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KR20140067092A - 형태적으로 제한된 단량체를 갖는 핵산 화합물의 합성 및 용도 - Google Patents

형태적으로 제한된 단량체를 갖는 핵산 화합물의 합성 및 용도 Download PDF

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KR20140067092A
KR20140067092A KR1020147009037A KR20147009037A KR20140067092A KR 20140067092 A KR20140067092 A KR 20140067092A KR 1020147009037 A KR1020147009037 A KR 1020147009037A KR 20147009037 A KR20147009037 A KR 20147009037A KR 20140067092 A KR20140067092 A KR 20140067092A
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KR
South Korea
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nucleic acid
compound
rna
group
formula
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020147009037A
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English (en)
Inventor
트레이시 제이. 매트레이
이보나 엠. 마치아지에비츄
마이클 이. 주니어. 휴스톤
Original Assignee
마리나 바이오테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 마리나 바이오테크, 인크. filed Critical 마리나 바이오테크, 인크.
Publication of KR20140067092A publication Critical patent/KR20140067092A/ko
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Abstract

핵산 화합물을 제조하기 위한 형태적으로 제한된 핵산단량체 (CRN)의 합성 및 용도. 세포에서 유전자의 발현 및 다른 핵산 기반 조절 시스템을 상향- 또는 하향-조절함으로써 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는데 유용한 치료 양상을 위하여, 핵산 화합물을 위한 핵산단량체를 고 수율 및 멀티-그램 규모로 제조하는 방법.

Description

형태적으로 제한된 단량체를 갖는 핵산 화합물의 합성 및 용도 {SYNTHESIS AND USES OF NUCLEIC ACID COMPOUNDS WITH CONFORMATIONALLY RESTRICTED MONOMERS}
발명은 유전자의 발현 및 세포 내 핵산에 의존하는 다른 세포 조절 시스템을 조절하여 질환을 치료하기 위한 핵산 화합물의 합성 및 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 단일-가닥 및 다중-가닥 핵산 화합물을 제조하는데 사용될 수 있는 다양한 형태적으로 제한된 핵산 단량체 (CRN)의 합성에 관한 것이다.
마이크로RNA의 식별 및 평가는 생물학 및 의학에서 가장 빠르게 성장하는 분야 중 하나이다. 마이크로RNA는 세포내 및 세포외 사건에 중요한 유전자 발현의 중심 조절제인 것으로 나타나기 때문에 정상 세포 생리를 유지하는데 주요 요소인 것으로 여겨진다. 따라서, 특정한 마이크로RNA의 손실 또는 특정한 마이크로RNA의 과발현은 질환에 대한 근본적 근거인 비정상 세포 과정으로 이어질 수 있다. 길항제를 사용한 이상(aberrant) 마이크로RNA의 억제, 또는 마이크로RNA 모방체를 사용한 보충이 세포 통신 경로 사이의 균형을 회복시킬 수 있다. CRN을 함유하는 핵산 화합물을 사용하는 치료적 접근은 마이크로RNA의 기능을 직접적 및 효과적으로 변경할 수 있다.
형태적으로 제한된 핵산 단량체를 함유하는 핵산 화합물 또는 CRN은 마이크로RNA 길항제로서 사용될 수 있다. 특정 마이크로RNA를 억제하는 것의 치료적 이익은 마이크로RNA에 의해 제어되는 하류 표적의 탈억제이다. 탈억제는 하류 표적이 마이크로RNA가 전형적으로 하향 조절하는 단백질을 발현할 수 있게 한다. 따라서, 마이크로RNA 억제는 특정 유전자 표적의 "상향 조절"을 허용하는 소수의 치료적 접근 중 하나이다.
