FI107807B - Tärkkelyksen entsymaattinen hydrolyysi glukoosiksi geenimanipuloidun entsyymin avulla - Google Patents

Description

5 107807 Tärkkelyksen entsymaattinen hydrolyysi glukoosiksi geeni-manipuloidun entsyymin avulla - Hydrolys av stärkelse tili glukos med hjälp av ett genmanipulerat enzym

Keksinnön kohteena on uusia entsyymejä ja menetelmä entsyymien käyttämiseksi glukoosin valmistamiseksi tärkkelyksestä. Erityisesti keksintö liittyy glukoamylaasi-entsyymivariant-teihin ja sellaisten erilaisten entsyymivarlanttien käyttöön 10 tärkkelysyksiköstä tai osittain hydrolysoidusta tärkkelyksestä valmistetun glukoosisaannon nostamiseksi.

Glukoamylaasi (1,4-a-D-glukaaniglukohydrolaasi, EC 3.2.1.3) on entsyymi, joka katalysoi D-glukoosin vapauttamista tärk-15 kelyksen tai vastaavista oligo- ja polysakkaridi-molekyylien ei-redusoivista päistä. Glukoamylaaseja valmistetaan useilla rihmasienillä ja hiivoilla, joista Aspergillukset ovat kaupallisesti tärkeimmät.

20 Kaupallisesti glukoamylaasientsyymiä käytetään viljatärkke-lyksen, joka on jo osittain hydrolysoitu a-amylaasin toimes-ta, muuttamiseksi glukoosiksi. Glukoosi muutetaan edelleen • · ... glukoosi-isomeraasilla seokseen, joka sisältää noin yhtä pal- » « jon glukoosia ja fruktoosia. Tämä seos tai seos, joka edel- ♦ · * *·* * 25 leen on rikastettu fruktoosin suhteen, on yleisesti käytetty • ♦ : korkeafruktoosiviljasiirappi, joka on kaupallistettu ympäri • · V·· maailmaa. Tämä siirappi on maailman tonniluvultaan suurin : tuote, joka on valmistettu entsymaattisella menetelmällä. Ne kolme entsyymiä, jotka ovat mukana tärkkelyksen muuttamisessa ·♦··; 30 fruktoosiksi, ovat tärkeimpiä teollisia entsyymejä, joita on .···. valmistettu, siitä huolimatta, että kaksi niistä, a-amylaasi ja glukoamylaasi, ovat suhteellisen halpoja painon tai akti- - · · * ’···* viteetin perusteella.

··· • · • « • · · 35 On olemassa kaksi pääasiallista ongelmaa, jotka liittyvät • · · · .···. glukoamylaasin kaupalliseen käyttöön korkeafruktoosivilja- siirapin valmistuksessa. Ensimmäinen ongelma liittyy glukoamylaasin lämpöstabiliteettiin. Glukoamylaasi ei ole yhtä lämpöstabiili kuin α-amylaasi tai glukoosi-isomeraasi ja se 2 107807 on eniten aktiivinen ja stabiili alemmilla pH-arvoilla kuin joko α-amylaasi tai glukoosi-isomeraasi. Niinpä sitä on käytettävä erillisessä astiassa alemmassa lämpötilassa ja pH:ssa. Toiseksi korkeissa kiintoaine-pitoisuuksissa, joita 5 käytetään kaupallisesti korkea-fruktoosiviljasiirapin valmistuksessa, glukoamylaasi syntetisoi di-, tri- ja tetrasak-karideja tuotetusta glukoosista. Niinpä glukoosin saanto ei ylitä 95 %:a teoreettisesta. Määrältään pääasiallinen muodostettu sivutuote on isomaltoosi, disakkaridi, joka sisältää 10 kahta glukosyyliradikaalia kytkettynä a- (1->·6) -sidoksella. Glukoamylaasi, joka pystyy tuottamaan glukoosia ilman sivutuotteita olisi kaupallisesti potentiaalisesti tärkeä, jos sen kustannukset eivät olisi merkittävästi korkeampia kuin nykyisin tuotetun entsyymin, joka pääasiallisesti valmiste-15 taan kahdella toisiaan hyvin lähellä olevalla sienilajilla Aspergillus nicrer ja Aspergillus awamori. Glukoamylaasit näistä kahdesta lähteestä ovat identtisiä.

Glukoamylaasit erilaisista sienilähteistä on sekvensoitu ja 20 niillä on korkea homologia (viite 1, 2). Korkea homologia erilaisten sienilähteiden välillä viittaa siihen, että kaikki entsyymit ovat rakenteellisesti ja toiminnallisesti samanlai- • · ... siä. Lisäksi kineettiset määritykset muutamilla glukoamylaa- • · *·” seilla ovat osoittaneet, että niiden alipaikkakohtaiset sito- » · · *·’ ' 25 misenergiat ovat melkein identtiset (viite 3, 4, 5, 6, 7) .

• · * * · • · · • « · · « · ·.*·: Hakija on suorittanut tutkimuksia koskien A. nigerista ja A^_ »·» ·* awamorista saatujen identtisten glukoamylaasien aminohappojen homologiaa, sekä yhdessä muiden glukoamylaasien kanssa että ·:*·· 30 yhdessä muiden entsyymien kanssa, jotka hydrolysoivat tärk- .··*. kelystä ja sen tapaisia aineita (viite 8) . Tämä tehtiin sel- ^ laisten aminohappojen, jotka olivat yhteisiä entsyymeissä, v · · *· "·'··' jotka eivät pysty lohkaisemaan a- (1—>6) -glukoosisidoksia • · · (pääasiallisesti α-amylaasi) , tunnistamiseksi niistä, jotka 35 pystyvät hydrolysoimaan a-(l-»6)-glukoosisidoksia (glukoamy- • * · · .*··. laasit ja isomaltaasi) .

• · ♦ · ·

Hakija on havainnut, että glukoamylaasi on edustettuna kolmessa kuudesta samansekvenssisestä alueesta useampien tärk- 3 107807 kelyshydrolaasien joukossa (viite 8). On määritetty, että Alue 1 A. nioer -glukoamylaasiradikaaleista 109-122, Alue 4 glukoamylaasiradikaaleista 172-184 ja Alue 6 radikaaleista 382-398 sisältävät nämä samankaltaisuudet sekvenssin suhteen.

5 Alueet edustavat sekvenssisamankaltaisuuksia entsyymeillä, jotka lohkaisevat ainoastaan α- (1—>4)-sidoksia, entsyymeillä, jotka lohkaisevat ainoastaan a- (1—>6)-sidoksia ja glukoamy-laasilla, joka lohkaisee molempia. Aminohapot asemissa 178, 182, 183 ja 184 erosivat ryhmien kesken, mikä viittaa amino-10 happojen vaihtoon näissä asemissa. Hakija on myös todennut homologiaa asemassa 119. Käyttämällä kasettimutagenisointia hakija on tehnyt aminohapposubstituointeja eräissä näissä asemissa homologiatutkimusten mukaisesti (viite 8).

15 Neljännentoista ICS-kokouksen yhteydessä Tukholmassa 1988 hakija esitti posterin, joka kuvasi, että asemasuunnattu mutageenisuus tukee Tyrll6:n ja Trpl20:n osallistumista substraattisitomiseen ja Glul80 katalyysiin. Lisäksi esitettiin, että Trpl70:lla on rooli isomaltoosin sitomisessa, 20 mutta tämä aspekti jää tutkittavaksi asemasuunnatulla muta-geenisuudella. Posteri paljasti myös, että Asnl82:n mutaatio Alarksi edellytti aktiivisen entsyymin, mutta mitään tuloksia • · ... ei esitetty eikä ehdotettu koskien tämän entsyymin suhteel- • · ”1 lista spesifisyyttä.

« » · 25 • · • · · M· Kuten edellä on todettu, epäkohta glukoamylaasin teollisessa • · käytössä on siinä, että D-glukoosisaannot rajoittuvat noin • · · V· 95 %:iin väkevissä tärkkelysliuoksissa. Tämä tapahtuu tärkke lyksen oc-1 (->6)-D-glukooosisidosten hitaan hydrolyysin takia ·;··· 30 ja siitä syystä, että D-glukoosista muodostuu asteittain erilaisia kasaantuvia kondensaatiotuotteita, pääasiallisesti \ a- (1—>6)-kytkettyjä isomalto-oligosakkarideja (viite 9). On '•y‘ käytännössä mutkikasta vähentää nopeutta, jolla glukoamylaasi lohkaisee ja sen takia muodostaa a-(1—>6)-sidoksia suhteessa ··· 35 nopeuteen, jolla se lohkaisee a-(1—>4)-sidoksia. Mutaatiot * · « · .·**. asemissa Trpl20, Aspl76, Glul79 ja Glul80 A. awamori -gluko- amylaasissa olivat kaikki kriittisiä entsyymiaktiviteetille (viitteet 10, 11).

4 107807

Hakija jatkoi muiden aminohappomutaatioiden tutkimista tavoitteen ollessa glukoamylaasin selektiivisyyden lisääminen maltoosin hydrolyysiin verrattuna isomaltoosin hydrolyysiin. Nämä kokeet ovat ongelmallisia, koska glukoamylaasin kolmi-5 ulotteista rakennetta ei ole määritetty. Sen sijaan käytettiin ensisijaisesti alueellisia sekvenssisamankaltaisuuksia muilla glukoamylaaseilla kuin A. awamorilla ja A. niaerilla tuotetuilla sekä muilla entsyymeillä, jotka ovat aktiivisia a-(l—>4)- ja a-(1^-6)-kytketyillä D-glukosyylioligo- ja poly-10 sakkarideilla (Kuvio 1).

Hakija suoritti siten testejä, jotka esimerkiksi koskivat Serll9:n, Leul77:n, Trpl78:n, Asnl82:n, Glyl83:n ja Serl84:n mutaatioita.

15

Alueella 1 (Kuvio 1) glukoamylaasilla on asemissa, jotka vastaavat A. niaer 119: ää, joko Ser, Ala tai Pro, joissa oc-amylaaseilla ja syklodekstriiniglukaanitransferaaseilla (CGTaasi) kaikilla on Tyr. Sen takia A. niaer -glukoamylaasin 20 Serll9 saatettiin läpikäymään mutaatio Tyr:ksi, jotta se voisi muistuttaa cc-amylaaseja ja CGTaaseja.

