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KR20010014047A - 생물학과 의학에 사용할 수 있는 보유물 크로마토그래피및 단백질 칩 어레이 - Google Patents

생물학과 의학에 사용할 수 있는 보유물 크로마토그래피및 단백질 칩 어레이 Download PDF

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KR20010014047A
KR20010014047A KR19997012077A KR19997012077A KR20010014047A KR 20010014047 A KR20010014047 A KR 20010014047A KR 19997012077 A KR19997012077 A KR 19997012077A KR 19997012077 A KR19997012077 A KR 19997012077A KR 20010014047 A KR20010014047 A KR 20010014047A
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KR
South Korea
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adsorbent
sample
substrate
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KR19997012077A
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헛첸스티윌리엄
입타이-텅
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사이퍼젠 바이오시스템스, 인코오포레이티드
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Abstract

본 발명은 샘플내 피분석물을 분할하는 용도의 보유물 크로마토그래피 방법을 제공한다. 상기 방법은 다수의 상이한 선택 조건하에 피분석물을 기재에 흡착시키는 단계 및 기재상에 보유된 피분석물을 탈착 분광 분석에 의해 검출하는 단계를포함한다. 이 방법은 임상적 진단 및 약물 발견을 포함하는 생물학 및 의학에 유용하다.
도 2

Description

생물학과 의학에 사용할 수 있는 보유물 크로마토그래피 및 단백질 칩 어레이{RETENTATE CHROMATOGRAPHY AND PROTEIN CHIP ARRAYS WITH APPLICATIONS IN BIOLOGY AND MEDICINE}
세포 기능은 정상 상태이든 병리 상태이든 간에 부분적으로 세포가 발현하는 유전자(즉, 유전자 기능)에 따라 달라진다. 유전자 발현은 정성적 측면과 정량적 측면에서 살펴볼 수 있다. 즉, 세포에 따라 발현되는 특정 유전자가 다르고 동일 유전자의 발현율도 상대적으로 상이할 수 있다. 차등 유전자 발현은, 예컨대 그 유전자가 암호하는 단백질 발현의 차이 또는 발현된 단백질의 해독후 변형으로 나타날 수 있다. 예컨대, 단백질은 탄수화물이나 인산염기가 부착되거나 또는 펩티드 절단을 통해 가공될 수 있다. 즉, 세포는 생화학적 측면에서 복잡한 유기 생체분자의 혼합물이다.
기능 게놈학("proteomics")의 1가지 목표는 세포 종류에 따라 차등 발현되는 유기 생체분자의 동정과 특성을 규명하는 것이다. 발현을 비교해 보면 세포의 특정 병리적 활성의 원인일 수 있는 분자를 동정할 수 있다. 예컨대, 정상 세포가 아닌 암 세포에서 발현되는 단백질을 동정하면 진단에 유용하게 사용할 수 있고, 궁극적으로 병리 상태의 치료 및 약물 개발에 유용할 것이다. 휴먼 게놈 프로젝트가 완료되면, 모든 인간 유전자가 클로닝되고 서열 분석되어 데이타베이스로 구축될 것이다. 이러한 "포스트 게놈"의 세상에서 차등 발현되는 단백질을 동정하게 되면, 이 단백질을 암호하는 유전자를 동정할 수 있게 된다. 따라서, 유전학의 힘을 통해 세포 기능의 문제를 다룰 수 있게 된다.
유전자 발현과 기능의 화학적 차등 분석에는 세포내 존재하는 복잡한 분자의 혼합물이 미량으로 존재하는 경우에도 분석하고, 이를 정량하여 동정할 수 있는 기구가 요구된다. 하지만, 이와 같은 목적에 현재 이용되는 분석 화학의 기구는 각 분야별로 제한되어 있다. 많이 사용되는 1가지 생체분자 분리 방법은 겔 전기영동이다. 흔히, 겔에 장입시킨 단백질을 등전 촛점으로 분리하는 1차 분리 방법과 이어서 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하는 2차 분리 방법이 함께 사용된다. 그 결과, 등전점(총 전하)과 크기(즉, 질량)의 차원에 따라 단백질을 분할하는 지도를 얻을 수 있다. 하지만, 유용한 이 방법은 여러 측면에서 단점이 있다. 첫째, 이 방법은 생체분자의 2가지 특성, 즉 질량과 등전점("pI")에 대한 정보만을 제공한다. 둘째, 각 차원에서의 분할력이 겔의 분할력에 의해 제한된다. 예컨대, 질량차가 약 5% 미만이거나 pI 차이가 약 0.5 미만인 분자는 분할하기가 종종 어렵다. 세째, 겔의 장입 용량이 제한적이어서 민감성이 제한적이다. 즉, 소량으로 발현되는 생체분자는 검출할 수 없다. 네째, 분자량이 약 10 내지 20 kDa 이하인 작은 단백질과 펩티드는 관찰되지 않는다.
다른 분석법을 이용하여 상기 단점 중 1가지 또는 그 이상을 극복할 수는 있지만 효율적으로 조합하기는 어렵다. 예컨대, 분석용 크로마토그래피는 각종 피분석물/흡착제 상호작용에 따라 생체분자를 분리할 수 있으나, 다중 차원의 분석은 어렵고 많은 시간이 소요된다. 또한, 이 방법 역시 민감도가 제한적이다.
임상 진단학은 질병의 공지된 마커를 특이적으로 검출하는 작용을 필요로 한다. 하지만, 이러한 진단학의 발전은 마커에 특이적으로 결합하거나 복잡한 혼합물 중에서 마커를 구별할 수 있는 시약들 제조하는데 시간이 필요하기 때문에 발전이 방해된다.
약물 발견은 리간드/수용체 상호작용을 조정하는 제제를 신속하게 선별하는 작용을 필요로 한다. 흔히, 이와 같은 선별 시의 속도 제한 단계는 리간드/수용체 상호작용을 검출하는 능력이다. 따라서, 결합 현상을 동정하는 신속하고 특이적인 방법은 당해 기술 분야를 일층 발전시킬 것이다.
지금까지, 리간드/수용체 쌍의 가능한 마커 또는 구성원을 동정하는 것에서부터 마커 또는 구성원에 특이적으로 결합하는 제제를 제조하는 방법은 어려운 문제였다. 1가지 방법은, 정상 조직과 발병 조직을 비교하여 발병 조직에서 상승되거나 감소되는 mRNA 종이나 발현된 서열 태그("EST")를 동정하는 것이다. 그 다음, 이 mRNA 종을 분리하고, 이 mRNA가 암호하는 폴리펩티드를 통상적인 재조합 DNA 방법을 통해 제조한다. 그 후, 얻어지는 폴리펩티드를 분리하여, 마커에 특이적인 항체를 유발시킬 수 있는 면역원으로 사용한다. 이 항체는, 예컨대 환자의 시료에 존재하는 마커의 양을 측정하는 ELISA 분석법에 사용할 수 있다.
이 방법은 지루하게 많은 시간이 걸린다. 이러한 항체를 얻는데에는 9개월 내지 1년이 소요될 수 있는데, 그 이유는 면역화용 폴리펩티드를 충분량 분리하기 위하여 진행되는 프로토콜에 많이 시간이 소요되기 때문이다. 또한, 이 방법은 RNA 발현의 차이가 단백질 발현의 차이로서 나타날 것이라는 가능성을 전제로 하는 것이지만, 이러한 추정이 항상 믿을만한 것은 아니다. 따라서, 차등 발현되는 단백질이 직접 검출되고 상당히 짧은 시간내에 특이적 리간드를 생성할 수 있는 방법은 이 분야에 상당한 잇점을 제공할 것이다.
즉, 유기 생체분자의 복합 혼합물을 분할하고, 이 혼합물 중의 각 생체분자를 동정하며, 1 이상의 표적 피분석물과 관련된 특이적 분자 인식 과정을 동정하는 기구는 분석 생화학, 생물학 및 의학 분야에 매우 필요로 되는 것이다.
본 출원은 1997년 6월 20일에 출원된 동시계류 중인 출원 60/054,333호 및 1997년 12월 1일에 출원된 동시계류중인 출원 60/067,484호(둘다 본 발명에 참고 인용됨)를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 분리 과학 및 분석 생화학 분야에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 유전자 기능 분석, 차등 유전자 발현, 단백질 규명, 세포 진단과 임상 진단 및 약물 선별을 비롯한 생물학과 의학에 사용된다.
도 1은 스트립 형태로 복수의 흡착제 점적을 포함하는 기재를 도시한 것이다. 이 스트립은 유인력의 기준(소수성, 이온성, 배위 공유 및 복합 기능)에 따라 분류된 6가지 상이한 흡착제 군을 포함한다. 이 스트립은 각 흡착제 종류마다 여러 점적을 포함하는데, 이 점적은 상이한 용출제에 의하여 여러 시간점에서 조사되거나 또는 후속 분석을 위하여 보관된다.
도 2는 소정의 어드레스성 위치에 존재하는 흡착제의 직각 배열(표면 상호작용 전위)을 도시한 것이다. 이 배열 역시 평판 형태를 취할 수 있다. 이 배열은 다양한 흡착제를 포함한다. 피분석물에 노출시, 각 스트립은 각종 용출제(선택성 허용한계 변형제)에 의해 세척될 수 있다. 상이한 선택성 조건하에 보유 여부를 분석하면 보유 지도 또는 인식 프로파일이 얻어진다.
도 3은 소정 위치로부터 피분석물을 탈착시켜 피분석물을 정량 분석하고 탈착된 피분석물을 레이저 탈착 질량 분광분석으로 정량 검출한 결과를 도시한 것이다.
도 4a는 본 발명에 의해 생성된 데이터를 분석하는데 사용할 수 있는 소프트웨어를 실행시키는데 사용되는 컴퓨터 시스템의 일예를 도시한 것이다. 도 4a는 모니터(3), 스크린(5), 캐비넷(7), 키보드(9) 및 마우스(11)를 포함하는 컴퓨터 시스템(1)을 도시한 것이다. 마우스(11)는 마우스 버튼(13)과 같은 1개 이상의 버튼을 보유할 수 있다. 캐비넷(7)은 본 발명을 입력시킨 코드를 포함하는 컴퓨터 프로그램을 저장 및 검색하는데 이용할 수 있는 하드 드라이브(도시되지 않음) 및 CD-ROM 드라이브(15)를 수용하고 있다. CD-ROM(17)이 컴퓨터 판독 저장 매체로서 제시되어 있지만, 기타 다른 컴퓨터 판독 저장 매체, 예컨대 플로피 디스크, DRAM, 하드 드라이브, 플래시 기억장치, 테이프 등을 이용할 수도 있다. 캐비넷(7)은 프로세서, 기억장치 등과 같은 유사한 컴퓨터 부재(도시되지 않음)도 수용한다.
도 4b는 본 발명에 의해 얻어진 데이터를 분석하는데 사용할 수 있는 소프트웨어를 실행하는데 사용되는 컴퓨터 시스템(1)의 시스템 블록 다이아그램이다. 도 4a에서 처럼, 컴퓨터 시스템(1)은 모니터(3)와 키보드(9)를 포함한다. 컴퓨터 시스템(1)은 중앙 프로세서(102), 시스템 기억장치(104), I/O 제어장치(106), 디스플레이 접합기(108), 착탈형 디스크(112), 고정 디스크(116), 네트워크 접속 장치(118) 및 스피커(120)와 같은 부속장치를 더 포함한다. 착탈형 디스크(112)는 플로피, 테이프, CD-ROM, 착탈형 하드 드라이브, 플래시 기억장치 등과 같이 착탈형 컴퓨터 판독 매체를 대표하는 것이다. 고정 디스크(116)는 내부 하드 드라이브, DRAM 등을 대표하는 것이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 기타 다른 컴퓨터 시스템은 부속장치를 더 포함하거나 또는 보다 적은 수로 포함할 수 있다. 예컨대, 기타 다른 컴퓨터 시스템은 1개 이상의 프로세서(102)(즉, 다중프로세서 시스템) 또는 개시 기억장치를 포함할 수 있다.
도 5a 내지 도 5F는 6조의 상이한 흡착제와 여러 종의 상이한 용출제를 포함하는 선택성 조건하에 리소자임의 보유 지도를 도시한 것이다.
도 6a 및 도 6b는 고정된 금속 흡착제를 이용한 인간 혈청 중에 존재하는 저분자량 및 고분자량 피분석물의 분할 결과를 도시한 것이다.
도 7a 및 도 7b는 동일한 용출제를 사용하여 각종 흡착제에 의해 얻어지는 혈청 중에 존재하는 저분자량 및 고분자량 피분석물의 분할 결과를 도시한 것이다.
도 8a 및 도 8b는 용출제로서 물을 사용하여 각종 흡착제에 의해 얻어지는 조기분만아 요 중에 존재하는 저분자량 및 고분자량 피분석물의 분할 결과를 도시한 것이다.
도 9는 소수성 페닐 흡착제와 3종의 용출제를 사용하여 얻은 조기분만아 요 중에 존재하는 피분석물의 분할 결과를 도시한 것으로, Tween 세척 조건시 피분석물 중 1가지(*)가 선택적으로 보유된다는 것을 나타내고 있다.
도 10a 내지 도 10d는 2종의 상이한 유방암 세포주의 세포 배양 배지 중에 존재하는 피분석물의 분할 결과를 도시한 것이다.
도 11은 6종의 상이한 흡착제와 3종의 상이한 용출제를 특징으로 하는 선택성 조건에 노출된 조기분만아 요의 합성 보유 지도를 도시한 것이다.
도 12는 조기분만아 요의 2차원 폴리아크릴아미드 겔(pI 및 겉보기 분자량)을 도시한 것이다.
도 13은 표적 피분석물에 특이적으로 결합하는 표면 단백질을 보유한 파지를 파지 디스플레이 라이브러리에서 패닝(panning)하는 방법을 도시한 것이다. 상부에 도시한 기재는 특이적으로 결합된 소수의 파지조차도 파지가 포함하는 많은 외피 단백질의 검출을 통해 탈착 분광분석으로 검출할 수 있다는 것을 나타내고 있다. 하부에는 표적 피분석물이 특이적으로 결합하도록 여러 흡착제 점적을 형성시킨 기재를 도시하고 있다. 이 점적에 파지를 노출시킨다. 결합된 파지를 탈착 분광분석으로 검출한다. 또 다른 점적에 결합된 파지는 분리하여 증식시킬 수 있다.
도 14는 패닝 방법에 의해 동정된 리간드제, 여기서는 단쇄 항체가 표적 단백질이 결합하게 되는 흡착제로서 단백질-단백질 상호작용 연구에 어떻게 사용되는 지를 도시한 것이다. 표적은 동일계내에서 정제하여(점적 2) 파지 디스플레이 라이브러리(점적 4)를 패닝하는데 사용한다. 단쇄 항체를 분리하여 흡착제로서 기재(점적 6)에 부착시킨다. 그 다음, 표적을 단쇄 항체에 흡착시킨다. 그 다음, 표적을 단백질-단백질 상호작용의 연구를 위하여 결합시킨다(점적 8).
도 15는 리간드, 여기에서는 단쇄 항체에 대한 단백질 결합을 방해하는 성질이 있는 약물 후보를 선별하는 방법을 도시한 것이다. 표적 단백질에 특이적인 단쇄 항체는, 예컨대 스스로 단백질 A 또는 단백질 G에 결합할 수 있는 항파지 항체를 통해 기재 상의 점적에 결합될 수 있다. 이 단쇄 항체를 표적 단백질 및 약물 후보에 노출시킨다. 피분석 단백질에 결합하여 피분석물에 대한 리간드 결합을 방해하는 약물의 성질은 탈착 분광분석으로 모니터한다.
도 16은 리간드에 대한 단백질 결합을 방해하는 성질에 기초하여 약물 후보를 선별하는 방법을 도시한 것이다. 이 방법은 도 15에 도시된 것과 유사하나, 약물 자체가 리간드에 결합하여 피분석물의 결합을 방해하는 약물의 성질을 탈착 분광분석으로 모니터한다.
도 17은 제2 리간드(표적 단백질 II)에 대한 표적 단백질(표적 단백질 I)의 결합을 방해하는 성질에 기초하여 약물 후보를 선별하는 방법을 도시한 것이다. 도 15 및 도 16에서와 같이, 표적은 스스로 리간드에 대한 흡착제가 되는 기재에 결합시킨다. 이 경우, 피분석물은 단쇄 항체를 통해 결합시키고, 그 다음 표적을 리간드 및 약물 후보에 노출시킨다. 그 결과, 피분석물과 리간드 사이의 결합(예컨대, 표적 피분석물에 대한 결합)을 방해하는 약물의 성질을 탈착 분광분석으로 모니터한다.
도 18은 차등 발현되는 mRNA 또는 폴리펩티드의 동정 단계에서 부터 시작하여 탈착 분광분석에 의해 검출되는 폴리펩티드에 특이적으로 결합시키기 위한 진단 기판을 만드는 단계까지를 도시한 흐름도이다.
도 19는 흡착제 어레이에 나타나는 헤모필러스(Hemophilus) 용균물의 보유 지도를 도시한 것이다. 도 19(A) : 음이온 흡착제, 도 19(B) : 정상 상 흡착제, 도 19(C) : Ni(II) 흡착제, 도 19(D) : 소수성 흡착제.
도 20은 헤모필러스 용균물내 존재하는 피분석물의 점진적 분할 결과를 도시한 것이다. 각 경우마다 사용된 흡착제는 음이온성 흡착제이다. 도 20(A) : 제1단계로서, 점적을 시료에 노출시킨 후 20 mM 인산나트륨, 0.5M 염화나트륨(pH 7.0) 150 ㎕로 세척하였다. 제2 단계로서, 용출제를 대표하는 인산나트륨과 흡착제를 특정 불변 세트에 첨가하였다. 새로운 용출 특성을 부가하였다. 도 20(B) : 점적을 20 mM 인산나트륨(pH 7.0) 외에도 0.05% Triton X100 및 0.15M NaCl(총 150 ㎕)로 세척하였다. 도 20(C) : 점적을 20 mM 인산나트륨(pH 7.0) 외에도 100 mM 이미다졸, 0.15M NaCl(총 150 ㎕)로 세척하였다.
도 21은 정상인의 혈청과 발병이 있는 혈청 중에 존재하는 성분을 비교한 결과를 도시한 것이다. 도 21(A) : 흡착제 어레이 Cu(II) 부위 상에 존재하는 정상 혈청의 보유물 지도. 도 21(B) : 흡착제 어레이 Cu(II) 부위 상에 존재하는 발병 혈청의 보유물 지도. 도 21(C) : 중첩 방식으로 조합시킨 양 혈청 시료의 보유 피분석물. 간단하게 나타내기 위하여, 보유된 피분석물의 각 피크를 막대로 변환시켰는데, 점선 막대는 정상 혈청에 보유된 피분석물을 나타내고, 실선 막대는 발병 혈청에 보유된 피분석물을 나타낸다. 도 21(D) : 양 시료 간의 차이를 보다 분명하게 구별하기 위하여, 시료에서 얻어지는 보유 피분석물의 비를 계산하고 디스플레이한 비교 플롯을 만들었다. "*"으로 표시한 2개의 피분석물은 발병 혈청에서 나타나는 유의적인 증가(5 내지 10배 증가)를 표시한 것이다.
도 22는 Cu(II) 흡착제를 이용한 대조군, 발병 마우스 요 및 약물 처리된 마우스 요의 보유물 지도 및 발병 요와 약물 처리된 요에 존재하는 마커의 정량 결과를 비교 도시한 것이다.
도 23은 "겔 도(gel view)" 형식으로 나타낸 4명의 인간 암 환자에서 얻은 요에 있는 피분석물의 보유물 지도를 도시한 것이다. 환자 1, 2 및 3 간의 판별 지도는 이 환자들 중에서 2가지 공통 피분석물이 증가된 양으로 존재하고 있음을 보여준다.
도 24는 유전자 VIII 외피 단백질의 검출을 통해 레이저 탈착 질량 분광분석으로 M13 파지를 검출한 결과를 도시한 것이다. 본래 1012/㎖ 인 파지의 희석률은 1:10 내지 1:100,000,000 범위이다.
도 25는 흡착제로서 항M13 항체를 사용하고 탈착 분광분석하여 얻은 M13 포획 결과를 도시한 것이다. 도 25(A)는 유전자 VIII 단백질과 유전자 III 단백질을 나타내는 피크를 가진 포획된 M13 파지를 도시한 것이다. 도 25(B)는 항체 흡착제를 나타내는 피크(단독 및 이중 하전됨)를 도시한 대조군이다.
도 26은 tat 단백질 흡착제를 이용한 항tat 단쇄 항체를 보유하는 M13 파지의 흡착 결과를 도시한 것이다. 파지 희석률 1:10 내지 1:10,000 범위하에 단일 강도를 나타내었다.
도 27은 1㎍/㎖(A) 및 100 ng/㎖(B)의 결합된 TGF-β수용체 융합 단백질에 대한 TGF-β결합의 보유 지도를 도시한 것이다. 실선은 유리 TGF-β수용체가 없는 경우의 결합을 도시한 것이고, 점선은 TGF-β수용체 존재하의 결합을 도시한 것이다.
도 28 내지 도 31은 보유물 크로마토그래피의 분할능을 도시한 것이다. 도 28(A) 내지 도 28(C)는 분자량 0 kD 내지 30 kD에서 소수성 흡착제, 양이온성 흡착제 및 Cu(II) 흡착제를 사용한 헤모필러스 용균물 유래의 단백질 분할 결과를 도시한 것이다. 각각의 보유된 피분석물은 막대로 표시하였고, 막대 높이는 보유된 피분석물의 강도를 나타낸다. 도 29(A) 내지 도 29(C)는 약 30 kD 내지 약 100 kD의 분자량에서 소수성 흡착제, 양이온성 흡착제 및 Cu(II) 흡착제를 사용한 헤모필러스 용균물 유래의 단백질 분할 결과를 도시한 것이다. 도 30은 3가지 흡착제 중 각 흡착제에서 얻어지는 헤모필러스 단백질 0 kD 내지 30 kD까지의 복합 분할 결과를 도시한 것이다. 도 31은 3가지 흡착제 중 각 흡착제에서 얻어지는 헤모필러스 단백질 20 kD 내지 100 kD까지의 복합 분할 결과를 도시한 것이다.
도 32는 정상 흡착제에 대한 GST 융합 단백질의 결합 결과를 도시한 것이다.
도 33은 흡착제 어레이에 결합된 GST 융합 수용체에는 특정 리간드가 결합하고(A), GST 융합 수용체를 포함하지 않는 대조 어레이에는 상기 리간드가 결합하지 않음을 도시한 것이다(B).
상세한 설명
I. 정의
본 명세서에 사용된 모든 과학 기술적 용어는 별다른 표시가 없는 한 본 발명이 속하는 당해 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 일반적인 의미를 갖는 것이다. 다음 문헌에는 본 발명에 사용된 많은 용어들에 대한 일반적 정의가 제시되어 있다. Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R.Rieger et al.(eds.), Springer Verlag(1991); and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991). 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이하의 용어들은 별다른 기재가 없는 한 다음과 같은 의미를 갖는다.
"피분석물"은 바람직하게 보유되어 검출되는 시료의 성분을 의미한다. 이 용어는 시료 중에 존재하는 단독 성분이거나 성분의 세트일 수 있다.
"흡착제"는 피분석물을 흡착할 수 있는 모든 물질을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "흡착제"라는 용어는 피분석물이 노출되는 단일 물질("단독체 흡착제")(예컨대, 화합물이나 작용기) 및 시료가 노출되는 복수의 상이한 물질("다중체 흡착제")을 모두 의미하는 것이다. 다중 흡착제에 사용되는 흡착제 물질은 "흡착제 종"이라 부른다. 예컨대, 기재 상의 어드레스성 위치는 상이한 결합 특성을 가진 다양한 흡착제 종(예컨대, 음이온 교환 물질, 금속 킬레이터 또는 항체)을 특징으로 하는 다중체 흡착제를 포함할 수 있다.
"흡착하다"라는 용어는 용출제(선택성 허용한계 변형제)로 세척하기 전이나 세척한 후 흡착제와 피분석물 사이에 검출가능한 결합을 의미한다.
"기재"란 흡착제가 부착 또는 침착되어 있는 고체상을 의미한다.
"결합 특성"은 피분석물에 대한 흡착제의 유인성을 나타내는 화학적, 물리적 특성을 의미한다. 동일한 용출 조건하에서 흡착제가 상이한 친화도로 동일 피분석물에 결합한다면 두 흡착제는 상이한 결합 특성을 가진 것이다. 결합 특성으로는, 예컨대 염 촉진된 상호작용 정도, 소수성 상호작용 정도, 친수성 상호작용 정도, 정전성 상호작용 정도 및 본 명세서에 기재된 기타 다른 특성의 정도를 포함한다.
"결합 조건"이란 피분석물이 노출되는 결합 특성을 의미한다.
"용출제"란 흡착제에 대한 피분석물의 흡착을 매개하는데 사용되는 제제, 일반적으로 용액을 의미한다. 또한, 용출제는 "선택성 허용한계 변형제"라고도 한다.
"용출 특성"이란 피분석물과 흡착제 간의 흡착을 매개하는 특성 용출제(선택성 허용한계 변형제)의 능력을 나타내는 특징을 의미한다. 피분석물과 흡착제를 접촉시켰을 때 흡착제에 대한 피분석물의 친화도가 상이하다면 두 용출제는 상이한 용출 특성이 있는 것이다. 용출 특성으로는, 예컨대 pH, 이온 강도, 물 구조의 변화, 세정제 강도, 소수성 상호작용의 변화 및 본 명세서에 기재된 기타 다른 성질을 포함한다.
"용출 조건"이란 피분석물이 노출되는 용출 특성을 의미한다.
"선택성 특징"이란 용출제로 세척한 후 피분석물이 흡착제에 보유되는 특이성을 나타내는 특정 용출 특성이 있는 용출제와 특정 결합 특성이 있는 흡착제의 복합 특징을 의미하는 것이다.
"선택성 조건"이란 용어는 피분석물이 노출되는 선택성 특징을 의미하는 것이다.
"유인성 기준"이란 한 분자를 다른 분자로 유인하는 화학적 및/또는 물리화학적 성질을 의미한다.
"유인성 강도"란 한 분자의 다른 분자에 대한 유인성 강도를 의미한다(또한, 친화도라고도 함).
"분할하다", "분할" 또는 "피분석물의 분할"이란 시료 중에 존재하는 1종 이상의 피분석물의 검출을 의미한다. 분할은 분리와 이어서 차등 검출을 통해 시료 중에 존재하는 복수의 피분석물의 검출을 포함한다. 분할은 혼합물에 존재하는 모든 다른 피분석물로부터 한 피분석물의 완전 분리를 필요로 하지는 않으며, 단지 2종 이상의 피분석물을 서로 구별할 수 있는 임의의 분리이면 충분하다.
"고정보 분할"이란 피분석물의 검출 뿐만 아니라 피분석물의 평가 대상인 1종 이상의 물리화학적 성질, 예컨대 분자량을 제공할 수 있는 피분석물의 분할을 의미한다.
"탈착 분광분석"이란 피분석물을 고정상에서 기체상으로 탈착시키는 에너지에 피분석물을 노출시키고, 이와 같이 탈착된 피분석물이나 이것의 구별가능한 부분을, 제2 고정상에 이 피분석물을 포획시키는 중간 단계없이 검출기로 직접 검출하는 피분석물의 검출 방법을 의미한다.
"검출"이란 검출되어야 하는 물체의 존재, 부재 또는 양을 동정하는 것을 의미한다.
"보유"란 용출제로 세척한 후 흡착제에 피분석물이 흡착되어 있는 것을 의미한다.
"보유 데이터"란 특성 선택성 조건하에 보유된 피분석물의 검출(경우에 따라 질량 검출을 포함)을 나타내는 데이터를 의미한다.
"보유 지도"란 복수의 선택성 조건하에 보유된 피분석물의 보유 데이터를 구체화한 가치값 세트(value set)를 의미한다.
"인식 프로파일"이란 복수의 선택성 조건하에 피분석물의 상대적 보유를 구체화한 가치값 세트를 의미한다.
"복합체"란 피분석물 2종 이상이 통합되어 형성된 피분석물을 의미한다.
"단편"이란 용어는 피분석물의 화학적, 효소적 또는 물리적 붕괴 생성물을 의미한다. 단편은 중성 상태이거나 이온 상태일 수 있다.
"차등 발현"이란 피분석물의 정성적 또는 정량적 존재에 대한 검출가능한 차이를 의미한다.
"생체 시료"란 바이러스, 세포, 조직, 기관 또는 어떤 제한없이 세포, 조직 또는 기관 용해물이나 균질물을 포함하는 유기체, 또는 혈액, 요, 뇌척수액과 같은 체액 시료를 의미한다.
"유기 생체분자"란 생물 기원의 유기 분자를 의미하는 것으로, 예컨대 스테로이드, 아미노산, 뉴클레오티드, 당, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 복합 탄수화물 또는 지질이 있다.
"작은 유기 분자"란 의약에 일반적으로 사용되는 유기 분자에 필적하는 크기의 유기 분자를 의미한다. 이 용어에는 유기 생체중합체(예컨대, 단백질, 핵산 등)는 포함되지 않는다. 바람직한 작은 유기 분자는 크기가 최대 약 5000 Da, 약 2000 Da 또는 최대 약 1000 Da 범위이다.
"생체중합체"는 생체 기원의 고분자, 예컨대 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 다당류 또는 폴리글리세라이드(예, 디글리세라이드 또는 트리글리세라이드)를 의미한다.
"폴리펩티드"란 아미노산 잔기, 이와 관련있는 천연 발생의 구조 변형체, 천연 발생되지 않는 펩티드 결합을 통해 결합시킨 합성 유사체, 관련 천연 발생의 구조 변형체 및 이것의 천연 발생되지 않는 합성 유사체로 구성된 중합체를 의미한다. 합성 폴리펩티드는, 예컨대 자동화된 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. "단백질"이란 용어는 일반적으로 큰 폴리펩티드를 의미한다. "펩티드"란 용어는 일반적으로 짧은 폴리펩티드를 의미한다.
"폴리뉴클레오티드"란 용어는 뉴클레오티드 단위로 구성된 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오티드에는 천연 발생의 핵산, 예컨대 데옥시리보뉴클레산("DNA") 및 리보뉴클레산("RNA") 뿐만 아니라 핵산 유사체를 포함한다. 핵산 유사체란 비천연 발생의 염기, 천연 발생의 포스포디에스테르 결합과는 다른 결합으로 다른 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드 또는 포스포디에스테르 결합과는 다른 결합을 통해 부착된 염기를 포함하는 것이다. 따라서, 뉴클레오티드 유사체는, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로트리에스테르, 포스포아미데이트, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA) 등을 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다. 이와 같은 폴리뉴클레오티드는 예컨대 자동 DNA 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. "핵산"은 일반적으로 대형 폴리뉴클레오티드를 의미한다. "올리고뉴클레오티드"란 용어는 일반적으로 뉴클레오티드가 약 50개 이하인 짧은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열(즉, A, T, G, C)로 표현되어 있을 때, 이것은 "T" 대신 "U"가 대체된 RNA 서열(즉, A, U, G, C)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"검출가능한 부" 또는 "표지"란 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 조성물을 의미한다. 예컨대, 유용한 라벨로는32P,35S, 형광성 염료, 전자 농축 시약, 효소(예컨대, ELISA에 일반적으로 사용되는 것), 비오틴-스트렙트아비딘, 디곡시게닌, 합텐 및 항혈청이나 모노클로널 항체가 형성용이한 단백질 또는 표적에 상보적인 서열을 가진 핵산 분자를 포함한다. 검출가능한 부는 흔히 시료 중에 존재하는 결합된 검출가능한 부의 양을 정량하는데 사용할 수 있는 측정가능한 시그널, 예컨대 방사성, 발색성 또는 형광성 시그널을 생성하는 것이다. 검출가능한 부는, 예컨대 스트렙트아비딘에 의해 인식되는 비오틴화된 뉴클레오티드 또는 방사성 뉴클레오티드의 병입과 같이 공유 결합이나 이온 결합, 반데르발스 결합 또는 수소 결합을 통해 프라이머 또는 프로브에 병입 또는 부착될 수 있다. 이 검출가능한 부는 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 간접 검출은 검출가능한 부에 제2의 직접 또는 간접 검출가능한 부를 결합시키는 것을 포함한다. 예컨대, 검출가능한 부는 결합 파트너의 리간드, 예컨대 스트립트아비딘의 결합 파트너인 비오틴, 또는 특이적으로 하이브리드할 수 있는 상보성 서열에 대한 결합 파트너인 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 이 결합 파트너는 그 자체 직접 검출될 수도 있다. 예컨대, 항체는 항체 자체에 형광성 분자가 표지될 수 있다. 또한, 결합 파트너는 간접 검출될 수도 있다. 예컨대, 상보성 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산은 다른 표지된 핵산 분자와의 하이브리드화를 통해 검출되는 분지형 DNA 분자의 일부일 수 있다. [예컨대, PD. Fahrlander and A. Klausner, Bio/Technology(1988) 6:1165] 시그널은, 예컨대 신틸레이션 계수, 덴시토미터법 또는 유동 세포계수법으로 정량할 수 있다.
"복수"란 2 이상을 의미한다.
"정제하다" 또는 "정제"란 정제해야 하는 조성물로부터 1종 이상의 오염물을 제거하는 것을 의미한다. 정제는 반드시 정제된 화합물이 100% 순수한 것을 요구하지는 않는다.
"리간드"란 표적 분자에 특이적으로 결합하는 화합물이다.
"수용체"란 리간드에 특이적으로 결합하는 화합물이다.
"항체"란 특이적으로 결합하여 에피토프(예, 항원)를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이것의 단편이 실질적으로 암호하는 폴리펩티드 리간드를 의미한다. 알려진 면역글로불린 유전자로는 카파 및 람다 경쇄 불변 영역 유전자, 알파, 감마, 델타, 입실론 및 뮤 중쇄 불변 영역 유전자 및 수많은 면역글로불린의 가변영역 유전자를 포함한다. 항체는, 예컨대 본래 면역글로불린으로 존재하거나 또는 각종 펩티다제로 분해시 생성되는 특성규명되어 있는 다수의 단편으로 존재한다. 예컨대, Fab' 및 F(ab)'2단편을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "항체"라는 용어는 전항체를 변형시켜 만들거나 재조합 DNA 방법으로 새로 합성한 항체 단편을 포함한다. 또한, 폴리클로널 항체, 모노클로널 항체, 키메라 항체 및 인체화된 항체를 포함하기도 한다. 항체의 "Fc"부란 1 이상의 중쇄 불변 영역 도메인, CH1, CH2및 CH3을 포함하지만, 중쇄 가변 영역은 포함하지 않는 면역글로불린 중쇄 부분을 의미한다.