RNA 간섭 또는 RNAi는 작은 억제 핵산 분자에 의해 매개되는 서열 특이적, 전사후 유전자 침묵화의 세포 과정을 나타낸다. RNAi 활성 분자는 표적화된 메신저 RNA의 일부에 상동성인 부분을 갖는 이중-가닥 RNA 또는 dsRNA일 수 있다. 긴 dsRNA는 다이서 (Dicer) 효소에 의해 약 19개의 염기 쌍 및 일반적으로, 각 3'-말단에서 오버행인 2개의 뉴클레오티드의 이중-가닥 영역을 갖는 21 내지 23개의 뉴클레오티드를 갖는 짧은 간섭 RNA 또는 siRNA로 처리될 수 있다. siRNA는 siRNA의 패신저 또는 센스 가닥을 절단하는 RNA-유도 침묵화 복합체 또는 RISC 복합체와 상호작용할 수 있다. siRNA의 가이드 또는 안티센스 가닥은 상보적 표적 mRNA에 결합할 수 있고, 이는 그 후 RISC에 의해 절단되어 유전자 침묵화를 일으킨다.
CRN을 함유하는 핵산 화합물은 단일-가닥 올리고뉴클레오티드의 그의 목표하는 표적에 대한 친화도를 증가시키는데 사용될 수 있고, 상기 표적은 메신저 RNA 또는 마이크로RNA이다.
CRN을 함유하는 핵산 화합물은 RNA 간섭 또는 번역 차단을 통하거나, 또는 마이크로RNA 모방체를 통해 유전자 표적을 침묵화 하는데 사용될 수 있다. 이들은 마이크로RNA 길항제를 통해 유전자 표적을 상향 조절하는데 사용될 수 있다.
필요한 것은 유전자의 발현 및 세포 내 다른 핵산 기반 조절 시스템을 상향 또는 하향 조절하여 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는데 유용한 치료 양식을 위한, 핵산 화합물에 대한 핵산 단량체를 멀티-그램 규모로 고 수율로 제조하는 효과적인 방법이다.
따라서 마이크로RNA, siRNA, 및/또는 안티센스 RNA에 관여하는 다양한 치료 양식에 유용한 향상된 안정성을 갖는 핵산 화합물에 대한 핵산 단량체를 제조하는 방법이 필요하다.
<간단한 개요>
본 발명의 실시양태는 하기를 포함한다:
하기 화학식 II를 갖는 화합물을 제공하고, 오존분해 또는 산화에 의해 화학식 II를 갖는 화합물을 변형시키고, 하기 화학식 V를 갖는 화합물을 단리하는 것을 포함하는, 하기 화학식 V를 갖는 화합물을 제조하는 방법.
<화학식 V>
Figure pct00001
상기 식에서 R1은 치환기 보호기이고, R2는 치환기 보호기이고, R1 및 R2 중 하나 또는 둘 다는 부피가 큰(bulky) 치환기 보호기이고, R1 및 R2는 임의로 결합되고, R3은 보호기이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이다.
<화학식 II>
Figure pct00002
B는 우리딘 또는 5-메틸우리딘일 수 있다. R1 및 R2는 1,1,3,3-테트라알킬디실록산-1,3-디일 기일 수 있다. R1 및 R2는 1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일 기일 수 있다. R3은 벤질일 수 있다.
오존분해에 의한 화학식 V를 갖는 화합물의 수율은 화학식 V를 갖는 화합물 5 그램 이상의 규모에서 적어도 50%일 수 있다. 오존분해에 의한 화학식 V를 갖는 화합물의 수율은 화학식 V를 갖는 화합물 10 그램 이상의 규모에서 적어도 50%일 수 있다. 오존분해에 의한 화학식 V를 갖는 화합물의 수율은 화학식 V를 갖는 화합물 10 그램 이상의 규모에서 적어도 70%일 수 있다. 오존분해에 의한 화학식 V를 갖는 화합물의 수율은 화학식 V를 갖는 화합물 10 그램 이상의 규모에서 적어도 80%일 수 있다.
상기 방법은 5'-히드록실 기를 보호하고, R3을 포스포르아미다이트로 치환하여, 화학식 V를 갖는 화합물을 하기 화학식 VI을 갖는 형태적으로 제한된 핵산 단량체 CRN으로 변형시키는 것을 추가로 포함한다.