• • « · · • · ... Alueella 4 Leul77 saatettiin läpikäymään mutaatio His:ksi ‘y;‘ koska entsyymit, joilla on aktiviteettia a- (l->6) -glukoosi- • · · *.* ' 25 sidoksiin tunnusomaisesti sisältävät aminohapporadikaaleja, • · : joilla on tässä homologisessa asemassa pienempiä alifaattisia • · :.*·· sivuketjuja, kun taas entsyymit, joilla on aktiviteettia ::: ainoastaan a- (1—>4)-D-glukoosisidoksiin, sisältävät ensisi jaisesti Phe:n tai Trp:n, joilla on suuria aromaattisia 30 sivuketjuja. Tässä asemassa esiintyvät myös Ile, Vai ja Leu.

• « · • · * ·* A. niaer -glukoamylaasin radikaalissa 178 Trp saatettiin :.i.: läpikäymään mutaatio Arg:ksi, koska Trp säilytettiin gluko- • « · amylaaseissa ja isomaltaasissa, jotka lohkaisevat a-(l-»6)-35 sidoksia, mutta Arg:ia löytyy kaikissa a-amylaaseissa, ··«« .···. maltaaseissa, CGTaasissa, amylomaltaasissa ja haarautuneessa • · entsyymissä, jotka eivät lohkaise mainittuja sidoksia.

5 107807

Perustuen samoihin vertailuihin Asnl82 saatettiin läpikäymään mutaatio Ala:ksi, koska Asn säilytettiin kaikissa glukoamy-laaseissa ja isomaltaasissa, mutta oli useimmissa a-amylaa-seissa korvattu radikaaleilla, jotka sisälsivät lyhyitä ali-5 faattisia sivuketjuja kuten Ala, Vai ja Ser, tavallisesti Ala.

A. niaer -glukoamylaasiasemassa 183 kaikilla gluko-amylaa-seilla on Gly, isomaltaasilla on hapan ketju Glu, kun taas 10 entsyymeillä, jotka lohkaisevat ainoastaan a-(l-»4)-glukoo-sisidoksia, on emäksinen sivuketju, ensisijaisesti Lys, joskin Arg myöskin esiintyy. Haarautunut entsyymi on ainoa oc-(1-M)-sidokseen vaikuttava entsyymi, joilla ei ole emäksistä ryhmää tässä asemassa, vaan sen sijaan Ala. Sen takia Glyl83 15 muutettiin Lys:ksi.

Asemassa 184 glukoamylaaseilla on Ser, Vai ja Met, kun taas isomaltaasilla on myös Vai. Entsyymit, jotka lohkaisevat a-(1—>4)-sidoksia, sisältävät kuitenkin enimmäkseen His:a tässä 20 asemassa, vaikka Gly, Leu, Gin ja Ser myös esiintyvät. Sen takia Serl84 muutettiin His:ksi.

• • · · · • · ... Tämän keksinnön mukaan on aikaansaatu menetelmä tärkkelyksen » · *·;·* tai osittain hydrolysoidun tärkkelyksen muuttamiseksi dekst- *·* * 25 roosia sisältäväksi siirapiksi, joka menetelmä käsittää vai- • » : heen, jossa tärkkelyshydrolysaatti muutetaan sokeriksi Asper- • « gilTus-kannasta saatavissa olevan glukoamylaasin sellaisen • · * : mutantin läsnä ollessa, jolla suhteessa Aspergillus niaerin glukoamylaasiin on korotettu selektiivisyys oi-(1—>4)-glukoo-30 sisidoksiin ja joka käsittää jonkin seuraavista mutaatioista: « * · • · ··« A. niqer -glukoamylaasin Ser 119:ää vastaavassa positiossa " · · · olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, « ·· edullisesti Tyr:lla; •j. 35 A. niqer -glukoamylaasin Asn 182: ta vastaavassa positiossa M·· .·*·. olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Asn, edullisesti Ala:11a; 6 107807 A. nicrer -glukoamylaasin Gly 183:a vastaavassa positiossa olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Gly, edullisesti Lys:lla; A. niaer -glukoamylaasin Ser 184:ää vastaavassa positiossa 5 olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, edullisesti Hisrlla.

Tämän keksinnön mukaan on näin ollen myös aikaansaatu Asper-aiUus-kannasta saatavissa olevan glukoamylaasin mutantti, 10 jolla on suhteessa Aspergillus niaerin glukoamylaasiin korotettu selektiivisyys a- (1—>4) -glukoosisidoksiin ja käsittää jonkin seuraavista mutaatioista: A. niger -glukoamylaasin Ser 119:ää vastaavassa positiossa 15 olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, edullisesti Tyr:lla; A. niger -glukoamylaasin Asn 182:ta vastaavassa positiossa olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Asn, edullisesti Ala:11a; 20 A. niger -glukoamylaasin Gly 183:a vastaavassa positiossa olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Gly, edullisesti Lys:lla; • · A. niger -glukoamylaasin Ser 184 :ää vastaavassa positiossa • · *** olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, • t · ]·*/ 25 edullisesti Hisilla; • · · •·ϊ · edellyttäen, että mutaation läpikäyneen entsyymin ollessa • · * * * *. *! johdettu A. niger -glukoamylaasista, Asn:n korvaaminen • « · ♦ Ala: 11a aminohappopositiossa Asn 182 ei ole ainoa mutaatio.

*:··· 30 Tämän keksinnön muut edut ovat helposti ymmärrettävissä, kun .1. se tulee paremmin selvitetyksi viittaamalla seuraavaan seik- • tt *. kaperäiseen kuvaukseen, jolloin sitä tarkastellaan liitetty- ♦ · · *”·’ jen kuvioiden yhteydessä, joissa: • · • · • · · 35 Kuvio 1 esittää A. niger -glukoamylaasin Alueen 1 (a) , Alueen • t«t .·**. 4 (b) ja Alueen 6 (c) vertailua muihin glukoamylaaseihin, oc- • •m amylaaseihin, isomaltaasiin, maltaasiin ja syklodekstriini-glukaanitransferaaseihin (viite 8) (Glukoamylaasien merkinnät: An: A. niger. Ro: Rhizopus oryzae. Sd: Saccharomyces 7 107807 diastaticus ja Sf: Saccharomycopis fibulicrera; α-amylaasien merkinnät: Ao: Aspergillus orvzae, Pp: Porcine pancreati, Bs: Bacillus subtilis ja Ba: Barley Isozymel; Rl: Kanin suolis-tonsisäinen isomaltaasi; maltaasin merkintä: Se: Saccharomv-5 ces cerevisiae; syklodekstriiniglukaanitransferaasien merkinnät: aB: alkalophilic Bacillus sp. strain 1011 ja Kp: Klebsiella pneumoniae. Varjostetut alueet edustavat sekvens-sivertailuja kuudessa, mutaation läpikäyneessä asemassa GA:ssa; alleviivaukset tarkoittavat identifioituja, toimin-10 nallisesti tärkeitä radikaaleja; * tarkoittaa GA katalyyttisiä ryhmiä);

Kuvio 2 esittää kaaviota, josta A. awamori-alukoamylaasin mutaatiot ilmenevät kohdissa Serll9, Leul77, Trpl78, Asnl82, 15 Glyl83 ja Serl84 ja jossa nukleotidimuutokset on merkitty pienillä kirjaimilla villityypin sekvenssin yläpuolella;

Kuvio 3 esittää plasmidi pGAC9:n (viite 20) kaaviota, jossa restriktiopaikat on merkitty; ja 20

Kuvio 4 esittää tietoja Asnl82-»Ala- ja villityyppiglukoamy-laasien kondensaatioreaktion tutkimuksista. Reaktio-olo- • ·

... suhteet olivat: 30 paino-% glukoosin lähtöpitoisuus 0,1 M

• · » ·

Hl natriumasetaattipuskurissa deuteriumoksidissa pH:n ollessa • · · 25 4,5 ja lämpötilan 35 °C. Asnl82-»Ala:n ja villityyppientsyy- • · · ··· : min pitoisuudet olivat 10 ja vastaavasti 5 mg/ml. Tuotteen • · muodostusnopeus edustaa isomaltoosin ja isomaltotrioosin : summaa seurattuna H NMR-spektrometrisesti (viite 22) 500 MHz:ssä 4,94 ppm:ssä Bruker AM-500-spektrometrillä. Merkki o ·:··: 30 edustaa Asnl82—>Ala- ja + villityyppientsyymiä. Lähtösuhde .***. nopeuksille, joilla muodostuminen a-(1-^6)-sidoksista a- ·*· *. (1—>4)-sidoksiin tapahtuu, on Asnl82—»Ala:lie 22 % villityyp- » ♦ * · *·”* piglukoamylaasin arvosta.

• · • · ·»· ·;· 35 Tämä keksintö esittää uusia entsyymi variantteja ja menetelmää ··*· ;***; entsyymin käyttämiseksi glukoosin valmistamiseksi tärkkelyk- »·« sestä. Yleisesti menetelmä käsittää prekursoritärkkelyksen osittaisen hydrolyysivaiheen a-amylaasin läsnä ollessa ja sen jälkeen D-glukoosin vapauttamisen tärkkelyksen tai vastaavien 8 107807 oligo- tai polysakkaridimolekyylien ei-redusoivista päätteistä edelleen hydrolysoimalla glukoamylaasin läsnäollessa a-(1—>4) — ja a- (1—>6) -glukoosisidoksia lohkaisemalla.

5 Erityisesti prekursoritärkkelyksen osittainen hydrolyysi a-amylaasia käyttäen aiheuttaa tärkkelysmolekyylin alkuhajoa-misen sen sisäisiä a-(l-»4)-sidoksia hydrolysoimalla. Kaupallisissa sovellutuksissa alkuhydrolyysi α-amylaasia käyttämällä suoritetaan lämpötilassa, joka on noin 105 °C. Käsi-10 tellään hyvin korkeaa tärkkelyspitoisuutta, joka edustaa tavallisesti 30-40 % kiintoainetta. Alkuhydrolyysi suoritetaan hyvin huolellisesti viiden minuutin ajan tässä korotetussa lämpötilassa. Osittain hydrolysoitu tärkkelys voidaan sitten siirtää toiseen astiaan ja inkuboida se noin tunnin 15 ajan lämpötilassa 85-90 °C, jolloin saadaan dekstroosiekvi-valentti (D.E.), joka on 10-15.