리간드 또는 수용체(예, 항체)는 이종 화합물의 시료 중에서 피분석물의 존재를 결정짓는 결합 반응에 리간드 또는 수용체가 작용할 때 피분석 화합물에 "특이적으로 결합"하거나 "특이적 면역반응성"이 있는 것이다. 따라서, 지정된 분석(예, 면역분석법) 조건하에서, 리간드 또는 수용체는 특정 피분석물에 우선적으로 결합하고 시료에 존재하는 기타 다른 화합물에 유의적인 양으로 결합하지 않는다. 예컨대, 폴리뉴클레오티드는 하이브리드화 조건하에 상보성 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 피분석물에 특이적으로 결합하고, 항체는 면역분석 조건하에 항체가 유발되는 에피토프를 보유한 항원 피분석물에 특이적으로 결합하며, 흡착제는 적당한 용출 조건하에 피분석물에 특이적으로 결합한다.
"제제"는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 미지 조성물 시료, 조합 소분자 어레이, 생물학적 거대분자, 박테리오파지 펩티드 디스플레이 라이브러리, 박테리오파지 항체(예, scFv) 디스플레이 라이브러리, 폴리솜 펩티드 디스플레이 라이브러리 또는 박테리아, 식물, 진균류 또는 동물 세포나 조직과 같은 생체 물질로 제조된 추출물을 의미한다. 이 제제의 이용에 적합한 기법은 파지 또는 유사 벡터내 재조합 항체의 라이브러리의 선택 단계를 포함한다. 문헌[Huse et al.(1989) Science 246:1275-1281; 및 Ward et al.(1989) Nature 341:544-546]을 참조 바란다. 휴즈 문헌에 기재된 프로토콜은 파지 디스플레이 기법과 함께 사용하면 보다 효과적이다. 예컨대, 문헌[Dower et al., WO 91/17271 및 McCarfferty et al., WO 92/01047]을 참조하기 바란다.
"재조합 폴리뉴클레오티드"란 천연적으로는 함께 결합되어 있지 않은 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 증폭되거나 조립된 재조합 폴리뉴클레오티드는 적합한 벡터에 포함될 수 있고, 이 벡터를 사용하여 적합한 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포는 "재조합 숙주 세포"라고 부른다. 이 재조합 숙주 세포내에서 상기 유전자를 발현시키면, 예컨대 "재조합 폴리펩티드"를 얻을 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 또한 비암호 기능(예컨대, 프로모터, 복제 오리진, 리보솜 결합 부위 등)을 제공할 수도 있다. 적합한 단세포 숙주로는 진핵 세포 또는 포유류의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는데 통상적으로 사용되는 것을 포함하며, 그 예로는 대장균과 같은 원핵세포, 효모 등의 진균류를 포함하는 진핵세포 및 곤충 세포(예, Sf9)와 동물 세포, 예컨대 CHO, R1.1, B-W, L-M, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(예, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10) 및 배양 인체 세포를 포함하는 포유류 세포를 포함한다.
"발현 조절 서열"이란 작동가능하게 결합된 뉴클레오티드 서열의 발현(전사 및/또는 해독)을 조절하는 폴리뉴클레오티드 중의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. "작동가능하게 결합된"이란 일부분의 활성(예, 전사를 조절하는 능력)이 다른 부분에 대해 작용(예컨대, 서열의 전사)하는 두 부분 사이의 기능적 관계를 의미한다. 발현 조절 서열로는, 예컨대 프로모터 서열(예, 유도성, 억제성 또는 구성성), 인헨서, 전사 종결인자, 개시 코돈(즉, ATG), 인트론에 대한 접목 시그널 및 종결 코돈을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
"발현 벡터"란 발현되어야 하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 결합된 발현 조절 서열 함유의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 의미한다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스 작용성 인자를 포함하며, 기타 다른 발현 인자는 숙주 세포 또는 시험관내 발현계에 의해 공급될 수 있다. 발현 벡터로는 당해 기술 분야에 공지된 모든 것을 포함하는데, 예컨대 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있는 코스미드, 플라스미드(예컨대, 나출형 또는 리포좀내 함유형) 및 바이러스가 있다.
"암호화"란 생물학적 과정에서 소정의 뉴클레오티드 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)이나 소정의 아미노산 서열을 가진 다른 중합체 및 거대분자를 합성하기 위하여 주형으로서 작용하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA 또는 mRNA 중에 존재하는 특정 뉴클레오티드 서열의 고유 성질 및 이로부터 나타나는 생물학적 성질을 의미한다. 따라서, 이 유전자에 의해 생성된 mRNA의 전사 및 해독으로 세포 또는 기타 생물학적 시스템내에 단백질이 생성된다면 유전자가 단백질을 암호화하는 것이다. 일반적으로 서열 목록에서 제공되고 mRNA 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 암호 가닥 및 전사의 주형으로 사용되는 유전자 또는 cDNA의 비암호 가닥은 모두 그 유전자 또는 cDNA의 단백질이나 기타 다른 생성물을 암호하는 것이라고 할 수 있다. 다른 표시가 없는 한, "아미노산 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열"에는 동일한 아미노산 서열을 암호하고 서로의 축퇴성 변형체인 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질과 RNA를 암호하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
"에너지 흡수 분자"란 탈착 분광분석기에서 에너지원으로부터 에너지를 흡수하여 프로브 표면으로부터 피분석물을 탈착시킬 수 있는 분자를 의미한다. MALDI에 사용되는 에너지 흡수 분자는 종종 "매트릭스"라고도 한다. 생체유기 분자의 레이저 탈착에 에너지 흡수 분자로서 흔히 사용되는 것은 신남산 유도체, 신나핀산 및 디히드록시벤조산이 있다.
II. 보유물 크로마토그래피
보유물 크로마토그래피는 시료 중에 존재하는 피분석물의 다중차원 분할 방법이다. 이 방법은 (1) 복수의 상이한 흡착제/용출제 조합("선택성 조건") 하에 시료 중의 피분석물을 기재에 선택적으로 흡착시키는 단계 및 (2) 이와 같이 흡착된 피분석물의 보유를 탈착 분광분석으로 검출하는 단계를 포함한다. 각 선택성 조건은 흡착된 피분석물을 흡착되지 않은 피분석물로부터 분리하는 1차원 분리를 제공한다. 탈착 질량 분광분석은 흡착된 피분석물을 질량에 따라 서로 분리하는 2차원 분리를 제공한다. 보유물 크로마토그래피는 복수의 상이한 선택성 조건을 사용하는 것을 포함하기 때문에 다중 차원의 분리가 이루어진다. 또한, 2가지 선택성 조건하에 1종 이상의 피분석물의 상대적 흡착성도 측정할 수 있다. 이와 같은 다중차원의 분리는 피분석물을 분할하는 동시에 특성규명할 수도 있다.
또한, 이와 같이 분리된 피분석물은 보유물 지도에 결합된 상태로 보존되어 피분석물 구조 및/또는 기능 등을 조사하기 위하여 쉽게 추가 처리될 수 있다. 또한, 결합된 피분석물은 기재에 노출된 다른 피분석물을 결합시키는 흡착제로서 사용될 수 있다. 종합하여 보면, 본 발명은 피분석물의 신속하고 다중차원적인 고정보 분할 방법을 제공한다.
이 방법은 여러가지 형식으로 이루어질 수 있다. 제1 구체예는 물리적으로 상이한 두 위치에 있는 2종의 흡착제에 피분석물을 흡착시키고 각 흡착제를 동일한 용출제(선택성 허용한계 변형제)로 세척하는 것이다. 제2 구체예는 물리적으로 상이한 두 위치에 있는 동일한 흡착제에 피분석물을 흡착시키고 2종의 상이한 용출제로 세척하는 것이다. 제3 구체예는 물리적으로 상이한 두 위치에 있는 2종의 흡착제에 피분석물을 흡착시키고 2종의 상이한 용출제로 세척하는 것이다. 제4 구체예는 피분석물을 흡착제에 흡착시키고, 제1 용출제로 세척한 뒤, 보유물을 검출한 다음, 흡착된 피분석물을 제2의 용출제로 세척하고 후속 보유물을 검출하는 것이다.
A. 보유물 크로마토그래피를 수행하는 방법
1. 선택성 조건에 피분석물을 노출시키는 단계
a. 기재 제조
보유물 크로마토그래피를 수행하는데 있어서, 흡착제에 보유되는 피분석물은 기재상에서 에너지원에 노출된다. 피분석물을 함유하는 시료는 피분석물을 기재에 고정시키기 전이나 고정시킨 후 흡착제에 접촉시킬 수 있고, 상기 기재는 피분석물을 탈착 수단에 제공시 사용되는 것이다. 접촉이 용이하도록 흡착제는 액체 형태 또는 고체 형태(즉, 기재 위 또는 고체상에 존재)일 수 있다. 구체적으로, 흡착제는 용액, 현탁액, 분산액, 유중수 유제, 수중유 유제 또는 마이크로에멀젼 형태일 수 있다. 흡착제를 현탁액, 분산액, 유제 또는 마이크로에멀젼 형태로 제공하는 경우에는 적합한 계면활성제를 제공할 수도 있다. 일 구체예로서, 액체 흡착제와 액체 시료를 혼합하여 시료와 흡착제를 접촉시킬 수 있다. 또는, 시료를 고체 지지체상에 제공하고, 접촉은 액체 흡착제 중에 시료 함유 고체 지지체를 담그거나, 침지시키거나 또는 디핑(dipping)시켜 실시할 수 있다. 또한, 시료는 고체 지지체상에 액체 흡착제를 분무하거나 세척하여 접촉시킬 수 있다. 이 구체예에서, 상이한 흡착제는 다른 용기에 제공할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 흡착제는 기재상에 제공한다. 기재는 흡착제를 결합 또는 유지시킬 수 있는 모든 물질이다. 일반적으로, 기재는 유리, 세라믹, 전도성 중합체(예, 탄화된 PEEK), TEFLON(등록상표명) 코팅 물질, 유기 중합체, 천연 생체중합체, 금속(예, 니켈, 황동, 강철 또는 알루미늄), 필름, 가교 중합체(예, 아가로스, 셀룰로스 또는 덱스트란)의 다공성 비드 및 비다공성 비드, 기타 불용성 중합체 또는 이의 조합물을 포함한다.
다른 일 구체예에 있어서, 기재는 탈착 검출기에 삽입되는 프로브 또는 시료 제공 수단의 형태일 수 있다. 예컨대, 도 1을 살펴보면 기재는 스트립 형태이다. 이 기재에 흡착제를 점적의 선형 어레이 형태로 부착시켜 각 점적을 피분석물에 노출시킬 수 있다. 별개의 점적이 일정한 줄로 정렬되어 복수의 흡착제가 어레이(30)를 형성하도록 여러 스트립을 함께 결합시킬 수도 있다. 또한, 기재는 정사각형, 직사각형 또는 원과 같은 일정한 기하학적 패턴을 형성하는 수평 줄과 수직 줄로 정렬된 흡착제 어레이를 보유한 판 형태일 수 있다.
프로브는 다음과 같이 제조할 수 있다. 기재는 스테인레스 스틸, 알루미늄 또는 규소 와이퍼와 같은 임의의 고체 물질일 수 있다. 금속 기재는 표면을 유도체화하는 물질로 코팅할 수도 있다. 예컨대, 금속 표면은 산화규소, 산화티탄 또는 금으로 피복할 수 있다.
그 다음, 표면을 이작용성 링커로 유도체화한다. 링커는 한쪽 말단에 표면상의 작용기와 공유 결합할 수 있는 작용기를 포함한다. 따라서, 이 작용기는 금의 설프히드릴 기이거나 무기 산화물일 수 있다. 링커의 다른쪽 말단에는 일반적으로 아미노 작용기가 존재한다. 유용한 이작용성 링커로는 아미노프로필 트리에톡시실란 또는 아미노에틸 디설파이드를 포함한다.
링커는 표면에 일단 결합된 후 흡착제로서 작용하는 기로 더 유도체화시킨다. 일반적으로, 흡착제는 프로브 상의 어드레스성 위치에 첨가한다. 프로브의 한 형태로서 직경이 약 3 ㎜인 점적을 직각 배열로 정렬시킨다. 흡착제는 그 자체가 유효 아미노기와 반응하는 기 및 흡착제로서 작용하는 작용기를 포함하는 이작용성 분자의 일부분일 수 있다. 작용기로는, 예컨대 정상상(산화규소), 역상(C18지방족 탄화수소), 4차 아민 및 설포네이트를 포함한다. 또한, 표면은 카르보디이미드 및 N-히드록시숙신이미드와 같은 기타 다른 이작용성 분자로 더 유도체화되어 예비활성화된 블랭크를 형성할 수 있다. 이 블랭크는 생체유기 흡착제(예, 핵산, 항체 및 기타 다른 단백질 리간드)로 작용성화될 수 있다. 생체중합체는 아민 잔기 또는 설프히드릴 잔기를 통해 블랭크 상의 작용기에 결합할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 흡착제는 유효 작용기를 통해 프로브의 표면에 결합되는 가교 중합체(예, 필름)에 결합된다. 이러한 중합체로는, 예컨대 셀룰로스, 덱스트란, 카르복시메틸 덱스트란, 폴리아크릴아미드 및 이것의 혼합물을 포함한다. 즉, 사용되는 것은 흡착제가 부착된 프로브이다.
또 다른 구체예에 있어서, 흡착제는 제1 기재에 부착시켜 중합체 비드 또는 유리 비드와 같은 고체상을 만들고, 이것을 다시 탈착 검출기의 탈착 에너지에 시료를 제공하는 수단으로서 작용하는 제2 기재상에 위치시킨다. 예컨대, 제2 기재는 소정의 어드레스성 위치에 일련의 웰을 보유한 평판 형태일 수 있다. 이 웰은 흡착제로 유도체화된 제1 기재, 예컨대 흡착제로 유도체화된 중합체 비드의 용기로서 작용할 수 있다. 이 구체예의 잇점은 피분석물이 제1 기재에 1가지 물리적 관계로 흡착된 뒤, 탈착 분광분석으로 분석하기 위한 시료 제공 기질로 전이될 수 있다는 것이다.
일반적으로, 기재는 흡착제에 결합되고 보유된 피분석물을 검출하기 위해 본 발명의 방법에 사용된 검출기에 사용할 수 있도록 개조한다. 일 구체예로서, 기재는 에너지원이 점적에 충돌하여 피분석물을 탈착시키는 탈착 검출기에 용이하게 장착할 수 있는 것이다. 이 기재는 수평 및/또는 수직으로 이동가능한 캐리지에 장착시키기에 적합한 것이고, 이 캐리지는 에너지원에 의한 조사 경로에 각 흡착제의 소정의 어드레스성 위치가 연속적으로 위치하도록 기재를 수평 및/또는 수직으로 이동시키고, 여기에 결합된 피분석물을 검출한다. 기재는 종래의 질량 분광분석용 프로브 형태일 수 있다.
기재의 스트립, 평판 또는 프로브는 통상적인 기법을 사용하여 만들 수 있다. 그 다음, 흡착제를 기재상에 직접 또는 간접적으로 결합, 고정 또는 침착시키고, 그 다음 피분석물을 함유하는 시료와 접촉시킬 수 있다. 이 흡착제는 부착 또는 고정화에 적합한 임의의 수단으로 기재에 직접 또는 간접적으로 결합시킬 수 있다. 예컨대, 공유 또는 비공유 결합을 통해 기재에 흡착제가 직접 결합하도록 흡착제로 기재를 유도체화하면 흡착제를 기재에 직접 결합시킬 수 있다.
기재에 대한 흡착제의 부착은 다양한 기작을 통해 실시할 수 있다. 즉, 미리 제조한 흡착제 분자를 기재에 부착시켜 완전하게 제조된 흡착제 분자로 기재를 유도체화할 수 있다. 또는, 기재에 전구체 분자를 부착시키고 이어서 제1 전구체 분자에 의해 기재에 결합된 연쇄에 추가 전구체 분자를 첨가하여 기재 상에 흡착제를 형성시킬 수 있다. 이와 같이 기재 상에 흡착제를 형성시키는 기작은 특히 흡착제가 중합체, 구체적으로 DNA 분자 또는 RNA 분자와 같은 생체중합체인 경우 매우 유용하다. 생체중합체 흡착제는 올리고뉴클레오티드 칩 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 기재에 부착된 제1 염기에 염기를 연속하여 더 첨가하여 만들 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,445,934호(Fodor et al.)를 참조하라.
도 2로부터 알 수 있듯이, 단일 기재에 결합시킬 수 있는 흡착제는 적게는 2개에서 부터 많게는 10, 100, 1000, 10,000개 또는 그 이상일 수 있다. 흡착제 부위의 크기는 실험 디자인과 목적에 따라 달라질 수 있다. 하지만, 충돌 에너지원의 직경(예, 레이저 점적 직경) 보다는 클 필요가 없다. 점적은 동일하거나 상이한 흡착제를 계속 유지할 수 있다. 일부 경우에는 기재상의 복수 위치에 동일 흡착제를 제공하여 복수의 다른 용출제에 대하여 평가하거나 또는 2차 가공과 같은 후속 사용이나 기준용으로 사용하기 위해 결합된 피분석물을 보관할 수도 있다. 또는, 복수의 상이한 흡착제를 가진 기재를 제공하는 경우에는 단일 시료에 대한 여러 흡착제의 조합으로 얻어지는 복수의 결합 특성을 이용하는 것이 가능하고, 그 결과 보다 다양한 피분석물을 결합 및 검출할 수 있게 된다. 단일 시료를 평가하기 위하여 기재 상에 존재하는 복수의 상이한 흡착제를 사용하는 것은 각각 상이한 크로마토그래피 컬럼을 이용하는 복수의 크로마토그래피 실험을 동시에 수행하는 것과 실질적으로 동일하지만, 본 발명의 방법이 단지 단일 시스템만을 필요로 한다는 잇점이 있다.
기재가 복수의 흡착제를 포함하는 경우에는, 소정의 어드레스성 위치에 흡착제를 제공하는 것이 특히 유용하다. 소정의 어드레스성 위치에 흡착제를 제공한 경우에 있어서, 소정의 제1 어드레스성 위치에 있는 흡착제는 제1 용출제로 세척하고 소정의 제2 어드레스성 위치에 있는 흡착제는 제2 용출제로 세척하는 것이 가능하다. 따라서, 흡착제의 결합 특성을 여러가지 방식으로 각각 선택적으로 변화시키는 복수의 용출제 존재하에서 피분석물에 대한 단일 흡착제의 결합 특성을 평가할 수 있다. 어드레스성 위치는 임의의 패턴으로 배열할 수 있으나, 규칙 패턴, 예컨대 직선, 직각 어레이 또는 원과 같은 규칙 곡선이 바람직하다. 이와 유사하게, 기재가 복수의 상이한 흡착제를 포함하는 경우에는 용출제의 존재하에 제시된 흡착제의 결합 특성을 규명하고자 각각의 여러 흡착제로 단일 용출제를 평가하는 것이 가능하다. 또한, 여러 용출제의 존재하에 여러 흡착제의 결합 특성을 평가하는 것이 가능하다.
(1) 증가 또는 구배 흡착제 표면
결합 특성이 상이한 일련의 흡착제는 기재 상에 복수의 상이한 중합체 흡착제를 합성시켜 제공할 수 있다. 상이한 중합체 흡착제는 기재에 전구체 분자를 부착시키고, 중합 반응을 개시시킨 뒤, 중합 반응을 각 흡착제마다 완결 시점을 달리하여 종결시켜 제조할 수 있다. 또한, 중합체 중의 말단 작용기는 이 중합체를 화학적으로 유도체화하기 위하여 여러 친화성 시약(예, -NH3또는 COO-)으로 다양한 정도로 반응시킬 수 있다. 중합 반응 또는 유도체화 반응을 종결시키면 중합 또는 유도체화 정도가 다양한 흡착제가 만들어진다. 중합 또는 유도체화의 다양한 정도는 각각 상이한 중합체 흡착제마다 다른 결합 특성을 제공한다. 이 구체예는 특히 기재 상에 복수의 상이한 생체중합체를 제공하는데 매우 유용하다.
필요한 경우, 중합 반응은 기재 자체에서보다는 반응 용기에서 실시할 수도 있다. 예컨대, 결합 특성이 다양한 중합체 흡착제는 중합/유도체화 반응이 진행되는 동안 반응 용기로부터 일정량의 생성물을 추출해내어 얻을 수 있다. 이와 같이 중합/유도체화 반응 동안 각각의 시점에서 추출한 일정량은 다양한 중합/유도체화도를 나타내어 복수의 상이한 흡착제를 제공할 것이다. 이러한 여러 일정량의 생성물은 결합 특성이 상이한 흡착제로서 이용할 수 있다. 또는, 복수의 상이한 흡착제는 반응을 종결시키는 단계, 일정량의 생성물을 수거하는 단계 및 중합/유도체화 반응을 재개시하는 단계를 연속 반복하여 제공할 수 있다. 따라서, 각 종결점에서 추출한 생성물은 다양한 중합/유도체화도를 나타내고, 결과적으로 결합 특성이 상이한 복수의 흡착제가 얻어질 것이다.
일 구체예에 있어서, 기재는 1 이상의 결합 특성을 1차원 또는 2차원 구배 로 변화시킨 흡착제가 피복된 스트립 또는 평판 형태로 제공한다. 예컨대, 스트립은 한쪽 말단이 약한 소수성이고 다른쪽 말단이 강한 소수성인 흡착제를 갖도록 만든다. 또는, 한쪽 모서리가 약한 소수성이며 음이온이고, 대각선의 반대편 모서리가 강한 소수성의 음이온성인 평판으로 만든다. 이와 같은 흡착 구배는 피분석물의 정량 분석에 유용하다. 흡착 구배는 조절 분무 적용하거나 시간별로 표면을 따라 흐르는 유동 물질로 만들어 구배 차원 상에서 반응을 점증적으로 완결시킬 수 있다. 이 공정을 직각으로 반복하면 여러 결합 특성을 가진 유사하거나 상이한 흡착제의 직각 구배를 제공할 수 있다.
피분석물을 함유하는 시료는 피분석물과 흡착제 사이에 결합을 가능하게 하는 임의의 적합한 방법을 사용하여 기재 상에 흡착제를 배치하기 전이나 배치한 후 흡착제에 접촉시킬 수 있다. 흡착제는 단순히 시료와 혼합 또는 결합시킬 수 있다. 시료와 흡착제의 접촉은 시료 중에 기재를 담그거나 침지시키거나, 또는 시료 중에 기재를 디핑하거나 또는 기재 상에 시료를 분무하거나, 기재 상을 시료로 세척하거나 또는 시료나 피분석물이 흡착제와 접촉되게 형성시켜 수행할 수 있다. 또한, 용출제 중에 시료를 용해시키거나 용출제와 시료를 혼합하고 용출제 용액과 시료를 전술한 임의의 기법(즉, 담금, 침지, 디핑, 분무 또는 세척)으로 흡착제와 접촉시켜 시료를 흡착제에 접촉시킬 수 있다.
b. 피분석물을 흡착제에 접촉시키는 단계
피분석물을 흡착제에 결합시키기 전에 시료를 용출제에 노출시키면 시료를 흡착제에 접촉시키는 동시에 흡착제의 선택성을 변화시키는 효과가 얻어진다. 흡착제에 결합하고, 그 결과 보유되는 시료의 성분으로는, 흡착제의 선택성을 변화시키는 용출 특성 없이 흡착제에 결합하는 모든 성분보다는, 시료와 혼합된 특정 용출제의 존재하에 흡착제에 결합하게 되는 성분만을 포함할 것이다.
시료는 피분석물을 흡착제에 결합시키기에 충분한 시간 동안 흡착제와 접촉시켜야 한다. 일반적으로, 시료와 피분석물의 접촉 시간은 약 30초 내지 약 12 시간 사이이다. 이 접촉 시간은, 특히 약 30초 내지 약 15 분 사이인 것이 바람직하다.
시료와 흡착제의 접촉 온도는 선택된 특정 시료와 흡착제의 함수이다. 보통, 시료는 주위 온도 및 압력 조건하에 흡착제와 접촉시키는 것이 일반적이나, 일부 시료의 경우에는 변화된 온도(일반적으로 4 ℃ 내지 37 ℃) 및 압력 조건이 바람직할 수 있고, 당업자라면 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
종래의 검출 기법에 비하여 본 발명의 또 다른 잇점은 본 발명을 통해 극소량의 시료를 가지고 많은 다양한 실험을 수행할 수 있다는 것이다. 일반적으로, 피분석물 수 원자몰 내지 100 피코몰을 함유하는 시료 약 1 ㎕ 내지 500 ㎕의 부피는 흡착제에 결합시키기에 충분하다. 보유된 모든 피분석물을 탈착 및 검출하는 단계로 처리되지 않는 임의의 흡착제 위치는 그 위에 피분석물을 보유하기 때문에 피분석물은 흡착제에 결합시킨 후 추가 실험을 위해 보존할 수 있다. 따라서, 단지 극소량의 시료만이 분석에 사용할 수 있는 경우에도 본 발명은 여러 흡착제 및/또는 용출제를 사용하는 복수의 실험을 시료의 낭비 없이 여러번 실시할 수 있다는 잇점을 제공한다.
c. 용출제로 흡착제를 세척하는 단계
시료를 피분석물과 접촉시켜 피분석물을 흡착제에 결합시킨 후, 흡착제를 용출제로 세척한다. 다중차원의 분석을 실시하려면 각각의 흡착제 위치를 적어도 상이한 제1 용출제 및 제2 용출제로 세척하는 것이 일반적이다. 용출제로 세척하면 특정 흡착제 상에 보유된 피분석물군이 변화된다. 용출제의 용출 특성과 흡착제의 결합 특성의 조합은 세척 후 흡착제에 보유되는 피분석물을 조절하는 선택성 조건을 제공한다. 즉, 세척 단계는 흡착제로부터 시료 성분을 선택적으로 제거한다.
세척 단계는 각종 기법을 사용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 전술한 바와 같이, 시료를 제1 용출제에 용해시키거나 혼합한 다음 시료를 흡착제에 접촉시킨다. 시료를 흡착제에 접촉시키기 전이나 접촉과 동시에 제1 용출제에 시료를 노출시키면 피분석물을 흡착제에 결합시키고 이어서 흡착제를 제1 용출제로 세척한 것과 동일한 총 효과가 처음으로 얻어진다. 이 흡착제에 복합 용액을 접촉시키고, 그 다음 흡착제를 제2 용출제 또는 그 이후의 용출제로 세척할 수 있다.
피분석물이 결합된 흡착제의 세척은 흡착제와 피분석물이 결합되어 있는 기재를 용출제중에 담그거나 침지시키거나 또는 디핑하여 수행하거나, 또는 용출제로 기재상을 세정, 분무 또는 세척하여 수행할 수 있다. 직경이 작은 친화성 시약 점적에 용출제를 유입시키는 최선의 방법은 미시유체학 방법이다.
피분석물이 단지 하나의 위치에서 흡착제에 결합되고 세척 단계에 복수의 다른 용출제가 사용되면 각 용출제의 존재하에 흡착제의 선택성에 대한 정보를 개별적으로 얻을 수 있다. 한 위치에 있는 흡착제에 결합된 피분석물은 제1 용출제로 세척하고 보유된 피분석물을 탈착 및 검출한 후 제2 용출제로 세척하고 보유된 피분석물을 탈착 및 검출하는 반복 패턴으로 이루어지는 용출제로의 각 세척 단계 후 측정될 수 있다. 세척 후 탈착 및 검출 단계는 동일한 흡착제를 사용하여 복수의 상이한 용출제에 대하여 연속적으로 반복할 수 있다. 이와 같은 방식으로, 단일 위치에 보유된 피분석물을 가진 흡착제는 복수의 상이한 용출제를 사용하여 재조사될 수 있어 각각의 세척 후 보유된 피분석물에 대한 많은 정보를 수집할 수 있게 된다.
또한, 상기 방법은 흡착제가 모두 동일하거나 상이하거나 간에 소정의 복수 어드레스성 위치에 제공될 때 유용하다. 하지만, 피분석물이 복수의 위치에서 동일하거나 상이한 흡착제에 결합되어 있는 경우에는, 세척 단계는 병행 공정을 포함하는 보다 조직적이고 효율적인 방식으로 실시될 수도 있다. 즉, 세척 단계는 제1 위치에 있는 흡착제를 용출제로 세척하고, 그 다음 제2 흡착제를 용출제로 세척한 다음, 제1 흡착제에 보유된 피분석물을 탈착시켜 검출하고, 이어서 제2 흡착제에 보유된 피분석물을 탈착시켜 검출하는 공정으로 실시될 수 있다. 바꾸어 말하면, 모든 흡착제는 용출제로 세척한 후 각각에 보유된 피분석물을 흡착제의 각 위치마다 탈착시켜 검출한다. 필요한 경우에는, 각 흡착제 위치에서 검출한 후 각 흡착제 위치마다 제2 세척 단계를 실시한 다음 제2 탈착 및 검출 단계를 실시할 수도 있다. 모든 흡착제 위치를 세척하고 각 흡착제 위치마다 탈착 및 검출하는 단계는 복수의 상이한 용출제를 사용하여 반복할 수 있다. 이와 같은 방식으로 전체 어레이를 이용하여 시료 중의 피분석물의 특성을 효율적으로 측정할 수 있다. 이 방법은 모든 흡착제 위치가 제1 세척 단계에서 동일한 용출제로 세척되거나 또는 복수의 흡착제가 제1 세척 단계에서 복수의 상이한 용출제로 세척되거나 간에 유용하게 사용될 수 있다.
2. 검출
세척후 흡착제에 보유된 피분석물을 기재에 흡착시킨다. 기재상에 보유된 피분석물은 흡착제로부터 피분석물을 탈착시키고 탈착된 피분석물을 직접 검출하는 탈착 분광분석으로 검출한다.
a. 탈착 방법
흡착제로부터 피분석물의 탈착에는 적절한 에너지원에 피분석물을 노출시키는 단계를 포함한다. 이것은 일반적으로 피분석물을 방사선 에너지 또는 에너지 입자에 충돌시키는 것을 의미한다. 예컨대, 에너지는 레이저 에너지(예컨대, UV 레이저) 형태의 광에너지 또는 플래시 램프 유래의 에너지일 수 있다. 또는, 에너지는 파스트 원자류일 수 있다. 또한, 열을 사용하여 탈착을 유도/보조할 수도 있다.
직접 분석에 사용되는 피분석물의 탈착 및/또는 이온화 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 그 1가지 방법은 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 또는 MALDI라는 것이다. MALDI에서는 피분석물 용액을 매트릭스 용액과 혼합하고 이 혼합물을 불활성 프로브 표면 상에 침착시킨 후 결정화시키는데, 이 결정내에 피분석물이 포획되어 탈착이 가능해진다. 매트릭스는 레이저 에너지를 흡수하고, 이 에너지를 피분석물에 명백히 부여하여 탈착과 이온화를 일으킬 수 있는 것을 선택한다. 일반적으로, 매트릭스는 UV 범위의 광을 흡수한다. 대형 단백질용 MALDI에 대해서는, 예컨대 미국 특허 제5,118,937호(Hillenkamp et al.) 및 미국 특허 제5,045,694호(Beavis and Chait)에 개시되어 있다.
표면 증강 레이저 탈착/이온화 또는 SELDI는 특이성, 선택성 및 민감성 면에서 MALDI보다 매우 향상된 것이다. SELDI는 미국 특허 제5,719,060호(Hutchens and Yip)에 개시되어 있다. SELDI는 피분석물의 포획 및/또는 탈착을 향상시키는 표면 상에서 에너지류에 피분석물을 노출시키는 탈착용 고체상 방법이다. 이와 반대로, MALDI는 피분석물 주위를 결정화하는 액체 물질과 피분석물을 혼합하는 액상 방법이다.
SEAC(표면 증강 친화성 포획)이라고 하는 SELDI의 한 변형예는 친화성 포획 장치(즉, 흡착제)와 함께 피분석물을 탈착 에너지에 노출시키는 것을 포함한다. 피분석물이 이와 같이 흡착되면 탈착 에너지원에 노출되는 기회가 증대되어 표적 피분석물을 양호하게 탈착시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 탈착을 보조하기 위하여 프로브에 에너지 흡수 물질을 첨가할 수 있다. 그 다음, 피분석물을 탈착시키기 위한 에너지원에 상기 프로브를 제공한다.
SEND(표면 증강 순물질 탈착)라고 하는 SELDI의 한 변형예는 피분석물을 상부에 배치한 에너지 흡수 물질 층을 사용하는 것을 포함한다. 기재 표면은 이 표면에 화학적으로 결합되고(또는) 결정이 실질적으로 없는 에너지 흡수 물질 층을 포함한다. 이 층의 표면에 피분석물을 실질적으로 혼합됨이 없이 단독물(즉, 순물질)로 피복시킨다. 매트릭스와 마찬가지로 에너지 흡수 분자는 탈착 에너지를 흡수하여 피분석물을 탈착시킨다. 이 방법은 피분석물이 보다 간단하고 균일한 방식으로 에너지원에 제공되고 용액 혼합물과 무작위 결정화의 현상이 제거되기 때문에 일층 향상된 방법이다. 이 방법은 보다 균일하고 예측가능한 결과를 제공하여 공정의 자동화가 가능할 것이다. 에너지 흡수 물질은 고전적인 매트릭스 물질이거나 pH가 중성화되거나 염기성 범위로 변화된 매트릭스 물질일 수 있다. 에너지 흡수 물질은 공유 또는 비공유 수단을 통해 프로브에 결합될 수 있다.
SELDI의 또 다른 변형예인 SEPAR(표면 증강 광불안정성 부착 및 박리)은 광불안정성 부착 분자의 사용을 포함하는 것이다. 광불안정성 부착 분자는 고체상(예컨대, 평평한 프로브 표면) 또는 기타 다른 고체상(예컨대, 비드)에 공유 결합되어 프로브의 일부가 될 수 있는 제1 부위와, 친화성 시약 또는 피분석물에 공유 결합될 수 있는 제2 부위를 가진 2가 분자이다. 또한, 광불안정성 부착 분자는 표면과 피분석물에 결합되면 광에 노출시 친화성 시약이나 피분석물을 방출시킬 수 있는 광불안정성 결합을 포함하기도 한다. 광불안정성 결합은 프로브 표면이나 피분석물(또는 친화성 시약)이 부착하는 부위 또는 부착 분자내에 존재할 수 있다.
b. 피분석물의 직접 검출 방법
탈착된 피분석물은 여러가지 수단으로 검출할 수 있다. 피분석물이 레이저 탈착/이온화 질량 분광분석에서와 같은 탈착 공정에서 이온화되는 경우에 검출기는 이온 검출기일 수 있다. 질량 분석계는 일반적으로 탈착된 이온의 비행 시간을 측정하는 수단을 포함한다. 이 정보는 질량으로 변환된다. 하지만, 탈착된 이온을 분할 및 검출하기 위하여 탈착된 이온의 질량을 측정할 필요는 없다. 즉, 이온화된 피분석물이 상이한 시점에서 검출기에 충돌한다는 사실이 이온화된 피분석물의 검출과 분할을 제공한다.
또는, 피분석물은 형광성부 또는 방사성부 등으로 검출가능하게 표지시킬 수 있다. 이 경우에, 검출기는 형광 검출기 또는 방사능 검출기일 수 있다.