<화학식 VI>
Figure pct00003
5'-히드록실 기는 DMTr 기로 보호될 수 있다. B는 시티디닐, 우리디닐, 또는 티미디닐 기로 변형될 수 있다. 형태적으로 제한된 핵산 단량체는 피리미딘 CRN일 수 있다. 피리미딘 CRN은 그의 글리코시드 전이반응에 의해 퓨린 CRN으로 변형될 수 있다. CRN은 핵산 화합물을 제조하는데 사용될 수 있다. 핵산 화합물은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 핵산 화합물은 마이크로RNA, 안티미어(antimir), 안타고미어(antagomir), 마이크로RNA 모방체, 마이크로RNA 전구체, RNA, siRNA, DNA, RNA 및 DNA, usiRNA, mdRNA, 짧은 헤어핀 RNA 또는 shRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 개시내용은 비시클릭 당을 합성하고 비시클릭 당을 실릴화 퓨린과 반응시켜 퓨린 CRN을 제조하는 방법을 기재한다. 비시클릭 당은 화학식 VI을 가질 수 있고, 여기서 B는 알콕시 기로 대체된다.
CRN은 하기 구조를 갖는다.
Figure pct00004
상기 구조에서 R은 메틸이고, R1은 독립적으로 H, 알킬, 또는 보호기이고, R2는 독립적으로 H, 알킬, 보호기, 또는 포스포르아미다이트 기이다.
CRN은 하기 구조를 갖는다.
Figure pct00005
핵산 화합물은 상기 CRN을 포함한다. 핵산 화합물은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
<도면의 간단한 설명>
도 1: 도 1은 본 개시내용의 형태적으로 제한된 핵산 단량체 또는 CRN을 제조하는 방법의 실시양태를 도시한다.
도 2: 도 2는 본 개시내용의 형태적으로 제한된 핵산 단량체 또는 CRN을 제조하는 방법의 실시양태를 도시한다.
<상세한 설명>
본 발명은 하나 이상의 형태적으로 제한된 핵산 단량체를 함유하는 핵산 화합물의 합성 및 용도에 관한 것이다. 형태적으로 제한된 핵산 단량체 또는 CRN은 리보핵산의 C2' 및 C4' 리보스 탄소를 연결하는 가교를 갖는 분자이다. RNA- 또는 DNA-기반 올리고뉴클레오티드 내에서의 CRN 치환은 혼성화 친화도를 증가시키고 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 향상시킬 수 있다. CRN 기술은 메신저 RNA 또는 마이크로RNA를 표적화하기 위한 고도로 강력하고 특정한 핵산-기반 치료법을 개발하는 직접적인 수단을 제공한다. 이러한 표적은 소분자 또는 모노클로날 항체에 의해 전형적으로 "약물화될 수 없는 것" 또는 "표적화하기 어려운" 질환 경로를 나타내고, 상당한 미충족 욕구를 갖는 질환 분야, 예컨대 염증, 대사 질환, 및 암에 적합하다.
본 개시내용은 일반적으로, 유전자를 침묵화하거나 또는 세포 내 핵산에 의존하는 세포 조절 시스템의 기능을 조절하여 질환을 치료하는데 사용하기 위한 핵산 화합물에 관한 것이다.
형태적으로 제한된 핵산 단량체
일부 측면에서, 본 개시내용의 핵산 화합물은, 다양한 치료 양식에서 화합물의 안정성을 유리하게 향상시키는 하나 이상의 형태적으로 제한된 핵산 단량체를 함유할 수 있다.
일부 형태적으로 제한된 핵산 단량체의 합성이 미국 특허 번호 6,833,361; 6,403,566 및 6,083,482에 기재된다.
일부 실시양태에서, 형태적으로 제한된 핵산 단량체는 단량체 R이고 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00006
상기 식에서 X는 독립적으로 각 경우에 O, S, CH2, C=O, C=S, C=CH2, CHF 또는 CF2로부터 선택되고; R2 및 R3은 독립적으로 각 경우에 수소, OH, O-알킬, F, SH, S-알킬, S-F, CN, N3, OCH3, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 모노포스페이트, 디포스포네이트, 트리포스포네이트, OH 기 당부분을 갖는 아미노산 에스테르, 또는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 모노포스포네이트, 디포스포네이트, 또는 트리포스포네이트의 전구약물, NH(CH=O), NH(C=O)-C(1-22) 포화 또는 불포화 알킬 쇄, 시클로알킬, 아릴 또는 헤테로시클릭으로부터 선택되고; B는 독립적으로 각 경우에 핵염기 또는 핵염기 유사체이다. 단량체 R에 기반하는 CRN을 포함하는 핵산 화합물에서 R2 및 R3은 핵산 화합물의 포스포디에스테르 결합일 수 있다.