Vaihe, joka käsittää D-glukoosin vapauttamisen tärkkelyksen tai vastaavien oligo- tai polysakkaridimolekyylien ei-redu- 20 soivista päätteistä edelleen hydrolysoimalla glukoamylaasin läsnä ollessa, suoritetaan tavallisesti erillisessä astiassa ...» alennetussa lämpötilassa 30:n ja 60 °C:n välillä. Substraat- • · ... tinesteen lämpötila lasketaan edullisesti alueeseen 55-60 °C.

*** Liuoksen pH lasketaan alueesta 6-6,5 alueeseen 3 - 5,5.

• · · ]·’/ 25 Liuoksen pH on edullisesti 4 - 4,5. Liuokseen lisätään gluko- • · · ··· · amylaasia ja reaktio suoritetaan 48-72 tunnin ajan.

• · • · · • ·· • · • · · ; Kuten edellä on mainittu, muodostuu kondensaatiotuotteita, jotka sisältävät a-(l->6)-sidottuja isomalto-oligosakkarideja.

·:··; 30 Nikolov et ai., 1988 (viite 9) on seikkaperäisesti selvittä- ·1. nnyt reversion kinetiikan. Tämän reversioreaktion merkitys on ··· ·, siinä, että vaikka glukoamylaasi pystyy hydrolysoimaan kaikki • · · *·”’ tärkkelyksestä löydetyt D-glukoosisidokset, D-glukoosisaantoja • · '···* yli 95 % teoreettisesta ei saavuteta väkevissä tärkkelysdekst- 35 riiniliuoksissa johtuen D-glukoosia koskevista kondensaatio- • · ** • · ♦ • · • · ·· · 9 107807 reaktioista, joita tavallisesti kutsutaan reversioreaktioiksi (viitteet 12 - 16).

Kondensaatioreaktio on bimolekyläärinen reaktio, kun taas hydrolyysireaktioon osallistuu vai yksi molekyyli. Sen 5 takia korkeiden kiintoainepitoisuuksien käyttö, mikä on tavallista teollisissa sovellutuksissa, johtaa merkittävien kondensaatiotuotemäärien muodostamiseen. Joskin tärkkelyksen käsittely alhaisemmissa konsentraatioissa vähentäisi kondensaatiotuotteita, tällainen muutos ei ole 10 kaupallisesti toivottavaa. Tämä johtuu siitä, että joko laimean glukoosituotteen liuoksen kuljetus (sillä on korkea paino suhteessa konsentroituun tuotesiirappiin) tai nesteen haihduttaminen glukoosituotteen väkevöimiseksi on erittäin kallista.

15 Tämän keksinnön mukaan on esitetty parannus, jossa inkuboidaan osittain hydrolysoituja tärkkelys- tai vastaavia oligo- ja polysakkaridimolekyylejä glukoamylaasin tai vastaavien entsyymien läsnäollessa, joilla on ainakin yksi mutaatio, jossa on substituoitu aminohappo, joka on 20 valittu vertailemalla muiden entsyymien rakenteellisesti • « ... vastaaviin alueisiin, jotka entsyymit yksinomaan '** hydrolysoivat vain a-(l—>4) -glukoosisidoksia. Tätä • · ♦ /*/ perustosiasiaa on käytetty entsyymien a-(l—>4)-glukooosi- ·'·♦ * sidosten selektiivisyyden lisäämiseksi. Kuten on selvitetty 25 tekniikan taustaa käsittelevässä osassa, nämä mutaatiot • ·« · johdettiin hakijan sekvenssivertailututkimuksista, jotka koskivat identtisiä A. niqer- ja A. awamori-:*·.: glukoamylaaseja. Kuten yllä on todettu, näissä tutkimuksissa tunnustettiin aminohappoja, jotka olivat . 30 yhteisiä vastaavissa entsyymeissä, jotka eivät pysty ’* hydrolysoimaan a-(l—>6 )-glukoosisidoksia niistä, jotka pystyvät hydrolysoimaan a-(l—>6)-glukoosisidoksia.

• · • · « • » » • ·

Erityisesti tehtiin aminohappojen mutaatiot asemissa, jotka • · 35 vastaavat A. niqer Alueen 1 radikaaleja 109-122, Alue 4:n radikaaleja 172-184 ja Alue 6:n radikaaleja 382-398, jotka 10 107807 oli saatettu läpikäymään mutaatio aminohappoihin, joilla oli homologiset asemat entsyymeissä, jotka selektiivisesti hydrolysoivat ainoastaan a-(l—>4)-glukoosisidoksia. Spesifiset mutaatiot, jotka osoittavat lisääntyvän 5 maltoosihydrolyysi-selektiivisyyden tehdään asemissa 119, 182, 183 ja 184. Hakija osoittaa edelleen merkittävän glukoosisaannon lisäyksen laskettuna yksikköä tärkkelystä kohti, jota on hydrolysoitu mutaatiota Alal82;lla läpikäyneellä glukoamylaasilla verrattuna suhteelliseen 10 saantoon, joka on saatu villityyppi-glukoamylaasilla, jolla on Asnl82.

On todettu, että mutaation läpikäyneellä glukoamylaasilla, jolla on Alal82, on merkittävästi korkeampi maltoosi/isomaltoosi-selektiivisyys (selektiivisyys 15 a-(l—>4)-glukoosisidosten hydrolyysiin verrattuna a-(l—>6)-glukoosisidosten hydrolyysiin), kun taas sillä on vain pieni lasku aktiviteetissa. Lisäksi isomaltoosin muodostuminen 30 % glukoosista oli mutaation läpikäyneellä

Asnl82—>Ala-glukoamylaasilla ainoastaan 20 % villityyppi- 20 amylaasin aiheuttamasta ja mitattuna NMRsllä ilmeni, että

Asnl82—>Ala vähensi alkunopeuden 80 %:lla verrattuna ... villityyppientsyymiin. 33-1/3 tunnin inkuboinnin jälkeen • · saadun isomaltoosisisällön mutaation läpikäyneen entsyymin • * * *·* ‘ läsnäollessa arvioitiin olevan noin kolmasosa siitä, mikä • « ' • · · ·’·· ‘ 25 oli saatu ekvivalenttisen määrän villityyppientsyymin V*: läsnäollessa. Edelleen saadaan tilastollisesti merkittävä »·· V : glukoosisaannon lisäys mutaation läpikäyneen Asnl82—>Ala- glukoamylaasin avulla verrattuna villityyppi-glukoamylaasiin. Hakija on todennut noin 1 %:n • · 30 glukoosisaannon lisäyksen (1 % jäljellä olevasta 5 %:n .* . saantopotentiaalista, eli 95 %:sta 96 %:in). Hakija on • · · ** * luonut entsyymin, joka lisää glukoosisaannon vähintään 20 %:lla jäljellä olevasta mahdollisesta saannosta. Tämä on :*:*.· aikaansaatu glukoamylaasimutaatiolla, jolla on korotettu :*·.! 35 spesifisyys a-(l—>4)-glukoosisidoksiin erityisesti verrattuna a-(l—>6)-glukoosisidoksiin samalla kun se säilyttää vähintään 75 % entsyymiaktiviteetista perustuen 11 107807 disakkaridimaltoosihydrolyysiin.

Mutaation läpikäynyttä glukoamylaasia voidaan käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä yhdistettynä entsyymiin, joka hydrolysoi ainoastaan a-(l—>6)-glukoosisidoksia 5 molekyyleissä, joilla on vähintään neljä glukosyyli-radikaalia. Erityisesti mutaation läpikäynyttä glukoamylaasia voidaan käyttää yhdistettynä pullulanaasiin tai isoamylaasiin. Isoamylaasin ja pullulanaasin käyttö haarojen poistoon, entsyymien molekyyliominaisuudet ja 10 entsyymien potentiaalinen käyttö glukoamylaasin kanssa on kuvattu kirjassa G.M.A. van Beynum et ai., Starch Conversion Technology Marcel Dekker, New York, 1985, 101-142.

Kuvio 1 esittää Alueiden 1, 4 ja 6 vertailua A. niqer-15 glukoamylaasilla, jolla on rakenteellisia samankaltaisuuksia muiden glukoamylaasien, a-amylaasien, isomaltaasin, maltaasin ja CGTaasin kanssa. Kuten yllä on todettu, tämä kartta hahmottaa perustelut substituointi-strategialle, jota on harjoitettu tämän keksinnön mukaisten 20 uusien entsyymien aikaansaamiseksi.

• « • · · • · « · YY. Kuvio 2 esittää kuvaa A. awamori-qlukoamvlaasin • · · / , mutaatioista kohdissa Serll9, Leul77, Trpl78, Asnl82, 4 » » j Glyl83 ja Serl84. Nukleotidimuutokset on merkitty pienillä *. *: kirjaimilla villityyppisekvenssin yläpuolella. Mutaatiot • «· : 25 asemissa 119, 182, 183 ja 184 ovat tämän keksinnön kohteena.

• 4 • · · • « · • 4

Mutanttigeenien valmistus, villityyppigeenien lähde ja • .* . eristys ja kloonausmenetelmät on kuvattu seikkaperäisesti • · « *· *; julkaisussa Sierks et ai., 1989 (viite 10).

30 Entsyymireagenssit, mutaatioiden rakentaminen käyttämällä :V: kasettimutagenisointia suoritettiin kuten on kuvattu julkaisussa Sierks et ai., 1989 (viite 10). Asnl82—>Ala- « · mutaatio rakennettiin Hpal-Apal-kasettiin käyttämällä nukleotidejä 12 107807 5 ' -ATGGGCCCGGTGTTGCACATTCGTAAG-3 ' ja 5'-GCTGGCTCGTCTTTCTTTACGATTGCTGT-3' ka s ettina j a mutageenisina pöhjustusaineina vastaavasti, sisältäen 15 emäsparin päällekkäisyyttä. Seuraavia oligonukleotidejä 5 käytettiin 119, 183 ja 184-mutanttien rakentamiseksi.