또한, 어레이 중의 각 위치에 있는 보유물에 결합된 피분석물 성분과 기능을 완전하게 분석하기 위하여 복수의 검출 수단을 연속으로 실행시킬 수도 있다.
c. 탈착 검출기
탈착 검출기는 피분석물을 흡착제로부터 탈착시키는 수단과 탈착된 피분석물을 직접 검출하는 수단을 포함한다. 즉, 탈착 검출기는 탈착된 피분석물을 또 다른 고체상에 포획시키고 후속 분석하는 중간 단계 없이 피분석물을 검출한다. 피분석물의 검출은 일반적으로 시그널 강도의 검출을 포함한다. 즉, 흡착제에 흡착된 피분석물의 양을 나타낸다.
이러한 2가지 부재 외에도 탈착 검출기는 다른 부재를 포함할 수 있다. 그 중 1가지는 탈착된 피분석물을 검출기쪽으로 가속화시키는 수단이다. 또 다른 부재는 탈착에서 부터 검출기에 의한 검출까지 피분석물의 비행시간을 측정하는 수단이다.
바람직한 탈착 검출기는 당해 기술 분야에 공지된 레이저 탈착/이온화 질량 분석계이다. 이 질량 분석계는 흡착된 피분석물, 예컨대 프로브를 보유하는 기재를 장착할 수 있는 포트(port)를 포함한다. 탈착은 레이저 에너지와 같은 에너지를 피분석물에 충돌시켜 실시한다. 이 장치는 어레이상의 점적이 레이저 빔의 선상에 위치하도록 표면을 이동시키는 수단을 포함할 수 있다. 피분석물에 레이저를 충돌시키면 본래의 피분석물이 비행 튜브로 탈착되고 이온화된다. 비행 튜브는 일반적으로 진공 공간을 의미한다. 진공 튜브의 한 부분에 있는 대전판은 이온화된 피분석물을 검출기쪽으로 가속화시키는 전위를 형성시킨다. 시계가 비행 시간을 측정하고 시스템 전자 수단이 피분석물의 속도를 측정하고, 이 속도를 질량으로 변환시킨다. 당업자에게는 자명하듯이, 이 부재들은 모두 탈착, 가속화, 검출, 시간 측정 등에 관한 각종 수단을 이용하는 탈착 검출기의 어셈블리에 본 명세서에 기재된 다른 부재와 결합될 수 있다.
B. 선택성 조건
본 발명의 1가지 잇점은 다양한 여러 결합 조건과 용출 조건에 피분석물을 노출시키는 능력으로, 피분석물의 분할능 증가와 피분석물에 대한 정보를 모두 인식 프로파일의 형식으로 제공한다. 종래의 크로마토그래피 방법에서와 같이, 피분석물을 보유하는 흡착제의 능력은 용출제에 대한 피분석물의 유인성 또는 친화도나 흡착제에 대한 용출제의 유인성이나 친화도와 비교되는 흡착제에 대한 피분석물의 유인성이나 친화도와 직접적인 관련이 있다. 시료의 일부 성분이 흡착제에 대해 전혀 친화도가 없으면 시료가 흡착제에 접촉하여도 흡착제에 결합하지 않을 것이다. 이와 같이 흡착제에 결합하는 능력이 없으면, 이 성분은 분할되는 피분석물로부터 즉시 분리될 것이다. 하지만, 사용된 특정 흡착제와 시료의 성질에 따라 수많은 여러 성분이 초기에 흡착제에 결합될 수 있다.
1. 흡착제
흡착제는 피분석물과 결합하는 물질이다. 보유물 크로마토그래피에는 복수의 흡착제를 이용할 수 있다. 여러 종류의 흡착제는 매우 다른 결합 특성, 다소 다른 결합 특성, 또는 미묘하게 다른 결합 특성을 나타낼 수있다. 매우 다른 결합 특성을 나타내는 흡착제는 일반적으로 유인 작용의 기본 원리나 상호작용의 방식이 다르다. 흡착제와 피분석물 사이의 유인 작용의 기본 원리로는, 예컨대 (1) 염 촉진성 상호작용, 예컨대 소수성 상호작용, 호황성 상호작용 및 고정 염료 상호작용; (2) 수소 결합 및/또는 반데르발스력 상호작용 및 전하 전이 상호작용, 예컨대 친수성 상호작용; (3) 이온 전하 상호작용, 구체적으로 양이온 또는 음이온 전하 상호작용과 같은 정전 상호작용; (4) 흡착제 상의 금속 이온과 피분석물이 배위 공유 결합(즉, 배위 착물 형성)을 형성하는 능력; (5) 효소 활성 부위 결합; (6) 가역 공유 상호작용, 예컨대 이황화 교환 상호작용; (7) 당단백질 상호작용; (8) 생체특이성 상호작용; 또는 (9) 전술한 상호작용 방식의 2종 이상의 조합을 포함한다. 즉, 흡착제는 2종 이상의 상호 작용의 기본 원리를 나타낼 수 있어, "복합 작용성" 흡착제라고 할 수 있다.
a. 염 촉진성 상호작용 흡착제
염촉진성 상호작용을 관찰하는데 유용한 흡착제로는 소수성 상호작용 흡착제를 포함한다. 소수성 상호작용 흡착제의 예로는 지방족 탄화수소, 구체적으로 C1-C18지방족 탄화수소를 가진 매트릭스 및 페닐기와 같은 방향족 탄화수소 작용기를 가진 매트릭스를 포함한다. 소수성 상호작용 흡착제는 비하전 용매에 의해 노출된 아미노산 잔기, 구체적으로 비극성, 방향족 및 소수성 아미노산 잔기라고 일반적으로 불리는 아미노산 잔기, 예컨대 페닐알라닌 및 트립토판을 포함하는 피분석물을 결합시킨다. 소수성 상호작용 흡착제에 결합하는 피분석물의 구체적인 예로는 리소자임과 DNA를 포함한다. 이것은 DNA 중의 방향족 뉴클레오티드, 구체적으로 퓨린 기 및 피리미딘기를 통해 DNA를 소수성 상호작용 흡착제에 결합시키기 때문인 것으로 추정되는데, 이러한 특정 이론에만 국한되지는 않을 것이다.
염 촉진성 상호작용에 유용한 또 다른 흡착제로는 호황성 상호작용 흡착제, 예컨대 미국 일리노이주 록포드에 소재하는 피어스 제품인 호황성 흡착제의 한 종류인 T-GEL(등록상표명)이 있다. 호황성 상호작용 흡착제는, 예컨대 IgG와 같은 면역글로불린에 결합한다. IgG와 T-GEL(등록상표명) 간의 상호작용의 기작은 완전히 공지된 것은 아니지만, 용매에 의해 노출된 trp 잔기가 역할을 하는 것으로 추정된다.
염 촉진성 이온 상호작용과 소수성 상호작용을 포함하는 제3의 흡착제로는 고정 염료 상호작용 흡착제가 있다. 고정 염료 상호작용 흡착제로는 고정 염료의 매트릭스, 예컨대 미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 바이오텍 제품인 CIBACHRON™블루를 포함한다. 고정 염료 상호작용 흡착제는 일반적으로 단백질과 DNA를 결합시킨다. 고정 염료 상호작용 흡착제에 결합하는 단백질의 구체적인 일예는 소 혈청 알부민(BSA)이다.
b. 친수성 상호작용 흡착제
친수성 상호작용을 기초로 한 수소 결합 및/또는 반데르발스력을 관찰하기에 유용한 흡착제로는 산화규소(즉, 유리)와 같은 정상상 흡착제를 포함하는 표면이 있다. 정상상 또는 산화규소 표면은 작용기로서 작용한다. 또한, 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 아가로스 또는 셀룰로스로 변형된 표면을 포함하는 흡착제는 친수성 상호작용 흡착제로서 작용할 수 있다. 대부분의 단백질은 수소 결합 또는 반데르발스력을 포함하는 친수성 상호작용을 통해 결합하는 일군의 아미노산 잔기(즉, 친수성 아미노산 잔기) 또는 이의 조합에 의해 친수성 상호작용 흡착제에 결합할 것이다. 친수성 상호작용 흡착제에 결합하는 단백질의 예로는 미오글로빈, 인슐린 및 시토크롬 C를 포함한다.
일반적으로, 극성 또는 하전된 아미노산을 고비율로 보유하는 단백질은 친수성 표면에 보유될 것이다. 또는, 표면 노출된 친수성 당 부를 가진 당단백질 역시 친수성 흡착제에 대해 높은 친화성이 있다.
c. 정전 상호작용 흡착제
정전 상호작용 또는 이온 전하 상호작용을 관찰하기에 유용한 흡착제로는 음이온 흡착제, 예컨대 황산염 음이온(즉, SO3 -) 매트릭스 및 카르복실산염 음이온(즉, COO-) 또는 인산염 음이온(OPO3 -)의 매트릭스가 있다. 황산염 음이온을 가진 매트릭스는 영구적으로 음하전을 띤다. 하지만, 카르복실산염 음이온을 가진 매트릭스는 pKa 보다 높은 pH에서만 음전하이다. pKa 보다 낮은 pH에서, 매트릭스는 실질적으로 중성의 전하를 나타낸다. 적합한 음이온성 흡착제로는 황산염 및 카르복실산염 음이온과 인산염 음이온의 조합물을 가진 매트릭스인 음이온성 흡착제가 있다. 이 조합물은 pH의 함수로서 계속 변화될 수 있는 음 전하의 강도를 제공한다. 이 흡착제는 리보뉴클레아제 및 락토페린과 같은 양전하를 가진 단백질과 거대분자를 유인하여 결합시킨다. 결합 상호작용은 리신 잔기, 아르기닌 잔기 및 히스티딜 잔기를 비롯한 양하전 아미노산 잔기와 흡착제 사이의 정전 상호작용에 의한 것으로 추정되지만, 이 이론으로만 국한하여 설명할 수는 없을 것이다.
정전 상호작용 또는 이온 전하 상호작용에 유용한 기타 다른 흡착제로는 양이온 흡착제를 포함한다. 양이온 흡착제의 구체적인 예로는 2가, 3가 또는 4가 아민의 매트릭스를 포함한다. 4가 아민은 영구적으로 양하전을 띠지만, 2가 아민과 3가 아민은 pH 의존적인 전하를 갖고 있다. 따라서, pKa 이하의 pH에서는 2가 및 3가 아민은 양하전을 띠고, pKa 보다 높은 pH에서는 음하전을 띤다. 또한, 적합한 양이온 흡착제로는 여러 2가, 3가 및 4가 아민의 조합을 보유하는 매트릭스인 양이온 흡착제가 있다. 이 조합물은 pH의 함수로서 계속적으로 변화할 수 있는 양전하의 강도를 제공한다. 양이온성 상호작용 흡착제는 아스파르트산 및 글루탐산 잔기와 같이 용매 노출성 아미노산 잔기를 가진 단백질을 비롯한 분자 상의 음이온 부위에 결합한다.
이온성 상호작용 흡착제(음이온성 및 양이온성 모두)인 경우에는 음이온과 양이온을 모두 포함하는 혼합형 이온 흡착제를 사용하는 것이 보통 바람직하다. 이와 같은 흡착제는 pH의 함수로서 지속적인 완충능을 제공한다. 이 지속적인 완충능으로 인하여 특히 pH 범위가 2 내지 11인 다양한 완충 성분을 보유하는 용출제에 조합된 피분석물을 노출시킬 수 있다. 이것은 고정된 적정성 양성자 교환기에 의해 특징지워지는 흡착제 상의 국소 pH 환경을 생성시킨다. 이와 같은 시스템은 크로마토포커싱이라고 알려진 고체상 분리 기법과 균등한 효과를 나타낸다. 하전된 탄수화물 성분이 주로 다른 난포 자극 호르몬의 아이소폼은 크로마토포커싱 흡착제에 의해 분리된다.
정전 상호작용을 관찰하는데 유용한 기타 다른 흡착제로는 정식 전하 또는 적정성 단백질 공여체 또는 수용체의 관여 없이 정전성 상호작용이 형성되어 있는 쌍극간 상호작용 흡착제가 있다.
d. 배위 공유 상호작용 흡착제
금속 이온과 배위 공유 결합을 형성하는 작용을 관찰하는데 유용한 흡착제로는, 예컨대 2가 및 3가 금속 이온을 보유하는 매트릭스를 포함한다. 고정화된 금속 이온 킬레이터의 매트릭스는 기본적으로 전이 금속 이온과 배위 공유 상호작용을 형성하는 1 이상의 전자 공여체기를 가진 고정화된 합성 유기 분자를 제공한다. 고정화된 금속 이온 킬레이터로서 작용하는 주요 전자 공여체기로는 산소, 질소 및 황을 포함한다. 금속 이온은 고정화된 금속 이온 킬레이트에 결합하여, 피분석물 상의 전자 공여기와 상호작용하는 일부 잔부를 보유한 금속 이온 착물을 형성시킨다. 적합한 금속 이온으로는 일반적인 전이 금속 이온, 예컨대 구리, 니켈, 코발트, 아연, 철 및 알루미늄과 칼슘 같은 다른 금속 이온을 포함한다. 금속 이온은 펩티드, 단백질 또는 핵산 중의 특정 아미노산 잔기와 선택적으로 상호작용하는 것으로 생각되지만, 이 이론에만 국한된다고 말할 수는 없다. 일반적으로, 이와 같은 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기로는 히스티딘 잔기, 티로신 잔기, 트립토판 잔기, 시스테인 잔기 및 아스파르트산과 글루탐산 같은 산소 기를 보유한 아미노산 잔기를 포함한다. 예컨대, 고정화된 철(III) 이온은 단백질 상의 포스포세린, 포스포티로신 및 포스포트레오닌 잔기와 상호작용한다. 고정화된 금속 이온에 따라서 전술한 아미노산 잔기의 국소 밀도가 충분한 단백질만이 흡착제에 보유될 것이다. 금속 이온과 단백질 간의 일부 상호작용은 매우 강하기 때문에 이 복합체로부터 단백질을 통상적인 방법으로 절단할 수는 없다. 고도로 인산화된 인간 β카제인은 고정화된 Fe(III)에 매우 강하게 결합된다. 6-히스티딘 태그와 함께 발현되는 재조합 단백질은 고정화된 Cu(II) 및 Ni(II)에 매우 강하게 결합한다.
e. 효소 활성 부위 상호작용 흡착제
효소 활성 부위 결합 상호작용을 관찰하는데 유용한 흡착제로는 프로테아제(예, 트립신), 포스파타제, 키나제 및 뉴클레아제를 포함한다. 이 상호작용은 효소 상의 촉매성 결합 부위와 피분석물(일반적으로 생체중합체) 상의 효소 결합 부위 간의 서열 특이적 상호작용이다. 이러한 유형의 효소 결합 부위로는, 예컨대 서열 중에 리신-리신 쌍 또는 리신-아르기닌 쌍을 가진 펩티드 및 단백질과 상호작용하는 트립신의 활성 부위를 포함한다. 보다 구체적으로, 대두 트립신 억제제는 고정화된 트립신의 흡착제와 상호작용하여 결합한다. 또는, 세린 프로테아제는 고정화된 L-아르기닌 흡착제 상에 선택적으로 보유된다.
f. 가역성 공유 상호작용 흡착제
가역성 공유 상호작용을 관찰하기에 유용한 흡착제로는 이황화물 교환 상호작용 흡착제를 포함한다. 이황화물 교환 상호작용 흡착제로는 고정화된 설프히드릴기, 예컨대 머캅토에탄올 또는 고정화된 디티오트레이톨을 함유하는 흡착제를 포함한다. 이 상호작용은 피분석물 상의 용매 노출성 시스테인 잔기와 흡착제 간의 공유 이황화 결합으로 주로 형성되는 것이다. 이와 같은 흡착제는 환원된 황 화합물을 포함하도록 변형된 염기를 포함하는 핵산 및 시스테인 잔기를 가진 단백질이나 펩티드를 결합시킨다.
g. 당단백질 상호작용 흡착제
당단백질 상호작용을 관찰하는데 유용한 흡착제로는 렉틴(즉, 올리고당을 보유한 단백질)이 고정화된 흡착제 같은 당단백질 상호작용 흡착제가 있고, 그 예로는 미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 바이오테크의 시판품인 CONCONAVALIN™이 있다. 이와 같은 흡착제는 거대 분자 상에 존재하는 탄수화물 부의 분자 인식을 비롯한 상호작용에 근거하여 작용한다. 당단백질 상호작용 흡착제와 상호작용하여 결합하는 피분석물의 예로는 당단백질, 구체적으로 히스티딘 고밀도 당단백질, 전세포 및 분리된 아세포 분획을 포함한다.
h. 생체특이적 상호작용 흡착제
생체특이적 상호작용을 관찰하기에 유용한 흡착제는 일반적으로 "생체특이적 친화도 흡착제"라고 불린다. 흡착이 선택적이고 친화도(평형 해리 상수, Kd)가 10-3M 이상 내지 (예컨대 10-5M, 10-7M, 10-9M)인 경우에 흡착이 생체특이적인 것으로 간주한다. 생체특이적 친화도 흡착제의 예로는 특정 생체분자와 특이적으로 상호작용하고 결합하는 임의의 흡착제를 포함한다. 생체특이적 친화도 흡착제로는, 예컨대 항원에 결합하는 고정화된 항체; DNA 결합 단백질, DNA 및 RNA에 결합하는 고정화된 DNA; 단백질과 효소에 결합하는 고정화된 기질 또는 억제제; 약물 결합 단백질에 결합하는 고정화된 약물; 수용체에 결합하는 고정화된 리간드; 리간드에 결합하는 고정화된 수용체; DNA 및 RNA 결합 단백질에 결합하는 고정화된 RNA; 비오틴 및 비오틴화된 분자에 결합하는 고정화된 아비딘 또는 스트렙트아비딘; 지질 결합 단백질에 결합하는 고정화된 인지질 막 및 소포를 포함한다. 효소는 피분석물 흡착제를 변형시킬 수 있는 유용한 흡착제이다. 세포는 흡착제로서 유용하다. 세포의 표면은 복잡한 결합 특성을 갖고 있다. 세포에 대한 흡착은, 예컨대 표면 수용체에 결합하는 시그널 분자 또는 리간드를 동정하는데 유용하다. 또한, 바이러스 또는 파지 역시 흡착제로서 유용하다. 바이러스는 종종 세포 표면 수용체에 대한 리간드를 가지고 있다(예컨대, CD4에 대한 gp120). 또한, 파지 디스플레이 라이브러리의 형태에서 파지 외피 단백질은 표적에 대한 결합을 시험하기 위한 제제로서 작용한다. 생체특이적 상호작용 흡착제는 전술한 바와 같은 공지의 특이적 상호작용에 따라 좌우된다. 흡착제가 이용될 수 있는 생체특이적 상호작용의 기타 다른 예는 당업자에게 자명하며 본 발명을 통해 고찰되고 있다.
일 구체예에 있어서, 생체특이적 흡착제는 표적 피분석물의 결합에는 직접 참여하지 않는 보조 또는 "헬퍼" 분자를 더 포함할 수 있다.
i. 결합 특이성의 정도
시료의 성분은 여러 상호작용 방식을 가진 흡착제에 노출시키면 여러 흡착제와의 상호작용에 따라 크게 분류할 수 있다. 따라서, 여러 상호작용 방식을 가진 흡착제에 대한 피분석물의 유인성이 제1의 분리 변수이다. 예컨대, 소수성과 관련된 유인성을 주로 하는 제1 흡착제 및 이온 전하와 관련된 유인성을 주로 하는 제2 흡착제에 피분석물을 함유하는 시료를 노출시키면, 소수성 흡착제에 결합하는 피분석물을 시료로부터 분리하고, 특정 이온 전하를 가진 흡착제에 결합하는 피분석물을 분리하는 것이 가능하다.
여러 친화성의 기본 원리를 가진 흡착제는 이 흡착제가 피분석물 뿐만 아니라 동일한 유인성 원리로 흡착제에 대해 유인성을 나타내는 시료 중의 기타 다른 임의 성분에도 결합하기 때문에 저특이성도로 피분석물 분할능을 나타낸다. 예컨대, 소수성 흡착제는 소수성 피분석물 뿐 아니라 시료 중의 기타 다른 소수성 성분도 결합시키고, 음하전된 흡착제는 양하전된 피분석물 뿐 아니라 시료 중의 기타 다른 양하전된 성분도 결합시킨다.
흡착제에 대한 피분석물의 유인성 기본 원리에 근거하여 분할된 피분석물은 비교적 중간 특이성의 결합 특성이나 변화된 유인성 강도의 결합 특성을 이용하여 더 정제할 수 있다. 중간 특이성의 결합 특성에 근거한 피분석물의 분할은, 예컨대 혼합 작용성 흡착제를 이용하여 수행할 수 있다. 즉, 일단 비교적 저특이성으로 피분석물을 분할한 후, 목적 피분석물을 유인하는 것으로 밝혀진 결합 특성을 기타 여러 결합 및 용출 특성과 함께 이용하여 보다 바람직하지 않은 성분을 제거하여 피분석물을 분할한다.
예컨대, 피분석물이 소수성 흡착제에 결합하는 경우, 이 피분석물은 유인성의 1가지 기본 원리로서 소수성 상호작용을 나타내고, 또한 제2의 다른 유인성 기본 원리를 나타내는 혼합 작용성 흡착제를 제공하여 다른 소수성 시료 성분으로부터 더 분할될 수 있다. 이 혼합 작용성 흡착제는 양하전된 소수성 피분석물을 결합시키기 위한 음하전된 이온성 상호작용과 소수성 상호작용을 나타낼 수 있다. 또는, 혼합 작용성 흡착제는 흡착제 상의 금속 이온과 배위 복합체를 형성하는 능력을 가진 소수성 피분석물을 결합시키기 위하여 금속 이온과 배위 공유 결합을 형성하는 능력과 소수성 상호작용을 나타낼 수 있다. 또 다른 중간 특이성의 결합 특성을 나타내는 흡착제의 예는 본 명세서에 기재된 상세한 설명과 전술한 예를 통해 당업자라면 충분히 알 수 있을 것이다.
중간 특이성의 결합 특성을 기본 원리로 한 피분석물의 분할은 비교적 고 특이성인 결합 특성을 이용하여 더 정제할 수 있다. 비교적 고 특이성의 결합 특성은 동일한 유인성의 기본 원리를 나타내지만 상이한 유인성 강도를 나타내는 각종 흡착제를 이용할 수 있다. 즉, 친화성의 기본 원리가 동일하더라도, 다른 시료 성분의 피분석물은 이 피분석물에 대해 여러 친화도를 가진 흡착제를 이용하여 더 분할할 수 있다.
예컨대, 피분석물의 산성 성질에 근거하여 흡착제에 결합하는 피분석물은 특정 산성 pH 범위에서 피분석물에 대해 친화성을 나타내는 흡착제를 이용하여 다른 산성 시료 성분으로부터 더 분할시킬 수 있다. 따라서, 피분석물은 pH 1 내지 2의 시료 성분에 유인된 제1 흡착제, pH 3 내지 4의 시료 성분에 유인된 제2 흡착제 및 pH 5 내지 6의 시료 성분에 유인된 제3 흡착제를 사용하여 분할할 수 있다. 이와 같은 방식에서, pH 5 내지 6의 피분석물에 결합하는 흡착제에 대해 특이적 친화성이 있는 피분석물은 pH 1 내지 4의 시료 성분으로부터 분할될 것이다. 특이성이 증가되는 흡착제는 유인 간격, 즉 동일한 유인 원리를 나타내는 흡착제의 결합 특성 간의 차이를 감소시킬 수 있다.
제1 흡착제에 흡착된 제1 피분석물은 그 자체가 흡착 성질을 가질 수 있다. 이 경우, 기재에 흡착된 제1 피분석물은 제2 피분석물을 분리하는 제2 흡착제가 될 수 있다. 또한, 보유된 제2 피분석물은 시료로부터 제3 피분석물을 분리하는 제3 흡착제로서 작용할 수 있다. 이 공정은 여러 차례 반복 과정으로 계속할 수 있다.
2. 용출제
용출제 또는 세척 용액은 피분석물과 흡착제 간의 흡착의 허용한계를 선택적으로 변화시킨다. 결합된 피분석물을 탈착 및 용출시키는 용출제의 능력은 용출 특성의 함수이다. 여러 용출제는 매우 다른 용출 특성, 다소 다른 용출 특성 또는 미묘하게 다른 용출 특성을 나타낼 수 있다.
용출제와 흡착제의 접촉 온도는 선택된 흡착제와 특정 시료의 함수이다. 일반적으로, 용출제는 0 ℃ 내지 100 ℃ 온도, 바람직하게는 4 ℃ 내지 37 ℃의 사이에서 흡착제에 접촉시킨다. 하지만, 일부 용출제의 경우에는 다른 온도가 바람직할 수 있고, 이 온도는 당업자라면 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
흡착제와 마찬가지로, 매우 다른 용출 특성을 나타내는 용출제는 일반적으로 유인 원리에 따라 달라진다. 예컨대, 용출제와 피분석물 사이의 각종 유인 원리로는 전하 또는 pH, 이온 강도, 물의 구조, 특정 경쟁적 결합 시약의 농도, 표면 장력, 유전 상수 및 이들의 2 이상이 조합을 포함한다.
a. pH계 용출제
pH(즉, 전하)를 기본 원리로 한 흡착제의 선택성을 변화시키는 용출제로는 공지의 pH 완충액, 산성 용액 및 염기성 용액을 포함한다. 소정의 흡착제에 결합된 피분석물을 특정 pH 완충액으로 세척하면, 전하가 변화될 수 있고, 이에 따라 특정 pH 완충액의 존재하에 피분석물과 흡착제 간의 결합 강도가 공격받을 수 있다. 즉, 용출제의 pH에서 흡착제에 대해 경쟁성이 낮은 피분석물은 탈착되고, 용출제의 pH에서 흡착제에 보다 강하게 결합하는 피분석물만이 남게 될 것이다.
b. 이온 강도계 용출제
이온 강도면에서 흡착제의 선택성을 변화시키는 용출제로는 각종 형태 및 농도의 염용액을 포함한다. 용출제 용액에 용해된 염의 양은 용출제의 이온 강도에 영향을 미치고 이에 대응하게 흡착제 결합력을 변화시킨다. 저농도의 염을 포함하는 용출제는 이온 강도에 비하여 흡착제 결합력의 보다 적은 변화를 제공한다. 고농도의 염을 함유하는 용출제는 이온 강도에 비하여 흡착제 결합력의 보다 큰 변화를 제공한다.
c. 물 구조계 용출제
물구조 또는 물농도를 개조시켜 흡착제의 선택성을 변화시키는 용출제로는 우레아와 카오트로픽 염 용액을 포함한다. 일반적으로, 우레아 용액으로는, 예컨대 0.1 내지 8M의 농도 범위를 가진 용액을 포함한다. 용출제를 제공하는 것으로 사용될 수 있는 카오트로픽 염으로는 티오시안산나트륨을 포함한다. 물구조계 용출제는 결합된 물구조 또는 수화성의 개조로 인하여 피분석물을 결합시키는 흡착제의 능력을 변화시킨다. 이와 같은 유형의 용출제로는, 예컨대 글리세롤, 에틸렌 글리콜 및 유기 용매를 포함한다. 카오트로픽 음이온은 비극성 부의 수용해도를 증가시켜 피분석물과 흡착제 사이의 소수성 상호작용을 감소시킨다.
d. 세정제계 용출제
표면 장력과 피분석물 구조면에서 흡착제의 선택성을 변화시키는 용출제로는 세정제 및 계면활성제를 포함한다. 용출제로서 사용하기에 적합한 세정제로는 CHAPS, TWEEN 및 NP-40과 같은 이온성 및 비이온성 세정제를 포함한다. 세정제계 용출제는 세정제의 소수성기와 친수성기가 도입될때 소수성 상호작용이 변화하여 피분석물에 결합하는 흡착제의 능력을 변화시킨다. 피분석물과 흡착제 간의 소수성 상호작용과 피분석물내의 소수성 상호작용이, 예컨대 SDS와 같은 이온성 세정제로의 단백질 변성으로 변화되면, 전하기가 도입된다.
e. 소수성계 용출제
유전상수면에서 흡착제의 선택성을 변화시키는 용출제는 소수성 상호작용면에서 흡착제의 선택성을 변화시키는 용출제이다. 이러한 능력으로 작용하는 적합한 용출제의 예로는 우레아(0.1 내지 8M) 유기 용매, 예컨대 프로판올, 아세토니트릴, 에틸렌 글리콜 및 글리세롤과, 전술한 것과 같은 세정제를 포함한다. 용출제로서 아세토니트릴의 사용은 역상 크로마토그래피에 일반적이다. 용출제 중에 에틸렌 글리콜을 첨가하면 호황성 흡착제와의 염 촉진성 상호작용으로부터 면역글로불린을 용출시키는데 효과적이다.
f. 용출제의 조합
적합한 용출제는 전술한 부류 중에서 선택되는 임의의 성분이거나 전술한 용출제 중 2종 이상의 조합물일 수 있다. 전술한 용출제 중 2종 이상을 포함하는 용출제는 다중 용출 특성에 따라 피분석물에 대한 흡착제의 선택성을 변화시킬 수 있다.
3. 2가지 변수의 다양성
여러 흡착제를 선택하여 상이한 결합 특성을 제공하는 능력과 여러 용출제로 세척하여 상이한 용출 특성을 제공하는 능력을 통해 피분석물이 흡착제에 결합되는 선택성에 각각 영향을 미칠 수 있는 2가지 상이한 변수를 변화시킨다. 이 2가지 변수가 크게 변화될 수 있다는 사실은 광범위한 결합 유인 조건 및 용출 조건을 제공하므로, 본 발명의 방법은 다양한 종류의 피분석물을 결합 및 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.
특정 시료를 분석하는데 유용한 흡착제 및 용출제의 선택은 피분석물의 본성이 알려지지 않았을지라도 시료의 본성 및 특정 피분석물 또는 특성규명하고자 하는 피분석물의 부류에 따라 달라진다. 일반적으로, 특히 분석하고자 하는 시료의 조성을 알지 못하는 경우에는 다양한 결합 특성과 다양한 용출 특성을 나타내는 시스템을 제공하는 것이 유리하다. 즉, 광범위한 선택성을 나타내는 시스템을 제공하면 1종 이상의 흡착제에 의해 목적 피분석물이 보유될 가능성이 유의적으로 증가하게 된다.
화학 분석이나 생화학 분석 분야의 당업자라면 광범위한 결합 특성과 용출 특성을 나타내는 시스템을 제공하고 피분석물의 분할능을 최대화할 수 있는 결합 및 용출 특성을 관찰하여 특정 피분석물을 보유하는데 유용한 선택성 조건을 측정할 수 있다. 본 발명은 광범위한 선택성 조건을 포함하는 시스템을 제공하기 때문에 당업자라면 과도한 실험없이도 소정의 피분석물에 대해 최적의 결합 특성과 용출 특성을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
C. 피분석물
본 발명은 적절한 선택성 조건을 통해 피분석물의 성질을 이용하여 피분석물의 다양한 생물학적, 화학적 또는 물리화학적 성질에 근거하여 피분석물을 분할할 수 있다. 적절한 선택성 조건을 통해 이용될 수 있는 피분석물의 많은 성질 중에는 소수성 지수(또는 피분석물 중에 존재하는 소수성 잔기의 척도), 등전점(즉, 피분석물이 하전을 띠지 않는 pH), 소수성 모멘트(또는 극성 잔기 및 비극성 잔기의 분포내 비대칭의 정도 또는 피분석물의 양쪽친화성의 척도), 측면 쌍극 모멘트(또는 피분석물내 전하 분포의 비대칭 척도), 분자 구조 인자(분자의 주쇄를 따라 존재하는 벌키 측쇄의 분포와 같은 피분석물 분자의 표면 윤곽을 변화시킴), 2차 구조 성분(예컨대, 헬릭스, 평행 및 역평행 시이트), 이황화 밴드, 용매 노출성 전자 공여 기(예, His), 방향족(또는 피분석물내 방향족 잔기 간의 pi-pi 상호작용의 척도) 및 하전된 원자 간의 선형 거리 등이 있다.
이것은 본 발명의 방법에서 적절한 선택성 특성을 선택하여 시료로부터 소정의 피분석물을 분할하는데 이용할 수 있는 성질의 대표적인 예이다. 시료로부터 특정 피분석물을 분할하는데 기본 원리가 될 수 있는 피분석물의 기타 적합한 성질은 당업자에게 공지되어 있고 당업자라면 쉽게 측정할 수 있을 뿐만 아니라 본 명세서에 충분히 설명되어 있다.
본 발명의 방법은 분석될 수 있는 시료 종류에만 제한되는 것은 아니다. 시료는 일반적으로 액체 상태가 많지만, 고체, 액체 또는 기체 상태일 수 있다. 고체 시료 또는 기체 시료는 적합한 용매에 용해하여 당업자에게 공지된 기법에 따라 액체 시료를 제공하는 것이 바람직하다. 시료는 생물학적 조성물, 비생물학적 유기 조성물 또는 무기 조성물일 수 있다. 본 발명의 기법은 생체 시료, 구체적으로 생물 유체 및 추출물 중의 피분석물을 분할하고, 비생물학적 유기 조성물, 구체적으로 작은 유기 분자 및 무기 분자의 조성물 중에 존재하는 피분석물을 분할하는데 특히 유용하다.
피분석물은 분자, 다량체 분자 복합체, 거대분자 어셈블리, 세포, 아세포 소기관, 바이러스, 분자 단편, 이온 또는 원자일 수 있다. 피분석물은 시료의 단일 성분이거나 또는 1종 이상의 특성(즉, 분자량, 등전점, 이온 전하, 소수성/친수성 상호작용 등)을 공통으로 가진 일군의 구조적, 화학적, 생물학적 또는 기능적 관련 성분일 수 있다.
본 발명의 보유물 크로마토그래피를 사용하여 분할할 수 있는 피분석물의 구체적인 예로는 펩티드, 단백질, 효소, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드와 같은 생물학적 거대분자; 이 생물학적 거대분자의 단편, 예컨대 핵산 단편, 펩티드 단편 및 단백질 단편; 상기 생물학적 거대분자의 복합체, 예컨대 핵산 복합체, 단백질-DNA 복합체, 수용체-리간드 복합체, 효소-기질, 효소 억제제, 펩티드 복합체, 단백질 복합체, 탄수화물 복합체 및 다당류 복합체; 작은 생물학적 분자, 예컨대 아미노산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 당, 스테로이드, 지질, 금속 이온, 약물, 호르몬, 아미드, 아민, 카르복실산, 비타민 및 조효소, 알코올, 알데히드, 케톤, 지방산, 포피린, 카로티노이드, 식물 성장 조절인자, 인산염 에스테르 및 뉴클레오시드 디포스포당, 합성 소분자, 예컨대 약학적 또는 치료학적 유효 제제, 단량체, 펩티드 유사체, 스테로이드 유사체, 억제제, 돌연변이원, 종양원, 항유사분열 약물, 항생제, 이오노포아, 항대사물질, 아미노산 유사체, 항균물질, 수송 억제제, 표면 활성제(계면활성제), 미토콘드리아 및 엽록체 작용 억제제, 전자 공여체, 담체 및 수용체, 프로테아제의 합성 기질, 포스파타제의 기질, 에스터라제 및 리파제의 기질 및 단백질 변형 시약; 및 합성 중합체, 올리고머 및 공중합체, 예컨대 폴리알킬렌, 폴리아미드, 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리설폰, 폴리스티렌, 폴리에테르, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리카보네이트, 폴리비닐 할라이드, 폴리실록산, POMA, PEG 및 전술한 2종 이상의 공중합체를 포함한다.