특정 실시양태에서, 형태적으로 제한된 핵산 단량체는 단량체 S이고 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00007
상기 식에서 X는 독립적으로 각 경우에 O, S, CH2, C=O, C=S, C=CH2, CHF, CF2로부터 선택되고; Z는 O이고; Y는 CH2이고; R2는 독립적으로 각 경우에 수소, F, OH, 또는 OCH3로부터 선택되고; R1 및 R3은 독립적으로 각 경우에 수소, OH, P(OR)2, P(O)(OR)2, P(S)(OR)2, P(O)(SR)OR, 아실, 카르보벤족시, 트리플루오로아세틸, p-니트로페닐옥시카르보닐, 또는 올리고머를 형성하기 위한 임의의 적합한 보호기 또는 활성화 기로부터 선택되고; R은 독립적으로 각 경우에 H, 2-시아노에틸, 디이소프로필아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 또는 소수성 차폐기(masking group)로부터 선택되고, 여기서 R은 (OR)2, 또는 (SR)OR의 경우에 동일하거나 또는 서로 다를 수 있다. 단량체 S를 기반으로 하는 CRN을 포함하는 핵산 화합물에서 R1 및 R3은 핵산 화합물의 포스포디에스테르 결합일 수 있다.
특정 실시양태에서, 핵산 화합물은 임의의 수의 CRN을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 핵산 화합물은 하나 이상의 단량체 R, 및 하나 이상의 단량체 S를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실, 하이포크산틴, 티민, 7-데아자아데닌, 이노신, C-페닐, C-나프틸, 이노신, 아졸 카르복스아미드, 네뷸라린, 니트로피롤, 니트로인돌, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 하이포크산틴, 슈도우리딘, 5-메틸우리딘, 5-프로피닐시티딘, 이소시티딘, 이소구아닌, 7-데아자구아닌, 2-티오피리미딘, 6-티오구아닌, 4-티오티민, 4-티오우라실, O6-메틸구아닌, N6-메틸아데닌, O4-메틸티민, 5,6-디히드로티민, 2-티오리보티미딘, 5,6-디히드로우라실, 4-메틸인돌, 에테노아데닌, 데옥시우리딘, 및 이들의 임의의 존재하는 데옥시 유사체로부터 독립적으로 선택되는 핵염기 또는 핵염기 유사체를 나타낸다.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실, 및 이들의 임의의 존재하는 데옥시 유사체로부터 독립적으로 선택되는 핵염기 또는 핵염기 유사체를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 핵산 화합물은 하나 이상의 CRN 및 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵산 단량체 또는 UNA를 함유할 수 있다. 히드록시메틸 치환된 핵산 단량체 및 히드록시메틸 치환된 핵산 화합물의 합성을 위한 일부 구조 및 방법을 PCT 국제 출원 PCT/US2008/064417에서 찾을 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 핵산 화합물은 2'-O-알킬-RNA 단량체, 2'-아미노-DNA 단량체, 2'-플루오로-DNA 단량체, LNA 단량체, PNA 단량체, HNA 단량체, ANA 단량체, FANA 단량체, CeNA 단량체, ENA 단량체, DNA 단량체, 및 INA 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 유사체를 함유할 수 있다.
형태적으로 제한된 핵산 단량체의 합성
형태적으로 제한된 핵산 단량체의 피리미딘 유사체는 우리딘 또는 5-치환된 우리딘 뉴클레오시드로부터 합성될 수 있다. CRN 또는 비시클릭 뉴클레오시드를 합성하기 위해, 탄소 원자가 2' 및 4' 위치에 첨가될 수 있다. 2' 및 4' 위치에서의 탄소 원자 치환기는 뉴클레오시드 내 2'-4' 가교를 형성하는데 사용될 수 있고, 따라서 비시클릭 CRN을 형성할 수 있다.