Ser—>Tyrll9 CGG CCG CCC CCA GTA ACC AGT GTA G

Gly—>Lysl83 CGT AAA GAA AGA GCT CTT GTT AAC TTC TTC

Ser—>Hisl84 CGT AAA GAA AGA GTG GCC ATT AAC TTC TTC CCA

Mutantit rakennettiin kuten kuvattiin yllä.

10 Mutaation läpikäyneen entsyymin tuotanto, puhdistus ja kineettinen karakterisointi tehtiin julkaisun Sierks et ai., 1989 (viitteet 10, 11) mukaan.

Plasmidin identifiointi ja menetelmä, jolla ympätään geeni plasmidiin on kuvattu seikkaperäisesti julkaisussa Sierks 15 et ai., 1989 (viite 10). Referenssi kuvaa plasmidin puhdistusta, subkloonausta, sekvensointia ja kasettimutagenisointia. Kuviossa 3 on esitetty kuva plasmidista restriktiopaikkoineen. Referenssi kuvaa • · edelleen geeniekspression ja glukoamylaasientsyymin • · III 20 valmistusta ja puhdistusta.

• » » • « · • 1 ♦ · » *♦· | Kuvio 3 osoittaa erityisesti plasmidin pGAC9 .

« « « ’· '1 Glukoamylaasigeeniä sisältävä plasmidi ympättynä V : hiivakantaan S. cerevisiae C468 talletettiin American Type

Culture Collection:ilia ja identifioitiin numerolla ATCC

25 20690 Cetus Corporationin toimesta 17. marraskuuta 1983.

Tämän plasmidin kasvuun ja ekspressioon hiivassa viitataan / . seuraavassa julkaisussa: Innis, M.A. et ai., (1985) • «· * I Expression, glycosylation and secretion of an Aspergillus glucoamylase by Saccharomyces cerevisiae. Science 228: 21 -30 26.

• · · • · · • · · • ·

Menetelmä, jolla poistetaan plasmidit hiivoista E.coli-replikaatioon, jonka totesimme toimivan pGAC9:lle, on 13 107807 esitetty seuraavassa julkaisussa: Hoffman, C.S. ja F. Winston (1987). Kymmenen minuutin ajan kestävä DNA-preparointi hiivasta vapauttaa tehokkaasti itsenäisiä plasmideja Escherichia coli-transformaatioon. Gene 57: 267-5 272. Sekvenssi pBR322 sallii plasmidin itsenäisen replikaation E. coli:ssa ja sisältää ampisilliinigeenin. Enol promoottori ja terminaattori ovat kaksi enolaasigeenin aluetta, jotka sallivat glukoamylaasigeenin ekspression hiivassa. Leu2 sekvenssi sallii hiivatransformanttien 10 valinnan leusiinivajanaisista ympäristöstä. Hiiva 2μ sekvenssi sallii plasmidin itsenäisen replikaation hiivassa. Pstl, EcoRI, Hindlll, BamHI ja Sali ovat restriktio-endonukleaasin paikkoja.

Menetelmä, jolla tuotetaan glukoamylaasia A. niqer:ista ja 15 A. awamori:sta on kuvattu julkaisussa Pazur et ai. (viite 18). Pazur-julkaisu kuvaa seikkaperäisesti glukoamylaasi-entsyymin tuotannon ja eristämisen, joka on edelleen kehitetty Clarke ja Svenssonin toimesta (viite 19) käyttämällä affiniteettikromatografiaa akarboosi-20 Sepharose:11a.

• · · » • ·

Glukoamylaasi on kaupallisesti saatavissa Novo Nordisk • · A/S:ltä, Bagsvaerd, Tanska; Cultor 0Y:ltä, Helsinki, Suomi; « · * .* . ja Gist-Brocades:ilta, Delft, Alankomaat. Pullulanaasi on • · · *;* ‘ saatavissa Novo Nordisk A/S:ltä. Isoamylaasi on saatavissa • · » 25 Sigma Chemical Corp.:lta, St. Louis, MO, U.S.A.

• · · • · ·

Seuraava kokeellinen aineisto antaa esimerkkejä mutaatioita « · :.'*i läpikäyneen glukoamylaasin selektiivisyydestä ja : aktiviteetista tämän keksinnön menetelmän mukaisesti, jolla / . tuotetaan glukoosia entsymaattisesti tärkkelyksestä.

« · · • · » • · 30 Esimerkki 1 • · • · · • · • · • · !'·· Mutaation läpikäyneiden glukoamylaasien kineettisten parametrien vertailu käyttäen maltoosia, isomaltoosia ja maltoheptaoosia substraatteina.

>07807 14

Tehtiin vertaileva tutkimus Saccharomvces cerevisiae:ssa ekspressoiduilla kuudella mutanttiglukoamylaasilla. Vertailut kuuden mutaatioita läpikäyneen glukoamylaasin kineettisten parametrien kesken tehtiin käyttämällä 5 maltoosia, isomaltoosia ja maltoheptaoosia substraatteina, ja niitä verrattiin villityyppi-glukoamylaasin vastaaviin arvoihin. Villityyppiglukoamylaasi tarkoittaa mutaatiota läpikäymätöntä glukoamylaasia ekspressoituna Saccharomvces cerevisiae:ssa. Koe suoritettiin sen takia, että entsyymien 10 selektiivisyys a-(l—>4)-sidosten (maltoosin) hydrolyysiin tulisi vertailtua a-(l—>6)-sidosten (isomaltoosin) hydrolyysiin.

Aineet ja menetelmät

Entsyymit, reagenssit ja mutaatioiden rakentaminen 15 kasettimutagenisointia käyttäen tehtiin kuten yllä on kuvattu (viite 10). Leul77—>His- ja Trp—>178 Arg-mutaatiot rakennettiin SnaBI-Hpal-kasetissa kuten aikaisemmin on kuvattu (viite 11) nukleotideilla 5'-ATAGTTAACTTCTTCCC AGTGATCATATCCTGTCTG-3' ja vastaavasti ...: 20 5 ' -ATAGTTAACTTCTTCGCGG-AGATCATATCCTGTCTG-3 ' . Asnl82—>Ala- • 4 .···, mutaatio rakennettiin Hpal-Apal-kasetissa käyttämällä 4 1 nukleotidejä !2.' 5 ' -ATGGGCCCGGTGTTGCACAGCAAT-CGTAAAG-3 ' ja vastaavasti : 5' -GCTGGCTCGTCTTTCTTTACGATTGCTCT-3' kasettina ja

• t I

25 mutageenisinä pöhjustusaineina, sisältäen 15 emäsparin *»1 ' päällekkäisyyttä (viite 21). Seuraavia oligonukleotidejä käytettiin 119-, 183- ja 184-mutanttien rakentamiseksi.

« 1 • ·» * ♦

Ser—>Tyrll9 CGG CCG CCC CCA GTA ACC AGT GTA G

.·! : Gly—>Lysl83 CGT AAA GAA AGA GCT CTT GTT AAC TTC TTC

• ' 1/. 30 Ser—>Hisl84 CGT AAA GAA AGA GTG GCC ATT AAC TTC TTC CCA

• · ·

Mutantit rakennettiin kuten kuvattiin yllä.

2 • · • · · • · · m ·

Mutaation läpikäyneiden entsyymien tuotanto, puhdistus ja kineettinen karakterisointi suoritettiin kuten oli kuvattu 15 107807 julkaisussa Sierks et ai., 1989 (viite 10). Tulokset Taulukossa V oli saatu 119-, 183- ja 184-mutanteillä, joissa glukoamylaasiaktiviteetti määritettiin yllä kuvatulla tavalla paitsi 45°C:ssa.

5 Tulokset ja niiden arviointi

Kuusi mutaatiota, Serll9—>Tyr, Leul77—>His, Trpl78—>Arg ja Asnl82—>Ala, Glyl83—>Lys ja Serl84—>His rakennettiin kloonattuun A. awamori-alukoamvlaasiqeeniin kasetti-mutagenisoinnilla ja ekspressoitiin S. cerevisiae:ssa.

10 Taulukossa I ja V on esitetty tuloksia kineettisistä tutkimuksista kuudella mutaatiolla käyttäen maltoosia, maltoheptaoosia ja isomaltoosia substraatteina. Tulokset yllä tuottivat selektiivisyyttä mutanteille asemissa 119, 183 ja 184, jotka on kuvattu Taulukossa VI.

15 Leul77—>His-mutaation kcat-arvot laskivat myös kaikille kolmelle substraatille verrattuna villityyppi-glukoamylaasiin, isomaltoosin osalta enemmän kuin ...j kymmenkertaisesti ja maltoosin ja maltoheptaoosin osalta .···. viisinkertaisesti. KM-arvot kasvoivat vähemmän kuin 50 % -20 maltoheptaoosin ja isomaltoosin osalta mutta kolmin-.* . kertaisesti maltoosin osalta. Isomaltoosihydrolyysin 4 I · *** * selektiivisyys maltoosihydrolyysiin verrattuna oli taas • · · ’· suhteellisen muuttumaton verrattuna siihen, mitä se oli « ·* ’ villityyppientsyymin kohdalla, kun taas maltoheptaoosi- 25 hydrolyysi verrattuna maltoosihydrolyysiin oli • » s/·· kaksinkertainen. Vaikka alifaattisen ja hydrofobisen

Leul77jn korvaaminen aromaattisella ja hydrofiilisella .·! ; His:llä tuskin vaikutti maltoosin selektiivisyyteen • · * verrattuna isomaltaasin selektiivisyyteen, sekvenssi- • « 30 samanlaisuudet viittavat siihen, että hydrofobisen • · V,: aromaattisen renkaan, joka on löydetty tässä asemassa J^·.; kaikkien α-amylaasien kohdalla paitsi Taka-amylaasi A:ssa, pitäisi lisätä sitä.