III. 정보 처리
특정 용출 조건하에 흡착제에 흡착된 피분석물의 검출은 시료 및 그 화학적 특성에 있어서 피분석물에 대한 정보를 제공한다. 흡착은 부분적으로 흡착제의 결합 특성에 의존한다: 흡착제에 결합하는 피분석물은 결합을 가능하게 만드는 특성을 보유한다. 예컨대, 특정 pH에서 양이온성인 분자는 이 pH를 포함하는 용출 조건하에 음이온성 흡착제에 결합한다. 강한 양이온성 분자만이 매우 강한 용출 조건하에 흡착제로부터 용출된다. 소수성 영역을 가진 분자는 소수성 흡착제에 결합하지만, 친수성 영역을 가진 분자는 친수성 흡착제에 결합한다. 또한, 상호작용의 강도는 부분적으로는 피분석물이 소수성 또는 친수성 영역을 보유하는 정도에 의존된다. 따라서, 시료내 특정 피분석물이 특정의 용출 조건하에 흡착제에 결합하는 지의 측정은 피분석물을 서로로부터 및 결합을 위한 적합한 화학적 특성을 보유하지 않는 피분석물로부터 분리함으로써, 혼합물내 피분석물을 분할할 뿐만 아니라, 특정 화학적 특성을 가진 피분석물 또는 개개의 피분석물의 종류를 확인한다. 다양한 용출 조건하에 1종 이상의 특정 흡착제상에 피분석물 보유에 대한 정보의 수집은 혼합물내 피분석물의 세세한 분할 뿐만 아니라, 피분석물에 대한 화학적 정보(자체적으로 그 동일성을 유도할 수 있음)를 제공한다. 이 데이타를 "보유도 데이타"로 지칭한다.
보유도 분석에서 생성된 데이타는 프로그램 가능한 디지털 컴퓨터를 사용하여 가장 용이하게 분석된다. 컴퓨터 프로그램은 일반적으로 코드를 기록하는 판독 가능한 매체를 보유한다. 특정의 코드는 기재 어레이상의 각 모양의 위치, 그 모양에서의 흡착제의 동일성 및 흡착제를 세척하는 데 사용되는 용출 조건을 포함하는 메모리에 제공된다. 이 정보를 사용하여, 프로그램은 특정 선택 특성을 한정하는 어레이상의 모양 세트를 확인할 수 있다. 컴퓨터는 또한 프로브상에 특정의 어드레스성 위치로부터 다양한 분자체에서 신호의 강도에 관한 데이터를 입력으로서 수용하는 코드를 보유한다. 이 데이타는 선택적으로 검출된 각각의 피분석물에 대해 신호 및 결정된 분자 질량의 강도를 포함하여 검출된 피분석물의 수를 나타낼 수 있다.
컴퓨터는 또한 데이터를 처리하는 코드를 포함한다. 본 발명은 데이터를 처리하는 다양한 방법을 고려한다. 한 가지 양태로, 이것은 피분석물 인지 프로필을 생성시키는 것을 포함한다. 예컨대, 분자 질량에 의해 확인되는 특정 피분석물의 보유도에 관한 데이터는 특정의 결합 특성, 예컨대, 음이온 흡착제 또는 소수성 흡착제에의 결합 특성에 따라 분류할 수 있다. 이 선택된 데이터는 특정의 피분석물의 화학적 성질의 프로필을 제공한다. 보유 특성은 피분석물의 기능을 반영하고, 이것은 다시 구조를 반영한다. 예컨대, 공유 금속 킬레이터와 배위 결합하는 보유도는 폴리펩티드 피분석물내 히스티딘 잔기의 존재를 반영할 수 있다. 다양한 pH 레벨에서 용출하에 다수의 양이온 및 음이온 흡착제에 대한 보유 레벨 데이터를 사용하면 단백질의 등전점을 유도할 수 있는 정보를 나타낼 수 있다. 이것은 다시 단백질내 이온성 아미노산의 가능한 수를 반영한다. 따라서, 컴퓨터는 결합 정보를 구조 정보로 변형시키는 코드를 포함할 수 있다. 또한, 피분석물의 2차 처리(예컨대, 해독후 변형)는 결합 또는 질량의 차에 의해 반영되는 변형된 인지 프로필을 산출한다.
또 다른 양태에서, 보유도 분석은 두 가지 상이한 세포형에 대한 선택도 허용 한계의 동일한 세트하에 수행하고, 두 분석으로부터의 보유도 데이터를 비교한다. 보유 지도에서의 차이(예컨대, 임의의 모양에서의 신호의 존재 또는 강도)는 두 셀에 의해 상이하게 표현되는 피분석물을 나타낸다. 이것은 예컨대, 두 보유도 분석 사이의 신호의 강도차를 나타내는 차이 지도를 산출하고 따라서, 어느 피분석물이 두 분석에서 흡착제에 의해 보유도가 증가 또는 감소되는 지를 나타내는 것을 포함할 수 있다.
컴퓨터 프로그램은 또한 프로그래머로부터 입력으로서 지시를 받는 코드를 포함할 수 있다. 어레이내 지정되고 사전 결정된 위치로부터 피분석물의 선택적 탈착에 대한 진행 및 논리 경로를 미리 예측하고 프로그램화할 수 있다.
컴퓨터는 데이터를 제시용의 또 다른 형식으로 변형시킬 수 있다. 데이터 분석은 예컨대, 수집된 데이터로부터 모양 위치의 함수로서 신호 강도를 측정하는 단계, "이상점(outliers)"(사전 결정된 통계 분포로부터 이탈되는 데이터)을 제거하는 단계 및 잔존 데이터로부터 피분석물의 상대 결합 친화도를 계산하는 단계를 포함할 수 있다.
생성되는 데이터는 다양한 형식으로 디스플레이될 수 있다. 한 가지 형식에서, 신호의 강도는 분자 질량의 함수로서 그래프상에 디스플레이된다. "겔 형식"으로 지칭되는 또 다른 형식에서, 신호의 강도는 암도의 선형 축강도를 따라 디스플레이되어 겔상의 밴드와 유사한 모양을 산출한다. 또 다른 형식에서, 특정 허용 한계에 도달하는 신호는 분자 질량을 나타내는 수평축상의 수직선 또는 막대로 제시된다. 따라서, 각각의 막대는 검출된 피분석물을 나타낸다. 데이터는 또한 결합 특성 및/또는 용출 특성에 따라 분류된 피분석물에 대한 신호 강도의 그래프에서 제시될 수 있다.
IV. 보유물 크로마토그래피의 응용
보유물 크로마토그래피는 다중 피분석물을 동시에 검출 및 특성 분석하는 것을 포함하는 조합 분리 방법을 포함한다. 이들 조합 방법은 다수의 이용 분야를 가진다. 그러한 이용 분야로는 표적 피분석물 검출 계획의 개발; 단백질 정제 전략의 개발; 단백질 정제 방법; 상보성 파지 디스플레이 라이브러리를 사용한 표적 에피토프 확인을 비롯하여 표적 피분석물에 결합하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 특이 파지의 확인; 피분석물의 물리 화학적 성질에 기초한 단백질 확인; 유전자 발현 점검 및 차등 단백질 디스플레이; 독물학적 선별; 다중 진단 마커의 동시 검출; 약물 발견; 다량체 단백질 어셈블리 점검 및 시험관내 폴리뉴클레오티드 해독의 검출 분야들이 있다.
A. 시료로부터 피분석물을 순차적으로 추출하는 방법
보유물 크로마토그래피는 다수의 흡착제/용출제 조건하에 피분석물의 보유도 분석을 포함한다. 이 방법을 변형시킨 한 가지 방법은 순차적 추출법이다. 순차적 추출법에서 시료는 두 가지 상이한 선택 조건에 독립적으로 노출시킨다. 확실히, 시료를 흡착제상의 시료로부터 특정 피분석물을 추출하기 위한 제1의 선택 조건에 노출시키고, 용출제중에 비흡착된 피분석물을 남긴다. 그 다음, 용출제를 제2 선택 조건에 노출시킨다. 이것은 또한 용출제로부터 다양한 피분석물을 추출한다. 빈번하게, 제1 노출 및 제2 노출에서의 흡착제가 유인(예컨대, 정상 상 및 소수성)에 대해 상이한 기초를 가진다면, 흡착제는 용출제로부터 상이한 세트의 피분석물을 추출한다. 이 제2 용출제를 제3의 선택 조건 등에 노출시킨다. 순차적인 추출을 실시하는 한 가지 방법에서, 흡착제는 시료를 그 상부에 혼합할 수 있도록 웰의 바닥에 넣는다. 용출제는 흡착제에 첨가하고, 시료내 피분석물 사이에 결합을 형성한 후에, 용출제 세척액을 수집한다. 수집된 세척액을 제2의 흡착제에 노출시키고, 피분석물을 결합에 의해 시료로부터 추출한다.
한 가지 양태에서, 순차적 추출의 목표는 분석용이라기 보다는 제조용이다. 보다 구체적으로 목표는 시료로부터 거의 목적하는 피분석물을 추출하는 것이 될 수 있다. 이 경우에, 시료는 통상 직경 약 수 ㎜의 점적상에서 수 ㎕와 같이 작다. 흡착제는 시료로부터 고갈시키고 싶지 않은 피분석물을 흡착하지 않도록 선택된다. 수차례의 반복후에, 최종적으로 세척된 세척액에는 목적하지 않은 피분석물을 고갈시키고, 탈착 분광분석법 또는 전통적인 크로마토그래피 방법에 의해 후속 분석에 대해 목적하는 피분석물을 잔류시킨다.
또 다른 양태로, 비보유된 시료는 자체적으로 임의의 분석 기법으로 피분석물에 대해 분석한다. 단일의 보유 단계후에도, 이 과정은 흡착제에 흡착된 재료 및 흡착되지 않은 상기 피분석물을 검사할 수 있게 한다.
B. 시료내 피분석물의 점진적인 분할 방법
보유물 크로마토그래피의 한 가지 목적은 복합 시료 혼합물로부터 피분석물의 명확한 분할이다. 이것은 특히 임상적 진단, 약물 발견 및 기능 게놈학에서의 이용 분야에 중요하다. 이 영역은 생물학적 시료로부터 1종 이상의 피분석물의 확인을 포함할 수 있다. 본 발명은 피분석물에 대한 개선된 분할도를 가진 선택 조건을 확인하는 방법을 제공한다. 본 방법은 피분석물이 보유되는 선택 조건을 확인하는 단계 및 반복 공정에서 추가의 결합 특성 또는 용출 특성을 피분석물의 개선된 분할을 제공하는 선택 조건에 부가하는 단계를 포함한다.
선택 조건에 노출된 복합 시료의 질량 스펙트럼은 일반적으로 시료의 다수 성분으로부터 신호를 포함한다. 신호의 복잡성은 피분석물의 명확한 분할을 방해할 수 있다. 피분석물의 점진적인 분할 방법은 시료내 피분석물의 명확한 검출에 대해 피분석물의 개선된 분할도로 선택 조건을 확인할 수 있게 한다. 선택 조건은 피분석물 신호가 기타 성분의 신호로부터 보다 쉽게 구별할 수 있는 것이라면 또 다른 선택 조건에 비교하여 피분석물의 "개선된 분할도"를 나타낸다. 이것은 예컨대, 흡착제에 결합된 피분석물의 수를 감소시켜서 신호의 총수를 감소시키거나 또는 피분석물에 대해 선택도 조건의 선택도를 증가시켜서 기타 신호와 비교할 때 피분석물 신호를 증가시킬 수 있다. 물론, 피분석물을 기재에 결합시키기만 할 경우에, 그것은 검출중에 유일한 피분석물 신호를 발생시킨다.
점진적인 분할 방법은 추가의 선택도(결합 또는 용출) 특성을 피분석물을 보유하는 것으로 알려진 선택 특성의 일정한 세트에 순차적으로 첨가하는 반복 공정을 포함한다. 제1 단계에서, 일련의 선택 조건을 시험하여 표적 피분석물을 보유하는 것을 확인한다. 다음 단계에서, 선택도 조건의 선택 특성중 1종 이상을 추가의 분석에 대해 일정한 세트에 대해 선택한다.
새로운 세트의 선택도 조건을 생성시킨다. 새로운 세트내 조건의 각각은 일정한 세트내 선택된 특성 및 일정한 세트내가 아닌 하나 이상의 새로운 조건을 포함한다. 예컨대, 일정한 세트가 음이온 흡착제 및 낮은 염 용출제를 포함하는 경우, 새로운 조건은 용출제의 pH를 변화시키는 것을 포함할 수 있다. 이들 새로운 변수는 각각 피분석물의 분할도를 개선시키는 능력에 대해 시험하고, 개선된 분할도를 가진 한 가지 변형된 선택 조건을 확인한다. 다음 단계에서, 개선된 분할도를 제공하는 첨가된 선택 조건은 일정한 세트에 첨가한다.
변형된 일정한 세트는 일정한 세트의 특성 및 한 세트의 새로운 특성을 포함하는 새로운 세트의 선택도 조건을 생성시킴으로써 동일한 방법으로 다시 시험한다. 따라서, 각 단계에서, 선택도 조건은 피분석물의 분할이 상기 단계에서 선택도 조건과 비교할 때 개선되도록 선택한다.
상기 방법은 예에 의해 잘 설명된다. 세포 시료는 통상 수백 또는 수천종의 단백질을 함유한다. 시료내 단일의 표적 단백질 피분석물의 명확한 분할을 얻고자 할 경우가 있다. 제1 단계에서, 보유도 지도는 다수의 선택 조건을 사용하여 표적 피분석물에 대해 개발한다. 예컨대, 흡착제는 음이온 교환기, 양이온 교환기, 정상상 흡착제 및 역상 흡착제일 수 있다. 각각의 흡착제상에서 시험되는 용출 조건은 다양한 pH 레벨, 다양한 이온 강도, 다양한 세제 조건 및 다양한 소수성에 기초한 조건일 수 있다. 예컨대, 4종의 상이한 용출 조건을 각 조건에 대해 시험할 수 있다. 따라서, 본 예에서 16종의 상이한 선택 조건을 그들이 표적 피분석물을 흡착하는 능력에 대해 시험한다.
이 보유도 지도로부터는 표적 피분석물이 보유되는 1종 이상의 선택도 조건을 선택한다. 표적이 최대로 결합되는 선택 조건을 선별할 수 있다. 그러나, 표적이 최대로 결합되는 경우가 아닌 조건을 선택하는 것이 유리할 수 있는데, 이것은 이 선택 조건이 기타 선택 조건보다 표적에 대해 더 선택성이 있는 경우에 그러하다. 이 예의 경우에는 보유도 지도의 분석으로부터 표적이 대략 중성의 pH에서 음이온 교환 흡착제에 의해 보유되지만, 또한 친수성 흡착제에 약하게 흡착된다는 것을 나타내는 것으로 가정한다.
피분석물의 보유를 초래하는 것으로 확인되는 선택 조건으로부터 한 가지 변수인 흡착제 또는 용출제를 모든 후속 선택 조건에 대해 사용하도록 선택한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "선택 조건 상수의 세트"에 첨가된다고 언급된다.
다음의 반복 단계에서는 제2의 다수의 선택 조건하에 표적 피분석물이 결합하는 능력을 시험한다. 제2 세트에서의 각각의 선택도 조건은 선택 조건 상수 세트의 요소를 포함한다. 그러나, 각각의 선택은 또한 또 다른 변수, 즉 선택 조건에 첨가되는 상이한 흡착제 또는 용출제를 포함한다. 따라서, 최소한의 상수 세트에서 이용하는 제한 범위내에서, 제2의 선택 조건 세트를 제1 세트보다 더 다양한 것으로 선택한다. 다양성을 증가시키는 방법은 예컨대, 흡착제의 용출 조건 또는 상이한 강도의 보다 미세한 단계적 변화를 시험하는 것을 포함한다. 그것은 또한 예컨대, 또 다른 선택 특성을 선택 조건에 첨가하는 것을 포함한다.
상기 예를 다시 거론하면, 음이온 교환 흡착제를 상수 세트에 첨가할 수도 있다. 이 조건은 이제 보다 다양한 변수, 예컨대, 용출제 또는 흡착제로 시험한다. 시험할 용출제는 제1의 반복 단계에서 시험하는 것보다 더 미세한 단계적 변화에서 다양한 낮은 pH 완충제를 포함할 수 있다. 예컨대, 제1 반복 단계는 pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0 및 pH 9.0에서 완충제를 시험할 수 있고, 표적이 중성 pH 근처에서 음이온 교환 흡착제에 결합하는 것을 나타냈다. 제2 반복 단계중에, 시험한 완충제는 pH 5.0, pH 5.5, pH 6.0, pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5 및 pH 8.0으로 존재할 수 있다. 또한, 이들 완충제는 각각 기타 용출 특성, 예컨대, 이온 강도, 소수성 등을 포함하도록 변화시킬 수 있다.
이 단계에서 일반적으로 산출되는 제2 보유 지도의 분석은 제1 라운드에서 확인되는 선택 조건보다 양호한 분할을 제공하는 조건을 확인할 수 있게 한다. 마찬가지로, 이 선택 조건의 변수중의 하나를 선택하고 다음 반복 단계에서 추가의 의문에 대한 선택 조건 상수 세트에 첨가한다.
상기 예를 다시 거론하면, 피분석물을 분할하는 제2 라운드의 선택 조건은 pH 6.5의 완충제를 사용하는 것을 가정한다. 이 용출제는 이제 상수 세트에 첨가할 수 있고, 이것은 이제 음이온 교환 수지 및 pH 6.5의 완충제를 포함한다. 다음 반복 단계에서 선택 조건은 이 상수 세트 및 또 다른 변수를 포함한다. 변수는 예컨대, 용출제에 새로운 요소(예컨대, 상이한 이온 강도)를 첨가하거나; 또는 또 다른 흡착제, 예컨대, 음이온 교환 흡착제와 혼합된 다양한 소수성 흡착제를 혼합물에 첨가하거나; 또는 음이온 교환 수지의 밀도를 변화시킬 수 있다. 또한, 선택 조건은 피분석물의 개선된 분할도를 나타내는 상기 세트로부터 확인된다.
상기 공정은 피분석물이 본질적으로 균일한 상태로 정제될 때까지 계속할 수 있다. 이 경우에, 선택 조건은 피분석물에 대해 특이적이다.
각 단계에서 시험한 변수의 수를 증가시킴으로써, 적합한 선택 조건을 확인하는 데 필요한 반복 단계의 수를 감소시킬 수 있다.
C. 피분석물의 정제분리용 정제 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 피분석물을 정제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 피분석물을 흡착하기 위한 유인의 근거를 신속히 확인하기 위해 보유물 크로마토그래피의 힘을 이용한다. 제1 단계는 피분석물을 다수의 선택 조건에 노출시키고, 보유물 크로마토그래피에 의한 조건하에 보유도를 측정한다. 이 단계는 피분석물의 인지 프로필 특성을 산출한다. 피분석물이 보유되는 선택 조건을 사용하여 피분석물의 정제분리용 정제에 대한 프로토콜을 개발한다.
피분석물의 정제분리용 정제의 경우, 피분석물은 순차적으로 흡착되고, 피분석물을 결합시키는 것으로 확인된 일련의 흡착제/용출제 조합으로부터 용출된다. 따라서, 예컨대, 인지 지도는 피분석물이 정상의 상 흡착제에 및 금속 킬레이터에 결합하는 것을 나타낼 수 있다. 피분석물은 피분석물에 결합하는 정상상 흡착제를 함유하는 제1 크로마토그래피 칼럼과 접촉시킨다. 비결합된 재료는 세척해 낸다. 그 후, 피분석물은 충분히 엄격한 세척에 의해 용출시킨다. 그 후, 용출제를 피분석물에 결합하는 금속 킬레이트 칼럼과 접촉시킨다. 비결합된 재료는 세척해 낸다. 그 후, 피분석물을 포함하는 결합된 재료는 금속 킬레이트 칼럼으로부터 용출시킨다. 이러한 방법으로, 피분석물은 예비량으로 분리된다. 시료의 예비량은 10 ㎕ 이상, 100 ㎕ 이상, 1 ㎖ 이상 또는 10 ㎖ 이상이다.
피분석물의 점진적 분할중에 산출된 정보를 사용하여 보다 대규모의 크로마토그래피(용출에 근거함) 단백질 정제 전략을 고안할 수 있다. 유인에 대한 흡착제의 기제, 결합 조건 및 표적 피분석물 단백질에 대한 용출 조건(즉, 선택 조건)은 보유물 크로마토그래피에 의해 정해진다. 이 정보는 엄청난 양의 시간, 에너지 및 이제는 대체는 정제 전략 디자인의 시행착오 과정중에 낭비될 귀중한 피분석물을 절약할 수 있다. 이 섹션에서는 또한 시판되는 흡착제로 실시되는 대규모 정제 노력을 제공한다.
D. 피분석물의 특이적 검출용 프로브의 제조 방법
본 발명은 탈착 분광 분석법에 의한 1종 이상의 피분석물의 특이적 검출용 프로브 뿐만 아니라, 이들 프로브를 생성시키는 방법을 제공한다. 그러한 피분석물 분할용 프로브는 진단 및 분석 방법에서 피분석물의 특이적 검출에 유용하다.
1종 이상의 피분석물 분할용 프로브를 생성시키는 제1 단계는 다수의 상이한 흡착제/용출제 조합하에 피분석물에 대한 보유도 지도를 산출한다. 예컨대, 피분석물의 분할은 각각의 5종의 상이한 용출제로 세척한 4종의 상이한 흡착제에 대해 측정할 수 있다. 이것은 각각의 피분석물에 대한 보유 데이터의 20개 세트를 제공한다. 생성되는 보유 지도의 분석은 어느 선택 조건(들)이 피분석물을 분할하는 지를 나타낸다. 바람직하게는, 모든 피분석물을 명확하게 분할하는 하나의 선택 조건을 확인할 수 있다. 그 후, 피분석물의 각각이 하나 이상의 흡착제 점적상에서 분할되도록 하나의 선택 조건이 피분석물 분할용 프로브에 사용하기 위해 선택된다. 프로브는 또한 피분석물(들)에 결합하지 않는 흡착제를 보유할 수 있다. 이 흡착제 점적은 대조군으로서 유용하다. 이 프로브는 이들이 피분석물(들)을 보유하고 분할하는 능력에 대해 선택된 어드레스성 위치에서 다수의 흡착제 점적을 포함할 수 있다. 이 경우에, 단일의 용출제 조건하에 피분석물에 결합하는 흡착제를 선택한다. 이것은 전체 프로브를 검출 과정에서 단일의 용출제로 세척할 수 있기 때문에 유용하다.
특정 피분석물에 대해 산출된 보유도 지도는 피분석물에 대해 관용화된 흡착제를 생성시키는 데 사용할 수 있다. 예컨대, 피분석물을 보유하는 흡착제의 성질은 피분석물의 유인 기제 세트를 나타낸다. 관용화된 흡착제는 유인에 대한 상기 기제를 제공하는 흡착제의 요소를 포함하는 다중 흡착제를 제조함으로써 설계할 수 있다. 그러한 관용 흡착제는 표적 피분석물에 대해 매우 선택적이다. 하나 또는 몇 가지의 관용 흡착제는 피분석물에 대한 인지 지도를 생성시키는 것을 충족시킬 수 있다. 예컨대, 특정의 용출 조건하에 피분석물이 특정한 정도의 소수성, 양전하 및 방향성을 가진 재료에 결합하는 흡착제를 보유하는 것으로 확인되는 경우에는 이들 3가지 특성 각각을 유인하는 작용기를 가진 조합 합성 전략의 사용을 통해 또는 설계에 의해 관용 흡착제를 생성시킬 수 있다. 이 흡착제에 대한 결합을 검출함으로써 피분석물을 확인한다.
상기 프로브는 시료내 피분석물(들)의 검출에 유용하다. 시료를 선택 조건에 노출시키고, 프로브를 탈착 분광분석법에 의해 질문한다. 프로브는 피분석물을 분할하기 때문에, 그 존재는 특징적 인지 프로필을 찾음으로써 검출할 수 있다. 그러한 프로브는 환자 시료내 한 세트의 진단 마커를 확인하는 데 특히 유용하다.
일 양태로, 어레이는 당해 단백질의 특정 부류에 도킹하도록 고안된다. 이것은 기능에 의해 한정되는 피분석물 뿐만 아니라 진단 마커를 포함한다. 예컨대, 세포 표면 단백질, 특정 부류의 효소(예컨대, 키나제), 전사 인자, 세포내 수용체 등에 특이적으로 도킹하는 어레이를 제조할 수 있다. 흡착제는 항체와 같은 생체 중합체에 특이적일 수 있다.
일 양태로, 흡착제는 특정 부류의 단백질에 대한 파지 디스플레이 단백질 리간드와 같은 유전자 팩키지가다. 이 경우에, 파지 디스플레이 라이브러리는 특정 부류의 분자로 사전 선별하여 그 부류에 결합하는 파지를 제거할 수 있다. 그 후, 군집으로부터 공제된 파지는 흡착제로서 사용한다.
E. 진단용 프로브 및 진단 방법
병리학적 조건의 진단은 자주 질병의 하나 이상의 환자 시료내 검출을 포함한다. 특정 조건은 단일의 진단용 마커의 존재에 의해 진단할 수 있다. 기타 조건의 진단은 다수의 진단용 마커의 검출을 포함할 수 있다. 또한, 몇 가지 마커의 검출은 진단의 신뢰도를 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 병리학적 상태의 하나 이상의 진단용 마커를 분할하는 하나 이상의 흡착제를 포함하는 탈착 분광 분석용 프로브를 제공한다.
상기 프로브의 제조는 먼저 검출할 마커를 선별하는 것을 포함한다. 마커는 임의의 질병 상태, 예컨대, 암, 심장 질병, 자동 면역 질병, 비루스 감염, 알쯔하이머병 또는 당뇨병에 대한 마커일 수 있다. 예컨대, 전립선 특이 항원(PSA)의 검출은 전립선암을 확실히 암시하는 것이다. HIV 감염은 몇 가지 HIV 단백질, 예컨대, p17, p24 또는 p55중 하나 및 p31, p51 또는 p66중 하나 및 gp41 또는 gp120/160중 하나에 대한 항체를 검출함으로써 진단할 수 있다. 뇌척수액내 아밀로이드-β42 및 타우 단백질이 검출된다는 것은 알쯔하이머병을 강력히 암시하는 것이다. 또한, 마커는 건강한 피검체 대 병리학적 상태를 가진 피검체의 차등 존재를 검출하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법에 의해 확인할 수 있다.
다음 단계에서, 1종 이상의 진단용 마커를 보유하는 흡착제를 개발한다. 모든 마커를 분할하는 단일 흡착제를 제조하는 것이 바람직하다. 이것은 예컨대, 여러 가지 항체를 보유하는 점적, 즉 그것이 각각 목적하는 마커중 하나에 결합하는 점적을 생성시킴으로써 수행할 수 있다. 한편, 프로브는 다수의 흡착제 점적, 즉 각각 선택 조건하에 하나 이상의 표적 피분석물을 분할할 수 있는 점적을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 흡착제는 마커에 특이적인 리간드를 포함하는 다중 흡착제이다. 예컨대, 흡착제는 표적 피분석물에 특이적으로 결합하는 항체, 폴리펩티드 리간드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 항체는 조합 라이브러리를 선별하여 확인되는 단쇄 항체이다. 특정 마커에 특이적인 단쇄 항체는 본원에 개시하는 방법으로 파지 디스플레이 라이브러리를 선별함으로써 개발할 수 있다.
또 다른 양태에서, 흡착제는 표적 피분석물을 특이적으로 보유하거나 또는 탈착 분광 분석법에 의해 명확한 분할에 대한 충분한 특이성으로 피분석물을 보유하는 비유기 생체 분자 성분을 포함한다. 특이 피분석물의 검출용 흡착제의 제조법에 대해서도 본원에서 개시한다.
중요한 것은, 이들 방법에 사용된 단일 흡착제 점적은 단일 피분석물에 특이적일 필요는 없으며, 따라서, 표적과 흡착제 사이의 생체 중합체 매개의 특이적 친화도를 필요로 하지 않는다는 것이다. 종래의 친화도 검출 방법은 생체 중합체와 표적 사이의 특이적 결합에 주로 의존해 왔다. 이것은 예컨대, 단백질에 대한 항체, 상보적 폴리뉴클레오티드에 대한 폴리뉴클레오티드 또는 탄수화물에 대한 렉틴의 특이적 친화도를 포함한다. 그러한 특이성은 상기 검출 수단이 간접적이고; 표적이 확인되지 않았고; 표지(흔히 흡착제에 결합된 것)가 확인되었기 때문에 필요하였다. 따라서, 흡착제에 대한 특이성이 클수록 오염물이 흡착제에 결합하여 특이적 검출을 방해하는 경향이 낮아진다. 그러나, 탈착 분광 분석법은 피분석물의 직접적 검출을 야기한다. 따라서, 오염물의 존재는 오염물의 신호가 표적의 신호와 중첩되지 않는 한 특이적 검출을 방해하지 않는다.
진단 방법은 먼저 시험할 환자 시료를 선별하는 단계를 필요로 한다. 시료는 예컨대, 조직, 혈액, 뇨, 변 또는 기타 체액(림프액, 뇌척수액, 관절간액 등)일 수 있다. 그 후, 시료는 진단 마커를 보유하게 하는 조건하에 진단용 흡착제를 함유하는 기재에 노출시킨다. 흡착제는 적합한 용출제로 세척한다. 그 후, 마커를 탈착 분광 분석법(예컨대, 질량 분광 분석법)에 의해 검출한다(예컨대, 분할한다).
본 발명은 또한 진단용 마커의 특이적 검출용 키트로서, (1) 흡착제와 용출제를 포함하는 선택 조건하에 하나 이상의 진단용 마커를 분할하는 하나 이상의 어드레스성 위치에서 하나 이상의 흡착제를 포함하는 탈착 분광 분석용 기재 및 (2) 용출제 또는 용출제 제조용 지시를 제공한다. 시료를 흡착제에 노출시키고 용출제로 세척할 경우에, 즉 선택 조건을 실행함으로써, 피분석물은 충분히 정제하거나 또는 특이적으로 결합시켜 탈착 분광 분석법으로 분할한다.
F. 단백질의 확인 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 단백질의 확인을 보조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 보유물 크로마토그래피를 사용하여 단백질 피분석물의 물리 화학적 특성에 대해 일치 매개변수를 측정하는 단계 및 일치 매개변수를 가진 단백질을 확인하기 위한 단백질 데이터베이스를 탐색하는 단계를 포함한다. 보유 특성에 기초한 물리 화학적 정보의 유도에 대해서는 상기 언급한 바와 같다. 데이터베이스는 통상 아미노산 서열 및/또는 각 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 통상 제공한다. 분자 질량, 소수성, pI, 단편 질량 등과 같은 구조적 특성은 상기 정보로부터 용이하게 유도할 수 있다. 피분석물 단백질은 데이터베이스내 단백질의 단 한가지 서브세트와 임의의 구체적인 구조적 특성을 공유할 수 있다. 따라서, 동일성 후보는 단백질 피분석물과 공유되는 구조적 특성에 따라 단백질을 분류함으로써 발견된다. 따라서, 부정확도, 특이성의 정도 또는 기준의 하나 이상의 물리 화학적 성질을 확인하는 데 있어서의 내재하는 신뢰 수준을 고려하면, 데이터베이스내 단백질은 기준의 모든 특성을 완벽하게 일치시킬 것으로는 예측할 수 없다. 따라서, 일치 매개변수는 예컨대, 단백질 피분석물의 특성과 데이터베이스내 기준 폴리펩티드의 특성 사이의 적합도를 확인하기 위하여 설정할 수 있다.
게놈내 유전자의 확인이 증가함에 따라, 임의의 단백질 피분석물이 기준 폴리펩티드로서 데이터베이스내에 존재하는 기회 역시 증가한다. 따라서, 이 방법은 시료내 당해 단백질을 신속하게 분할하고, 단백질에 대한 구조 정보를 얻은 다음, 이 단백질을 확인하기 위해 이 정보를 사용할 수 있게 한다.
G. 다량체 분자를 어셈블리하는 방법
흡착제가 목적 분자에 도킹하는 능력은 다량체 분자를 제조하고 그 어셈블리를 수행하는 화합물을 평가하는 데 유용하다. 다량체 분자의 단위를 흡착제에 결합시킨다. 그 후, 다량체 분자의 또 다른 단위를 보유하는 시료에 노출시킨다. 결합 매개변수를 시험하기 위한 다양한 조건하에 노출을 수행할 수 있다. 서브유니트가 다량체에 결합하는 것은 탈착 분광분석에 의해 점검할 수 있다. 그 다음, 후속 서브유니트는 동일한 방법으로 결합에 대해 시험할 수 있다. 본원에 개시한 약물 선별 방법은 조립체와 방해하는 능력에 대해 제제를 시험하는 데에 유용하다. 따라서, 이 공정의 1 단계의 피분석물은 다음 단계에서 흡착제가 된다.
H. 효소 분석을 수행하는 방법
본 발명은 또한 효소 분석을 수행하는 방법을 제공한다. 효소 분석은 일반적으로 효소가 활성적인 조건하에 효소 기질을 사용하여 시험할 시료에 노출시키는 단계를 포함한다. 효소가 기질상에서 작용하게 한 후에, 효소 반응의 생성물을 검출한다. 정량 분석에서, 생성물의 양을 측정한다. 이 양은 통상 대조군 또는 표준 곡선과 비교하여 시료내 효소 활성의 양을 산출한다.
본 발명은 시료내 효소 활성의 양을 검출하는 단계를 포함하여 효소를 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 효소의 활성이 종종 그 질량이 본래의 기질과 상이한 생성물을 생성시킨다는 사실을 이용한다. 이 방법에서는, 기재에 결합하는 흡착제를 포함하는 고체상을 제조한다. 일정량의 기재를 흡착제에 결합시킨다. 그 후, 흡착제를 임의의 효소가 기질에 작용하게 하는 조건 및 시간하에 시료에 노출시킨다. 그 후, 임의의 결합 재료를 탈착 분광 분석법으로 검출한다. 효소 활성의 생성물의 분자 질량 특성을 가진 피분석물의 검출은 효소의 존재의 지표를 제공한다. 신호 강도는 시료내 효소 활성량의 함수가 된다.