수케다 (Sukeda) 등은 3' 위치의 실록실 보호기로부터 비닐 기를 분자내 전이하여 2' 위치에 탄소 원자를 첨가하는 한가지 방법을 예증하였다. 문헌 [Sukeda et al., J. Org. Chem. Vol. 65, 8988-8996, 2000]을 참조한다. 비닐 기를 전이하여 (R)-2'-비닐 치환 리보-배열 뉴클레오시드 입체이성질체를 수득하였다.
본 개시내용의 방법에서, 우리딘 또는 5-메틸우리딘 리보뉴클레오시드의 2,2'-안히드로우리딘 중간체로부터 출발하여, 5'-히드록실 기는 모노메톡시 트리틸 기 (MMT)로 보호될 수 있다. 그 후, 아이오딘화나트륨 및 토스산 산으로 친핵성 개환하여 2'-데옥시-2'-아이오도-3'-O-디메틸비닐실릴-5'-MMT-O-피리미딘 리보뉴클레오시드를 수득한다. 후속하는 비닐 전이 반응에서 모노메톡시 트리틸 기가 더욱 안정하기 때문에 5'-히드록실 기를 보호하는데 모노메톡시 트리틸 기가 디메톡시 트리틸 기보다 바람직하다. 라디칼-개시 비닐 전이 반응의 완료 후, 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (TBAF)를 사용하여 잔류 실란이 제거될 수 있다. 단일 정제 단계가 사용될 수 있고, 절차는 50 그램 이상의 양의 생성물 2'-데옥시-2'-비닐-5'-MMT-O-피리미딘 리보뉴클레오시드까지 측정가능하다.
3' 위치에 대해, 3' 위치는 벤질 기로 보호될 수 있고, MMT 보호기는 제거될 수 있고, 5' 위치는 데스-마르틴 퍼아이오디난으로 산화되어 4'-히드록시메틸 기를 도입할 수 있다. 하기 화학식 I을 갖는 생성된 디올 화합물은 다양한 CRN 및 CRN-함유 분자를 제조하기에 적절한 2' 및 4' 탄소 원자 치환기를 함유한다.
<화학식 I>
Figure pct00008
디올 화합물 화학식 I은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, R은 H 또는 메틸이다.
당업계에 공지되지 않은 것은 화학식 I을 갖는 디올 화합물로부터 CRN 핵산 단량체로의 고 수율 및 멀티-그램 규모인 견고한 경로이다.
화학식 I을 갖는 디올의 2'-비닐 치환기는 4' 치환기와의 공유 가교를 형성할 수 있는 반응성 기로 변형되어야 한다. CRN에 도달하는 한가지 방식은 2'-비닐 치환기를 2'-히드록시메틸 치환기로 변형하는 것이다. 이 변형의 수행에서, 상당한 문제는 고 수율의 2'-히드록시메틸 치환기를 멀티-그램 규모의 핵산 단량체로 수득하는 것이다.
예를 들어, 디올 화학식 I의 4'-히드록시메틸 및 5'-히드록실 기로 메실레이트기를 첨가하는 것은, 디올 화학식 I을, 예를 들어, 사산화오스뮴으로 처리하여 2'-비닐 치환기를 2'-히드록시메틸 치환기로 변형하는 것을 견디기에 불충분한 보호이다. 일반적으로, 단지 저 수율만이 수득될 수 있었다.
또한, 화학식 I을 갖는 디올 화합물의 2'-비닐 치환기는 오존분해에 의해 2'-히드록시메틸 치환기로 충분히 변형될 수 없었다. 실제로, 1 그램 미만의 작은 규모로 저 수율이 단지 수득될 수 있었는데, 이는 상기 방법을 비현실적으로 만드는 것이다. 어떤 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 다른 것들 중에 오존분해하에서 반응성을 나타내는 것은 3'-벤질 보호기일 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명은 고 수율을 갖고 멀티-그램 규모인, 화학식 I의 디올 화합물에서 CRN 핵산 단량체로의 성공적인 경로를 제공한다.