16 107807

Trpl78—>Arg-xnutaation Kcat-arvot laskivat 5 - 8 -kertaisesti näille kolmelle substraatille verrattuna villityyppi-glukoamylaasiin. KM-arvot laskivat lievästi maltoosille ja nousivat lievästi maltoheptaoosille 5 verrattuna villityyppi-entsyymiin. Isomaltaasin KM-arvo nousi kuitenkin enemmän kuin kaksinkertaiseksi, mikä johti maltoosin selektivisyyden kaksinkertaistamiseen isomaltaasi-hydrolyysiin verrattuna. Selektiivisyys maltoheptaoosiin verrattuna maltoosipilkkomiseen oli 10 muuttumaton.

Asnl82—>Ala-mutaation kcat-arvot laskivat lievästi jokaiselle näille kolmelle substraatille verrattuna villityyppi-glukoamylaasiin, mutta ei läheskään siinä määrin kuin muiden mutaatioiden kohdalla. Maltoosin KM-arvo 15 laski lievästi, maltoheptaoosin arvo nousi lievästi ja isomaltoosin arvo kaksinkertaistui. Nämä sidosmuutokset heijastuivat maltoosiselektiivisyyden enemmän kuin kaksinkertaiseen nousuun isomaltoosipilkkomiseen nähden verrattuna villityyppi-glukoamylaasiin sekä 20 maltoheptaoosiselektiivisyyden merkittävään laskuun :**: verrattuna maltoosihydrolyysiin.

/* * « · *·» .*·’· Trpl78—>Arg- ja Asnl82—>Ala-mutaatiot johtivat toivottuun 0 ί maltoosiselektiivisyyden nousuun verrattuna ; isomaltoosihydrolyysiin, joskin edelliseen liittyi paljon ·;** 25 suurempi kcat-arvojen pudotus näille kolmelle substraateille i » * kuin jälkimmäisen osalta. Nämä kaksi mutaatiota . . pohjautuivat substituutioihin, joiden tarkoitus oli tehdä • · · *'e/ glukoamylaasin aktiivinen paikka enemmän samankaltaiseksi • · · * kuin aktiivinen paikka sellaisilla amylaaseilla, joilla ei 30 ole kykyä hydrolysoida a-(l—>6) -D-glukoosisidoksia. Koska • « ...·· nämä kaksi mutaatiota vaikuttivat eri tavoin maltoosin ja /. isomaltoosin sidokseen, kun taas k__fc-arvot pienenivät • * * '-'öu *·**’ määrällisesti samassa suhteessa kaikille kolmelle 4 · * ^ substraatille Trpl78 ja Asnl82 vaikuttavat alipaikkaan 2 35 sellaisella tavalla, että ne vaikuttavat toisiinsa vahvemmin maltoosin kuin isomaltoosin kohdalla.

17 107807

Seri19—>Tyr-mutantin kineettiset parametrit osoittivat ' hieman korkeamman kcat-arvon ja alemman KH-arvon maltoosille ja hieman korkeamman kcat-arvon ja kaksinkertaisen Κ,,,-arvon isomaltoosille. Tämä johti maltoosin osalta enemmän kuin 5 kaksinkertaisesti korotettuun spesifisyyteen verrattuna isomaltoosiin. Glyl83—>Lys-mutantti osoitti lievästi korotetun kcat-arvon ja pienennetyn KM-arvon maltoosilla ja korotetut kcat- ja KM-arvot isomaltoosille, mikä johti selektiivisyyden lievään nousuun. Lopuksi Serl84—>His-10 mutantti myös nosti kcat- ja vähensi KH-arvon maltoosille, mutta vaikutti vain vähän isomaltoosin kineettisiin parametreihin. Tämä aiheutti tälle mutantille suhteellisen spesifisyyden nousun, joka oli juuri alle kaksinkertainen.

Yllä kuvatut tulokset osoittavat, että kaikki sekvenssi-15 homologiaan perustuvat mutaatiot (asemat 119, 178, 182, 183 ja 184) a-(l—>4)-entsyymeillä johtivat korotettuun maltoosihydrolyysiselektiivisyyteen, ja kaikilla mutaatioilla asema 178:n mutaatiota lukuunottamatta oli ainoastaan lievästi alennettu joskaan ei parempaa 20 aktiviteettiä. On hyvät perustelut sille, että mutaatiot * » ... näissä kahdessa alueessa yhtä hyvin kuin kolmannessa « · *** samankaltaisuus-alueessa (Alue 6) aikaansaavat myös . I · ***/ selektiivisyyden lisääntymistä. Tämä todistaa myös, että • · » ·«· · hakijan valitsemat aminohapot eivät välttämättä ole ainoat « » *· *t 25 eivätkä parhaat valinnat tietyssä paikassa, koska «·· V · lukuisissa tapauksissa useampi kuin yksi aminohappo olisi voinut tulla poimituksi. Tämä antaa tärkeät perustelut 2*\j päätellä, että mikä tahansa mutaatio näissä kolmessa »’Vt alueessa ja mikä tahansa aminohappo yhdessä näistä .* . 30 paikoista kuuluu tämän keksinnön suojapiiriin.

• » · « * *

Mutaatiot osoittavat, että on mahdollista ennustaa « * : toiminnallisia muutoksia entsyymiaktiviteetissa kokonaan ·’·.· homologian perusteella entsyymeillä, joilla ei ole • * tunnettua kolmiulotteista rakennetta, mutta joilla on 35 toiminnallisia eroja, joita voidaan korreloida tunnettuihin 18 107807 toiminnallisiin radikaaleihin.

Esimerkki 2

Kondensaatiotutkimuksia Asnl82—>Ala- ja villityyppi-glukoamylaaseille 5 Korkeilla glukoosipitoisuuksilla glukoamylaasit katalysoivat kondensaatioreaktioita ja isomaltoosi on merkittävin akkumuloitu tuote. Seuraava koe vertailee Asnl82—>Ala- ja villityyppi-glukoamylaasin kondensaatioreaktioiden katalysointia.

10 Inkuboitiin 30 paino-% lähtöglukoosipitoisuus 0.1 M

natriumasetaattipuskurissa deuteriumoksidissa pH:ssa 4.5 lämpötilassa 35°C. Asnl82—>Ala- ja villityyppientsyymin pitoisuudet olivat 10 ja vastaavasti 5 mg/ml. Tuotemuodostuksen nopeus edustaa isomaltoosin ja 15 isomaltotrioosin summaa määritettynä *H NMR- spektrometrisesti 500 MHz:11a mitattuna 4.94 ppm:lla Bruker AM 500 spektrometrillä.

« • · · · • · .·**. Kuviossa 4 o edustaa Asnl82—>Ala- ja + villityyppi-« « · entsyymiä. Korjattuna entsyymipitoisuuksien eroja 20 huomioiden, lähtösuhde nopeuksille, millä muodostuminen a- i- · · (1—>6):sidoksista a-(l—>4):sidoksiin tapahtuu, on Asnl82- • « · *..* ->Ala-mutantille 22 % villityyppiglukoamylaasin arvosta « » · *·* käyräsovituksella määritettynä (viite 22).

• * *.'·: Tiedot osoittavat, että isomaltoosimuodostumisen alkunopeus • « « V · 25 Asnl82—>Ala-mutantilla katalysoituna laski * : viisinkertaisesti verrattuna villityyppi-glukoamylaasiin, • · kuten näkyy kuviosta 4. Tämä johtuu isomaltoosin • · • välimuotokompleksin spesifisestä destabiloitumisesta. Tämä • · · koe esittää vaikutusmekanismia, millä mutanttientsyymi • » ·.*·· 30 saattaa nostaa konsentroidusta tärkkelysliuoksesta saadun glukoosisaannon yli 95 %, joka tavallisesti saavutetaan.

19 107807

Kuudenkymmenen tunnin inkubaatioajän jälkeen villityyppi-glukoamylaasin tuottama isomaltoosin ja isomaltotrioosin kokonaispituus lähestyi tasapäinoarvoansa (noin 0.14 M), kun taas kaksinkertaisen Asnl82—>Ala-mutanttimäärän 5 tuottama kokonaispitoisuus oli vähemmän kuin 0.1 M.

Esimerkki 3

Asnl82—>Ala mutaation läpikäyneen entsyymin ja mutaation läpikäymättömän entsyymin vertaileva tutkimus glukoosisaantoa silmälläpitäen 10 Seuraavat kokeet vertailevat glukoosisaannon (glukoosipitoisuus, g/L) seuraavilla entsyymeillä: luonnollinen glukoamylaasi Aspergillus niqer:ista sekä haaroja lohkaisevilla entsyymeillä että ilman sellaisia; villityyppiglukoamylaasi Saccharomvces cerevisiaersta sekä 15 haaroja lohkaisevilla entsyymeillä että ilman sellaisia; ja Asnl82—>Ala-glukoamylaasi Saccharomvces cerevisiae:sta sekä haaroja lohkaisevilla entsyymeillä että ilman sellaisia. Kuten on todettu yllä, niitä kahta haaroja ;··· lohkaisevaa entsyymiä, joita käytettiin, pullulanaasia ja .*··. 20 isoamylaasia, on jo rajoitetussa määrin käytetty tähän tarkoitukseen. -Mikään haaroja lohkaiseva entsyymi ei pysty • · · .* . hydrolysoimaan a-(l—>6)-sidoksia substraateilla, joilla on I vähemmän kuin noin neljä glukosyyliradikaalia. Entsyymit • · » eivät siten pysty hydrolysoimaan isomaltoosia, jolla on • · · *·* ’ 25 ainoastaan kaksi glukoosiradikaalia.

• · ·*.’·: Glukoosin ja isomaltaasin välinen tasapaino säilyy • · · · muuttumattomana. Tämä tapahtuu käytetystä entsyymistä .·. : riippumatta. Koska tasapaino määräytyy yksinomaan reaktion • »· termodynamiikan perusteella, muutos suhteellisessa 30 nopeudessa, millä kaksi glukoosimolekyylia muodostuu • · isomaltoosin hydrolyysista tulee täsmäämään samaan • · suhteelliseen muutokseen nopeudessa, millä isomaltoosi muodostuu kahden glukoosimolekyylin kondensaation seurauksena. Tämä on riippuvainen systeemin mikros- 20 107807 kooppisesta palautuvuudesta.