I. 생물학적 재료 사이에서 상이하게 발현되는 피분석물을 확인하는 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 2 이상의 시료 사이에서 상이하게 발현되는 유기 생분자, 특히 단백질을 확인하는 방법을 제공한다. "차등 발현"은 두 시료 사이의 피분석물의 양 또는 질의 차이를 언급한다. 그러한 차이는 해독후 변형을 통해 전사로부터 단백질 발현의 임의의 단계에서 나타날 수 있다. 이 방법은 보유물 크로마토그래피의 특별한 분할력 및 민감도를 이용한다. 먼저, 동일한 세트의 선택 조건을 사용하는 인지 프로필은 두 생물학적 시료로부터 피분석물에 대해 제조한다. 사용된 선택 조건의 수가 증가할수록, 비교할 수 있는 피분석물의 수가 증가한다. 그 다음, 인지 지도를 비교하여 두 세트의 흡착제가 상이하게 보유하는 피분석물을 확인한다. 차등 보유도는 정량 보유도를 포함한다. 이것은 예컨대, 발현의 상승 또는 감소 조절을 나타낸다. 차등 보유 역시 피분석물내 질적 차이를 포함한다. 예컨대, 단백질의 해독후 변형에서의 차이는 결합 특성의 차이(예컨대, 단백질이 당부가되면, 그것은 렉틴 흡착제에 상이하게 결합함) 또는 질량의 차이(예컨대, 해독후 변형에 의한 절단의 차이의 결과로서)로서 검출 가능한 인지 지도의 차이를 산출할 수 있다. 분석은 프로그램 가능한 디지털 컴퓨터에 의해 수행할 수 있다.
본 방법은 두 세포형 사이에서 차등 발현되는 유전자를 검출하는 데 특히 유용하다. 두 세포형은 정상 세포 대 병리학적 세포, 예컨대, 암 세포 또는 상이한 레벨의 세포 또는 발생 또는 분화의 상이한 단계에서의 세포 또는 세포 주기의 상이한 부분에서의 세포일 수 있다. 그러나, 본 방법은 또한 상이한 조건에 노출된 동일한 유형의 두 세포를 검사하는 데 유용하다. 예컨대, 본 방법은 독물학적 선별에 및 세포내 유전자 발현을 조절하는 능력에 대해 약물을 시험하는 데에 유용하다. 그러한 방법에서, 한 가지 생물학적 시료는 시험 약물에 노출시키고, 다른 세포는 노출시키기 않는다. 그 다음, 시료의 보유물 지도를 비교한다. 이 방법은 단백질 또는 기타 생분자가 발현시에 증가 또는 감소하거나, 상이한 보유 특성 또는 상이한 질량에 근거한 일정 방법으로 변화된다는 것을 나타낸다.
보유 지도로부터 얻은 차등 발현된 단백질의 물리 화학적 성질에 대한 정보를 사용하여, 상기 단백질의 동일성 후보를 본원에 개시한 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
상기 방법은 질병의 진단용 마커의 확인에 유용하다. 정상 시료 또는 세포와 비교하여 환자 시료 또는 발병된 배양 세포에서 차등 발현되는 단백질은 진단용 마커일 수 있다. 일반적으로, 통계적으로 유의 수준인 환자 군집의 시료를 정상 시료과 비교하는 것이 최선이다. 이런 방식으로, 정보를 수집하여 병리 상태를 나타내는 전부 또는 유의 수준의 숫자의 개인과 공통되는 진단 마커를 확인한다.
1. 이화작용 신호 증폭에 의한 민감도의 증가
복합 혼합물내 대형 단백질의 차등 존재(예컨대, 차등 발현에서 기인함)를 검출하는 민감도는 대형 단백질을 보다 작은 조각으로 단편화하고 보다 작은 조각을 검출함으로써 상당히 증가시킬 수 있다. 증가된 민감도는 여러 인자로 인한 것이다. 먼저, 시료내 모든 단백질이 예컨대, 효소적 분할에 의해 단편화되는 경우에, 대형 단백질은 소형 단백질보다 더 많은 단편을 생성시키는 것 같다. 둘째, 탈착 분광 분석법의 전체 민감도는 보다 고분자 질량보다 더 낮은 분자 질량에서 더 크다. 셋째, 단백질을 단편화하는 것은 그 표적으로부터 신호의 수를 증가시켜서 그 표적을 검출하는 경향을 증가시킨다. 넷째, 단백질의 단편화는 단백질의 하나 이상의 단편을 포집하고, 따라서, 검출하는 경향을 증가시킨다. 다섯째, 단백질이 두 시료에 차등 존재하는 경우, 그 단백질로부터 신호의 수를 증가시킴으로써, 양의 차이는 검출하기가 더 용이할 것 같다.
또한, 상기 방법은 직관에 반하는 것이다. 일반적으로는 분석전에 피분석물의 혼합물의 복잡성을 감소시키고자 한다. 단편화는 복잡성을 증가시킨다.
따라서, 본 발명의 일 양태에서, 피분석물의 검출 감도는 피분석물을 검출전에 보다 낮은 분자 질량의 단편으로 전환시켜 증가시킨다. 단편화는 당해 분야에 알려진 임의의 수단으로 얻을 수 있다. 예컨대, 단백질 피분석물은 엔도프로테아제를 사용하여 단편화할 수 있다. 탄수화물 피분석물은 글리코시다제를 사용하여 단편화할 수 있다. 핵산은 엔도뉴클레아제를 사용하여 단편화할 수 있다. 시료는 흡착제와 도킹시키기 전후에 단편화 처리를 할 수 있다.
J. 수용체에 대한 리간드를 확인하는 방법
생물학적 계내의 기능적 경로는 빈번히 수용체와 리간드 사이의 상호작용을 포함한다. 예컨대, 전사 활성화 사이의 결합은 전사 인자와 리간드의 선행 결합을 포함한다. 다수의 병리학적 상태는 수용체와 그 리간드 사이의 비정상적 상호작용을 포함한다. 수용체와 리간드 사이의 결합의 차단은 약물 발견의 빈번한 표적이 된다. 그러나, 수용체에 대한 리간드의 동일성은 알려져 있지 않으며; 수용체는 "고립(orphan)" 수용체이다.
본 발명은 보유물 크로마토그래피를 사용하여 수용체에 대한 리간드를 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법은 수용체를 흡착제에 도킹시키는 것을 포함한다. 그 후, 수용체에 대한 리간드를 보유하는 것으로 의심되는 시료는 수용체와 리간드 사이의 결합에 적합한 용출 조건하에 도킹된 수용체에 노출시킨다. 그 후, 수용체에 결합된 리간드는 탈착 분광 분석법으로 검출한다. 본 방법의 힘은 부분적으로는 민감도로부터 탈착 분광 분석법까지 유도되어 흡착제에 도킹된 재료의 소량을 검출한다.
수용체를 흡착제에 도킹시키는 데는 수용체를 보유하고, 바람직하게는 특이적으로 수용체에 결합하는 흡착제를 확인하는 단계를 필요로 한다. 특이적으로 단백질에 결합하는 흡착제를 확인하는 방법을 본원에 개시한다. 한 가지 방법에서, 흡착제는 수용체에 특이적인 항체를 포함한다. 또 다른 양태에서, 수용체는 특이적 결합에 대한 부분을 포함하는 재조합 융합 단백질로서 생성된다. 예컨대, 수용체는 항체의 Fc 부분과 융합될 수 있다. 그러한 부분은 흡착제내에 혼입될 수 있는 단백질 A에 결합한다.
리간드의 존재에 대해 시험한 시료는 의사의 판단 범위내에 있다. 예컨대, 수용체가 핵 수용체인 경우, 시료는 핵 추출물일 수 있다. 수용체가 세포질 수용체인 경우, 시료는 세포가 노출되는 표면의 유체, 예컨대, 상피 세포 표면 수용체에 대한 혈청일 수 있다.
시료는 일반적으로 결합을 형성하기에 충분한 시간 동안, 예컨대, 37℃에서 수 시간 동안 생리적 조건하에 수용체와 항온 처리한다. 그 후, 비결합 재료를 세척해 낸다. 이 방법은 통상의 기법이 확인하는 데 수개월을 요하는 리간드를 신속히 확인할 수 있다.
보유물 크로마토그래피는 여러 개의 흡착제 점적상에서 시료를 병행 처리할 수 있게 한다. 따라서, 이 방법은 리간드의 존재에 대해 다수의 시료를 시험하는 것 뿐만 아니라, 다수의 항온 처리 및 용출 조건하에 단일 시료의 시험을 포함한다.
확인된 리간드의 질량 및 다양한 물리 화학적 성질을 측정함으로써, 리간드를 게놈 데이터베이스로부터 정보를 사용하여 적극적으로 확인할 수 있다.
상기 방법의 또 다른 양태에서, 세포에 노출되고 세포로부터 도킹된 단백질을 가진 한 세트의 프로브를 제조한다. 이 프로브는 도킹된 분자에 결합하는 세포로부터 분자를 확인하기 위한 2차 프로브로서 그 자체로 유용하다. 프로브로부터 보유물 지도를 제조한 후에, 일반적으로 2차 프로브를 제조하는 데 사용된 것보다 덜 엄격한 조건하에 프로브를 2차적으로 시험 재료에 노출시키고, 어드레스성 위치를 분석한다. 새로이 프로브에 도킹한 분자가 이미 도킹된 분자에 결합된 것이다.
K. 약물 발견 방법
수용체와 그 리간드 사이의 결합에 간섭하는 분자를 확인하는 것이 약물 개발에 있어 중요한 단계이다. 본 발명은 흡착제 및 피분석물을 시험 화합물에 노출시키고, 흡착제와 피분석물 사이의 결합을 탈착 분광 분석법으로 검출함으로써, 흡착제와 피분석물(예컨대, 수용체 흡착제 및 리간드 피분석물) 사이의 결합을 조절하는 능력에 대해 화합물을 선별하는 방법을 제공한다.
약물 후보에 대해 조합 라이브러리를 신속히 선별하는 데에는 수천종의 약물에 표적 상호작용을 노출시키고 상호작용을 방해하거나 또는 촉진하는 약물을 확인하는 능력이 필요하다. 보유물 크로마토그래피는 리간드/수용체쌍중 하나의 멤버를 기재에 도킹시키고, 그것을 제2 흡착제로서 사용할 수 있게 한다. 그 후, 그 멤버를 그 상대 및 약물에 노출시킨 후, 그 상대가 결합되는 지 여부 및 그 정도를 탈착 분광 분석법으로 측정할 수 있다. 선별 방법에서 보유물 크로마토그래피의 장점은 흡착제를 통해 기재에 수용체를 특이적으로 도킹하는 능력, 병행 처리를 위해 다수의 흡착제 점적상에 수용체를 신속히 전개하는 능력, 및 탈착 분광 분석법을 통해 판독 결과에 의해 가능한 처리 속도를 포함한다.
1. 선별 분석
본 방법은 흡착제를 제공하는 단계; 하나 이상의 선택 조건하에 약물의 존재 및 부재하에 표적 피분석물과 흡착제를 접촉시키는 단계 및 약물의 존재 및 부재하의 결합하는 양을 측정하는 단계를 제공한다. 결합량은 보유물 크로마토그래피로(예컨대, 인지 프로필을 준비함으로써) 측정한다. 실험은 약물을 첨가하지 않은 대조군으로 또는 상이한 양 또는 유형의 약물을 첨가한 대조군으로 수행할 수 있고, 제로(0) 양을 외삽에 의해 측정한다. 결합량의 통계적으로 유의 수준의 차(p<0.05)는 시험 약물이 결합을 조절하는 지를 나타낸다.
상기 방법은 약물 표적 후보로서 피분석물(예컨대, 단백질)을 선별하는 데 특히 유용하다. 혈청 또는 일부 기타 표적 세포형으로부터 단백질 보유 지도 또는 인지 프로필의 개발후에, 약물을 그 어드레스성 위치에서 보유된 피분석물의 어레이에 노출시킨다. 결합을 허용한 후에, 비결합 약물을 용출시키거나 또는 세척해 낸다. 지정된 선택 조건하에 결합된 제제를 보유한 상기 피분석물은 약물 자체가 보유 지도에서 새로운 성분으로서 나타나기 때문에 탈착 질량 분광 분석법으로 직접 확인한다(약물은 직접 탈착되거나 검출됨). 상기 방법은 작용 물질이든 길항 물질이든 약물 후보를 이들이 피분석물에 결합하거나 하나 이상의 과정을 조절하는 능력에 대해 선별하는 데 특히 유용하다.
2. 수용체 및 리간드
흡착제 및 표적 피분석물이 특이적 결합에 개입될 필요는 없다. 그러나, 구체적으로 유용한 방법에서 흡착제 및 표적 피분석물은 리간드/수용체쌍이다.
일 양태에서, 리간드/수용체쌍은 호르몬 및 세포 표면 수용체 또는 세포내 수용체이다. 흡착제는 막 결합 수용체의 경우에 전체 세포 또는 세포막일 수 있다. 단백질 수용체 또는 기타 약물 표적 후보를 흡착제로서 사용하여 조합 약물 라이브러리를 선별할 수 있다. 수백 또는 수천종의 약물 후보를 단일 수용체형 또는 어드레스성 위치에 적용할 수 있다. 비결합 및 약한 결합 약물 후보(즉, 제제)의 제거후에, 결합된 제제를 탈착 분광 분석법으로 검출 및 확인한다.
또 다른 양태로, 흡착제는 표적 기재에 결합하고 변형시키는 효소이다. 제제는 그들이 피분석물의 효소적 변형을 조절하는 능력에 대해 선별한다. 예컨대, 효소 활성은 피분석물의 인지 프로필이 효소 활성의 생성물의 그것과 상이할 수 있기 때문에 검출할 수 있다. 차등 보유도는 제제가 결합을 변화시킨다는 것을 나타낸다.
수용체/수용체는 다양한 방법으로 기재상에 보유시킬 수 있다. 한 가지 방법에서, 수용체/리간드는 비특이적 흡착제에 의해 직접 보유된다. 또 다른 방법에서, 흡착제는 수용체/리간드에 대해 특이적이다. 예컨대, 흡착제는 수용체/리간드에 특이적인 항체를 보유할 수 있다. 수용체/리간드는 융합부가 흡착제에, 예컨대, Fc 단편이 단백질 A에 결합하는 방식으로 특이적으로 결합하는 융합 단백질일 수 있다. 한 가지 방법에서, 유전자 팩키지, 예컨대, 파지 디스플레이 라이브러리에서 유래한 파지는 그 표면에 수용체/리간에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 가지는 것으로서, 기재에 결합한다. 리간드는 폴리펩티드에 의해 포집된다. 또한, 흡착제는 기재에 이미 도킹된 피분석물일 수 있다. 즉, 흡착제는 2차 흡착제, 3차 흡착제 등일 수 있다.
본 발명은 약물(또는 기타 제제)가 표적에 결합하는 직간접적인 결과를 평가하는 특히 유용한 방법을 제공한다. 표적 세포형의 단백질로부터 생성된 보유물 지도에서 하나 이상의 피분석물의 검출은 제제(예컨대, 약물 후보)가 1) 표적 결합 단백질 자체, 2) 일부 기타 피분석물(약물 결합 단백질은 아님) 또는 3) 유전자 발현(상승 또는 감소 조절)에 미치는 작용으로 인해 변화시킬 수 있다. 상기 방법을 프로테오믹스, 기능 게놈학, 약물 발견, 치료 약물 모니터링 및 임상적 진단학에 이용되는 가장 강력한 수단중 하나로 만드는 것은 약물의 존재 및 부재하에 관찰된 일반적인 보유물 지도 또는 인지 프로필에서 약물 유도된 차이인 상기 변화를 검출하는 보유물 크로마토그래피의 높은 분할력 및 정보 생성력이다.
3. 시험 제제
프로티모신 발현을 조절하는 능력으로 선별할 수 있는 시험 제제를 시험 동물에 또는 시험관내에서 배양된 세포에 투여한다. 시험할 제제의 선택은 의사의 판단 범위에 속한다. 그러나, 약물로서의 투여의 다양성 및 용이성으로 인해, 소분자가 시험 제제로서 바람직하다.
a. 화학적 방법
시험할 제제는 다수의 출처로부터 선택할 수 있다. 예컨대, 분자의 조합 라이브러리가 선별에 이용 가능하다. 그러한 라이브러리를 사용하여, 수천의 분자를 조절 활성에 대해 선별할 수 있다. 한 가지 바람직한 양태에서, 다량의 처리량 선별 방법은 다수의 잠재적 치료 화합물(후보 화합물)을 함유하는 라이브러리를 제공하는 단계를 포함한다. 그러한 "조합 화학 라이브러리"는 본원에 기재하는 바와 같이 하나 이상의 분석법으로 선별하여 목적하는 특징적 활성을 나타내는 상기 라이브러리 멤버(특정의 화학종 또는 아종)를 확인한다. 이렇게 확인된 화합물은 통상의 "주도 화합물"로서 작용하거나 또는 자체로 잠재적 또는 실제 치료제로서 사용할 수 있다.
조합 화학 라이브러리의 제조 및 선별은 당업자에게는 널리 알려져 있다. 그러한 조합 화학 라이브러리로는 펩티드 라이브러리를 들 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다(예컨대, 미국 특허 제5,010,175호, Furka (1991) Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-493, Houghton 등 (1991), Nature, 354:84-88 참조). 펩티드 합성법은 결코 본 발명과 함께 사용하기 위해 의도된 유일한 방법은 아니다. 화학 다양성 라이브러리를 생성시키기 위한 기타 화학적 방법을 사용할 수도 있다. 그러한 화학적 방법으로는 펩토이드(PCT 공개 번호 WO 91/19735, 1991년 12월 26일), 암호화된 펩티드(PCT 공개 번호 WO 93/20242, 1993년 10월 14일), 무작위 바이오-올리고머 (PCT 공개 번호 WO 92/00091, 1992년 1월 9일), 벤조디아제핀(미국 특허 제5,288,514호), 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드와 같은 다이버소머(Hobbs 등, (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. 미국 90: 6909-6913), 비닐로거스 폴리펩티드 (Hagihara 등, (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568), 베타-D-글루코스 스캐폴딩을 가진 비펩티드성 펩티드유사물(Hirschmann 등, (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218), 소형 화합물 라이브러리의 유사 유기 합성(Chen 등, (1994) J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661), 올리고카르바메이트(Cho 등, (1993), Science 261: 1303) 및/또는 펩티딜 포스포네이트(Campbell 등, (1994) J. Org. Chem. 59:658)가 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 일반적으로는 문헌[Gordon 등. (1994) J. Med. Chem. 37:1385]을 참조할 수 있고, 상기 화학적 방법은 또한 핵산 라이브러리, 펩티드 핵산 라이브러리(예컨대, 미국 특허 제5,539,083호 참조), 항체 라이브러리(예컨대, Vaughn 등 (1996) Nature Biotechnology, 14(3):309-314) 및 PCT/US96/10287호 참조), 탄수화물 라이브러리(예컨대, Liang 등 (1996) Science, 274:1520-1522 및 미국 특허 제5,593,853호 참조) 및 소형 유기 분자 라이브러리(예컨대, 벤조디아제핀, Baum (1993) C&EN, 1월 18일, 33면, 이소프레노이드 미국 특허 제5,569,588호, 티아졸리디논 및 메타티아자논 미국 특허 제5,549,974호, 피롤리돈 미국 특허 제5,525,735호 및 제5,519,134호, 모폴리노 화합물 미국 특허 제5,506,337호, 벤조디아제핀 미국 특허 제5,288,514호 등 참조)가 있다.
조합 라이브러리의 제조 장치는 시판된다(예컨대, 357 MPS, 390 MPS; 켄터키주 루이스빌 소재의 어드밴스트 켐 테크, 심포니; 매사츄세츠주 워번 소재의 레이닌, 433A; 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템스, 9050 플러스; 매사츄세츠주 베드포드 소재의 밀리포어).
L. 피분석물에 특이적으로 결합하는 제제를 생성시키는 방법
본 발명은 표적 피분석물에 특이적으로 결합하는 제제, 예컨대 단쇄 항체를 생성시키는 방법을 제공한다. 상기 제제는 리간드/수용체 상호작용의 연구에서 표적을 도킹시키는 특이 진단 제제로서 유용하다. 이 방법은 동물을 면역화함으로써 항체를 생성시킬 수 없거나 실제적이지 않은 작은 양으로 분리할 수 있는 표적에 대해 제제를 생성시키는 데 특이 유용하다. 이 방법은 거기에 부착된 표적을 가진 기재를 제공하는 단계; 선별할 제제를 나타내는 유전자 팩키지의 디스플레이 라이브러리를 제공하는 단계; 표적과의 상호 작용을 통해 유전자 팩키지를 특이적으로 보유하도록 라이브러리를 표적에 노출시키고 탈착 분광 분석법으로 보유된 유전자 팩키지를 검출하는 단계를 포함한다.
이들 단계는 간접 검출 수단과 관련된 오프 라인 증폭 및 표지 전략을 포함하여 별도의 선택 및 검출 절차와 관련된 전이 손실 및 모호성 없이 복합 군집내 다수의 흡착제-피분석물 후보에 대해 병행 수행할 수 있다.
1. 기재의 제공
상기 방법의 제1 단계는 선별할 디스플레이 라이브러리의 폴리펩티드 제제에 대한 표적으로서 작용하는 흡착제를 포함하는 기재를 제공하는 것을 포함한다. 일 양태에서, 기재에는 이미 부착된 표적 흡착제가 제공된다. 또 다른 양태로, 기재는 표적 피분석물에 결합하는 흡착제를 가지는 기재를 제공하고, 피분석물의 보유를 허용하는 용출 조건하에 피분석물에 흡착제를 노출시키며, 디스플레이 라이브러리에 대한 표적으로 표적 흡착제를 사용함으로써 제공된다. 일 양태로, 표적은 비교되는 두 세포형 사이에 차등 발현된다. 예컨대, 표적은 차등 발현되는 mRNA로부터 유래하거나 또는 차등 발현되는 폴리펩티드일 수 있다. 보유물 크로마토그래피 방법에 의해 그러한 차등 발현되는 단백질을 확인하는 방법은 전술한 바와 같다.
일단 차등 발현되는 단백질 피분석물이 확인되면, 피분석물을 명확하게 분할하는 선택 조건을 개발할 수 있다. 피분석물의 보유가 특이적이거나 배타성인 것이 보다 바람직하다. 전술한 피분석물의 점진적인 분할 방법은 복합 시료로부터 표적 피분석물에 특이적으로 결합하는 선택 조건을 확인하는 것이 가능하다. 일 양태로, 결합된 표적은 효소에의 노출에 의해 변형시킬 수 있다.
한편, 이 방법은 mRNA 또는 EST 단계에서 시작할 수 있다. 이 방법에서, 차등 발현되는 mRNA 또는 EST는 통상의 방법으로 확인한다. 그 후, 이들 분자는 도킹용 흡착제상에서 시험관내 및 동일계에서 전사 및 해독된다. 예컨대, 다수의 흡착제 점적을 가진 탈착 분광 분석법에 대한 기재를 제조한다. 기재는 실린더형 튜브로 덮어서 웰의 바닥에 흡착제를 가진 웰을 생성시킨다. 웰에는 차등 발현되는 mRNA(통상 cDNA의 형태로)의 시험관내 전사 및 해독에 대한 시약을 넣는다. (방법에 대해서는 예컨대, 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning-- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 뉴욕 (1989) and Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel 등 편집(Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.)] 참조). mRNA 또는 EST의 해독은 흡착되는 폴리펩티드를 생성시킨다. 실린더형 튜브를 제거하고, 흡착제 점적은 용출제로 세척하여 폴리펩티드 피분석물을 보유하는 선택 조건을 확인한다.
2. 디스플레이 라이브러리의 제공
제2 단계는 디스플레이 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 디스플레이 라이브러리는 펩티드("폴리펩티드 제제")의 임의의 종류의 조합 라이브러리를 그 표면상에 디스플레이시키는 유전자 팩키지로 구성된다. 그러나, 단쇄 항체는 이들이 후속 면역 분석법에 사용할 수 있기 때문에 매력적이다.
다양한 종류의 디스플레이 라이브러리 및 그 사용 방법이 당해 분야에 알려져 있다. 디스플레이 방법의 기본 개념은 선별할 폴리펩티드 리간드와 폴리펩티드를 암호화하는 회수 가능한 폴리뉴클레오티드 사이의 물리적 연합을 구축하는 것이다. 이러한 물리적 연합은 다량체 분자 복합체, 이 경우에는 유전자 팩키지, 예컨대, 폴리펩티드를 암호화하는 파지 게놈을 둘러싸는 캡시드의 일부로서 폴리펩티드를 디스플레이시키는 파지 입자에 의해 제공된다. 폴리펩티드와 그 유전 물질 사이의 물리적 연합의 구축에 의해 상이한 폴리펩티드를 보유하는 다수의 유전자 팩키지의 동시적인 대량 선별이 가능하게 된다. 표적에 대한 친화성을 가진 폴리펩티드를 디스플레이시키는 유전자 팩키지는 표적에 결합하며, 이들 팩키지는 표적에 대한 친화도 선별에 의해 농축된다. 이들 팩키지로부터 디스플레이되는 폴리펩티드의 동일성은 그 각각의 게놈으로부터 측정할 수 있다. 이들 방법을 사용하여 목적 표적에 대한 결합 친화도를 가진 것으로 확인되는 폴리펩티드가 통상의 수단으로 대량으로 합성될 수 있다.
디스플레이 라이브러리에 가장 빈번히 사용되는 유전자 팩키지는 박테리오파지, 특히 필라멘트성 파지, 구체적으로 파지 M13, Fd 및 F1이다. 대부분의 연구는 융합 단백질을 형성하는 상기 파지의 gIII 또는 gVIII내로 디스플레이되는 폴리펩티드를 암호화하는 라이브러리를 삽입하여 왔다. 예컨대, WO91/19818호(Dower); WO 91/18989호(Devlin); WO 92/01047호(유전자 III)(MacCafferty); WO 92/06204호 (Huse); WO 92/18619호(유전자 III)(Kang) 참조. 또한 문헌[Cwirla 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 87, 6378-6382 (1990); Ladner 등, 미국 특허 제5,223,409호 및 Ladner 등의 미국 특허 제5,571,698호 참조. 그러한 융합 단백질은 신호 서열, 통상은 파지 코트 단백질 이외의 분비된 단백질, 디스플레이시킬 폴리펩티드 및 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질 또는 그 단편으로부터 유래한 신호 서열을 포함한다. 외래의 암호 서열이 종종 유전자 III 또는 유전자 VIII의 N-말단에 또는 그 근처에 삽입되지만, 기타 삽입 부위도 가능하다. 일부 필라멘트성 파지 벡터를 조작하여 유전자 III 또는 유전자 VIII을 생성시켜 왔다. 그러한 벡터에서, 외래의 서열은 두 사본중 단지 하나내로 삽입한다. 기타 사본의 발현은 파지 입자내로 혼입된 융합 단백질의 비율을 효과적으로 희석시키고, 파지 성장에 유해한 폴리펩티드에 대한 선별의 감소에 유용할 수 있다. 박테리아(박테리오파지 또는 파지)를 감염시키는 비루스의 표면상의 항체 단편의 디스플레이는 광범위한 친화도 및 역학 특성을 가진 인체 sFvs를 생성시킬 수 있다.
또 다른 변형예에서는, 외래 폴리펩티드 서열을 파지 코트 단백질 및 파지 포장 서열을 암호화하지만 복제할 수 없는 파지미드 벡터내로 클로닝한다. 파지미드는 헬퍼 파지에 의한 감염에 의해 세포내로 형질감염시키고 패키징한다. 파지미드계의 사용은 또한 코트 단백질로부터 형성되고 헬퍼 파지로부터 발현된 코트 단백질의 야생형 사본을 가진 폴리펩티드를 디스플레이시킨 융합 단백질을 희석시키는 효과를 가진다(WO 92/09690호(Garrard) 참조).
진핵세포 비루스를 사용하여 유사한 방법으로 폴리펩티드를 디스플레이시킬 수 있다. 예컨대, 몰로니 뮤린 백혈병 비루스의 gp70에 융합된 인체 헤레굴린 (heregulin)의 디스플레이는 문헌[Han 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 92, 9747-9751 (1995)]에 보고되어 있다. 포자를 복제 가능한 유전자 팩키지로 사용할 수도 있다. 이 경우에, 폴리펩티드는 포자의 외면으로부터 디스플레이된다. 예컨대, 비. 서브틸리스에서 유래한 포자가 적합한 것으로 보고되었다. 이들 포자의 코트 단백질의 서열은 문헌[Donovan 등, J. Mol. Biol. 196, 1-10 (1987)]에 제시되어 있다.
세포를 복제 가능한 유전자 팩키지로 사용할 수도 있다. 디스플레이되는 폴리펩티드는 세포 표면상에 발현되는 세포 단백질을 암호화하는 유전자내로 삽입한다. 살모넬라 티피뮤리엄, 바실러스 서브틸리스, 슈도모나스 에어루지노사, 비브리오 콜레라, 클렙시엘라 뉴모니아, 나이제리아 고너리아, 나이제리아 메닌지티디스, 박테로이즈 노도서스, 모락셀라 보비스 및 특히 에스케리챠 콜리를 포함하는 박테리아 세포가 바람직하다. 외면 단백질의 상세한 사항은 미국 특허 제5,571,698호 (Ladner 등) 및 문헌[Georgiou 등, Nature Biotechnology 15, 29-34 (1997)] 및 그 인용 문헌들에 논의되어 있다. 예컨대, 이. 콜리의 lamB 단백질이 적합하다.
3. 디스플레이 라이브러리의 선별
제3 단계는 표적에 특이적으로 결합하는 리간드를 확인하는 디스플레이 라이브러리를 선별하는 것을 포함한다. 표적을 보유하는 기재를 폴리펩티드와 표적 분자 사이의 특이적 결합에 적합한 용출 조건하에 폴리펩티드 제제를 디스플레이시키는 디스플레이 라이브러리에 노출시킨다. 표적을 인지하는 제제를 가지는 유전자 팩키지는 기재에 이미 부착된 표적에 결합된다. 비결합 입자의 제거 및 결합된 입자의 보유는 용출 조건에 노출시킴으로써 이루어진다.
유전자 팩키지의 군집, 이 경우 M13 파지는 1 ㎖당 대량 1011플라크 형성 단위(pfu)를 결합된 표적 흡착제(예컨대, 단백질)의 어드레스성 어레이를 가진 기재에 도입시킨다. 접촉시에 표적 흡착제(즉, 선택도 허용 한계 변형제 또는 용출제)에 대해 최적화된 선택도 조건을 선택함으로써, 단지 작은 서브세트, 바람직하게는 5 내지 10개 미만의 총 파지 유전자형을 선택적으로 보유한다. 비결합 파지(즉, 표적 흡착제에 결합하지 않은 파지) 및 표적 흡착제에 느슨하게 결합된 파지는 거의 대부분의 선택성 피분석물-표적 흡착제 상호작용(들)을 파괴하는 용출제에 노출시켜 제거한다는 것을 주목해야 한다. 표적 흡착제에 대한 최고 친화도를 가진 폴리펩티드를 디스플레이시키는 상기 파지가 선택적으로 보유된다.
4. 표적에 특이적으로 결합되는 제제를 함유하는 결합된 유전자 팩키지의 검출
제4 단계에서, 유전자 팩키지의 표적에의 결합은 탈착 분광 분석에 의해 검출한다. 예컨대, M13 파지는 수천개 사본수의 단일 코트 단백질을 가진다. 탈착 분광 분석에서 레이저를 사용하여 파지를 타격할 때, 코트 단백질은 제거되고 검출 가능하다. 이런 방법으로, 라이브러리가 표적에 결합된 제제를 가진 파지를 보유하는지 여부를 측정할 수 있다. 후속 분석을 위한 유전자 팩키지를 갖기 위해, 선별 단계는 프로브상의 상이한 위치에서 병향하여 수행하거나 또는 기재는 레이저가 표면에 결합된 모든 유전자 팩키지를 제거하지 않도록 충분히 큰 물리적 치수를 가질 수 있다. 이 방법은 피분석물에 결합된 몇개의 파지도 검출할 수 있기 때문에 특히 강력하다.
M13의 경우에, 바람직한 검출 방법은 탈착 분광 분석에 의해 "마커" 단백질 신호로서 유전자 VIII 코트 단백질의 모양을 점검하는 것이다. 이러한 방식으로, 본원 발명자들은 결합된 5개 정도의 적은 파지 입자(pfu)를 가진 "양의" 표적 흡착제를 검출하였다(파지 입자수는 공지의 희석으로부터 계산에 의해 평가함). 기타 파지 마커는 선호도 순으로 유전자 V, 유전자 X 및 유전자 III(그 융합 생성물 포함)을 포함한다.
최고의 친화성 흡착제를 사용한 상기 흡착제 위치, 즉 고 선택 조건(즉, 엄격한 용출제)에의 노출에 보유된 최소수의 파지를 가진 어레이내의 상기 위치의 검출 후에, 결합된 팩키지를 이제 기타 용도에 대한 점프 오프 점으로서 사용할 수 있다.
5. 유전자 팩키지의 분리
일 양태로, 본 방법은 또한 추가의 분석용으로 유전자 팩키지를 분리하는 것을 포함한다. 이 분석은 유전자 팩키지를 재생하는 단계 및 그로부터 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함한다. 분리된 파지는 통상의 방법으로 재생시킬 수 있다. 예컨대, 보유된 파지를 생물학적 증폭 부형제, 예컨대, 이.콜리와 영양 배지에 노출시켜 후속 분석용 유전자 팩키지를 성장시킬 수 있다. 단일 클론을 기재상에 보유된 피분석물에 결합하는 능력에 대해 추가로 분석할 수 있다.
6. 폴리펩티드 제제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 서열 분석
결합된 유전자 팩키지의 폴리펩티드 제제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의서열 분석에 의해 폴리펩티드 제제를 생성시키는 정보를 얻는다. 서열 분석은 흡착제로부터 유전자 팩키지를 분리하는 단계, 그것을 재생시키는 단계, 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계 및 뉴클레오티드 서열을 임의의 이용 가능한 수단으로 서열 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 방법으로, 유전자 팩키지는 기재를 적합한 재료, 예컨대, 유전자 팩키지에 의한 감염되는 세포와 접촉시켜서 동일계에서 재생시킬 수 있다. 또 다른 양태로, 서열 분석은 동일계에서 수행한다. 이 방법은 유전자 팩키지를 용해시키는 단계 및 임의의 공지된 수단(예컨대, PCR)으로 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다. 몇 가지 상이한 유전자 팩키지는 표면상에 이용 가능한 상이한 에피토프에 결합시킬 수 있다. 이 경우에, 단지 한 종류의 파지만이 에피토프에 결합하도록 용출 조건을 변화시킬 수 있다.
7. 폴리펩티드 제제의 생성
한 가지 중요한 다음 단계는 폴리펩티드 제제를 생성시키는 것을 포함한다. 분리된 제제는 예컨대, 진단시의 표적의 특정 검출용 또는 리간드/수용체 상호 작용의 연구용 흡착제로서 사용할 수 있다.
한 가지 방법에서, 폴리펩티드의 생성 단계는 이 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 먼저 서열 분석하는 것을 포함한다. 아미노산 서열은 뉴클레오티드 서열로부터 유도할 수 있다. 서열 분석은 전술한 방법으로 수행할 수 있다. 서열은 폴리펩티드 제제의 재조합 또는 화학적 합성에 대한 기초가 될 수 있다.
또 다른 방법에서, 폴리펩티드는 유전자 팩키지를 재생시켜서 생성할 수 있다. 이것은 유전자 팩키지가 폴리펩티드 제제의 다수 사본을 보유할 때 특히 효과적이다. 유전자 팩키지는 분리와 동일계에서 또는 분리후에 재생시킬 수 있다.