오존분해 및 다른 경로의 변형에 대해 예상 밖으로 유리한 안정한 중간체가 하기 화학식 II를 갖는 보호된 화합물일 수 있음이 발견되었다.
<화학식 II>
Figure pct00009
상기 식에서 5'-히드록실은 부피가 큰 치환기 R1로 보호되고, 4'-히드록시메틸은 부피가 큰 치환기 R2로 보호되고, 3'-히드록실은 치환기 R3으로 보호되고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이다. 치환기 R1 및 R2는 점선으로 도시된 바와 같이 임의로 결합된다.
일부 실시양태에서, 치환기 R1 및 R2 중 하나는 부피가 큰 치환기이다.
일부 실시양태에서, 오존분해 및 다른 경로의 변형에 대해 유리하게 안정한 중간체는 하기 화학식 III을 갖는 보호된 화합물일 수 있다.
<화학식 III>
Figure pct00010
상기 식에서 5'-히드록실 및 4'-히드록시메틸은 1,1,3,3-테트라알킬디실록산-1,3-디일 기로 보호되고, R4는 알킬 기이고, Bn은 벤질이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이다. 특정 실시양태에서, R4는 이소프로필이다.
일부 실시양태에서, 핵염기는 우리딘 또는 5-메틸우리딘이고, 보호된 화합물은 하기 화학식 IV를 가질 수 있다.
<화학식 IV>
Figure pct00011
상기 식에서 R은 수소 또는 메틸이고, iPr은 이소프로필이고, 5'-히드록실 및 4'-히드록시메틸은 1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일 기 (TIPDS 또는 TIPS)로 보호된다.
위치 R1 및 R2에 대한 부피가 큰 치환기의 예는 트리메틸실릴 (TMS), tert-부틸디메틸실릴 (TBDMS), 트리-이소-프로필실릴옥시메틸 (TOM)을 포함한다.
위치 R1 및 R2에 대한 부피가 큰 치환기의 예는 디메톡시트리틸 (DMT) (비스-(4-메톡시페닐)페닐메틸)을 포함한다.
화학식 II, III 또는 IV를 갖는 보호된 화합물은 2'-비닐 치환기의 오존분해 및 다른 경로의 변형에 대해 유리하게 안정할 수 있다. 오존분해 후, 화학식 IV의 화합물은 하기 화학식 V를 갖는 화합물로 변형된다.
<화학식 V>
Figure pct00012
화학식 II, III 또는 IV를 갖는 보호된 화합물의 예상 밖으로 유리한 안정성은 다른 것들 중에 오존분해에 대한 3'-벤질 보호기의 감소된 민감도를 포함할 수 있다. 오존분해에 의한 2'-비닐 치환기의 변형의 초기 수율은 50% 이상일 수 있고, 추가로 산화되어 90%까지 수율을 제공할 수 있는 2'-비닐 형태의 40% 회수를 동반할 수 있다.
화학식 II, III 또는 IV를 갖는 보호된 화합물을 출발점으로서 사용하여, 2'-비닐 치환기의 변형을 고 수율로 높은 규모로 달성하여, CRN의 합성을 고 수율로 높은 규모로 수득할 수 있다.
(a) 2'-비닐 치환기를 2'-히드록시메틸 치환기로 오존분해하고, (b) 2'-히드록시메틸 치환기를 아실화하여 충분히-보호된 뉴클레오시드를 수득하고, (c) 완충 테트라부틸암모늄 플루오라이드로 TIPDS 기를 제거하여 디올 형태를 재생하고, (d) 재생된 디올 형태의 4'-히드록시메틸 치환기 및 5'-히드록실 기를 메실화하고, (e) 2'-위치를 탈아실화하고, (f) α-4'-메실-O-치환기를 2'-히드록시메틸 치환기와 축축하여 비시클릭 구조를 형성함으로써 화학식 II, III 또는 IV를 갖는 보호된 화합물이 CRN으로 변형될 수 있다. 여기서, 부분적으로 보호된 비시클릭 뉴클레오시드는 추가의 단계로 포스포르아미다이트화될 수 있다.
