- Mutante zeigte leicht erhöhte kcal und herabgesetzte KM Werte mit Maltose und erhöhte kcat- und KM-Werte für Isomaltose, was zu einer leichten Zunahme der Selektivität führte. Schließlich erhöhte die Ser184→His-Mutante ebenfalls kcat und senkte KM für Maltose, mit einer geringen Wirkung auf die kinetischen Parameter für Isomaltose. Dies erzeugte eine erhöhte relative Spezifität von knapp unter dem Zweifachen für diese Mutante.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß sämtliche Mutationen, die auf einer Sequenzhomologie (Positionen 119, 178, 182, 183 und 184) mit den α-(1→4)- Enzymen beruhen, in einer erhöhten Selektivität für eine Hydrolyse von Maltose resultierten, aber sämtliche bis auf die Mutation der Position 178 besaßen nur eine leicht herabgesetzte, wenn nicht bessere Aktivität. Dies ist daher ein guter Nachweis dafür, daß andere Mutationen in diesen zwei Regionen sowie in der dritten Region mit einer Ähnlichkeit (Region 6) ebenfalls eine Zunahme der Selektivität bereitstellen werden. Dies ist auch Beleg dafür, daß die Aminosäuren, die die Anmelderin ausgewählt hat, nicht die einzige oder die beste Wahl an einer bestimmten Position sein können, da in einer Anzahl von Fällen mehr als eine Aminosäure hätte ausgewählt werden können. Dies liefert ausreichende Gründe dafür, den Schluß zu ziehen, daß irgendeine Mutation in diesen drei Regionen und ir gendeine Aminosäure an einer der Positionen von der vorliegenden Erfindung mitumfaßt ist.
Diese Mutationen zeigen, daß es möglich ist, funktionelle Veränderungen in der enzymatischen Aktivität vorauszusagen, gänzlich basierend auf einer Homologie mit Enzymen, für die keine dreidimensionale Struktur bekannt ist, aber für die funktionelle Unterschiede bestehen, die mit bekannten funktionellen Resten korreliert werden können.

Beispiel 2

Kondensationsstudien für die Asn182→A1a- und Wildtyp-Glucoamylasen Bei hohen Glucosekonzentrationen katalysieren Glucoamylasen Kondensationsreaktionen, von denen Isomaltose das bedeutendste akkumulierende Produkt ist. Das folgende Experiment vergleicht die Katalysen der Kondensationsreaktionen für die Asn182→A1a- und Wildtyp-Glucoamylasen.
30% (w/w) anfängliche Glucose in 0,1 M Natriumacetatpuffer in Deuteriumoxid bei pH 4,5 wurde bei 35ºC inkubiert. Die Asn182→A1a- und Wildtyp- Enzymkonzentrationen betrugen 10 bzw. 5 mg/ml. Die Rate der Produktbildung stellte die Summe von Isomaltose und Isomaltotriose dar, wie sie durch ¹H-NMR- Spektroskopie bei 500 MHz verfolgt wurde, die bei 4,94 ppm auf einem Spektrometer Typ Bruker AM-500 gemessen wurde.
In Fig. 4 stellt o das Asn182→A1a und + das Wildtyp-Enzym dar. Wenn die Unterschiede in den Enzymkonzentrationen korrigiert werden, beträgt das anfängliche Verhältnis der Bildungsraten von α-(1→6)- zu α-(1→4)-Bindungen für die Asn182→A1a-Mutante 22% dessen der Wildtyp-Glucoamylase, wie durch Kurvenanpassung bestimmt wurde (Ref. 22).
Die Daten zeigen, daß die anfängliche Rate der Isomaltose-Bildung, die durch die Asn182→A1a-Mutante katalysiert wurde, im Vergleich zu der Wildtyp- Glucoamylase wie in Fig. 4 gezeigt um das 5-fache abnahm. Dies ist Folge der spezifischen Destabilisierung des Isomaltose-Übergangszustand-Komplexes. Dieses Experiment zeigt einen Wirkungsmechanismus, durch den das mutante Enzym die Glucoseausbeute aus konzentrierter Stärkelösung über die 95%, die normalerweise erhalten werden, anheben kann.
Nach sechzig Stunden Inkubation näherte sich die Gesamtkonzentration von Isomaltose und Isomaltotriose, die durch die Wildtyp-Glucoamylase erzeugt wurde, ihrem Gleichgewichtswert an (ungefähr 0,14 M), während die, die durch die doppelte Menge an Asn182→A1a-Mutante erzeugt wurde, weniger als 0,1 M war.