폴리펩티드를 재조합에 의해 생성시키는 방법은 다음과 같이 진행할 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 논의한 것들과 같은 임의의 수단으로 서열 분석하거나 또는 분리할 수 있다. 그 후, 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터에 포함시킨다. 발현 벡터는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 보유한다. 발현 벡터를 사용하여 당해 분야에 널리 알려진 수단으로 폴리펩티드 제제를 재조합에 의해 발현시킬 수 있다.
표적은 하나 이상의 에피토프를 보유할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 이 방법은 표적에 특이적인 하나 이상의 폴리펩티드 제제를 생성시킬 수 있다.
표적 특이적 제제를 임상적 진단 또는 약물 발견에 사용된 프로브용 흡착제로서 사용할 수 있다. 즉, 그러한 프로브가 표적에 특이적으로 결합하는 그 표면제상에 보유되기 때문에, 이들을 사용하여 생물학적 시료과 같은 복합 혼합물로부터 표적을 분리하고, 탈착 분광 분석에 의해 표적을 검출한다. 또한, 제제와 표적 사이의 상호작용이 생체 특이적일 수 있기 때문에, 전술한 점진적 분할 방법에 의해 개발된 흡착제보다 2배 사이로 더 큰 친화도를 포함할 것 같다.
8. 표적의 펩티드 에피토프의 분리
한 가지 변형예에서 상기 방법에 의해 표적 피분석물의 펩티드 에피토프를 분리할 수 있다. 이 방법은 "항-이디오타입" 유사 연구를 이용한다. 요약하면, 표적 피분석물의 에피토프는 예컨대, 파지 디스플레이 라이브러리로 선별한다. 분리된 파지는 예컨대, 피분석물의 에피토프를 인지하는 단쇄 항체를 보유한다. 이들 파지는 다시 제2 디스플레이 라이브러리를 선별한다. 제1 라이브러리의 단쇄 항체에 결합하는 제2 라이브러리에서 유래한 파지는 단쇄 항체에 의해 인지되는 에피토프의 구조를 모방하는 디스플레이된 폴리펩티드를 보유한다.
상기 방법의 일 양태로, 표적 피분석물에 결합하는 폴리펩티드 제제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 제제가 유전자 VIII과의 융합체로서 디스플레이되는 M13 파지를 생성시킨다. 따라서, 이 파지는 그 표면에 수백개 사본수의 표적 펩티드를 가진 코트를 가진다. 그 후, 이 파지를 흡착제에 도킹시킨다. 도킹은 예컨대, 유전자 III에 결합하는 리간드를 통해 수행하거나 또는 유전자 III을 변형시켜 기재상의 리간드에 대한 수용체를 포함시킬 수 있다. 다음, 이 파지를 제2 디스플레이 라이브러리에 노출시킨다. 도킹된 파지에 결합하는 라이브러리로부터 유래한 유전자 팩키지를 상기한 바와 같이 검출하고 분리한다. 제2 디스플레이 라이브러리는 그 유전자 VIII 단백질이 기재에 도킹된 파지의 유전자 VIII로부터 구별될 수 있도록 일부 종류의 대량 표지를 보유하는 것이 바람직하다. 따라서, "피분석물 표적"으로서 또는 흡착제로서 물질의 확인은 결합된 물질을 사용하여 이어서 또 다른 물질에 결합하는 지 여부에 좌우될 수 있다. 당업자라면 알 수 있듯이, 이미 도킹된 물질에 결합하는 능력은 말단 결합된 물질을 선택적으로 제거하는 조건을 확인하는 방법과 마찬가지로 계속될 수 있다.
발명의 개요
본 발명은 보유물(retentate) 크로마토그래피용 장치 및 방법을 제공한다. 보유물 크로마토그래피는 다중 차원의 분리 방법을 통해 복잡한 혼합물 중의 피분석물 분할시 많은 정보를 제공하는 조합 방법이다. 이 방법은 유전자 기능, 단백질, 기능, 세포 기능 및 유기체 전체의 기능에 관여하는 피분석물의 발현 패턴을 직접 검출하기 위한 통합된 단일 작업 시스템을 특징으로 하여 생물학과 의학 분야에 통합된 피분석물의 검출과 기능 분석력을 동시에 제공한다. 1가지 양태로서, 본 발명은 유전자 기능, 단백질 기능 또는 전체 거대 분자 어셈블리, 세포 및 유기체 전체의 기능을 발견 또는 진단하는 통합 작동 시스템을 제공한다.
보다 구체적으로, 피분석물은 각종 2차원 방식으로 분할되어 다중 차원의 정보를 제공할 수 있다. 피분석물은, 먼저 2종 이상의 상이한 선택성 조건, 예컨대 음이온/양이온 전위, 소수성/친수성 또는 특이적 생체분자 인식과 같은 조건하에 고정상에 흡착되는 능력에 따라 2 이상의 상이한 제1차원으로 분리한다. 그 다음, 피분석물을 탈착 분광분석(예컨대, 레이저 탈착 질량 분광분석)으로 질량에 근거하여 제2 차원으로 분리하여 분리된 피분석물을 검출한다. 피분석물이 흡착하는 흡착제의 본성은 피분석물에 대한 물리화학적 정보를 제공한다.
따라서, 본 발명은 병행 피분석물 가공력과 다중체 피분석물 가공력을 포함하는 것을 특징으로 하는 분자 발견 및 진단 장치를 제공한다. 피분석물은 직접 검출되기 때문에, 본 발명은 단일 단위 조작 동안 동일 "회로"(즉, 어드레스성 "칩" 위치)로부터 2종 이상의 독립적인 표적 피분석물의 시그널을 동시에 전송할 수 있다.
보유물 크로마토그래피는 여러 가지 면에서 종래의 크로마토그래피와는 다른 것이다. 첫째, 보유물 크로마토그래피는 흡착제 상에 보유되는 피분석물을 검출한다. 종래의 크로마토그래피 방법은 피분석물을 검출하기 전에 흡착제로부터 용출시킨다. 즉, 종래의 크로마토그래피에서는 흡착제로부터 용출되지 않는 피분석물을 검출할 수 있는 통상적이거나 편리한 수단이 전혀 없다. 따라서, 보유물 크로마토그래피는 보유된 피분석물의 화학적 특성 또는 구조적 특성에 대한 직접적인 정보를 제공한다. 둘째, 흡착 크로마토그래피와 검출용 탈착 분광분석의 조합은 10-15몰범위의 뛰어난 민감도와 매우 미세한 분할능을 제공한다. 세째, 보유물 크로마토그래피는 부분적으로 피분석물을 직접 검출할 수 있기 때문에 다양한 여러 선택성 조건으로 보유물을 신속하게 분석하는 성질을 제공하고, 그 결과 시료 중에 존재하는 피분석물을 신속하고 다중 차원으로 특성 규명할 수 있다. 네째, 흡착제는 소정의 어드레스성 위치의 어레이에서 기재에 부착될 수 있다. 따라서, 여러 용출 조건하에서 상기 어레이 상의 여러 흡착제 부위(즉, "친화성 부위" 또는 "점적")에 노출된 피분석물을 병행 가공할 수 있다.
보유물 크로마토그래피는 생물학과 의학에 많이 사용된다. 그 용도로는 피분석물의 생화학적 조합 분리 및 정제, 차등 유전자 발현 및 분자 인식 과정의 연구, 진단 및 약물 발견 등을 포함한다.
분석용 기구로서 사용될 수 있는 보유물 크로마토그래피의 1가지 기본적인 용도는 여러 흡착제/용출제를 조합한 조합적 분류별로 시료를 노출시키는 단계 및 여러 조건하에서 피분석물의 행동을 검출하는 단계를 포함한다. 그 결과, 피분석물을 정제할 뿐만 아니라 시료 중의 피분석물을 검출하는데 유용한 조건도 동정할 수 있다. 이와 같은 방식으로 동정된 흡착제를 가진 기재는 피분석물의 특이적 검출기로서 사용할 수 있다. 점진적 추출 방법에서는, 시료를 제1 흡착제/용출제 조합에 노출시키고, 이와 같이 제1 흡착제에 흡착된 피분석물이 없는 세척물을 제2 흡착제에 노출시켜 다른 피분석물을 분리해낸다. 또한, 피분석물이 보유되는 것으로 동정된 선택성 조건은, 피분석물을 함유하는 불순 시료를 이 피분석물이 보유되게 하는 흡착제에 후속적으로 노출시키고 불순물은 제거한 후, 후속 단계 동안 흡착제로부터 보유된 피분석물을 수집하는 정제분리용 정제 절차에 사용할 수 있다.
본 발명의 제1 양태는 어레이내 어드레스성 위치에 있는 특정 선택성 조건을 특징으로 하는 분자 인식 과정(예컨대, 표적 흡착제-표적 피분석물 상호작용)의 각 부류 또는 종류를 어드레스성 위치에 결합된 분자가 위치되어 있는 상태(즉, "보유") 동안 직접 검출한다는 것이다. 즉, 직접 방식이기 때문에, 선택 및 검출에는 표적 피분석물의 용출, 회수, 증폭 또는 표지화 과정이 필요하지 않다.
본 발명의 제2 양태는 어드레스성 어레이내에 존재하는 1 이상의 위치에서 1 이상의 목적한 분자 인식 과정의 검출이 이루어지기 때문에 흡착제-피분석물이 소량 보다 많이 분리 또는 소비될 필요가 없다는 것이다. 따라서, 사용되지 않은 분획은 추가 어셈블리 또는 탈어셈블리, 변형 또는 증폭(직접 또는 간접)을 비롯한 구조 및 기능 해명을 목적으로 하는 1가지 이상의 "2차 가공" 과정을 동일계내(즉, 어드레스성 위치의 경계내)에서 직접 수행한 후 추가 조사될 수 있다.
피분석물을 보유하는 것으로 입증된 흡착제 또는 용출제를 추가 변수로 시험하여 보다 우수한 결합 특성이 있는 조합물을 동정하는 "점진적 분할"이라고 하는 반복 공정을 이용하면 피분석물에 대한 특이성이 향상된 흡착제를 개발할 수 있다. 또 다른 방법은 피분석물에 특이적인 항체 흡착제를 이용하여 기재를 신속하게 형성시키는 것이다. 이 방법은 피분석물을 흡착제에 결합시키는 단계 및 이 피분석물에 결합하는 파지를 파지 디스플레이 라이브러리 중에서 선별하는 단계를 포함한다.
또한, 보유물 크로마토그래피는 분자 생물학 및 세포 생물학에도 사용될 수 있다. 2가지 시료 중에 상이하게 존재하는 피분석물(예컨대, 2가지 세포 추출물에서 차등 발현되는 단백질)은 탈착 분광분석법으로 분석할 수 있는 다양한 분석용 흡착제/용출제 조합물에 상기 시료를 노출시켜, 다른 분리 및 검출 시스템이 비교될 수 없는 고정보의 분할력이 있는 시스템을 이용할 수 있게 된다. 미지의 표적 단백질은 흡착제/용출제 조합의 화학적 특성에 근거하여 분자량을 비롯한 물리화학적 특성을 측정하여 동정할 수 있고, 이 정보를 이용하여 유사한 프로파일을 가진 단백질을 데이터베이스에서 선별할 수 있다.
분리 생화학에 사용되는 방법과 이 방법으로 얻어지는 흡착제는 진단에 유용하게 사용된다. 보다 구체적으로, 주요 진단 마커를 검출하는 화학적 흡착제 또는 생체특이적 흡착제를 개발할 수 있다. 특정 구체예에서, 기재는 질병이나 증후군을 진단하는 조합된 마커에 따라 선택된 흡착제 점적 어레이를 보유할 수 있다.
또한, 보유물 크로마토그래피는 약물 규명에 유용하다. 수용체/리간드 쌍의 한 성분을 흡착제에 결합시키고, 결합 파트너를 결합시키는 능력을 제제의 존재하에 시험한다. 이와 같이 흡착이 신속하게 시험될 수 있기 때문에 제제의 조합 라이브러리는 상호작용의 조정 능력을 쉽게 시험할 수 있다.
제1 목적으로, 본 발명은 시료에 존재하는 1종 이상의 피분석물을 고정보 분할하는 방법을 제공한다. 이 방법은 복수의 피분석물을 병행하여 분리 및 검출하는 단계를 포함하는 조합 분리 방법이다. 이 방법은 a) 각각의 선택성 조건이 흡착제와 용출제의 조합을 특징으로 하는 2종 이상의 상이한 선택성 조건에 피분석물을 노출시켜 흡착제에 피분석물이 보유되게 하는 단계, 및 b) 여러 선택성 조건하에 보유된 피분석물을 탈착 분광분석으로 검출하는 단계를 포함한다. 상이한 선택성 조건하에 보유된 피분석물을 검출하면 피분석물이 고정보 분할된다.
제1 구체예에 있어서, 병행 가공을 위하여 소정의 여러 어드레스성 위치에 각각의 상이한 선택성 조건을 지정한다. 다른 구체예에 있어서, 이 방법은 i) 피분석물을 지정 위치의 1차 선택성 조건에 노출시켜 피분석물을 흡착제에 보유시키는 단계, ii) 1차 선택성 조건하에 보유된 피분석물을 탈착 분광분석으로 검출하는 단계, iii) 상기 지정 위치에 있는 흡착제를 상이한 2차 선택성 조건하에 세척하여 이 흡착제에 피분석물을 보유시키는 단계, 및 iv) 2차 선택성 조건하에 보유된 피분석물을 탈착 분광분석으로 검출하는 단계를 포함한다.
제2 구체예에 있어서, 피분석물은 유기 생체분자, 다량체 분자 복합체 또는 거대분자 어셈블리이다. 다른 구체예에 있어서, 유기 생체분자는 효소, 면역글로불린, 세포 표면 수용체 또는 세포내 수용체이다.
제3 구체예에 있어서, 흡착제로는 음이온 흡착제, 양이온 흡착제, 소수성 상호작용 흡착제, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 렉틴, 염료, 환원제, 탄화수소 또는 이의 조합물을 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 흡착제는 유리, 세라믹, 자기 물질, 유기 중합체, 전도 중합체, 천연 생체중합체, 금속 또는 유기 중합체로 코팅된 금속을 포함하는 기재에 부착되어 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 흡착제는 마이크로에멀젼, 라텍스, 층 또는 비드 형태이다. 또 다른 구체예에 있어서, 기재 상의 위치는 직선이나 직각 어레이로 배열되기도 한다. 다른 구체예에 있어서, 피분석물을 선택성 조건에 노출시키기에 앞서 흡착제를 기재 상의 여러 위치에 배치한다. 또 다른 구체예에 있어서, 흡착제는 피분석물을 선택성 조건에 노출시킨 후 기재 상의 여러 위치에 배치되기도 한다. 다른 구체예에 있어서, 상이한 선택성 조건은 상이한 결합 조건 또는 상이한 용출 조건을 포함한다.
제4 구체예에 있어서, 검출 단계는 레이저 탈착 질량 분광분석으로 피분석물의 질량을 측정하는 단계를 포함한다.
제5 구체예에 있어서, 선택성 조건은 흡착제가 피분석물을 최대로 보유할 수 있는 조건으로 선택한다. 다른 구체예에서 1종 이상의 피분석물은 피분석물이 1종 보다 많은 것이다. 또 다른 구체예에 있어서, 복수의 선택성 조건은 상이한 흡착제와 동일 용출제를 특징으로 한다.
제6 구체예는 피분석물을 보유하는 것으로 확인된 선택성 조건 유래의 흡착제를 어드레스성 위치에 함유하는 기재를 제공하는 단계를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 용출 조건은 pH, 완충력, 이온 강도, 물의 구조 특성, 세정제 종류, 세정제 강도, 소수성 또는 유전 상수에 따라 달라진다. 또 다른 구체예에 있어서, 복수의 선택성 조건은 동일 용출제의 사용을 특징으로 하기도 한다.
제7 구체예에 있어서, 본 발명은 시료로부터 피분석물을 연속 추출하는 방법을 제공한다. 이것은 병행되는 복수의 피분석물에 대한 조합된 연속 분리 및 정제 개발 방법이다. 이 방법은 a) 피분석물을 함유하는 시료를 1차 선택성 조건에 노출시켜 제1 흡착제에 피분석물이 보유되게 하고, 나머지 비보유 시료를 얻는 단계, b) 피분석물을 함유하는 비보유성 시료를 수집하고 비보유성 시료를 2차 선택성 조건에 노출시켜 제2 흡착제에 피분석물이 보유되게 하고 나머지 비보유성 시료를 얻는 단계, 및 c) 여러 선택성 조건하에 보유된 피분석물을 탈착 분광분석으로 측정하는 단계를 포함한다.
제2 목적으로, 본 발명은 결합 특성이 1 이상의 선형 축을 따라 일정 구배로 변화하는 흡착제를 포함하는 탈착 분광분석용 기재를 제공한다.
제3 목적으로, 본 발명은 시료 중에 존재하는 피분석물에 대하여 향상된 분할능이 있는 선택성 조건을 점진적으로 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) (i) 각 선택성 조건이 1종 이상의 결합 특성과 1종 이상의 용출 특성을 특징으로 하는 일군의 선택성 조건에 시료를 노출시키는 단계, (ii) 각 선택성 조건하에 보유된 피분석물을 탈착 분광분석으로 측정하는 단계, 및 (iii) 피분석물을 보유하는 선택성 조건을 동정하는 단계로 시료 중의 피분석물을 보유하는 선택성 조건을 동정하는 단계; 및 (b) (i) 동정된 선택성 조건으로 부터 1종 이상의 결합 특성이나 용출 특성을 선택하고 선택성 특징 불변 군에 첨가하는 단계, (ii) 변형군에 속하는 각각의 선택성 조건이 (1) 불변군에 속하는 선택성 특징과 (2) 불변군에 속하지 않는 결합 특성이나 용출 특성을 포함하는 변형 선택성 조건군에 시료를 노출시키는 단계, 및 (iii) 종래 동정된 선택성 조건과 비교하여 향상된 분할능으로 피분석물을 보유하는 변형군 유래의 선택성 조건을 탈착 분광분석으로 동정하는 단계를 포함한다. 한가지 구체예는 단계 (b)를 1회 이상 반복하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예는 시료로부터 표적 피분석물만이 보유되는 선택성 조건이 동정될 때까지 단계 (b)를 반복하는 것을 포함한다.
제4 목적으로, 본 발명은 점진적 분할 방법에 의해 피분석물을 분할하는 것으로 동정된 선택성 조건 유래의 흡착제를 포함하는 탈착 분광분석용 기재를 제공한다. 한가지 구체예에 있어서, 기재는 선택성 조건 유래의 용출제 또는 흡착제와 함께 용출제 사용시의 지침서를 더 포함하는 키트 형태로 제공된다.
제5 목적으로, 본 발명은 불순 시료로부터 피분석물을 정제용으로 정제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 a) 시료를 복수의 상이한 선택성 조건하에 기재에 노출시키고, 상이한 선택성 조건하에 보유된 피분석물을 탈착 분광분석으로 검출한 뒤, 피분석물이 보유되는 선택성 조건을 동정하는 단계, b) i) 동정된 선택성 조건하에 피분석물을 흡착제에 노출시켜 피분석물이 흡착제에 보유되게 하는 단계, ii) 기재에 보유되지 않는 불순물로부터 피분석물을 분리하는 단계 및 iii) 이 피분석물을 흡착제로부터 수거하는 단계를 포함하는 일련의 순서를 동정된 복수의 상이한 선택성 조건마다 반복하여 피분석물을 정제하는 단계를 포함한다.
제6 목적으로, 본 발명은 시료 중에 존재하는 1종 이상의 피분석물을 검출하는 기재를 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 피분석물 특이적 흡착제를 디자인하고 동정하는 조합 방법이다. 이 방법은 표적 피분석물을 검출하는데 유용하다. 이 방법은 a) 흡착제와 용출제의 조합을 특징으로 하는 2종 이상의 상이한 선택성 조건에 시료를 노출시켜 흡착제에 피분석물이 보유되게 하는 단계, b) 피분석물이 보유되어 있는 1종 이상의 선택성 조건을 탈착 분광분석으로 동정하는 단계 및 c) 동정된 선택성 조건 유래의 1종 이상의 흡착제를 포함하는 기재를 제조하는 단계를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 동정 단계는 복수의 피분석물이 보유되는 1종 이상의 선택성 조건을 동정하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제조 단계는 용출 조건하에 피분석물을 보유하는 복수의 흡착제를 다중체 흡착제로서 포함하는 기재를 제조하는 단계를 포함한다.
제7 목적으로, 본 발명은 1종 이상의 진단 마커를 특징으로 하는 질병에 대하여 환자를 진단하는 방법을 포함한다. 이 방법은 복수의 진단 마커를 동시 검출하는 조합 방법이다. 이 방법은 a) 용출 조건하에 1종 이상의 진단 마커를 분할하는 흡착제를 각 어드레스성 위치에 함유하는 1종 이상의 어드레스성 위치를 포함하여 탈착 분광분석에 사용하기 위한 기재를 제공하는 단계, b) 이 기재를 용출 조건하에 환자의 생체 시료에 노출시켜 진단 마커가 보유되게 하는 단계 및 c) 보유된 진단 마커를 탈착 분광분석으로 검출하는 단계를 포함한다. 보유된 진단 마커의 검출을 통해 질병을 진단할 수 있다.
제8 목적으로, 본 발명은 (1) 흡착제와 용출제를 포함하는 선택성 조건하에 피분석물을 분할하는 흡착제를 각각 함유하는, 1종 이상의 어드레스성 위치를 포함하고 탈착 분광분석에 사용되는 기재, (2) 선택성 조건에 시료를 노출시키기 위한 지침서 또는 용출제를 포함하는, 시료 중의 피분석물을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 한가지 구체예에서, 키트는 복수의 진단 마커를 특징으로 하며, 기재는 복수의 어드레스성 위치를 포함하고, 각 어드레스성 위치는 1종 이상의 진단 마커를 분할하는 흡착제를 포함한다.
제9 목적으로, 본 발명은 환자 시료 유래의 병리적 증상에 대한 복수의 진단 마커를 분할하는 1종 이상의 흡착제를 1종 이상의 어드레스성 위치에 포함하는 탈착 분광분석용 기재를 제공한다.
제10 목적으로, 본 발명은 피분석물 단백질의 동질 후보를 선택하는 방법을 제공한다. 이 방법은 2종 이상의 물리화학적 성질에 근거하여 단백질을 동정하는 조합 방법이다. 이 방법은 a) i) 단백질 피분석물의 물리화학적 특징을 동정하는 유인성에 근거하여 기재에 대한 단백질 피분석물의 흡착이 매개되는 복수의 상이한 선택성 조건하에 피분석물을 노출시키는 단계, 및 ii) 상이한 선택성 조건하에 보유된 피분석물을 탈착 분광분석으로 검출하는 단계에 의해 시료 중에 존재하는 단백질 피분석물의 적어도 제1 및 제2 물리화학적 특징에 대한 부합 변수를 구체화한 가치값 세트를 결정하는 단계, 및 b) i) 일군의 기준 폴리펩티드의 각 구성원에 대하여 기준 폴리펩티드의 적어도 제1 및 제2 물리화학적 특징을 구체화한 가치값 세트를 포함하는 데이터베이스에 접근하는 단계, ii) 단백질 피분석물의 물리화학적 특징을 구체화한 가치값 세트를 입력하는 단계, iii) 이 데이터베이스로부터 부합 변수의 가치값 세트를 보유하는 기준 폴리펩티드를 분류하는 단계를 프로그램가능한 디지탈 컴퓨터에서 수행하는 단계를 포함한다. 이와 같이 분류된 기준 폴리펩티드는 단백질 피분석물과 동질성이 있는 후보를 제공한다. 분류되지 않은 기준 폴리펩티드는 동질성 후보로서 배제된 것이다.
제11 목적으로, 본 발명은 피분석물을 후속적으로 보유시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 다량체 거대분자 또는 초대분자 어셈블리 모니터 방법이다. 이 방법은 분자 인식 간섭에 의해 약물을 발견하는 방법으로 유용하다. 이 방법은 a) 제1 시료를 제1 흡착제와 용출제에 노출시켜 이 흡착제에 제1 피분석물이 보유되게 하고, 흡착된 피분석물을 탈착 분광분석으로 검출하여 보유된 제1 피분석물을 제2 흡착제로 사용하는 단계, b) 제2 시료를 제2 흡착제와 용출제에 노출시켜 제2 피분석물이 제2 흡착제에 보유되게 하고, 흡착된 제2 피분석물을 탈착 분광분석으로 검출하여 보유된 제2 피분석물을 제3 흡착제로 사용하는 단계를 포함한다.
제12 목적으로, 본 발명은 시료 중에 존재하는 효소를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 a) 흡착제를 포함하는 고체상과 이 흡착제에 결합되는 효소 기질을 제공하여, 이 효소 기질 상에 존재하는 효소의 활성으로 특징적인 분자 질량을 가진 생성물을 생성시키는 단계, b) 시료에 기질을 노출시키는 단계, 및 c) 생성물을 탈착 분광분석으로 검출하는 단계를 포함한다. 생성물의 검출을 통해 효소가 검출된다.
제13 목적으로, 본 발명은 제1 생체 시료와 제2 생체 시료 중에서 피분석물이 차등 존재(예컨대, 차등 발현)하는지를 측정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 차등 단백질 디스플레이로 차등 유전자 발현을 모니터하는 조합 방법에 유용하다. 이 방법은 a) 제1 시료 중에 존재하는 피분석물의 제1 보유 지도를 1종 이상의 선택성 조건하에 측정하는 단계, b) 이와 동일한 선택성 조건하에 제2 시료중에 존재하는 피분석물의 제2 보유 지도를 측정하는 단계, 및 c) 제1 보유 지도와 제2 보유 지도 사이의 차이를 측정하는 단계를 포함한다. 보유 지도 중의 차이를 통해 제1 시료와 제2 시료 중에 차등 존재하는 피분석물을 측정할 수 있다.
제1 구체예에 있어서, 이 방법은 한 단백질이 2종의 상이한 세포 사이에서 차등 발현되는지를 측정하는 것이고, 제1 시료와 제2 시료는 세포 또는 세포 유래의 물질을 포함한다. 제2 구체예에 있어서, 제제가 생체 시료내 존재하는 단백질의 발현을 변화시키는지를 측정하고자 한다면 제2 생체 시료가 아닌 제1 생체 시료에 제제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 제3 구체예에 있어서, 제1 생체 시료는 건강한 검체에서 얻은 것이고 제2 생체 시료는 병리학적 증상을 겪는 검체에서 얻은 것이다. 이 시료는, 예컨대 혈액, 요, 혈청 및 조직 중에서 선택할 수 있다. 병리적 검체 유래의 시료에서 증가되는 것으로 밝혀진 피분석물은 후보 진단 마커이다. 일반적으로, 진단 마커의 확인은 많은 검체 중에 존재하는 마커의 검출을 포함한다.
제14 목적으로, 본 발명은 수용체에 대한 리간드를 동정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 a) 수용체가 결합되어 있는 흡착제를 포함하는 기재를 흡착제에 제공하는 단계, b) 이와 같이 결합된 수용체를, 이 수용체와 리간드 사이를 결합시키는 조건하에 리간드를 함유하는 시료에 노출시키는 단계, 및 c) 결합된 리간드를 탈착 분광분석으로 검출하는 단계를 포함한다.
제15 목적으로, 본 발명은 제제가 표적 피분석물과 흡착제 사이의 결합을 조정하는지를 측정하는 선별 방법을 제공한다. 이 방법은 약물 개에 사용되는 조합 방법이다. 이 방법은 a) 용출 조건하에 표적 피분석물이 결합하는 흡착제를 포함하는 기재를 제공하는 단계, b) 이 용출 조건하에 제제와 표적 피분석물에 기재를 노출시켜 표적 피분석물과 흡착제 간을 결합시키는 단계, c) 표적 피분석물과 흡착제 간의 결합 양을 탈착 분광분석으로 검출하는 단계 및 d) 흡착제를 첨가하지 않고 용출 조건하에 기재를 표적 피분석물에 노출시켰을 때의 대조 결합양이 상기 측정양과 상이한 지를 측정하는 단계를 포함한다. 측정양과 대조양 간의 차이는 흡착제가 결합을 조정한다는 것을 시사한다.
제16 목적으로, 본 발명은 표적 흡착제에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드제를 암호하는 폴리뉴클레오티드 함유의 유전자 팩키지를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 일 양태로서 보유물 지도화로 분리된 표적 단백질이나 시험관내 전사 및 해독으로 동일계내 생성된 표적 단백질의 이용을 포함하여, 디스플레이 라이브러리로부터 피분석물 특이적 파지를 선택하는 조합 방법이다. 이 방법은 a) 표적 흡착제를 포함하는 기재를 제공하는 단계, b) 폴리펩티드제를 암호하는 뉴클레오티드 서열 함유의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 암호된 폴리펩티드제가디스플레이되는 표면을 보유하는 복수의 상이한 유전자 팩키지를 포함하는 디스플레이 라이브러리를 제공하는 단계, c) 폴리펩티드제와 표적 흡착제 사이이 특이적 결합을 형성시키는 용출 조건하에 디스플레이 라이브러리에 기재를 노출시켜 폴리펩티드제를 포함하는 유전자 팩키지를 기재상에 보유시키는 단계, 및 d) 이 기재 상에 보유되는 유전자 팩키지를 탈착 분광분석으로 검출하는 단계를 포함한다.
이 방법의 일 구체예에 있어서, 디스플레이 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리이다. 다른 구체예에 있어서, 파지는 M13이다. 또 다른 구체예에 있어서, 폴리펩티드는 단쇄 항체이다. 또 다른 구체예에 있어서, 표적 피분석물은 상이한 표현형을 가진 세포 사이에 차등 발현되는 폴리펩티드 피분석물이다. 또 다른 구체예에 있어서, 기재는 세포 또는 세포막을 포함한다.
다른 구체예에 있어서, 표적 흡착제를 포함하는 기재를 제공하는 단계는, i) 용출 조건하에 표적 피분석물을 보유하는 흡착제 함유의 기재를 제공하는 단계, 및 ii) 표적 피분석물이 이 흡착제에 보유되게 하는 용출 조건하에 표적 피분석물에 흡착제를 노출시켜 표적 피분석물을 표적 흡착제로 만드는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 표적 피분석물은 표적 폴리펩티드이고, 흡착제를 노출시키는 단계 ii)는 표적 폴리펩티드를 암호하는 폴리뉴클레오티드를 시험관내 해독시켜 동일계내에서 표적 폴리펩티드를 흡착제 상에 생성시키는 단계를 포함하고, 또한 기재 상에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열을 동일계내에서 증폭시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 기재는 (1) 고착 폴리펩티드를 결합시키는 흡착제 및 (2) 고착 폴리펩티드와 표적 흡착제 폴리펩티드를 디스플레이하는 표면을 보유하고, 상기 표적 흡착제를 암호하는 뉴클레오티드 서열 함유의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 표적 유전자 팩키지를 포함하며, 이 표적 유전자 팩키지는 고착 폴리펩티드를 통해 흡착제에 결합되어 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 폴리펩티드제를 암호하는 뉴클레오티드 서열을 서열분석하는 단계, 보유된 유전자 팩키지를 분리하거나 폴리펩티드제를 생성시키는 단계 중 어느 하나의 단계를 더 포함한다.
제17 목적에 있어서, 본 발명은 유전자 팩키지의 표면상에 디스플레이되는 고착 폴리펩티드에 결합하는 흡착제를 함유하는 탈착 분광분석용 기재를 제공하는데, 상기 유전자 팩키지의 표면은 표적 폴리펩티드를 더 디스플레이하고, 상기 유전자 팩키지는 표적 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열 함유의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
제18 목적에 있어서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드의 해독을 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 a) 탈착 분광분석에 사용하기 위한 흡착제를 함유하는 기재를 제공하는 단계, b) 이 기재를 폴리펩티드 암호성 폴리뉴클레오티드 및 이 폴리뉴클레오티드를 시험관내 해독시키는 제제와 접촉시켜 폴리펩티드를 생성하는 단계, c) 이 기재를 용출제에 노출시켜 상기 흡착제에 폴리펩티드가 보유되게 하는 단계, 및 d) 보유된 폴리펩티드를 탈착 분광분석으로 검출하는 단계를 포함한다. 폴리펩티드의 검출을 통해 폴리뉴클레오티드의 해독이 검출된다.
하기 실시예들은 한정하기 위함이 아니라 예시하기 위하여 제공된다.
하기 실시예에서는, 하기 생성물 및 용어를 이용한다. 계란 흰자 라이소자임 (10 pmole/㎕물로 희석된 1 ㎕)은 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미컬 캄파니에서 시판된다. "인간 혈청"은 20 mM 인산나트륨 완충제, 0.5 M NaCl, pH 7.0에서 1 내지 5로 희석된 인간 혈청 1 ㎕의 조성물을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "㎎"은 밀리그램(들)을 의미하고; "㎖"은 밀리리터(들)를 의미하며; "㎕"는 마이크로리터(들)를 의미하고; "㎝"는 센티미터(들)를 의미하며; "㎚"는 나노미터(들)를 의미하고; "M"은 몰을 의미하며; "mM"은 밀리몰을 의미하고; "min"은 분(들)을 의미하며; "%" 또는 "퍼센트"는 달리 지정하지 않으면 중량%를 의미하고; "NaCl"은 염화나트륨을 의미하며; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 의미한다.
I. 보유물 크로마토그래피에 대한 프로토콜
하기의 프로토콜은 보유물 크로마토그래피를 수행하는 절차의 예들이다.
A. 보유물 지도 작성용 프로토콜(크로마토그래피 시리즈 어레이 사용)
1. 시료 처리
생물학적 시료(예컨대, 혈청, 뇨, 세포 추출물 또는 세포 배양 배지)을 HEPES 또는 20 mM Na 포스페이트, pH 7.2중의 0.01% 트리톤 X100에서 희석한다. 필요에 따라 시료를 청징화하기 위해 원심분리한다.
2. 시료 부가
시료(1 내지 5 ㎕)을 음이온성 정상상 또는 TED-Cu(II) 흡착제 어레이의 점적에 첨가한다. 소수성 흡착제 어레이의 경우, 0.5% TFA를 함유하는 0.5 ㎕의 아세토니트릴과 각 점적을 사전 습윤화한다. 아세토니트릴을 건조시키기 전에 시료를 점적에 첨가한다. 시료가 점적상에서 농축되게 한다(거의 건조 상태로).