<화학식 VI>
Figure pct00013
예를 들어, 일부 실시양태에서, (f1) 3'-벤질 기를 수소로 대체하고, (g1) 남은 β-4'-히드록시메틸 치환기를 포스포르아미다이트 화학법에 적합한 기, 예를 들어, 4,4'-디메톡시트리틸 (DMTr) 기로 보호하고, (h1) 3'-포스포르아미다이트 기를 첨가하여 CRN 포스포르아미다이트를 수득함으로써 포스포르아미다이트 기가 첨가될 수 있다.
<화학식 VII>
Figure pct00014
추가 실시양태에서, (f2) 3'-벤질 기를 수소로 대체하고, (g2) 3'-트리에틸실릴 기를 첨가하고, (h2) 4'-아실을 벤질아미노 기 또는 벤질시티딘으로 전환함으로써 포스포르아미다이트 기가 첨가될 수 있다. 여기서, 부분적으로 보호된 비시클릭 뉴클레오시드는 추가의 단계로 포스포르아미다이트화될 수 있다. 이 경로에 의해, 각각의 3'-포스포르아미다이트화 CRN의 티미딘, 시티딘 및 우리딘 형태가 제조될 수 있다.
대안적 실시양태에서, (a) 2'-비닐 치환기를 2'-히드록시메틸 치환기로 오존분해하고, (b) 2'-히드록시메틸 치환기를 메실화하고, (c) TIPDS 기를 완충 테트라부틸암모늄 플루오라이드로 제거하여 디올 형태를 재생하고, (d) α-4'-히드록시메틸-치환기를 2'-메실-O 치환기와 축합하여 비시클릭 구조를 형성함으로써 화학식 II, III 또는 IV를 갖는 보호된 화합물이 CRN으로 변형될 수 있다. 여기서, 부분적으로 보호된 비시클릭 뉴클레오시드는 추가의 단계로 포스포르아미다이트화될 수 있다.
<화학식 VI>
Figure pct00015
일부 실시양태에서, 하기 반응이 수행될 수 있다.
Figure pct00016
추가 실시양태에서, 하기 반응이 수행될 수 있다.
Figure pct00017
　　　추가 실시양태에서, 하기 반응이 수행될 수 있다.
Figure pct00018
여기서 TES는 트리에틸실릴이다.
　　　도 1은 본 개시내용의 형태적으로 제한된 핵산 단량체 또는 CRN을 제조하는 방법의 실시양태를 도시한다.
　　　도 2는 본 개시내용의 형태적으로 제한된 핵산 단량체 또는 CRN을 제조하는 방법의 실시양태를 도시한다.
　　　추가 실시양태에서, 퓨린 리보뉴클레오시드는 피리미딘 CRN의 글리코시드 전이반응에 의해 접근될 수 있다.
　　　추가 실시양태에서, 퓨린 CRN 핵산 단량체는 비시클릭 당을 합성하고 실릴화 퓨린과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
　　　다양한 유기 기 및 보호기를 제조하는 방법이 당업계에 공지되고 그의 사용 및 수정은 일반적으로 당업자의 능력 내에 있다. 예컨대, 문헌 [Stanley R. Sandler and Wolf Karo, Organic Functional Group Preparations (1989)]; [Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques (1996)]; [Leroy G. Wade, Compendium Of Organic Synthetic Methods (1980)]를 참조하고; 보호기의 예는 문헌 [T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups In Organic Synthesis (3rd Ed. 1991)]에서 찾을 수 있다. 예컨대, 문헌 [Helmut Vorbrueggen, Handbook of Nucleoside Synthesis (2001)]을 참조한다.
형태적으로 제한된 핵산 단량체
일부 측면에서, 본 개시내용은 다양한 CRN 화합물을 제공한다.
일부 실시양태에서, CRN 화합물은 하기 구조를 갖는다.
Figure pct00019
여기서 R은 메틸이고, R1은 독립적으로 H, 알킬, 또는 보호기이고, R2는 독립적으로 H, 알킬, 보호기, 또는 포스포르아미다이트 기이다.