Beispiel 3

Vergleichsstudie des mutierten Asn182→A1a-Enzyms gegenüber dem unmutierten Enzym in Hinsicht auf die Ausbeute an Glucose

Die folgenden Experimente vergleichen die Glucoseausbeute (Glucosekonzentration, g/L) zwischen der nativen Glucoamylase aus Aspergillus niger mit und ohne Verzweigungs-spaltende Enzyme, der Wildtyp-Glucoamylase aus Saccharomyces cerevisiae mit oder ohne Verzweigungs-spaltende Enzyme und der Asn182→A1a- Glucoamylase aus Saccharomyces cerevisiae mit und ohne Verzweigungsspaltende Enzyme. Wie vorstehend beschrieben, sind die beiden verwendeten Verzweigungs-spaltenden Enzyme, Pullulanase und Isoamylase, bereits in einem begrenzten Ausmaß für diesen Zweck verwendet worden. Keines der Verzwei gungs-spaltenden Enzyme kann α-(1→6)-Bindungen in Substraten mit weniger als ungefähr 4 Glucosylresten hydrolysieren. Demgemäß können die Enzyme nicht Isomaltose hydrolysieren, die nur zwei Glucosylreste besitzt.
Das Gleichgewicht zwischen Glucose und Isomaltose bleibt unverändert. Dies geschieht unabhängig davon, welches Enzym verwendet wird. Da das Gleichgewicht nur durch die Thermodynamik der Reaktion bestimmt wird, wird eine Veränderung in der relativen Rate, bei der zwei Moleküle Glucose durch die Hydrolyse von Isomaltose erzeugt werden, zusammenpassen mit der gleichen proportionalen Veränderung in der Rate, mit der Isomaltose erzeugt wird durch die Kondensation von zwei Molekülen Glucose. Dies ist von der mikroskopischen Reversibilität des Systems abhängig.

Material und Methoden

Der Stamm der Hefe Saccharomyces cerevisiae, der die Glucoamylase von Aspergillus awamori trägt, entweder mutiert (Asp 182→A1a) oder unmutiert (bezeichnet als Wildtyp), wurde bei 30ºC für 72 Stunden in Ansätzen von 10 Liter in einem 19 Liter fassenden Lab-Line Bioengineering-Fermenter in der Fermentationsanlage der Universität des Staates Iowa wachsen gelassen. Das Wachstumsmedium enthielt anfänglich 2% Glucose, 1,7 g/L Hefe-Stickstoffbasis, 5 g/L Ammoniumsulfat, 100 mg/L L-Histidin, aber kein Leucin. Da das Plasmid, das das Glucoamylase-Gen trägt, die L-Leucin-Erzeugung kodiert, während der Ausgangshefestamm dies nicht tat, wurde L-Leucin aus dem Medium ausgeschlossen. Das Medium wurde durch die Zugabe von Ammoniumhydroxid bei pH 4,5 gehalten. Es wurde dem Medium Luft zugegeben, so daß Sauerstoff bei 80% Sättigung blieb. Glucose wurde nach 27, 52 und 60 Stunden zugegeben, um seine Konzentration zurück auf 2% zu bringen, oder wurde nur einmal, nach 48 Stunden, wie derum auf 2% zugegeben, so daß die Wirkung der Glucosekonzentration auf die Glucoamylaseausbeute studiert werden konnte.