3. 세척
a. 음이온성 흡착제 어레이
점적 1을 20 mM HEPES 또는 Na 포스페이트, pH 7.2로 세척한다. 시료를 완전히 건조시키기 전에 세척액 2 ㎕를 먼저 점적에 첨가한다. 세척액을 점적상에 15 초 이상 유지시킨다. 10회 피펫팅한다. 제1 세척액을 완전히 제거하고, 상기 용액 2 ㎕의 제2 세척액으로 반복한다. 점적 2를 상기와 같이 20 mM Na 포스페이트, pH 7.2중에서 0.2M NaCl 로 세척한다. 점적 3을 상기와 같이 20 mM Na 포스페이트, pH 7.2중에서 1M NaCl 로 세척한다. 점적 4를 상기와 같이 20 mM 트리스HCl, pH 8.5로 세척한다. 점적 5를 상기와 같이 0.1M Na 아세테이트, pH 4.5로 세척한다. 점적 6을 상기와 같이 20 mM HEPES 또는 Na 포스페이트, pH 7.2중의 0.05% 트리톤 X100으로 세척한다. 점적 7을 상기와 같이 20 mM HEPES 또는 Na 포스페이트, pH 7.2중의 3M 우레아로 세척한다. 점적 8을 상기와 같이 물중 10% 아세토니트릴로 세척한다. 전체 어레이를 물로 완전히 세척한다. 칩을 공기 건조시킨다. 0.3 ㎕의 에너지 흡수 분자(50% 아세토니트릴, 0.5% 트리플루오로아세트산에 제조된 포화 용액)를 첨가한다. 칩을 공기 건조시킨다. 각 점적상에 보유된 단백질을 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광계로 분석한다.
b. 정상상 흡착제 어레이
점적 1을 5 mM HEPES, pH 7로 세척한다. 시료를 완전히 건조시키기 전에 세척액 2 ㎕를 먼저 점적에 첨가한다. 세척액을 점적상에 15 초 이상 유지시킨다. 10회 피펫팅한다. 제1 세척액을 완전히 제거하고, 상기 용액 2 ㎕의 제2 세척액으로 반복한다. 점적 2를 상기와 같이 20 mM Na 포스페이트, 0.15M NaCl 로 세척한다. 점적 3을 상기와 같이 20 mM Na 포스페이트, 0.5M NaCl, pH 7.2로 세척한다. 점적 4를 상기와 같이 0.1M Na 아세테이트, pH 4.0으로 세척한다. 점적 5를 상기와 같이 20 mM Na 포스페이트, 0.15M NaCl, pH 7.2중에서 0.05% 트리톤 X100으로 세척한다. 점적 6을 상기와 같이 20 mM Na 포스페이트, 0.15M NaCl, pH 7.2중의 3M 우레아로 세척한다. 점적 7을 상기와 같이 1% TFA로 세척한다. 점적 8을 상기와 같이 물중 30% 이소프로판올:아세토니트릴(1:2)로 세척한다. 전체 어레이를 물로 완전히 세척한다. 칩을 공기 건조시킨다. 0.3 ㎕의 에너지 흡수 분자(50% 아세토니트릴, 0.5% 트리플루오로아세트산에 제조된 포화 용액)를 첨가한다. 칩을 공기 건조시킨다. 각 점적상에 보유된 단백질을 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광계로 분석한다.
c. TED-Cu(II) 흡착제 어레이
점적 1을 20 mM Na 포스페이트, 0.5M NaCl, pH 7.2로 세척한다. 시료를 완전히 건조시키기 전에 세척액 2 ㎕를 먼저 점적에 첨가한다. 세척액을 점적상에 15 초 이상 유지시킨다. 10회 피펫팅한다. 제1 세척액을 완전히 제거하고, 상기 용액 2 ㎕의 제2 세척액으로 반복한다. 점적 2를 상기와 같이 20 mM Na 포스페이트, 0.5M NaCl, pH 7.2로 세척한다. 점적 3을 상기와 같이 20 mM Na 포스페이트, 0.5M NaCl, pH 7.2중에서 100 mM 이미다졸로 세척한다. 점적 4를 상기와 같이 0.1M Na 아세테이트, 0.5M NaCl, pH 4.0으로 세척한다. 점적 5를 상기와 같이 20 mM Na 포스페이트, 0.15M NaCl, pH 7.2중에서 0.05% 트리톤 X100으로 세척한다. 점적 6을 상기와 같이 20 mM Na 포스페이트, 0.15M NaCl, pH 7.2중의 3M 우레아로 세척한다. 점적 7을 상기와 같이 1% TFA로 세척한다. 점적 8을 상기와 같이 물중 10% 아세토니트릴로 세척한다. 전체 어레이를 물로 완전히 세척한다. 칩을 공기 건조시킨다. 0.3 ㎕의 에너지 흡수 분자(50% 아세토니트릴, 0.5% 트리플루오로아세트산에 제조된 포화 용액)를 첨가한다. 칩을 공기 건조시킨다. 각 점적상에 보유된 단백질을 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광계로 분석한다.
d. 소수성 흡착제 어레이
점적 1을 0.1% TFA중의 5% 아세토니트릴로 세척한다. 시료를 완전히 건조시키기 전에 세척액 2 ㎕를 먼저 점적에 첨가한다. 세척액을 점적상에 15 초 이상 유지시킨다. 10회 피펫팅한다. 제1 세척액을 완전히 제거하고, 상기 용액 2 ㎕의 제2 세척액으로 반복한다. 점적 2를 상기와 같이 0.1% TFA중의 50% 아세토니트릴로 세척한다. 점적 3을 상기와 같이 20 mM Na 포스페이트, 0.15M NaCl, pH 7.2중에서 0.05% 트리톤 X100으로 세척한다. 점적 4를 상기와 같이 20 mM Na 포스페이트, 0.15M NaCl, pH 7.2중의 3M 우레아로 세척한다. 전체 어레이를 물로 완전히 세척한다. 칩을 공기 건조시킨다. 0.3 ㎕의 에너지 흡수 분자(50% 아세토니트릴, 0.5% 트리플루오로아세트산에 제조된 포화 용액)를 첨가한다. 칩을 공기 건조시킨다. 각 점적상에 보유된 단백질을 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광계로 분석한다.
B. 항체-항원 분석 프로토콜; 수용체 리간드 분석(활성전 흡착제 어레이 이용)
1. 활성전 흡착제 어레이에서의 항체 고정
편평하고 청결한 표면에 활성화전 흡착제 어레이를 배치한다. 이소프로판올 0.5 ㎕로 미리 수화시킨 활성화전 흡착제 어레이의 각 점적상에 항체 또는 수용체 또는 대조 용액으로 점적한다(이소프로판올이 건조되기 전에 각 점적당 1 ㎕ 항체를 첨가한다).
습식 챔버에서 항온처리한다(4℃ 또는 실온에서 2∼18 시간).
피펫을 사용하여 점적에서 잔류 용액을 제거한다.
전체 칩상의 PBS중 1M 에탄올아민(pH 7.4) 1 ㎖를 첨가하여 점적상의 잔여 활성 부위를 차단한다. 칩을 PBS중 1% 트리톤 X-100으로 2회 세척한다. 15 ㎖ 원뿔형 플라스틱관내 세척 용액 9 ㎖중 칩을 담그고, 15분 이상 동안 벤치탑(benchtop) 교반기에서 흔든다.
전술한 바와 같이 0.1 M 아세트산나트륨, pH 4.0 중 0.5 M NaCl로 세척한다.
전술한 바와 같이 0.1 M 트리스HCl, pH 8.0 중 0.5 M NaCl로 세척한다.
전술한 바와 같이 PBS로 세정한다. 그 다음 PBS로 칩을 피복하고 사용 준비가 될때까지 4℃에서 저장한다.
2. 항원 또는 리간드의 결합
칩상에서 PBS를 가볍게 진탕하거나 또는 블롯팅한다.
각 점적에 시료 1∼5 ㎕를 첨가한다. 항원 또는 리간드 농도가 매우 낮은 시료의 경우, 흡착제 어레이를 바이오프로세서내에 둔다. 칩상의 점적 및 바이오프로세서 웰을 PBS 200 ㎕로 2회 세척한다. 시료 300 ㎕를 각 웰에 첨가한다. 접착 테이프로 밀봉한다.
진탕하면서 항온처리한다(4℃ 또는 실온에서 1∼18 시간).
3. 세척
점적으로부터 시료를 제거하고, 2㎕의 PBS, pH 7.2 중 0.1% 트리톤 X100으 각 점적을 2회 세척한다. 제1 세척 용액 2 ㎕를 점적에 첨가한다. 세척 용액을 15초 이상 동안 점적상에 둔다. 피펫팅을 10회 한다. 제1 세척액을 완전히 제거한 후, 제2 세척액 2 ㎕로 반복한다. 그 다음 0.1 M HEPES, pH 7.4 중 0.5 M NaCl로 세척한다.
전체 어레이를 물로 철저히 세척한다.
4. 보유 단백질 분석
칩을 공기건조 한다.
0.3 ㎕ 에너지 흡수 분자(50% 아세토니트릴, 0.5% 트리플루오로아세트산에서 제조된 시나핀산 또는 EAM1 또는 CHCA 포화 용액)를 첨가한다.
칩을 공기 건조한다.
레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기를 사용하여 각 점적상에서 보유 단백질을 분석한다.
II. 리소자임의 인식 프로필
본 발명자들은 정보분할능이 큰 보유물 크로마토그래피를 사용하여 리소자임에 대한 인식 프로필을 얻었다. 프로필은 6개의 흡착제를 이용한 리소자임의 분할을 포함하며, 각각의 흡착제는 각종 상이한 선택성 허용한계 변형제하에 존재한다. 분석 결과 리소자임의 물리화학적 성질을 다르게 특성규명하는 40개의 상이한 분광 사진기가 생긴다.
A. 친수성 흡착제 어레이를 사용한 리소자임 인식 프로필
닭의 난백 리소자임을 스테인레스 스틸 기재상에 있는 산화규소 흡착제의 크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이의 각종 점적에 첨가한다. 실온에서 15분 동안 습식 챔버에서 항온처리한 후, 흡착제의 상이한 점적 각각을 다음과 같은 용출제(선택성 허용한계 변형제) 중 하나로 세척한다.
(1) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0,
(2) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0 중 0.2 M NaCl,
(3) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0 중 0.4 M NaCl,
(4) 25 mM 아세트산나트륨 완충액, 0.125 M NaCl, pH4.5,
(5) 1% TFA,
(6) 수중 10% 아세토니트릴,
(7) 수중 20% 아세토니트릴,
(8) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl, pH7.0 중 0.05% 트윈 20, 및
(9) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0 중 3 M 우레아.
3회 흡착제 점적의 안과 밖에서 세척 용액 1 ㎕를 피펫팅하여 세척한다. 이 과정을 새로운 세척 용액의 분액으로 반복한다. 이어서, 흡착제 점적을 물 1 ㎕로 2회 세척한다. 시나핀산의 분액 0.3 ㎕(5 ㎎/㎖ 50% 아세토니트릴:0.5% TFA)를 첨가하고 공기 건조한다. 이 어레이는 질소 레이저(355 nm) 및 60 cm 비행관을 사용하여 질량 분석기로 분석한다. 데이터는 컴퓨터로 분석하고 데이터 중첩 제시를 위해 GRAMS/32c(갈락틱 인더스트리즈 코포레이션에서 입수가능)로 보낸다.
도 5a는 정상상 크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이상에 리소자임 인식 프로필의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 하부 프로필은 pH7 완충액 단독으로 세척한 후에 산화규소 흡착제상에 보유된 리소자임 시그널 강도를 나타낸다. 선택성 허용한계 변형제내 염화나트륨(0.2∼0.4 M)이 혼재되어 있으면, 리소자임의 보유량을 감소시킨다. 이는 이산화규소(pH7에서 음으로 하전됨) 흡착제와 리소자임(염기성 단백질)의 상호작용이 이온 교환 기작을 포함한다는 것을 보여준다. 선택성 허용한계 변형제의 pH를, 예컨대 아세트산나트륨 완충액에서 pH4.5로 낮추거나 또는 1% TFA에서 <2로 낮추면, 이산화규소 흡착제상의 음전하를 거의 완전히 제거하여, 리소자임은 더 이상 존재하지 않는다. 선택성 허용한계 변형제내의 극성 조절제(예, 아세토니트릴과 같은 유기 용매, 또는 트윈 20과 같은 세정제, 또는 우레아)는 이산화규소 흡착제와 리소자임의 상호작용을 감소시킨다. 이는 기타 상호작용 기작이 친수성 상호작용을 포함한다는 것을 제시하는 것이다.
B. 소수성 흡착제 어레이를 이용한 리소자임 인식 프로필
닭의 난백 리소자임을 이산화규소가 코팅된 스테인레스 스틸 기재상에 피복된 폴리프로필렌(C3소수성) 흡착제의 크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이의 각종 점적에 첨가한다. 실온에서 15분 동안 습식 챔버에서 항온처리한 후, 흡착제의 상이한 점적 각각을 다음과 같은 용출제(선택성 허용한계 변형제) 중 하나로 세척한다.
(1) 0.1 % TFA
(2) 0.1 % TFA 중 10 % 아세토니트릴,
(3) 0.1 % TFA 중 20 % 아세토니트릴,
(4) 0.1 % TFA 중 50 % 아세토니트릴,
(5) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl, pH7.0 중 0.05% 트윈 20, 및
(9) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl, pH7.0 중 3 M 우레아.
3회 흡착제 점적의 안과 밖에서 세척 용액 1 ㎕를 피펫팅하여 세척한다. 이 과정을 새로운 세척 용액의 분액으로 반복한다. 이어서, 흡착제 점적을 물 1 ㎕로 2회 세척한다. 시나핀산의 분액 0.3 ㎕(5 ㎎/㎖ 50% 아세토니트릴:0.5% TFA)를 첨가하고 공기 건조한다. 이 어레이는 질소 레이저(355 nm) 및 60 cm 비행관을 사용하여 질량 분석기로 분석한다. 데이터는 컴퓨터로 분석하고 데이터 중첩 제시를 위해 GRAMS/32c로 보낸다.
도 5b는 소수성 C3크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이상에서 리소자임 인식 프로필의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 하부 프로필은 0.1% TFA 단독으로 세척한 후에 소수성 C3흡착제상에 보유된 리소자임 시그널 강도를 나타낸다. 선택성 허용한계 변형제내 극성 조절제(예, 아세토니트릴)가 혼재되어 있으면 소수성 C3흡착제상에 리소자임의 보유량을 감소시킨다. 소수성 C3흡착제로부터 리소자임을 용출시키기 위한 아세토니트릴 농도 범위는 20∼50%이다. 세정제(트윈 20) 또는 우레아를 선택성 허용한계 변형제내에 포함해도 소수성 C3흡착제상의 리소자임 보유량을 상당히 감소시키지는 않는다.
C. 페닐 소수성 흡착제 어레이를 이용한 리소자임 인식 프로필
닭의 난백 리소자임을 이산화규소가 코팅된 스테인레스 스틸 기재상에 피복된 폴리스티렌(페닐 소수성) 흡착제의 흡착제 어레이의 각종 점적에 첨가한다. 실온에서 15분 동안 습식 챔버에서 항온처리한 후, 하나의 흡착제 점적을 다음과 같은 용출제(선택성 허용한계 변형제) 중 하나로 세척한다.
(1) 0.1 % TFA
(2) 0.1 % TFA 중 10 % 아세토니트릴,
(3) 0.1 % TFA 중 20 % 아세토니트릴,
(4) 0.1 % TFA 중 50 % 아세토니트릴,
(5) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl, pH7.0 중 0.05% 트윈20, 및
(6) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl, pH7.0 중 3 M 우레아.
3회 흡착제 점적의 안과 밖에서 세척 용액 1 ㎕를 피펫팅하여 세척한다. 이 과정을 새로운 세척 용액의 분액으로 반복한다. 이어서, 흡착제 점적을 물 1 ㎕로 2회 세척한다. 시나핀산의 분액 0.3 ㎕(5 ㎎/㎖ 50% 아세토니트릴:0.5% TFA)를 첨가하고 공기 건조한다. 이 어레이는 질소 레이저(355 nm) 및 60 cm 비행관을 사용하여 질량 분석기로 분석한다. 데이터는 컴퓨터로 분석하고 데이터 중첩 제시를 위해 GRAMS/32c로 보낸다.
도 5c는 소수성 페닐 크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이상에서 리소자임 인식 프로필의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 하부 프로필은 0.1% TFA 단독으로 세척한 후에 소수성 페닐 흡착제상에 보유된 리소자임 시그널 강도를 나타낸다. 선택성 허용한계 변형제내 극성 조절제(예, 아세토니트릴)가 혼재되어 있으면 리소자임의 보유량을 감소시킨다. 소수성 C3흡착제로부터 리소자임을 용출시키기 위한 아세토니트릴 농도 범위는 20∼50%이지만, C3및 페닐 표면에 보유된 리소자임 피크 강도를 20% 아세토니트릴 세척 조건하에서 비교한 경우, 페닐 흡착제와 리소자임의 상호작용의 강도가 작다. 세정제(트윈 20) 또는 우레아를 선택성 허용한계 변형제내에 포함하면 소수성 페닐 흡착제상의 리소자임 보유량을 상당히 감소시킨다.
D. 음이온 흡착제 어레이를 사용한 리소자임 인식 프로필
닭의 난백 리소자임을 산화규소가 코팅된 스테인레스 스틸 기재상에 피복된 음이온기(SO3 -) 흡착제(즉, 양이온 교환 흡착제)의 흡착제 어레이의 각종 점적에 첨가한다. 실온에서 15분 동안 습식 챔버에서 항온처리한 후, 흡착제의 상이한 점적 각각을 다음과 같은 용출제(선택성 허용한계 변형제) 중 하나로 세척한다.
(1) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0,
(2) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0 중 0.1 M NaCl,
(3) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0 중 0.2 M NaCl,
(4) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0 중 0.4 M NaCl,
(5) 25 mM 아세트산나트륨 완충액, 0.125 M NaCl, pH4.5,
(6) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl, pH7.0 중 0.05% 트윈20, 및
(7) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0 중 3 M 우레아.
3회 흡착제 점적의 안과 밖에서 세척 용액 1 ㎕를 피펫팅하여 세척한다. 이 과정을 새로운 세척 용액의 분액으로 반복한다. 이어서, 흡착제 점적을 물 1 ㎕로 2회 세척한다. 시나핀산의 분액 0.3 ㎕(5 ㎎/㎖ 50% 아세토니트릴:0.5% TFA)를 첨가하고 공기 건조한다. 이 어레이는 질소 레이저(355 nm) 및 60 cm 비행관을 사용하여 질량 분석기로 분석한다. 데이터는 컴퓨터로 분석하고 데이터 중첩 제시를 위해 GRAMS/32c로 보낸다.
도 5d는 양이온 교환 크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이상에서 리소자임 인식 프로필의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 하부 프로필은 pH7 완충액 단독으로 세척한 후에 음이온 흡착제상에 보유된 리소자임 시그널 강도를 나타낸다. 선택성 허용한계 변형제내 염화나트륨(0.1∼0.4 M)이 혼재되어 있으면 리소자임의 보유량을 감소시킨다. 이는 음이온 흡착제와 리소자임(염기성 단백질)의 상호작용이 이온 교환 기작을 포함한다는 것을 보여준다. 리소자임을 용출시키는데 0.4 M NaCl 농도가 필요하다. 선택성 허용한계 변형제의 pH를, 예컨대 아세트산나트륨 완충액에서 pH4.5로 낮추어도, 강 음이온성 흡착제상의 리소자임 보유량에 영향을 주지 않는다. 선택성 허용한계 변형제내의 극성 조절제(예, 트윈 20과 같은 세정제, 또는 우레아)는 음이온 흡착제와 리소자임의 상호작용을 감소시킨다. 이는 음이온 흡착제와 소수성 리소자임 단백질의 상호작용이 용출제의 극성에 의해 조절된다는 것을 보여준다.
E. 양이온 흡착제 어레이를 사용한 리소자임 인식 프로필
닭의 난백 리소자임을 산화규소가 코팅된 스테인레스 스틸 기재상에 피복된 양이온(4차 아민) 흡착제의 흡착제 어레이의 각종 점적에 첨가한다. 실온에서 15분 동안 습식 챔버에서 항온처리한 후, 흡착제의 상이한 점적 각각을 다음과 같은 용출제(선택성 허용한계 변형제) 중 하나로 세척한다.
(1) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0,
(2) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0 중 0.1 M NaCl,
(3) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0 중 0.2 M NaCl,
(4) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0 중 0.4 M NaCl,
(5) 25 mM 아세트산나트륨 완충액, 0.125 M NaCl, pH4.5,
(6) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl, pH7.0 중 0.05% 트윈 20, 및
(7) 20 mM 인산나트륨 완충액, pH7.0 중 3 M 우레아.
3회 흡착제 점적의 안과 밖에서 세척 용액 1 ㎕를 피펫팅하여 세척한다. 이 과정을 새로운 세척 용액의 분액으로 반복한다. 이어서, 흡착제 점적을 물 1 ㎕로 2회 세척한다. 시나핀산의 분액 0.3 ㎕(5 ㎎/㎖ 50% 아세토니트릴:0.5% TFA)를 첨가하고 공기 건조한다. 이 어레이는 질소 레이저(355 nm) 및 60 cm 비행관을 사용하여 질량 분석기로 분석한다. 데이터는 컴퓨터로 분석하고 데이터 중첩 제시를 위해 GRAMS/32c로 보냈다.
도 5E는 양이온(음이온 교환) 흡착제 크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이상에서 리소자임 인식 프로필의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 양이온 흡착제상의 염기성 리소자임 단백질 보유량은 매우 작다. 리소자임 보유량에 대해 선택성 허용한계 변형제의 조절 효과는 최소이다.
F. 고정된 금속 이온 흡착제 어레이를 사용한 리소자임 인식 프로필
닭의 난백 리소자임을 산화규소가 코팅된 스테인레스 스틸 기재상에 피복된 고정된 금속(이미노디아세테이트-Cu) 흡착제의 흡착제 어레이의 각종 점적에 첨가한다. 실온에서 15분 동안 습식 챔버에서 항온처리한 후, 흡착제의 상이한 점적 각각을 다음과 같은 용출제(선택성 허용한계 변형제) 중 하나로 세척한다.
(1) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.5M NaCl, pH7.0,
(2) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.5 M NaCl, pH7.0 중 5 mM 이미다졸,
(3) 0.1 M 아세트산나트륨 완충액,0.5 M NaCl, pH4.5,
(4) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl, pH7.0 중 0.05% 트윈20 또는
(7) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.5 M NaCl, pH7.0 중 3 M 우레아.
3회 흡착제 점적의 안과 밖에서 세척 용액 1 ㎕를 피펫팅하여 세척한다. 이 과정을 새로운 세척 용액의 분액으로 반복한다. 이어서, 흡착제 점적을 물 1 ㎕로 2회 세척한다. 시나핀산의 분액 0.3 ㎕(5 ㎎/㎖ 50% 아세토니트릴:0.5% TFA)를 첨가하고 공기 건조한다. 이 어레이는 질소 레이저(355 nm) 및 60 cm 비행관을 사용하여 질량 분석기로 분석한다. 데이터는 컴퓨터로 분석하고 데이터 중첩 제시를 위해 GRAMS/32c로 보낸다.
도 5F는 고정된 금속 크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이상에서 리소자임 인식 프로필의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 하부 프로필은 pH7 완충액 단독으로 세척한 후에 고정된 구리 이온 흡착제상에 보유된 리소자임 시그널 강도를 나타낸다. 선택성 허용한계 변형제내 히스티딘 결합 경쟁적 친화성 리간드(예, 이미다졸)가 혼재되어 있으면 리소자임을 보유하지 않는다. 이는 고정된 구리 이온 흡착제와 리소자임(서열내 단일 히스티딘 잔기가 있음)의 상호작용이 배위 공유 결합 기작을 포함한다는 것을 보여준다. 선택성 허용한계 변형제의 pH를 아세트산나트륨 완충액에서 pH4.5로 낮추면, 고정된 구리 흡착제상의 리소자임 보유량이 감소된다. 이는 리소자임상의 히스티딘 잔기가 양성자화하여 배위 공유 상호작용을 억제한 결과로 보인다. 세정제(예, 트윈 20)를 함유하고 있어도 상호작용에는 영향을 주지 않는다. 우레아가 혼재되어 있으면 고정된 구리 흡착제상에 리소자임을 보유하지 않는다.
III. 인간 혈청내 피분석물의 분할
본 발명자들은 각종 흡착제 및 용출제를 사용하여 인간 혈청내 피분석물을 분할하였다. 이들 결과는 피분석물이 상이한 흡착제에 의해 차등 보유하고, 보유 크로마토그래피가 저분자량 및 고분자량에서 정보를 제공할 수 있다는 것을 보여준다.
A. 고정된 금속 이온 흡착제 어레이를 사용한 인간 혈청 단백질 인식 프로필
인간의 혈청을 산화규소가 코팅된 스테인레스 스틸 기재상에 피복된 고정된 금속 이온(트리스(카르복시메틸)에틸렌아민-Cu) 흡착제의 흡착제 어레이의 각종 점적에 첨가한다. 실온에서 15분 동안 습식 챔버에서 항온처리한 후, 흡착제의 상이한 점적 각각을 다음과 같은 용출제(선택성 허용한계 변형제) 중 하나로 세척한다.
(1) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.5 NaCl, pH7.0,
(2) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.5 M NaCl, pH7.0 중 5 mM 이미다졸,
(3) 0.1 M 아세트산나트륨 완충액, 0.5 M NaCl, pH4.5,
(4) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl, pH7.0 중 0.05% 트윈20 또는
(5) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.5 M NaCl, pH7.0 중 3 M 우레아.
3회 흡착제 점적의 안과 밖에서 세척 용액 1 ㎕를 피펫팅하여 세척한다. 이 과정을 새로운 세척 용액의 분액으로 반복한다. 이어서, 흡착제 점적을 물 1 ㎕로 2회 세척한다. 시나핀산의 분액 0.3 ㎕(5 ㎎/㎖ 50% 아세토니트릴:0.5% TFA)를 첨가하고 공기 건조한다. 이 어레이는 질소 레이저(355 nm) 및 60 cm 비행관을 사용하여 질량 분석기로 분석한다. 데이터는 컴퓨터로 분석하고 데이터 중첩 제시를 위해 GRAMS/32c로 보낸다.
도 6a 및 6B는 고정된 금속 크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이상의 혈청 단백질 인식 프로필의 저분자량 및 고분자량에서의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 하부 프로필은 pH7 완충액 단독으로 세척한 후에 혈청 단백질이 고정된 구리 이온 흡착제상에 보유된다는 것을 나타낸다. 선택성 허용한계 변형제내 히스티딘 결합 경쟁적 친화성 리간드(예, 이미다졸), 또는 세정제(예, 트윈 20), 또는 우레아가 혼재되어 있거나, 또는 선택성 허용한계 변형제의 pH를 4.5로 낮추면, 동일한 흡착제상에 복합 단백질 혼합물의 상이한 성분의 보유량을 차등적으로 증가 또는 감소시킨다.
B. 다수의 상이한 흡착제를 사용한 인간 혈청 단백질 인식 프로필
인간 혈청을 다음과 같은 상이한 흡착제의 흡착제 어레이의 각종 점적에 첨가한다.
(1) C3소수성 흡착제,
(2) 페닐 소수성 흡착제,
(3) 음이온 교환 흡착제,
(4) 양이온 교환 흡착제, 및
(5) 고정된 금속(트리스(카르복시메틸)에틸렌디아민-Cu) 흡착제.
각 흡착제를 이산화규소 코팅된 스테인레스 스틸 기재상에 피복한다. 실온에서 15분 동안 습식 챔버에서 항온처리한 후, 흡착제의 점적 각각은 선택성 허용한계 변형제로서 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15M NaCl, pH7.0 중 0.05% 트윈20을 사용하여 세척한다.
3회 흡착제 점적의 안과 밖에서 세척 용액 1 ㎕를 피펫팅하여 세척한다. 이 과정은 새로운 세척 용액의 분액으로 반복한다. 이어서, 흡착제 점적을 물 1 ㎕로 2회 세척한다. 시나핀산의 분액 0.3 ㎕(5 ㎎/㎖ 50% 아세토니트릴:0.5% TFA)를 첨가하고 공기 건조한다. 이 어레이는 질소 레이저(355 nm) 및 60 cm 비행관을 사용하여 질량 분석기로 분석한다. 데이터는 컴퓨터로 분석하고 데이터 중첩 제시를 위해 GRAMS/32c로 보낸다.
도 7a 및 7B는 각종 흡착제의 크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이상에서 혈청 단백질 인식 프로필의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 다수의 상이한 흡착제(결합 특성이 다른 흡착제)상에서 단일 선택성 허용한계 변형제를 사용하면 상이한 흡착제상의 복합 단백질 혼합물의 다른 성분의 보유량을 차등적으로 증가 또는 감소시킨다.
IV. 조기분만아 뇨에서의 피분석물 분할
본 발명자들은 각종 흡착제 및 용출제를 사용하여 조기분만아 뇨내 피분석물을 분할하였다. 이들 결과는 흡착제가 피분석물을 차등적으로 보유하기 때문에, 각종 흡착제를 사용하면 우수한 분할능을 제공한다는 것을 보여준다. 또한, 이들 결과는 우선적으로 특정 피분석물을 보유하는 흡착제를 확인할 수 있는 능력을 나타내며, 이는 정제법 개발에 유용하다.
A. 각종 흡착제 및 동일한 용출제(물)를 사용한 조기분만아 뇨에서의 피분석물의 분할
조기분만아 요(2 ㎕)를 다음과 같은 상이한 흡착제로 피복한 탄화 PEEK 중합체 기재의 각종 점적에 첨가한다.
(1) C8소수성 흡착제(옥틸 세파로스, 시그마에서 입수가능),
(2) 페닐 소수성 흡착제(페닐 세파로스, 시그마에서 입수가능),
(3) 음이온 교환 흡착제(Q 세파로스, 시그마에서 입수가능),
(4) 양이온 교환 흡착제(S 세파로스, 시그마에서 입수가능),
(5) 고정된 금속 흡착제(IDA-Cu, 킬레이팅 세파로스, 파마시아에서 입수가능), 및
(6) 고정된 금속 흡착제(트리스(카르복시메틸)에틸렌디아민-Cu 세파로스).
실온에서 15분 동안 습식 챔버에서 항온처리한 후, 흡착제의 점적 각각은 선택성 허용한계 변형체로서 물을 사용하여 세척한다. 3회 흡착제 점적의 안과 밖에서 세척 용액 1 ㎕를 피펫팅하여 세척한다. 이 과정을 새로운 세척 용액의 분액으로 반복한다. 이어서, 흡착제 점적을 물 1 ㎕로 2회 세척한다. 시나핀산의 분액 0.3 ㎕(5 ㎎/㎖ 50% 아세토니트릴:0.5% TFA)를 첨가하고 공기 건조한다. 이 어레이는 질소 레이저(355 nm) 및 150 cm 비행관을 사용한 휴렛 팩커드의 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석한다. 데이터는 HP MALD1 TOF 소프트웨어로 분석하고 데이터 중첩 제시를 위해 GRAMS/32c로 보낸다.
도 8a 및 8B는 크로마토그래피 시리즈의 각종 흡착제상에서 조기분만아 요 단백질의 저분자 질량 및 고분자 질량에서의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 각종 흡착제(결합 특성이 다른 흡착제)상에서 단일 선택성 허용한계 변형제(즉, 물)를 사용하면 상이한 흡착제상의 복합 단백질 혼합물의 다른 성분의 보유량을 차등적으로 증가 또는 감소시킨다.
B. 3개의 상이한 용출제 및 기재에 간접적으로 커플링된 소수성 페닐 흡착제를 사용한 조기분만아 요에서 피분석물의 분할
조기분만아 요(2 ㎕)를 페닐 소수성 흡착제로 코팅된 탄화 PEEK 중합체 기재의 각종 점적에 첨가한다(페닐 세파로스, 시그마로부터 입수가능). 15분 동안 습식 챔버에서 항온처리한 후에, 흡착제의 각 점적을 다음과 같은 용출제(선택성 허용한계 변형제) 중 하나를 사용하여 세척한다.
(1) 물,
(2) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 NaCl, pH7.0 중 2 M 우레아, 및
(3) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M, NaCl, pH7.0 중 0.1% 트윈 20.
3회 흡착제 점적의 안과 밖에서 세척 용액 1 ㎕를 피펫팅하여 세척한다. 이 과정을 새로운 세척 용액의 분액으로 반복한다. 이어서, 흡착제 점적을 물 1 ㎕로 2회 세척한다. 시나핀산의 분액 0.3 ㎕(5 ㎎/㎖ 50% 아세토니트릴:0.5% TFA)를 첨가하고 공기 건조한다. 이 어레이는 질소 레이저(355 nm) 및 150 cm 비행관을 사용한 휴렛 팩커드(모델 2030)의 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석한다. 데이터는 HP MALD1 TOF로 분석하고 데이터 중첩 제시를 위해 GRAMS/32c로 보낸다.
도 9는 크로마토그래피 시리즈의 소수성 페닐 흡착제상에서 조기분만아 요 단백질 인식 프로필의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 단일 흡착제상에 상이한 용출 특성이 있는 각종 용출제를 사용하면 복합 단백질 혼합물의 상이한 성분의 보유량을 차등적으로 증가 또는 감소시킨다. 성분들 중 하나(*로 표시)는 PBS 중 0.1% 트윈 20을 용출제로서 사용한 경우 소수성 페닐 흡착제상에 선택적으로 보유된다.
V. 2종의 다른 세포주로부터 얻은 배양 배지내에서 단백질 확인
본 실시예는 흡착제 어레이, 즉 크로마토그래피 시리즈를 이용하여 세포내에서 차등적으로 발현되는 단백질의 확인법을 예시한 것이다.
2개의 상이한 유방암 세포주는 같은 시간 동안 일정한 조성의 배양 배지에서 배양한다. 여과 유닛으로 농축한 후에, 기재로서 산화규소가 코팅된 스테인레스 스틸상에 피복된 고정된 금속(트리스(카르복시메틸)에틸렌디아민-Cu) 흡착제의 흡착제 어레이(미국 캘리포니아 팔로알토에 소재하는 사이퍼젠 바이오시스템즈 인코포레이티드)의 각종 점적에 각 배양 배지 분액 1 ㎕를 첨가한다. 실온에서 15분 동안 습식 챔버에서 항온처리한 후에, 다음과 같은 용출제(선택성 허용한계 변형제) 중 하나를 사용하여 흡착제의 점적을 세척한다.
(1) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.5 NaCl, pH7.0,
(2) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.5 M NaCl, pH7.0 중 20 mM 이미다졸,
(3) 0.1 M 아세트산나트륨 완충액, 0.5 M NaCl, pH4.5,
(4) 20 mM 인산나트륨 완충액, 0.15 M NaCl, pH7.0 중 0.1% 트윈20,
(5) 10 mM 인산나트륨 완충액, 0.5 M NaCl, pH7.0 중 3 M 우레아, 또는
(6) 1% TFA.
3회 흡착제 점적의 안과 밖에서 세척 용액 1 ㎕를 피펫팅하여 세척한다. 이 과정을 새로운 세척 용액의 분액으로 반복한다. 이어서, 흡착제 점적을 물 1 ㎕로 2회 세척한다. 시나핀산의 분액 0.3 ㎕(5 ㎎/㎖ 50% 아세토니트릴:0.5% TFA)를 첨가하고 공기 건조한다. 이 어레이는 질소 레이저(355 nm) 및 60 cm 비행관을 사용한 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석한다. 데이터는 컴퓨터로 분석하고 데이터 중첩 제시를 위해 GRAMS/32c(갈락틱 인더스트리즈 코포레이션)로 보낸다.
도 10a는 고정된 금속(Cu) 크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이상에 세포주 1의 세포 분비된 단백질 인식 프로필의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 단일 흡착제상에서 선택성 허용한계가 상이한 각종 용출제를 사용하여 세포 배양 배지와 같은 복합 단백질 혼합물의 상이한 성분의 보유량을 차등적으로 증가 또는 감소시킨다.