Materiaalit ja menetelmät

Saccharomvces cerevisisae-hiivakantaa, jolla oli glukoamylaasia Aspergillus awamori:sta, jolloin 5 glukoamylaasi oli joko läpikäynyt mutaation (Aspl82—>Ala) tai ei ollut läpikäynyt mitään mutaatiota (kutsuttu villityypiksi), viljeltiin 30°CiSsa 72 tunnin ajan kymmenen litran erissä 19 litran Lab-Line Bioengineering fermentorissa Iowa State University Facility:ssä.

10 Elatusaine sisälsi alussa 2 % glukoosia, 1.7 g/L

hiivatyppiemästä, 5 g/L ammoniumsulfaattia, 100 mg/L L- histidiiniä mutta ei yhtään leusiiniä. Koska plasmidi, joka kantoi glukoamylaasigeenin, koodasi L-leusiinin tuotantoa kun taas emohiivakanta ei tehnyt sitä, jätettiin L-leusiini 15 pois elatusaineesta. Elatusaine pidettiin pH:ssa 4.5 lisäämällä ammoniumhydroksidia. Lisättiin ilmaa elatusaineeseen niin, että happi pysyi 80 %:n kyllästysasteessa. Glukoosia lisättiin ajankohtina 27, 52, ja 60 h jotta sen pitoisuus palautuisi 2 %:in tai sitä ;··· 20 lisättiin vain kerran ajankohtana 48 h, tässäkin .···. tapauksessa 2 %:in, jotta glukoosipitoisuuden vaikutusta • · · glukoamylaasisaantoon voitaisiin tutkia.

• · « • 1 • 1 · • · · | Viljelyliemi suodatettiin ultrasuodatusmembraanilla ja • ·« *,.1 otettiin talteen kirkas supernatantti, joka sisälsi • · · *·1 ‘ 25 viilityyppiglukoamylaasin tai mutaation läpikäyneen glukoamylaasin. Talteenotetut supernatantit konsentroitiin # · ultrasuodatuksella 100 mL:aan, lyofilisoitiin, liuotettiin • · » : uudestaan, dialysoitiin ja syötettiin DEAE-Fractogel- .·. : pylvääseen, joka eluoitiin joko portaattomasti laskevalla 30 pH:11a tai portaattomasti nousevalla natriumkloridilla.

• ·

Fraktiot, jotka sisälsivät glukoamylaasiaktiviteettia, • · laskettiin pylvääseen sisältäen Sepharose-kytkettyä akarboosia, pseudo-tetrasakkaridi, joka spesifisesti inhiboi glukoamylaasia. Glukoamylaasi-akarboosi-kompleksi 35 hajotettiin 1.7 M Tris-eluentilla (viite 19).

21 107807

Puhdistetut glukoamylaasinäytteet, jotka olivat lähtöisin kolmesta tyypistä, viljeltiin DE15-dekstriinissä pH:ssa 4.5 ja 35°C:ssa 120 tunnin ajan. Kolme tyyppiä olivat 1) A. awamori-glukoamvlaasi, joka oli saatu Miles 5 Laboratories:lta, Elkhart, IN, USA, jolla oli glukoamylaasi I-muoto (sama kuin se, joka oli tuotu S. cereviviae:en ympätyllä glukoamylaasigeenillä), eristettynä pylväskromatografisesti ja käytännöllisesti katsoen puhdistettu homogeenisuuteen, 2) villityyppi-glukoamylaasi, 10 joka oli tuotettu hiivafermentaatiolla ja 3) mutaation läpikäynyt glukoamylaasi (Aspl82—>Ala), joka oli tuotettu samalla tavoin. Jokainen näistä kolmesta glukoamylaasi-tyypistä inkuboitiin kolmella eri tavalla: joko yksin pitoisuudessa 4.5 IU/mL, pitoisuudessa 4.5 IU/mL 4.5 15 IU/mL:11a pullulanaasia ja pitoisuudessa 4.5 IU/mL 4.5 IU/mL:11a isoamylaasia. Kaikki entsyymiaktiviteetit mitattiin kansanvälisissä yksiköissä (IU) isoamylaasia lukuunottamatta, jonka kohdalla yksikkö oli määriteltynä valoabsorbanssin lisäämisellä 0.1:llä 60 nM:ssä 10 mm:n 20 kyvetissä tunnin kestävän riisitärkkelyksen hydrolyysin :**: jälkeen ja käyttämällä redusoivan sokerin määritystä.

.·*·. Kaikissa yhdeksässä kokeessa mitattiin glukoosipitoisuus spektrofotometrisesti glukoosioksidaasi-hapetuksen jälkeen.

• · · • · « · · • · · *Γ* ! Tulokset • » » • · · • · • · · • · · *·* 25 Parhaat tulokset saatiin kun glukoosipitoisuuden annettiin laskea nollaan ajankohdan 20 h läheisyydessä ja kun se pysyi siinä ajankohtaan 48 h asti. Ajankohdassa 48 h • * · : glukoosia lisättiin, jotta pitoisuus palautuisi takaisin 2 : %:in. Glukoosipuutteen aikana hiiva luultavasti kasvoi • · · 30 hiivatyppiemäksessä olevilla orgaanisilla aineilla, koska • · ei havaittu mitään kasvunopeuden laskua. Glukoamylaasi- • * tuotanto käynnistyi kun glukoosipitoisuus saavutti nollan.

♦ · • · · • · · • «

Tavallisesti puhdistetaan glukoamylaasi laskemalla se DEAE-Fractogel-pylvään läpi laskevalla lineaarisella pH- 22 107807 gradientilla 6 - 3. Mutaation läpikäynyt entsyymi ei kuitenkaan adsorboitunut hyvin näissä olosuhteissa, koska suuri osa poistui huokostilavuuteen. Sen takia se puhdistettiin pH:ssa 6 käyttämällä lineaarista 5 suolagradienttia 0.0:sta 0.4:än M natriumkloridia. Saatiin ainoastaan yksi glukoamylaasipiikki tällä pylväällä ja pylväällä, joka oli pakattu Sepharoseien kytketyllä akarboosilla, jossa akarboosi on potentiaalinen glukoamylaasi-inhibiittori.

10 Taulukkojen II-IV mukaan glukoosisaannot olivat korkeimmillaan kun dekstriini hydrolysoitiin 35°C:ssa ja pH:ssa 4.5 ja kun glukoosimylaasi oli sekoitettuna joko pullulanaasiin tai isoamylaasiin, joka nopeasti lohkaisi substraattimolekyylien a-(l—>6)-sidokset, jolloin se antoi 15 glukoamylaasille mahdollisuuden hydrolysoida jäljellä olevat a-(l—>4)-sidokset nopeammin. Tämä käyttäytyminen on havaittu muiden toimesta ja seoksia käytetään tosiaan usein kaupallisesti. Mutaation läpikäynyt glukoamylaasi antoi hieman korkeamman saannon kuin luonnollinen A. awamori- 20 glukoamylaasi tai hiiva-villityyppiglukoamylaasi, ja erot olivat tilastollisesti merkittäviä. Glukoosi-pitoisuuksien .··*. huiput saavutettiin lähellä ajankohtaa 60 h samalla tavoin .*··. kuin glukoosin teollisessa valmistuksessa glukoamylaasilla> • * · joka kuitenkin tapahtuu 60°C:ssa mieluummin kuin 35°C:ssa.

• · · • · · · • · • * · 25 Taulukoiden II, III, ja IV vertailussa on merkityksellistä, että glukoamylaasi Asnl82—>Ala-mutantti yksin (ilman haaroja lohkaisevaa entsyymiä) aiheutti glukoosituotannossa • · :.*·· merkittävän nousun verrattuna luonnolliseen tai V · villityyppi-glukoamylaasiin, joka nousu oli 1 % yhdessä » .·. : 30 setissä reaktio-oloja. Käyttämällä tämän keksinnön mukaista | menetelmää saadaan siis merkittävä glukoosisaannon nousu . yksikköä hydrolysoitua tärkkelystä kohti suhteessa saantoon, joka saadaan inkuboimalla tärkkelystä ja/tai vastaavia oligo- ja polysakkaridimolekyylejä mutaatiota 35 läpikäymättömän glukoamylaasin kanssa, jolla on Asn aminohappoasemassa 182.

23 107807

Yllä annetut tiedot osoittavat, että glukoamylaasi-entsyymi, jolla on Asnl82—>Ala-mutaatio, johtaa entsyymiselektiivisyyden nousuun a-(l—>4)-sidosten suhteen verrattuna a-(l—>6)-sidoksiin samoin kuin 5 glukoosituotannon 1 %:n nousuun. Jopa marginaaliset parannukset, jotka glukoosisaannossa ylittävät 95 %:n ovat, kaupallisesti merkittäviä.

Hakija on osoittanut, että pullulanaasin tai isoamylaasin lisäys glukoamylaasiin aina johtaa nopeammin maksimaalisen 10 glukoosisaannon saavuttamiseen. Pullulanaasin lisäys antaa hieman korkeamman maksimisaannon kuin glukoamylaasi yksin, todennäköisesti siitä syystä, että haaroja lohkaisevat entsyymit nopeasti lohkaisevat a-(l—>6)-sidokset, jotka estävät glukoamylaasia hydrolysoimasta a-(l—>4)-sidoksia. 15 Isoamylaasin lisäys oli vähemmän tehokas glukoosin maksimisaannon nostamisessa, ja molemmat tulokset tukevat muiden tekemiä havaintoja tällä alalla.

Asnl82—>Ala-mutanttiglukoamylaasi antoi hieman korkeampia :··· maksimisaantoja kuin luonnollinen tai villityyppientsyymit, .·*·. 20 jolloin luonnollinen entsyymi ja villi tyyppi-entsyymi • · · luultavasti olivat identtisiä keskenään villityyppi- • * · entsyymissä olevaa, S. cerevisiaern (viite 20) lisäämää • · · *!’! lisä-glykosylaatiota lukuunottamatta. Mutanttientsyymi pullulanaasin tai isoamylaasin kanssa antoi korkeamman *·* * 25 saannon kuin luonnon entsyymi tai villityyppi-entsyymi yhdistettynä pullulanaasiin tai isoamylaasiin.