Das Fermentationsnährmedium wurde durch eine Ultrafiltrationsmembran filtriert und der klare Überstand, der die Wildtyp-Glucoamylase oder die mutierte Glucoamylase enthielt, wurde gesammelt. Die gesammelten Überstände wurden durch Ultrafiltration auf 100 mL konzentriert, gefriergetrocknet, wieder gelöst, dialysiert und auf eine DEAE-Fractogel-Säule gegeben, die mit entweder einem absteigenden pH-Gradienten oder einem ansteigenden Natriumchlorid-Gradienten eluiert wurde. Die Fraktionen, die die Glucoamylaseaktivität enthielten, wurden auf eine Säule von Sepharose-gekoppelter Acarbose gegeben, einem Pseudo- Tetrasaccharid, das auf spezifische Weise die Glucoamylase inhibiert. Der Glucoamylase-Acarbose-Komplex wurde durch Verwendung von 1,7 M Tris- Elutionsmittel aufgebrochen (Ref. 19).
Gereinigte Glucoamylaseproben der drei Typen wurden in DE15-Dextrin bei pH 4,5 und 35ºC für 120 Stunden inkubiert. Die drei Typen waren: 1) Glucoamylase von A. awamori, die von Miles Laboratories, Elkhart, IN, USA, erhalten worden war, mit der Glucoamylase I-Form (die gleiche, wie die von dem in S. cerevisiae insertierten Glucoamylase-Gen erzeugte), die durch Säulenchromatographie aufgetrennt wurde und praktisch bis zur Homogenität gereinigt wurde, 2) Wildtyp- Glucoamylase, die durch eine Hefefermentation erzeugt wurde, und 3) mutierte Glucoamylase (Asp 182→A1a), das auf die gleiche Weise erzeugt wurde. Jede der drei Glucoamylase-Typen wurde auf drei verschiedene Weisen inkubiert: Entweder allein bei 4,5 IU/mL, bei 4,5 IU/mL mit 4,5 IU/mL Pullulanase und bei 4,5 IU/mL mit 4,5 Einheiten/mL Isoamylase. Sämtliche Enzymaktivitäten wurden in internationalen Einheiten (International Units, IU) gemessen, mit Ausnahme von Isoamylase, bei der eine Einheit als der Anstieg der Lichtabsorption bei 60 nm von 0,1 in einer Kuvette von 10 mm, folgend der Hydrolyse von Reisstärke für eine Stunde und der Anwendung eines Assays eines reduzierenden Zuckers defi niert wurde. In sämtlichen neun Experimenten wurde die Glucosekonzentration nach Oxidation mit Glucoseoxidase durch ein spektrophotometrisches Verfahren gemessen.