도 10b는 고정된 금속(Cu) 크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이상에 양 세포주의 세포 분비된 단백질 인식 프로필의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 10 mM 인산나트륨 완충액, 0.5 M NaCl, pH7.0 중 0.1% 트윈20 + 3 M 우레아을 사용하여 보유되지 않은 물질을 세척해낸다. 7532 Da에 나타난 피크는 세포주 1에서 분비된 단백질(세포주 2에서는 발현되지 않음)에서의 주요 보유 피크이다.
도 10c는 고정된 금속 (Ni) 크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이상에 세포주 1의 세포 분비된 단백질 인식 프로필의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 동일한 용출제, 즉 10 mM 인산나트륨 완충액, 0.5 M NaCl, pH7.0 중 0.1% 트윈20 + 3 M 우레아을 사용하나 상이한 표면 상호작용 전위(즉, 고정된 Ni 금속 대 고정된 Cu 금속)를 가지는 흡착제를 이용하여, 7532 Da 피크는 세포주 1이 분비하는 모든 단백질 중에서 유일한 보유 단백질이다. 삽입체는 확장된 규모에서 동일한 질량 스펙트럼을 나타낸다. 3766 Da에서의 작은 피크는 이중으로 하전된 동일한 단백질의 종이다.
도 10d는 동일계 트립신 분해 전(아래 프로필) 및 후(위 프로필) 고정된 금속 (Ni) 크로마토그래피 시리즈 흡착제 어레이상에 세포주 1의 세포 분비된 단백질 인식 프로필의 복합 질량 스펙트럼을 나타낸다. 순수한 단백질에 대해 만든 펩티드 지도는 그 단백질의 핑거프린트이며 동정에 사용할 수 있다.
VI. 2D 겔 전기영동과 보유물 크로마토그래피의 비교
보유물 크로마토그래피의 제1 장점은 다차원으로 피분석물을 급속하게 분할할 수 있는 능력이 있어, 각종 물리 화학적 특성에 관한 고 정보 내용을 산출한다. 대조적으로, 2D 겔 전기 영동는 단지 2차원으로 분할할 수 있다.
도 11은 크로마토그래피 시리즈의 페닐 소수성 흡착제상에서 조기분만아 요 단백질을 나타낸다. 각종 용출제 및 흡착제를 사용하면 다차원 정보를 산출한다. 상이한 선택성 조건을 사용하면 복합 단백질 혼합물(예컨대 조기분만아 요)의 각종 성분의 보유량을 증가 또는 감소시켜, 피분석물을 세밀하게 분할할 수 있다.
대조적으로, 도 12는 pI 및 분자 질량에 따라 조기분만아 요중 단백질의 2차원 분리를 나타낸다. 보유물 크로마토그래피내 흡착제를 사용한 경우는 6차원에 관한 정보를 제공하는 것과는 대조적으로, 겔은 2차원에 관한 정보만 제공한다. 점적은 질량 분석기로 잘 분할되지 않으며, 매우 큰 분자 질량 및 매우 적은 분자 질량에서의 분할은 제한된다.
VII. 시료로부터 피분석물의 연속 추출
피분석물은 선택도 조건에 시료를 연속적으로 노출한 다음 보유되지 않은 시료를 수거하여 연속 추출하였다.
헤모필러스(Hemophilus) 넉아웃 돌연변이 용해물은 10% 글리세롤 50 mM EDTA내에서 제조하였다.원심분리후에, 상청액을 25 mM HEPES, pH 7.4중 0.01% 트리톤 X100내에서 1:3으로 희석하였다. 희석 시료 분액 2 ㎕를 흡착제 어레이 음이온 부위의 점적에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 항온처리한 후, 음이온 부위에 남아있는 시료를 흡착제 어레이 정상상 부위의 점적으로 전달하였다. 음이온 부위의 점적을 0.01% 트리톤 X100 25 mM HEPES 2 ㎕로 2회 세척하였다. 10회 점적 안과 밖에서 세척 용액을 피펫팅하여 세척하였다. 정상상 점적상에 초기에 첨가된 시료와 세척물이 혼합되었다.
실온에서 30분 동안 항온처리한 후에, 정상상 부위에 잔여 시료를 흡착제 어레이 Ni(II) 부위의 점적으로 전달하였다. 정상상 부위의 점적을 인산염 완충 염수 2 ㎕로 2회 세척하였다. 10회 점적 안과 밖에서 세척 용액을 피펫팅하여 세척한다. Ni(II) 점적상에 초기에 첨가된 시료와 세척물을 혼합하였다.
Ni(II) 점적이 거의 건조되도록 시료를 농축한 후에, 인산염 완충 염수중 100 mM 이미다졸 2 ㎕로 2회 세척하여 미결합된 피분석물을 회수하였다. 10회 점적 안과 밖에서 세척 용액을 피펫팅하였다. 세척물을 흡착제 어레이 지방족 소수성 부위의 점적으로 전달하였다.
소수성 부위가 거의 건조되도록 시료를 농축시키고, 비결합된 피분석물을 0.1% 트리플루오로아세트산내 5% 아세토니트릴 2 ㎕로 2회 세척하여 제거하였다. 10회 점적 안과 밖에서 세척용액을 피펫팅하여 세척한다.
음이온, 정상상, Ni(II) 및 소수성 부위의 각 점적을 물 2 ㎕로 세척하여 잔여 완충액을 제거하였다. 50% 아세토니트릴, 0.5% 트리플루오로아세트산내 시나핀산 용액의 분액 0.3 ㎕을 각 점적에 첨가하였다. 각 부위에 보유된 피분석물을 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석하였다.
도 19A 내지 도 19D는 흡착제 어레이상에서 헤모필러스 용해물의 보유 지도를 나타낸다. 3000∼25000 Da 질량 범위내의 여러개의 피크를 흡착제상에서 관찰하였다. 각각의 흡착제는 시료내 피분석물 각각에 대해 다른 보유량을 나타내는 것에 주의해야 한다.
VIII. 피분석물의 점진적 분할
피분석물을 분할하는 선택성 조건하에 새로운 결합 특성 또는 용출 특성을 가하여, 피분석물의 분할을 개선시키는 선택성 조건을 형성할 수 있다. 본 실시예예에서, 시료는 Cu(II) 흡착제에 결합시키고 제1 용출제 및 2종의 제2 용출제에 노출시켰다. 제2 용출제는 다른 용출 조건을 가하여 제1 용출제와 다르게 하였다. 각각은 피분석물의 분할을 개선시키는 조건을 가하였다.
10% 글리세롤내에 제조된 헤모필러스 야생형 정지기 용해물을 20 mM 인산나트륨, 0.5 M 염화나트륨, pH7.0내에서 1:1로 희석하였다. 원심분리후에, 상청액 150 ㎕ 분액을 바이오프로세서내 흡착제 어레이 Cu(II) 부위의 각 점적과 함께 항온처리하였다. 30분 동안 저온에서 혼합한 후에, 시료를 제거하였다. 각 점적을 다른 용해물과 함께 세척하였다. 제1 점적을 150 ㎕의 20 mM 인산나트륨, 0.5 M 염화나트륨, pH 7.0으로 세척하였다. 제2 점적은 20 mM 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH 7.0외에 0.05% 트리톤 X100 150 ㎕를 사용하여 세척하였다. 제3 점적은 20 mM 인산나트륨, 0.15 M NaCl, pH 7.0과 100 mM 이미다졸 150 ㎕를 사용하여 세척하였다. 각각은 혼합하면서 5분 동안 점적과 함께 세척 용액을 항온처리하여 세척하였다. 세척을 2회 반복하였다. 각 점적은 물로 세척하여 세정제 및 완충액을 제거하였다.
흡착제 어레이를 바이오프로세서로부터 제거하였다. 50% 아세토니트릴 0.5% 트리플루오로산내 시나핀산 용액의 분액 0.3 ㎕를 각 점적에 첨가하였다. 각 점적상에 보유된 피분석물을 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석하였다.
도 20 (A) 내지 (C)는 전술한 3가지 용출 조건하에 세척한 후 흡착 어레이 Cu(II) 부위에 헤모필러스 용해물의 보유 지도를 나타낸다. 2000∼18000 Da 질량 범위의 여러개의 피크가 관찰되었다. "*"로 표시된 단백질은 도 20(A)의 보유 지도내에서 소량 성분이었다. 동일한 완충액에 세정제인 트리톤 X100을 첨가하여 선택성 조건을 변형시킨 경우[도 20(B)], 동일한 단백질 "*"는 다른 피분석물보다 많이 보유되어 있었으며, 더 잘 분할되었다. 친화도 치환자인 이미다졸의 첨가로 선택성 조건을 변형시킨 경우[도 20(C)], 단백질 "*"은 잔류 지도내에의 기타 피분석물로부터 고도로 분할되었다.
피분석물에 대한 분할을 개선시키는 선택성 조건의 점진적 확인 단계를 채택하여 총 헤모필러스 용해물로부터 단백질의 예비용 정제를 위한 방법을 형성할 수 있다.
IX. 피분석물의 차등 발현: 마커 단백질 발견
A. 인간 혈청
정상 인간 혈청 또는 질병이 있는 인간 혈청 0.5 ㎕의 분액을 20 mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl, pH7.0의 동부피로 희석하였다. 각각을 흡착제 어레이 Cu(II) 부위상에서 상이한 점적에 가하였다. 4℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, 각 점적을 2㎕의 20 mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl, pH7.0으로 2회 세척하였다. 점적의 안과 밖에서 10회 세척 용액을 피펫팅하여 세척하였다. 마지막으로 각 점적을 2 ㎕의 물로 세척하여 잔여 완충액을 제거하였다. 50% 아세토니트릴 0.5% 트리플루오로아세트산 중 시나핀산 용액의 분액 0.3㎕를 각 점적에 첨가하였다. 각 점적에서 보유된 피분석물을 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석하였다.
도 21(D)에서 "*"로 표시된 단백질은 정상 혈청보다 발병 혈청에서 상당히 많이 존재한다. 이 결과는 임상 진단에 사용될 수 있는 질병 마커의 발견 방법을 예시하는 것이다.
B. 마우스 요
정상의 마우스 요, 질병이 있는 마우스 요 또는 약물 치료한 마우스 요의 분액 1 ㎕를 흡착제 어레이 Cu(II) 부위의 다른 점적에 가하였다. 실온에서 10분 동안 항온처리한 후에, 각 점적을 20 mM 인산나트륨, 0.15M NaCl, pH7.0 중 100 mM 이미다졸 2 ㎕로 2회 세척하였다. 점적의 안과 밖에서 10회 세척 용액을 피펫팅하여 세척하였다. 마지막으로 각 점적을 2 ㎕의 물로 세척하여 잔여 완충액을 제거하였다. 50% 아세토니트릴 0.5% 트리플루오로아세트산 중 시나핀산 용액의 분액 0.3㎕를 각 점적에 첨가하였다. 각 점적에서 보유된 피분석물을 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석하였다.
정상(대조군) 마우스 요, 질병이 있는 마우스 요 및 약물 치료를 받은 마우스 요의 보유물 지도는 도 22에 나타나있다. 하나의 피분석물은 발병 마우스 요(중간 패널)내 다량으로 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 동일한 피분석물이 정상 마우스 요(상부 패널)에서 발견되지 않았고, 약물 치료된 마우스 요에서는 휠씬 감소된 양으로 발견되었다. 이 피분석물은 가능한 질병 마커로서 사용할 수 있다. 정량적 진단 분석의 실행성을 예시하기 위해서, 보유된 마커 단백질의 피크하의 면적을 계산하고 표에 제시하였다. 발병 마우스 요와 약물 처리된 마우스 요 사이에 분명한 정량적 차이가 관찰된다. 실험적 편차를 보정하기 위해서, 내부 표준 피분석물을 사용하였다. 각 요 시료에 대해 정규화된 질병 마커 피크 면적(즉, 내부 표준 물질의 피크 면적으로 나눈 마커의 피크 면적)은 하부 패널에 제시되어 있다. 피크 면적은 약물 치료 후에 발병 요 마커 면적보다 10배 이상 감소한다.
C. 인간의 요
정상 인간 및 암 환자로부터 취한 요를 인산염 완충 염수 중 0.01% 트리톤 X100내에서 1:2로 희석되었다. 정상 인간 또는 질병이 있는 인간의 요 분액 1.5 ㎕를 이소프로판올/아세토니트릴(1:2) 0.1% 트리플루오로아세트산의 0.5 ㎕로 미리 수화시킨 흡착제 어레이 지방족 소수성 부위의 상이한 점적에 가하였다. 30분 동안 4℃에서 항온처리한 후에, 각 점적을 10 mM 트리스HCl, 0.05 M NaCl, pH7.5 중 50% 에틸렌글리콜 2 ㎕로 세척하였다. 점적의 안과 밖에서 10회 세척 용액을 피펫팅하여 세척하였다. 각 점적을 마지막으로 물 2 ㎕로 세척하여 잔여 에틸렌 글리콜 및 완충액을 제거하였다. 50% 아세토니트릴 0.5% 트리플루오로아세트산 중 시나핀산 용액 0.3 ㎕ 분액을 각 점적에 첨가하였다. 각 점적에 보유된 피분석물을 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석하였다.
4명의 암환자 및 정상 인간의 요의 보유물 지도는 도 23(A)에 제시되어 있다. 트리스/NaCl 완충액내 50% 에틸렌 글리콜로 세척한 후에 흡착제 어레이 소수성 부위상에 여러개의 단백질 피크가 보유되어 있었다. 가능한 질병 마커를 확인하기 위해서, 개개 환자 요와 정상 요간의 판별 지도를 플롯한다. 기준선 위의 차이 플롯에서의 각 막대기는 환자 요에서 다량 존재하는 피분석물을 나타낸다(도 23B∼23D). 환자의 판별 지도에서의 패턴 변형은 개체군에서의 개별적인 변화를 반영한 것이다. 그러나, 약 7500 Da(*로 표시)의 클러스터 피분석물 및 약 5000 Da의 피분석물은 모든 환자에게 일관하여 다량 존재하는 것으로 나타나며, 따라서 가능한 질병 마커로서 확인될 수 있다.
X. 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 파지 포획
단백질 칩 표면에 흡착된 바이러스는 탈착 분석기로 검출할 수 있다. 바이러스의 외피 단백질에 대한 항체(흡착제로 사용됨)는 바이러스를 포획할 수 있다. 흡착제로서 사용된 표적 단백질은 표적에 대해 1본쇄 항체를 나타내는 파지를 포획할 수 있다.
A. 흡착제 기재에 의한 파지 디스플레이 항체의 검출 감수성
성장 배지내 M13 파지(1012입자/㎖)를 25 mM HEPES, pH7,4내 0.01% 트리톤 X100으로 계단 희석하였다. 희석된 파지 현탁액 각각의 분액 0.25 ㎕를 흡착제 어레이 지방족 소수성 부위의 점적에 첨가하였다. 50% 아세토니트릴, 0.5% 트리플루오로아세트산 중 CHCA 분액 0.3 ㎕를 첨가하였다. 시료를 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석하였다.
M13 파지 유전자 VIII 단백질을 어레이상에서 고감도로 검출하였다. 도 24A 내지 도 24E. 파지 현탁액을 10,000,000배로 희석되었을 때 검출가능한 시그널(시그널/노이즈>2)을 얻었다.
B. 흡착제 어레이에 의한 M13 파지 확인
토끼 항M13 항체(스트라타젠)를 단백질 A 하이퍼 D(바이오세프라)상에 고정하고, 인산염 완충 염수, pH7로 광범위하게 세척하였다. 성장 배지내 M13 파지(1012입자/㎖) 현탁액의 분액 1∼10 ㎕을 고정된 항M13 항체의 분액 1 ㎕와 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 인산염 완충 염수, pH7 중 0.05% 트윈 20으로 세척한 다음 물로 세척하여 세정제 및 완충액을 제거하고, 포획된 파지의 분액을 시나핀산의 존재하에 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석하였다.
항M13 항체 대조군은 항체 시그널(단독 하전 또는 이중 하전)만을 나타낸다. 도 25A. M13 파지가 항체에 의해 포획된 경우, 파지로부터 가장 쉽게 확인할 수 있는 단백질 피크는 1본쇄 항체가 있는 유전자 VIII 단백질 및 유전자 III 단백질 융합체이다. 도 25(B). M13 파지 유전자 VIII 단백질은 이 방법에 의해 높은 효율로 검출되기 때문에, 파지 포획의 감도 모니터로서 사용할 수 있다.
C. 1본쇄 항체를 디스플레이하는 M13 파지의 특이적 포획
HIV-1 Tat 단백질(맥커슨 바이오서비시즈)을 미리활성화시킨 기재에 커플링시켰다. 에탄올아민으로 차단한 후에, 어레이를 인산염 완충 염수, pH7 중 0.005% 트윈 20으로 세척한 다음, 인산염 완충 염수, pH7 중 0.1% BSA로 세척하였다. Tat 단백질에 대해 1본쇄 항체를 디스플레이하는 M13 파지의 계단 희석물을 Tat 단백질 흡착제 어레이와 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다. Tat 단백질에 대한 1본쇄 항체를 디스플레이하지 않는 M13 파지의 계단 희석물의 음성 대조군은 동일한 방식으로 Tat 단백질 흡착제 어레이와 함께 항온처리하였다. 인산염 완충 염수내 0.05% 트윈 20으로 어레이를 세척하고, 인산염 완충 염수, pH7.0 중 1 M 우레아로 세척한 다음, 마지막으로 물로 세척하여 완충액 및 우레아를 제거하였다. 50% 아세토니트릴 0.5% 트리플루오로아세트산 중 CHCA 분액 0.3 ㎕를 첨가하였다. 보유된 파지를 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석하였다.
Tat 단백질에 대한 1본쇄 항체를 나타내는 M13 파지의 특이적 결합이 농도 의존 방식(고딕선)으로 관찰되었다. 도 26(A) 내지 (D). 비특이적 M13 파지에 의한 비특이적 결합은 흡착제 어레이상에서 최소였다(점선). 이들 결과는 표적 피분석물을 특이적으로 인식하는 1본쇄 항체를 암호하는 유전자 함유 파지를 검출하는 고감도 방법을 예시한다.
XI. 화합물이 수용체와 리간드간의 결합을 억제하는지 여부를 측정하는 검색법.
본 발명의 방법은 테스트 제제가 수용체에 대한 리간드의 결합을 조절하는지 여부를 측정하는데 사용할 수 있다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 보유물 크로마토그래피가 유리 TGF-β수용체에 의해서 흡착제로서 사용되는 결합 TGF-β 수용체와 TGF-β간의 결합 억제를 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
TGF-β재조합 수용체-Fc 융합 단백질(R&D, 미네소타)를 단백질 G 흡착제 어레이상에 특이적으로 결합시켰다. TGF-β(R&D, 미네소타)를 세포 조정 배지내로 계단 희석하고(2 ×농축) 4℃에서 밤새 수용체-Fc 단백질 G 흡착제 어레이와 함께 항온처리하였다. 세포 조정 배지에서 계단 희석된 TGF-β의 또 다른 세트를 조절제의 존재하에 수용체-Fc 단백질 G 흡착제와 함께 항온처리하였다. 이 실시예에서, 조절제는 유리 TGF-β수용체였다. 동일한 조건하에 항온처리한 후, 칩을 PBS내 0.05% 트리톤 X100으로 세척한 다음 PBS 중 3M 우레아로 세척하였다. 시나핀산 0.3 ㎕의 분액을 각 점적에 첨가하고 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석하였다.
도 27(A)는 수용체-Fc 단백질 G 흡착제 어레이(고딕선)에 1㎕/㎖ TGF-β의 특이적 결합을 나타낸다. 세포 조정 배지내에 단백질은 거의 또는 전혀 결합 상태로 발견되지 않았다. 도 27(B)는 수용체 Fc 단백질 G 흡착제 어레이(고딕선)에 대한 TGF-β 100 ng/㎖의 특이적 결합을 나타낸다. TGF-β 및 수용체-Fc 단백질 G 흡착제 어레이의 항온처리가 조절제(유리 TGF-β)의 존재하에 수행되는 경우, 결합은 TGF-β100 ng/㎖(도 27(A), 점선)일 때 완전히 제거되고 TGF-β1 ㎕/㎖(도 27(B), 점선)일 때 결합 자취만이 남았다. 이 예에서, 조절제(동일한 수용체)는 리간드에 대한 특이적 결합 친화도가 높아서, 표적 피분석물 결합을 매우 효과적으로 경쟁시킨다. 기타의 경우, 조절제의 유무하에 흡착제에 결합된 표적 피분석물의 비율은 조절제 효과의 지표이다.
XII. 보유물 크로마토그래피의 분할력
본 실시예는 상이한 선택성 조건하에 시료를 유사하게 처리하여 시료내 단백질을 분할하는 보유물 크로마토그래피의 능력을 입증하는 것이다.
헤모필러스 인플루엔자 용해물은 10% 글리세롤내에서 제조하였다. 원심분리후에, 상청액을 25 mM HEPES(pH7.4) 중 0.01% 트리톤 X100에서 1:3으로 희석하였다. 희석된 시료 2 ㎕ 분액을 흡착제 어레이 양이온 부위의 점적에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 항온처리한 후, 점적을 25 mM HEPES, pH7.4로 세척하였다. 희석 시료의 제2 분액 2 ㎕를 흡착제 어레이 지방족 소수성 부위의 점적에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 항온처리한 후에, 점적을 물로 세척하였다. 희석 시료의 제3 분액 2 ㎕를 흡착제 어레이 Cu(II) 부위의 점적에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 항온처리한 후에, 점적을 인산염 완충 염수, pH 7.4 중 0.05% 트리톤 X100으로 세척하였다. 50% 아세토니트릴 0.5% 트리플루오로아세트산 중 시나핀산 용액의 분액 0.3 ㎕를 각 점적에 첨가하였다. 각 부위상에 보유된 피분석물을 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석하였다.
결과는 도 28 내지 도 31에 제시되어 있다. 총 보유된 피분석물 계수는 약 550이었다. 본 실시예의 결과는 동시에 여러 피분석물을 분리 및 검출하는 것을 포함하여 조합 분리에 대한 방법을 예시한다.
XIII. 다량체 구조의 순차적 어셈블리
본 실시예는 제1 흡착제상에 제2 흡착제를 형성하는 방법을 예시하고 있다. 이어서 2차 흡착제는 표적 피분석물에 대한 특이적 흡착제로서 작용한다.
20 mM 트리스, 100 mM 염화나트륨, 0.4% NP40, pH7.2에서 희석된 GST 융합 수용체 0.5 ㎕ 분액을 흡착제 어레이 정상 부위의 점적에 첨가하였다. 점적상에서 용액을 농축하여 거의 건조시켰다. 이 점적을 2 ㎕의 10 mM 트리스, 50 mM 염화나트륨, pH7.2의 3회 세척하였다. 점적 안과 밖에서 세척 용액을 피펫팅하여 3회 세척하였다. 마지막으로 물 2 ㎕로 점적을 2회 세척하여 잔여 완충액을 제거하였다. 50% 아세토니트릴, 0.5% 트리플루오로아세트산 중 시난핀산 용액 0.3 ㎕ 분액을 점적에 첨가하였다. 잔여 GST 융합 수용체를 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기로 분석하였다(도 32)
20 mM 트리스, 100 mM 염화나트륨, 0.4% NP40, pH7.2 중 GST 융합 수용체 0.5 ㎕ 분액을 흡착제 어레이 정상 부위의 점적에 첨가하였다. GST 단백질만(수용체는 없음)을 함유하는 시료를 음성 대조군으로서 또 다른 점적에 가하였다. 용액을 거의 건조될 때까지 점적에서 농축하였다. 0.5 ㎕의 10 mM 트리스, 50 mM 염화나트륨, pH7.2를 각 점적에 첨가하였다. 실온에서 정치 10초 후에 피펫을 사용하여 용액을 제거하였다.
96 기타 리간드의 라이브러리 중 특이적 리간드를 함유하는 용액의 분액 1 ㎕를 각 점적에 즉시 첨가하였다. 흡착제 어레이를 실온에서 1 시간 동안 습식 챔버에서 항온처리하였다. 각 점적을 수중 30% 이소프로판올:아세토니트릴(1:2) 2 ㎕로 2회 세척하였다. 10회 흡착제 점적의 안과 밖에서 세척 용액 1 ㎕를 피펫팅하여 세척하였다. 50% 아세토니트릴, 0.5% 트리플루오로아세트산 중 α-시아노-4-히드록시신남산 용액의 분액 0.3 ㎕를 점적에 첨가하였다. 수용체상에 포획된 리간드를 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기를 사용하여 분석하였다.
도 33A는 흡착제 어레이 정상 부위에서 포획된 GST 융합 수용체에 대한 96 기타 리간드의 라이브러리중 특정 리간드의 결합을 나타낸다. 도 33B는 동일한 어레이에서 포획된 GST 단백질(수용체는 없음)에 대한 리간드의 결합이 없다는 것을 보여주며, 이는 실험의 음성 대조군으로 사용한다.
본 발명은 보유물 크로마토그래피에 대한 신규 물질 및 방법을 제공한다. 특정 실시예를 제공하였지만, 전술한 설명은 예시적인 것이며 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 당업자라면 본 명세서를 검토하여 여러가지 변형이 가능하다는 것을 알 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 설명으로 결정되는 것이 아니라, 등가의 모든 범위와 함께 첨부된 청구항을 참조하여 결정해야 한다.
본 명세서에서 인용된 모든 공보 및 특허 문헌은 각 공보 또는 특허 문서가 개별적으로 나타난 바와 동일한 범위로 모든 취지에 대해 전문을 참고로 인용한다. 출원인들은 각종 참조문헌을 인용함으로써 임의의 특정 참고문헌을 본 발명의 "종래 기술"로 한정하려는 것은 아니다.

Claims (30)

  1. 샘플내 1종 이상의 피분석물을 검출하는 용도의 기재를 제조하는 방법으로서, a) 흡착제와 용출제의 배합물에 의해 한정되는 선택 조건인 2종 이상의 상이한 선택 조건에 샘플을 노출시켜 피분석물을 흡착제에 보유시키는 단계; b) 피분석물이 보유되는 1종 이상의 선택 조건에서 탈착 분광 분석에 의해 확인하는 단계; 및 c) 확인된 선택 조건의 1종 이상의 흡착제를 포함하는 기재를 제조하는 단계를 포함하는, 샘플내 1종 이상의 피분석물을 검출하는 용도의 기재를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 확인 단계가 다수의 피분석물이 보유되는 1종 이상의 선택 조건을 확인하는 것인, 샘플내 1종 이상의 피분석물을 검출하는 용도의 기재를 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제조 단계가 용출 조건하에 피분석물을 다중 흡착제로서 보유하는 다수의 흡착제를 포함하는 기재를 제조하는 것인, 샘플내 1종 이상의 피분석물을 검출하는 용도의 기재를 제조하는 방법.
  4. 샘플내 피분석물에 대한 개선된 분할도로 선택 조건을 점진적으로 확인하는 방법으로서, (a) (i) 1종 이상의 결합 특성 및 1종 이상의 용출 특성에 의해 한정되는 선택 조건인 한 세트의 선택 조건에 샘플을 노출시키고; (ii) 각 선택 조건하에 보유된 피분석물을 탈착 분광 분석에 의해 검출하며; (iii) 피분석물을 보유하는 선택 조건을 확인함으로써 샘플내 피분석물을 보유하는 선택 조건을 확인하는 단계; 및 (b) (i) 확인된 선택 조건으로부터 1종 이상의 결합 특성 또는 용출 특성을 선별하고 그것을 선택 특성 상수 세트에 첨가하고; (ii) 샘플을 변형된 세트의 선택 조건, 여기서, 변형된 세트내 각각의 선택 조건은 (1) 상수 세트내 선택 특성 및 (2) 상수 세트내에 존재하지 않는 결합 특성 또는 용출을 포함하는 것인 선택 조건에 노출시키며; (iii) 먼저 확인된 선택 조건과 비교하여 개선된 분할도로 피분석물을 보유하는 변형된 세트로부터 탈착 분광 분석에 의해 선택 조건을 확인함으로써, 피분석물에 대한 개선된 분할도로 선택 조건을 확인하는 단계를 포함하는, 샘플내 피분석물에 대한 개선된 분할도로 선택 조건을 점진적으로 확인하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단계 (b)를 1회 이상 반복하는 단계를 추가로 포함하는, 샘플내 피분석물에 대한 개선된 분할도로 선택 조건을 점진적으로 확인하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 샘플로부터 표적 피분석물만을 보유하는 선택 조건이 확인될 때까지 단계 (b)를 반복하는 것을 포함하는, 샘플내 피분석물에 대한 개선된 분할도로 선택 조건을 점진적으로 확인하는 방법.
  7. 제4항의 방법에 의해 피분석물을 분할하는 것으로 확인된 선택 조건으로부터 흡착제를 포함하는 탈착 분광 분석용 기재.
  8. 제7항에 있어서, 흡착제와의 배합물로 용출제를 사용할 때의 지시문 또는 선택 조건으로부터 용출제를 추가로 포함하는 키트 형태인 탈착 분광 분석용 기재.
  9. 피분석물이 제1 및 제2 생물학적 샘플에 차등 존재하는지 여부를 측정하는 방법으로서, a) 하나 이상의 선택 조건에 대해 제1 샘플에서 피분석물에 대한 제1 보유 지도를 측정하는 단계; (b) 동일한 선택 조건에 대해 제2 샘플에서 피분석물에 대한 제2 보유 지도를 측정하는 단계; 및 c) 제1 보유 지도와 제2 보유 지도 사이의 차이를 검출하여, 보유 지도에서의 차이가 피분석물이 제1 및 제2 샘플에 차등 존재한다는 결정 기준을 제공하는 단계를 포함하는, 피분석물이 제1 및 제2 생물학적 샘플에 차등 존재하는지 여부를 측정하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 제1 생물학적 샘플이 건강한 피검체로부터 유래한 것이고, 제2 생물학적 샘플이 병리학적 상태를 겪는 피검체로부터 유래한 것인, 피분석물이 제1 및 제2 생물학적 샘플에 차등 존재하는지 여부를 측정하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 생물학적 샘플이 제1 및 제2 세포 추출물을 포함하는 것인, 피분석물이 제1 및 제2 생물학적 샘플에 차등 존재하는지 여부를 측정하는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 보유 지도가 다수의 선택 조건을 포함하는 것인, 피분석물이 제1 및 제2 생물학적 샘플에 차등 존재하는지 여부를 측정하는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 검출 단계전에 피분석물을 분자 질량이 피분석물의 질량보다 더 적은 하나 이상의 단편으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인, 피분석물이 제1 및 제2 생물학적 샘플에 차등 존재하는지 여부를 측정하는 방법.
  14. 제9항에 있어서, 차이를 검출하는 단계를 프로그램 가능한 디지털 컴퓨터에서 수행하는 것인, 피분석물이 제1 및 제2 생물학적 샘플에 차등 존재하는지 여부를 측정하는 방법.
  15. 제9항에 있어서, 제제를 제1 생물학적 샘플에 투여하지만 제2 생물학적 샘플에는 투여하지 않는 단계를 추가로 포함하여, 제제가 생물학적 샘플내 단백질의 발현을 변화시키는지 여부를 측정하는 것인, 피분석물이 제1 및 제2 생물학적 샘플에 차등 존재하는지 여부를 측정하는 방법.
  16. 제10항에 있어서, 샘플이 혈액, 뇨, 혈청 및 조직으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 피분석물이 제1 및 제2 생물학적 샘플에 차등 존재하는지 여부를 측정하는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 제1 생물학적 샘플에서보다 제2 생물학적 샘플에서 더 많은 양으로 존재하는 피분석물을 확인하여 피분석물이 병리학적 상태에 대한 후보 진단 마커로서 확인되는 단계를 추가로 포함하는, 피분석물이 제1 및 제2 생물학적 샘플에 차등 존재하는지 여부를 측정하는 방법.
  18. 제11항에 있어서, 제1 세포 추출물이 건강한 세포로부터 유래한 것이고, 제2 세포 추출물이 암 세포로부터 유래한 것인, 피분석물이 제1 및 제2 생물학적 샘플에 차등 존재하는지 여부를 측정하는 방법.
  19. 피검체에서 하나 이상의 진단 마커를 특징으로 하는 질병을 진단하는 방법으로서, a) 용출 조건하에 하나 이상의 진단 마커를 분할하는 흡착제를 포함하는 하나 이상의 어드레스성 위치를 포함하는 탈착 분광 분석용 기재를 제공하는 단계; b) 용출 조건하에 기재를 피검체로부터 얻은 생물학적 샘플에 노출시켜 진단 마커를 보유하게 하는 단계; 및 c) 탈착 분광 분석에 의해 보유된 진단 마커를 검출하여 질병을 진단하는 단계를 포함하는, 피검체에서 하나 이상의 진단 마커를 특징으로 하는 질병을 진단하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 진단이 다수의 진단 마커의 검출을 포함하고, 어드레스성 위치가 복수의 진단 마커를 분할하는 흡착제를 포함하는 것인, 피검체에서 하나 이상의 진단 마커를 특징으로 하는 질병을 진단하는 방법.
  21. 샘플내 피분석물 검출용 키트로서, (1) 흡착제와 용출제를 포함하는 선택 조건하에 피분석물을 분할하는 흡착제를 포함하는 하나 이상의 어드레스성 위치를 포함하는 탈착 분광 분석용 기재 및 (2) 샘플을 선택 조건에 노출시키기 위한 지시문 또는 용출제를 포함하는, 샘플내 피분석물 검출용 키트.
  22. 제21항에 있어서, 질병의 진단용이고, 하나 이상의 피분석물이 질병에 대한 하나 이상의 진단 마커인 것인, 샘플내 피분석물 검출용 키트.
  23. 제22항에 있어서, 다수의 진단 마커 및 기재를 특징으로 하는 질병이 하나 이상의 진단 마커를 분할하는 흡착제를 포함하는 다수의 어드레스성 위치를 포함하는 것인, 샘플내 피분석물 검출용 키트.
  24. 제23항에 있어서, 하나 이상의 흡착제가 하나 이상의 진단 마커를 각각 보유하는 흡착제 종을 포함하는 다중 흡착제인, 샘플내 피분석물 검출용 키트.
  25. 제23항에 있어서, 하나 이상의 흡착제가 생체 중합체를 포함하지 않는 것인, 샘플내 피분석물 검출용 키트.
  26. 제23항에 있어서, 하나 이상의 어드레스성 위치가 진단 마커에 특이적인 리간드를 포함하는 것인, 샘플내 피분석물 검출용 키트.
  27. 제26항에 있어서, 리간드가 항체인, 샘플내 피분석물 검출용 키트.
  28. 환자 샘플로부터 얻은 병리학적 상태에 대한 다수의 진단 마커를 분할하는 하나 이상의 흡착제를 하나 이상의 어드레스성 위치에 포함하는 탈착 분광 분석용 기재.
  29. 제28항에 있어서, 하나 이상의 흡착제가 생체 중합체를 포함하지 않는 것인 탈착 분광 분석용 기재.
  30. 제28항에 있어서, 하나의 흡착제가 복수의 진단 마커를 분할하는 것인 탈착 분광 분석용 기재.
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