• · · « · • · · : Yhteenvetona voidaan todeta, että tämän keksinnön .·, : menetelmän mukaisesti käytettyinä yllä mainitut • « · * mutanttiglukoamylaasientsyymit antavat korkeamman 30 glukoosisaannon hydrolysoitua tärkkelysyksikköä kohti *.·.* verrattuna saantoon, joka on saatavissa inkuboimalla • » tärkkelystä ja/tai vastaavia oligo- tai polysakkaridimolekyylejä mutaation läpikäymättömän glukoamylaasin läsnäollessa, joten tämä edustaa 24 107807 kaupallisesti arvokasta keksinnöllistä menetelmää.

Lisäksi koeaineisto osoittaa, että entsyymien perusrakenteen vertailu ja informaation käyttö toiminnallisiin radikaaleihin voi johtaa siihen, että 5 pystytään ennustamaan muutettu muoto, joka on seurauksena aminohappokorvauksesta.

• · · 1 • · • · ··· • « · • · « • · · * · • « · • ♦ ♦ ··# · « · · • ♦· • · • · · • · · • · » • · • · » • «i « « • · · • · « • · » • · • ♦ · • ·· • · • · • ♦ • · · • · · m « • ♦ « · · • · · « · 25 107807

Referenssilista 1. Tanaka, Y. et al, (1986) Comparison of amino acid sequences of a glucoamylase from Aspergillus saitoi with 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4)-ethyl carbodiimide. J.

5 Biochem., 91, 125 - 133.

2. Itoh, T., et al., (1987) Nucleotide sequence of the glucoamylase gene GLU1 in yeast Saccaromvcopsis fibuligera.

J. Bacteriol., 169, 4171 - 4176.

3. Hiromi, K., (1970) Interpretation of dependency of rate 10 parameters on the degree of polymerisation of substrate in enzyme-catalyzed reactions. Evaluation of subsite affinities of exo-enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun., 40, 1-6.

4. Savel'ev, A.N. et al., (1982) Carboxyl groups in active 15 site of glucoamylase from Aspergillus awamori. Biochemistry (USSR), 47, 1365 - 1367.

·”·* 5. Tanaka, A. et al., (1983) Fraktionation of isoenzymes :***: and determination of the subsite structure of glucoamylase • · · ·*·’: from Rhizopus niveus. Agr. Biol. Chem., 47, 573 - 580.

• · · • « « ,·. : 20 6. Koyama, T. , et al., (1984) Subsite affinity of the • · · #···* glucoamylase from Aspergillus saitoi. Chem. Pharm. Bull.

32, 757 -761.

• « *· *: 7. Meagher, M.M. , (1989) Subsite mapping of Aspergillus • · · ’.* * niqer glucoamylases I and II with malto- and 25 isomaltooligosaccarides. Biotechnol. Bioeng., 34, 681 - .1..: 688.

• · • · • · · *·*·* 8. Svensson, B. , (1988) Regional Distant Sequence Homology • ·

Between Amylases, α-glucosidases and transglucanosilases. FEBS Lett., vol. 230, p. 72 - 76.

26 107807 9. Nikolov, Z.L., et al., (1989) Kinetics, equilibria and modeling of the formation of oligosaccarides from D-glucose with Aspergillus nicer glucoamylases I and II. Biotechnol. Bioeng., 34, 694 - 704.

5 10. Sierks, M.R. et al., (1989) Site-directed mutagenesis at the active site Trpl20 of Aspergillus awamori glucoamylase. Protein Eng., 2, 621 - 625.

11. Sierks, M.R et al., (1990) Determination of Aspergillus awamori.glucoamylase catalytic mechanism by site-directed 10 mutagenesis at active site Aspl76, Glul79 and Glul80. Protein Eng., lähetetty julkaistavaksi.

12. Pazur, J.H. et al., (1967) Carbohydr. Res., 4, 371.

13. Watanabe, T. et al., (1969) Starke, 21, 18.

14. Watanabe, T. et al., (1969) Starke, 21, 44.

15 15. Hehre, E.J. et al., (1969) Arch. Biochem. Biophys., ;··; 135, 75.

• « · • · - 16. Pazur, J.H. et al., (1977) Carbohydr. Res.,58, 193.

« « I

• · « · · • · · *Γ] I 17. Svensson, B. et al. , (1983) The complete amino acid

* M

20 sequence of the glycoprotein, glucoamylase Gl, from « · ♦ *·* ‘ Aspergillus niaer. Carlsberg Res. Commun. , 48, 529 - 544.

« · 18. Pazur, J.H. et al., (1959) J. Biol. Chem., 234, 1966.

« « · • · · <a · · : 19. Innis, M.A. et al., (1985) Expression, Glycosylation « * · ....: and Secretion of an Aspergillus glucoamylase by * · 1

Saccaromyces cerevisiae. Sciences, 228, 21 - 26.

» · * · · « « « • · • · V·· 20. Sierks, M.R. et al., (1990) Catalytic Mechanism of

Fungal Glucoamylase as Defined by Mutagenesis of Aspl76, Glul79 and Glul80 in the Enzyme from Aspergillus awamori.

27 107807

Protein Eng., voi. 3, 193 - 198.

21. Sierks, M.R., (1988) Mutagenesis of the Active Site of Glucoamylase from Aspergillus awamori. Ph. D. väitöskirja, Iowa State University.

5 22. Svensson, B. ja Sierks, M.R., julkaisemattomat tiedot.

• · * · • « « • · • · <»» *»« • * * ft · ♦ « ft • « · * · » • * « · • · f · * * »« f ♦ · ft * ♦ ·« · « · • « · ft ft · ft · ft • * ft « ft · • • · ft ft * • · · « · « · · ft · • * • ft · ft ft · • « · • · ft · « · ft ft »· # · 107807 28

Cj a ^ S " o a “1 ~ o o r» O Sj· O O rv O O <r ID ”v ' j-1 , 44 44 -H *4 44 44 Ι/Ί <Ö r-*. m •j—^ i—i n «N CO ~+

H η »«Γ O O

^ ^ ^ ·-* CD O O O vo O r* o • as oh n < «s *** ^ S3 +J Λ O -r —.

φ JJ fn -» O O —< CQ <ti < O O ·α © o Ό*

•H iH

44 *H ♦* -M Ή -M CD

»W «ή r«* o m (D ® co o*» ©

<D03c ^ ^ ^ ^ O

Gflj «* ^^03 W-1 © o o -T © o O

•H tÖ < *· >own no m * rH w 2 >1 ~ C S *·

.Lj 5 — 0D <~v O

n «J — rs -JO OVO

n o »e - · .

v. O O O O O *5 44 44 44 44 44 44 t-- H H ? cr.

0 dn _ “S

tL ® <» O

H r. no rv rv no .r^O

Ό ·Η — ao vt rv vo rv O — O

S- U “· ... · ·

fydj1- *-·*" — o © ri O 1*1 O rv O

ÄwH» — Ό r- νΛ r"i 6 ~ e <a _ — •HS Ξ to (0 o Q_W —.«-1 to O O r» 0· = OO OO θ' un -P , r-| * +Ι·Μ· +· Ή *l Ή —

g 3 o S

6 ft <1 m O

0 ft d ^ O -v O

tn S, 2 ^ n ^ n ®^°.

•H >1 -J ex o v» O m Οσ>0 O O

• 4J — vi -f — vn ·**· (0 ·Η — «n

-I—tl—I

r-i ^ Λ *,t,'C‘H — — — • ♦ · *H ^ * ''"ft 1 w 1 ^ • ••tO tdr— W « » O <0 I w l pv t

• •Of-1 X . X tj X

···— a *> — a — — a •••Cu --- tn_. -W _ _ W ^ --- 4-4 1-4 ’** · -P 1 CJ l Oi ,i r. rv rv u ,v. : λ·η o *» — x ow'-x^'rt'-xutj o — *.·· ffl+J - v ϊ 5i o - 5 Ϊ ^ ^ ~ .·:*. oc g m ^ ~ - S * ~ *χ • · · ij JS 2 UXU 2 U X U —i <J X <J N -N X ^ • ιϊΐ O p J< — Jt ii Jt <fl _Si Si Ji 44 4> “ “ r-t+J +J 0 C «Λ*< cd d ^ ϋ δ _*υ ^ ^ se s o ® • « <y ^ * · ♦ ^ , s **

* * * **· 4-J

• * C -H

.·;·. -h h

·,· · to +J

. O O) . . O g i ··: +j «u • · I-1 5-1 ••••: s s • •aa • # * v-i # « ·

* \ O

: ·.: λ ♦ . ^ 3

•H

3 cd E-< 29 107807

Taulukko II Glukoosituotanto DE15 dekstriinistä luonnollisen

Aspergillus niger-glukoamylaasin avulla ilman haaroja lohkaisevia entsyymejä ja niiden kanssa.

x

Glukoosipitoisuus, g/L

Kulunut Glukoamyiaasi Glukoamylaasi Glukoamylaasi aika, h + Pullulanaasi + Isoamylaasi ~Έ 172, 182, 190 205,213,227 202,211,225 25 215,231,233 237,251,259 239,243,247 30 236,241,252 252,270,273 246,248,271 36 245,260,278 266,279,280 260,267,274 46 263,277,282 279,285 282,287 51.5 281,288 285,295 284,291 57.5 287,291 279,289,291,301 286,290,297 61.5 277,285,290 289,294 286,294 70.5 279,285,285,291 283,287· 280,294 78 274,282,284 280,285 279,291 * Ι·Μ 83 J 280,284 282,290 285,291 « · * 1 /S1. 96 279,279,285 277,289 279,287 104.5 279,282 279,283,284,287 274,280,283,292 I 1 *·'1: 120 274,280 275,280,281,285 276,282 * 1 m ----- --— . .