Ergebnisse

Die besten Ergebnisse wurden erhalten, wenn man Glucose auf eine Konzentration von Null bei etwa 20 Stunden fallen und dort bis zu 48 Stunden verbleiben ließ. Nach 48 Stunden wurde ausreichend Glucose zugegeben, um die Konzentration wieder auf 2% zu geben. Während des Zeitraums des Glucosemangels wuchs die Hefe vermutlich auf organischen Stoffen in der Hefe-Stickstoffbasis, da keine Abnahme in der Wachstumsrate festgestellt wurde. Die Glucoamylaseerzeugung begann, wenn die Glucose die Null-Konzentration erreichte.
Normalerweise wird Glucoamylase durch eine Passage über eine DEAE- Fractogel-Säule mit einem absteigenden linearen Gradienten von pH 6 auf 3 gereinigt. Das mutierte Enzym wurde unter diesen Bedingungen jedoch nicht gut adsorbiert, da ein großer Teil bei dem Leervolumen austrat. Deshalb wurde es bei pH 6 unter Verwendung eines linearen Salzgradienten von 0,0 bis 0,4 M Natriumchlorid gereinigt. Es wurde nur ein Glucoamylase-Peak mit dieser Säule und mit einer Säule, die mit Acarbose gepackt war, einem potenten Glucoamylase- Inhibitor, der an Sepharose gekoppelt war, erhalten.
Unter Bezugnahme auf die Tabellen II-IV waren die Glucoseausbeuten am höchsten, wenn Dextrin bei 35ºC und pH 4,5 mit Glucoamylase hydrolysiert wurde, die mit entweder Pullulanase oder Isoamylase gemischt war, die auf schnelle Weise α-(1→6)-Bindungen in den Substratmolekülen spaltete, und dadurch der Glucoamylase erlaubte, die verbleibenden α-(1→4)-Bindungen schneller zu hydrolysieren. Dieses Verhalten ist auch durch andere festgestellt worden, und in der Tat werden derartige Gemische oft industriell verwendet. Die mutante Glucoamylase ergab leicht höhere Glucoseausbeuten, als es entweder die native Glucoamylase aus A. awamori oder die Wildtyp-Glucoamylase aus der Hefe tat, wobei die Unterschiede statistisch signifikant waren. Es wurden Peak-Glucosekonzentrationen bei etwa 60 Stunden erhalten, was der industriellen Erzeugung von Glucose mit Glucoamylase ähnlich ist, was jedoch bei 60ºC statt bei 35ºC geschieht.
Es ist von Bedeutung, wenn man die Tabellen II, III und IV vergleicht, daß die Asn182→A1a-Mutante der Glucoamylase allein (ohne ein Verzweigungsspaltendes Enzym) eine signifikante Zunahme bei der Herstellung von Glucose um 1% bei einem einzelnen Satz von Reaktionsbedingungen gegenüber der nativen oder der Wildtyp-Glucoamylase erzeugte. Demgemäß kann die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine signifikante Zunahme bei der Ausbeute von Glucose pro Einheitsmenge an hydrolysierter Stärke erzeugen in bezug auf eine Ausbeute aus dem Inkubieren der Stärke- und/oder verwandter Oligo- und Polysaccharid-Moleküle in Gegenwart der unmutierten Glucoamylase, die Asn an Aminosäureposition 182 besitzt.
Die vorstehenden Daten zeigen, daß das Glucoamylase-Enzym, das die Asn182→A1a-Mutation besitzt, zu einer erhöhten Selektivität des Enzyms für α- (1→4)-Bindungen gegenüber einer Bildung von α-(1→6)-Bindungen sowie einem 1%-igen Anstieg der Glucoseerzeugung führt. Kommerziell gesehen sind sogar marginale Verbesserungen über die 95%-igen Ausbeuten von Glucose hinaus signifikant.
Die Anmelderin hat gezeigt, daß die Zugabe von Pullulanase oder Isoamylase zu der Glucoamylase immer eine schnellere Herangehensweise an die maximale Glucoseausbeute ergibt. Die Zugabe von Pullulanase ergibt eine leicht höhere maximale Ausbeute als es die Glucoamylase allein tut, wahrscheinlich weil die die Verzweigungen spaltenden Enzyme schnell α-(1→6)-Bindungen spalten, die die Hydrolyse von α-(1→4)-Bindungen durch die Glucoamylase behindern. Die Zugabe von Isoamlyase war weniger wirksam bei der Erhöhung der maximalen Glucoseausbeute, wobei beide Ergebnisse die Befunde von anderen in dem technischen Gebiet unterstützten.
Die Asn182→A1a-Mutante der Glucoamylase ergab leicht höhere maximale Ausbeiten als es die nativen oder Wildtyp-Enzyme taten, wobei die nativen und Wildtyp-Enzyme vermutlich zueinander identisch sind, mit der Ausnahme einer zusätzlichen Glycosylierung in dem Wildtyp-Enzym, die durch die S. cerevisiae hinzugefügt wurde (Ref. 20). Das mutante Enzym mit Pullulanase oder Isoamylase ergab eine höhere Ausbeute, als es die nativen oder Wildtyp-Enzyme mit Pullulanase oder Isoamylase taten.
Abschließend ist festzustellen, daß die vorgenannten mutanten Glucoamylase- Enzyme, die gemäß dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, eine erhöhte Glucoseausbeute pro Einheitsmenge an hydrolysierter Stärke im Vergleich zu der Ausbeute beim Inkubieren der Stärke- und/oder verwandter Oligo- und Polysaccharid-Moleküle in der Gegenwart von unmutierten Glucoamylasen bereitstellen, und auf diese Weise ein kommerziell wertvolles erfinderisches Verfahren bereitstellen.
Ferner zeigen die experimentellen Belege, das Vergleiche der Enzym- Primärstruktur und die Verwendung von Informationen über funktionale Reste zu einer Vorhersage von veränderten Bildungen im Anschluß an einen Austausch von Aminosäuren führen können.