* 1 1 2 " " 1 - ’ 1 11 - - - - -

Maks. glukoosi, g/L 287.7 ±4.1- 291.3 ±4.11 -90.7 ±45' SS: h 63.1 59.6 63.9 «. 1 · « I » » .Kulmakerroin 7 0 h:n -0.123 ± 0.0602 -0.086 ± 0.0582 -0.164 ± 0.099“1 J^.Jjälkean, g/L h ··«·1 — .. . . . _ _ .. - . _ - - - — - — • · ·1·. 1 95 % varmuusraja • 1 t * 1 » 2 Keskivirhe * 1 · • ·» 2 • 4 30 107807

Taulukko III Glukoosituotanto DE15 dekstriinistä Saccharomvces cerevisiae-villitvvppiqlukoamvlaasin avulla ilman haaroja lohkaisevia entsyymejä ja niiden kanssa.

Glukoosipitoisuus, g/L

Kulunut Giukoamyiaasi Glukoamylaasi Glukoamylaasi aiica, n + pullulanaasi + Isoamylaasi ~~12 171, 180 190,196 182, 192 25 218,220 231,245 214,236 30 230,243 241,249 231,235 36 249,269 243,257 257,263 46 266,280 264,286 256,284 51.5 270,286 289,301 270,289 57 J 267,303 288,292 280,289,292 61.5 284,292 288,290 281,287 70.5 278,285,292 276,288,300 279,290 . 78 284,288 274,274,280 281,285 «««« .···. 83.5 272,278 280,289 280,284,291 • · • · · :T: 96 280,286 280,284 276,279,285 104.5 277,282 283,284 275,279,280,281 • 1 • · · 120 278,279,283 278,281,284 278,282,286 • · · • · · _____ __ ------—- __ — — _________— . Saks. glukoosi, g/L 288.3±6.11 288.6±52“ 286.8±6.0- • · · ·# aika, h 66.4 62.5 67.3 •'· · maks .

Tsilmakerroin 70 h = n -0.088 ±0.075- -0.««±0.098~ JD.08S ±0.066" * jälkeen, g/L h - * 95 % varmuusraja • · · 31 107807

Taulukko IV Glukoosituotanto DE15 dekstriinistä Saccharomvces cerevisiae-Asnl82—>Ala-glukoamylaasin avulla ilman haaroja lohkaisevia entsyymejä ja niiden kanssa.

Glukoosipitoisuus, g/L

Kulunut Glukoamylaasi Glukoamylaasi Glukoamylaasi aika, h + Pullulanaasi + Isoamylaasi 12 189, 194 229“. 235* 201,241- 25 229,247 237,2L7 233,233 30 247,252 252.262 257.269 36 258,276 2S0,286 259.280 46 261-, 266“ 271“, 310“ 286,293 51.5 288,292 289,299 286.293 57.5 289,294 291,299 287.292 61.5 280,289 279,285,289,295 280.286 70.5 280,288 281,287 275,289 78 281,287 277,289 283.290 « · * · « · .··♦. 83.5 283.287 276,288 279.286 • ·» 96 279,284 279,284 276.284,285.287 II: 104.5 282,284 273,285,291 284,286 • · no 276,280,284 279,285,291 279,283 • · « • · · ^ I - » ~ —^» • l_l ,¥kS. glukoosi, */1,290.7 ±4.3” 293.0±5.7** 29t.2±5.4-* » · · *;#aika, h 616 58-5 ' 60.6 : jnpks.

/Kulmakerroin 70 h:n -0.088 ± 0.05 1 0.029 ± 0.093“““ -0.033 ± 0.0S 1 “““ •.‘^jälkeen, g/L h • ______________ ____ • m · · · _ - - 1 — . i . i . i- .

• « Il II Il — ,·,·.* Ei käytetty epälineaarisessa regressiossa ·.·.·** 95 % varmuusraja • .*** Keskivirhe » i « • · * • · 32 107807

CN C"| CN CN

2 ώ ώ ώ ώ . ' οι ιο ό c; •H g - ^ n tn — γ-~ »— —

O

o —----- S *> % 2 n ^ ^

m S

O X g r-, Ό n cn :<0 · O ____________

Co·· tn

T* £ H cc m O

>i:(0 .O 3 r~, ·τ >/~i (N

+J H -* _·_·_· _· 4-1 »H Ή ' ’ ' ’ O) :cö ra _______ —_

+> E M

U S ^ ^ Π 'S.

K £ Ξ ^ e*® J ^ ^ ^ ^ **3 --- CD m o g 6 · -M § _ ·Η·3*Μ λ ^Ο'ΐΓ'Τ 0 CU 5 2 - CN ^ - +J<C« £ o o o o km S4 (Ura· 2 ________ ^ ·· <o -g

K -H S

Λ-l Cj S"4 ,_i /-.i -> ^ (— CD C ^ . ~. · 11 ^ r~ γ~- r~ . -P 3 *··· 4-1 CJ Q* I I . I —--—

* * 0) O .H

... cd in -u s : : e ^ 4J * Tr o o .*:*. Retied.

: : : m +j 2 -* • c n (1) p : .*. <u <a m --

:.: : ·Η 1-1 2 ^ ,H

. . Ρ·Η E« en :·.: -p -p si 0 . : c;o-h <e o ~ 5 ... e & )4 ^ 4J — — — — — : : : +j s +j h e :« (tr? <0 ___ S Ή C CD £ • * * ^ ♦ · J*L ' • · · • · « • · · ______________ . ! : > .H a, ^ O 3: * : o i, * - “ ~ ..... ftp C r? .>% l= Λ m m “ - 3 “ ή r t r * * Ή r* ^ -S' ^

··· H c »4 y ... CJ

·.·.* 3 a > V5 N/ C/3 <0 .\J l·* ti· =- - : =- — -- - - =jj 33 107807

Taulukko VI Mutanttientsyymien maltoosiselektiivisyys (G2) verrattuna isomaltoosiin (iG2) ja maltoheptaoo-siselektiivisyys (G7) verrattuna maltoosiin WT S-Y119 G-K183 S-H184 G2/iG2 564 1320 709 995 G7/G2 74 41 53 52 • · · · • · • · · « · • « · • ·« . _ - .

• · · • · « • » • · · • · * • ·· · • I • · » • « • · * • · · • « · • · • · · • · * • · M* « · » • « · • ·

i I * I

• «· • · • · ♦ · • · · • · · • · « · • « · • * · • ·

Claims (9)

1. Menetelmä tärkkelyksen tai osittain hydrolysoidun tärkkelyksen muuttamiseksi dekstroosia sisältäväksi siirapiksi, 5 tunnettu siitä, että se käsittää vaiheen, jossa tärkkelys-hydrolysaatti muutetaan sokeriksi Aspergillus-kannasta saatavissa olevan glukoamylaasin sellaisen mutantin läsnä ollessa, jolla suhteessa Aspergillus nigerin glukoamylaasiin on korotettu selektiivisyys α-(1—>4)-glukoosisidoksiin ja 10 joka käsittää jonkin seuraavista mutaatioista: A. niger -glukoamylaasin Serll9:ää vastaavassa positiossa olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, edullisesti Tyr:lla;

15 A. niger -glukoamylaasin Asnl82:ta vastaavassa positiossa olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Asn, edullisesti Ala:11a; A. niger -glukoamylaasin Glyl83:a vastaavassa positiossa olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Gly, 20 edullisesti Lysrlla; . A. niger -glukoamylaasin Serl84:ää vastaavassa positiossa • · olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, • · ···* edullisesti Hisilla. ··· • · · • · · • · ·.: · 25

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii- • · tä, että mutaation läpikäynyt glukoamylaasi on johdettu :T: glukoamylaasista, joka on saatavissa A. nicrerista tai A. awamorista. • · ,···, 30

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet- ’·* tu siitä, että mutaation läpikäynyt glukoamylaasi sisältää * • · · kaksi tai useampia aminohapon korvauksia. • · · • * • ♦ • · ·

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, .···. 35 tunnettu siitä, että glukoamylaasiannos on alueella 0,05 -. • · 0,5 AG-yksikköä grammaa kuivaa kiintoainetta kohti. ! 07807

5. Jonkin edellä mainitun patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää tärkkelyshydro-lysaatin muuttamisen sokeriksi konsentraatiossa, joka on vähintään 30 paino-% kuivaa kiintoainetta. 5

6. Jonkin edellä mainitun patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muuttaminen sokeriksi suoritetaan haaroja lohkaisevan entsyymin läsnäollessa, jolloin entsyymi on valittu ryhmästä, johon sisältyy pullulanaasit 10 ja isoamylaasit, edullisesti Bacillus acidopullulvticusista johdettu pullulanaasi tai Pseudomonas amyloderamosasta johdettu isoamylaasi.

7. Jonkin edellä mainitun patenttivaatimuksen mukainen me-15 netelmä, tunnettu siitä, että muuttaminen sokeriksi suoritetaan pH-alueella 3-5,5 ja lämpötilassa 30-60 °C 48-72 tunnin ajan, edullisesti pH:ssa 4-4,5 ja lämpötilassa 55-60 °C.

8. Aspergillus-kannasta saatavissa olevan glukoamylaasin ><t. mutantti, tunnettu siitä, että sillä on suhteessa Asperail- • · ... lus niaerin glukoamylaasiin korotettu selektiivisyys a- • · ”1 (1—>4)-glukoosisidoksiin ja käsittää jonkin seuraavista mu- • · · taatioista: • ♦ • · · • · · 9 C «·· · ^j • ·.*·· A. niaer -glukoamylaasin Serll9:ää vastaavassa positiossa • · · ί.ί : olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, edullisesti Tyrrlla; ·:··· A. niqer -glukoamylaasin Asnl82:ta vastaavassa positiossa 30 olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Asn, ··· • edullisesti Ala:11a; • · · '*·|·* A. niqer -glukoamylaasin Glyl83:a vastaavassa positiossa • « olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Gly, ··· edullisesti Lys:lla; ···· .***. 35 A. niqer -glukoamylaasin Serl84:ää vastaavassa positiossa • * · olevan aminohapon korvaamisen muulla aminohapolla kuin Ser, edullisesti Hisrlla; 107807 edellyttäen, että mutaation läpikäyneen entsyymin ollessa johdettu A. nicrer -glukoamylaasista, Asn:n korvaaminen Ala:11a aminohappopositiossa Asnl82 ei ole ainoa mutaatio.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen glukoamylaasin mutantti, tunnettu siitä, että se käsittää kaksi tai useampia aminohapon korvauksia. 10