DRUCKSCHRIFTEN

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22. Svensson, B. und Sierks, M.R., unveröffentlichte Daten. Tabelle 1 Kinetische Parameter für die Hydrolyse von Maltose, Maltoheptaose und Isomaltose durch mutante und Wildtyp-Glucoamylasen von A. awamori bei pH 4,4 und 50ºC Tabelle II Erzeugung von Glucose aus DE15-Dextrin durch native Glucoamylase aus Aspergillus niger mit und ohne Verzweigungs-spaltende Enzyme
*95% Konfidenzgrenze
** Standardfehler Tabelle III Erzeugung von Glucose aus DE15-Dextrin durch die Wildtyp-Glucoamylase aus Saccharomyces cerevisiae mit und ohne Verzweigungsspaltende Enzyme
*95% Konfidenzgrenze
** Standardfehler Tabelle IV Erzeugung von Glucose aus DE15-Dextrin durch die Asn182→4A1a-Glucoamylase aus Saccharomyces cerevisiae mit und ohne Verzweigungsspaltende Enzyme
* Nicht verwendet in nichtlinearer Regression
**95% Konfidenzgrenze
*** Standardfehler Tabelle V Kinetische Konstanten für Mutanten, bestimmt bei 45ºC, pH 4,5 unter Verwendung eines 0,05 M Natriumacetatpuffers. Die Werte für kcat sind in s&supmin;¹ und die für KM sind in mM Tabelle VI Selektivitäten von mutanten Enzymen für Maltose (G2) gegenüber Isomaltose (102) und Maltoheptaose (G7) gegenüber Maltose

Claims

1. Verfahren zum Umsetzen von Stärke oder teilweise hydrolysierter Stärke zu einem Sirup, der Dextrose enthält, wobei das Verfahren den Schritt des Verzuckerns eines Stärkehydrolysats in Gegenwart einer Mutante einer Glucoamylase umfaßt, die von einem Stamm von Aspergillus erhältlich ist, die, in bezug auf die Glucoamylase von Aspergillus niger, eine erhöhte Selektivität für α-(1→4)-glucosidische Bindungen aufweist, und die eine der folgenden Mutationen umfaßt:

Substitution der Aminosäure in der Position, die Ser119 der Glucoamylase von A. niger entspricht, mit einer anderen Aminosäure als Ser, vorzugsweise Tyr;

Substitution der Aminosäure in der Position, die Asn182 in der Glucoamylase von A. niger entspricht, mit einer anderen Aminosäure als Asn, vorzugsweise A1a;

Substitution der Aminosäure in der Position, die Gly183 in der Glucoamylase von A. niger entspricht, mit einer anderen Aminosäure als Gly, vorzugsweise Lys;

Substitution der Aminosäure in der Position, die Ser184 der Glucoamylase von A. niger entspricht, mit einer anderen Aminosäure als Ser, vorzugsweise His.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die mutierte Glucoamylase von einer Glucoamylase abgeleitet ist, die von A. niger oder A. awamori erhältlich ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mutierte Glucoamylase zwei oder mehrere dieser Aminosäuresubstitutionen umfaßt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Dosierung der Glucoamylase in einem Bereich von 0,05 bis 0,5 AG-Einheiten pro Gramm an Feststoffen liegt.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, das das Verzuckern eines Stärkehydrolysats mit mindestens 30 Gew.-% an Feststoffen umfaßt.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Verzuckern in Gegenwart eines Verzweigungs-spaltenden Enzyms, ausgewählt aus Pullulanasen und Isoamylasen, durchgeführt wird, vorzugsweise einer Pullulanase, die von Bacillus acidopullulyticus abgeleitet ist, oder einer Isoamylase, die von Pseudomonas amyloderamosa abgeleitet ist.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Verzuckerung bei einem pH von 3 bis 5,5 und einer Temperatur von 30 bis 60ºC für 48 bis 72 Stunden, vorzugsweise bei einem pH von 4 bis 4,5 und einer Temperatur von 55 bis 60ºC, durchgeführt wird.

8. Mutante einer Glucoamylase erhältlich von einem Stamm von Aspergillus, die, in bezug auf die Glucoamylase von Aspergillus niger, eine erhöhte Selektivität für α-(1→4)-glucosidische Bindungen aufweist, und die eine der folgenden Mutationen umfaßt:

Substitution der Aminosäure in der Position, die Ser184 der Glucoamylase von A. niger entspricht, mit einer anderen Aminosäure als Ser, vorzugsweise His;

mit der Maßgabe, daß wenn das mutierte Enzym von der Glucoamylase von A. niger abgeleitet ist, die Substitution von A1a für Asn in der Aminosäureposition Asn182 nicht die einzige Mutation ist.

9. Mutierte Glucoamylase nach Anspruch 8, umfassend zwei oder mehrere dieser Aminosäuresubstitutionen.