본 개시내용의 CRN 화합물은 당업계의 기술을 고려할 때 본원에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 CRN 화합물은 포스포르아미다이트 5-메틸시티딘 CRN이다.
Figure pct00020
CRN 핵산단량체를 함유하는 핵산 화합물
하나 이상의 CRN을 함유하는 본 개시내용의 핵산 화합물은 마이크로RNA, 안티미어, 안타고미어, 마이크로RNA 모방체, 또는 마이크로RNA 전구체 또는 예비-마이크로RNA일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 화합물은 마이크로RNA를 표적하기 위해 사용될 수 있는 단일 가닥 안티센스 분자일 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 화합물은 RNA 복합체인 마이크로RNA 모방 분자일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 화합물은 큰 개입 비코딩 RNA (lincRNA) 또는 Piwi-상호작용 RNA (piRNA)일 수 있다.
하나 이상의 CRN을 함유하는 본 개시내용의 핵산 화합물은 RNA, DNA, RNA 및 DNA, usiRNA, siRNA, mdRNA, 소형 헤어핀 RNA 또는 shRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 제1 가닥 및 제1 가닥에 상보적인 제2 가닥을 포함하는 핵산 화합물을 제공하며, 여기서 제1 가닥 및 제2 가닥은 어닐링되어 이중-가닥 영역을 형성할 수 있으며, 이중-가닥 영역은 하나 이상의 미스매치를 포함하며, 여기서 제1 가닥 또는 제2 가닥의 핵산단량체 중 하나 이상은 형태적으로 제한된 핵산단량체이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 화합물은 함께 RNA 이중나선을 이루는 2개 가닥을 가질 수 있다. RNA 이중나선은 또한 소위 가이드 가닥 또는 제1 가닥인 안티센스 가닥, 및 소위 또한 센스 가닥 또는 제2 가닥인 패신저 가닥으로 구성될 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 화합물은 단일 가닥 RNA 분자, 예를 들어 안티센스 RNA, 또는 기능적 RNA (fRNA), 또는 비-코딩 RNA (ncRNA), 또는 소형 템포럴(temporal) RNA (stRNA), 또는 마이크로RNA (miRNA), 또는 소형 핵 RNA (snRNA), 또는 소형 간섭 RNA (siRNA), 또는 소형 인 RNA (snRNA), 또는 리보솜 RNA (rRNA), 또는 전이 RNA (tRNA), 또는 상기 중 어느 하나의 전구체 RNA일 수 있다.
추가로, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 dsRNA는 서열 특이적 RNAi를 매개할 수 있는 핵산 분자, 예를 들어 메로이중나선 RNA (mdRNA), 틈이 있는(nicked) dsRNA (ndsRNA), 갭이 있는 dsRNA (gdsRNA), 소형 간섭 핵산 (siNA), siRNA, 마이크로-RNA (miRNA), 소형 헤어핀 RNA (shRNA), 소형 간섭 올리고뉴클레오티드, 소형 간섭 치환된 올리고뉴클레오티드, 소형 간섭 변형된 올리고뉴클레오티드, 화학적으로 변형된 dsRNA, 또는 전사후 유전자 침묵 RNA (ptgsRNA)를 설명하기 위해 사용된 다른 용어와 동등한 것으로 여겨진다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 화합물은 형태적으로 제한된 핵산단량체인 핵산 화합물의 가닥의 핵산단량체의 1% 내지 75%를 가질 수 있다.
핵산 화합물은 8 내지 60개 핵산단량체 길이의 가닥을 가질 수 있다. 핵산 화합물은 10 내지 40개 핵산단량체 길이의 가닥을 가질 수 있다.
핵산 화합물은 10 내지 23개 염기 쌍, 또는 12 내지 21개 염기 쌍, 또는 14 내지 21개 염기 쌍, 또는 15 내지 21개 염기 쌍, 또는 16 내지 21개 염기 쌍의 이중-가닥 영역을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 화합물은 제1 가닥이 약 15개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드를 갖는 RISC 활성화제, 또는 제1 가닥이 약 26개 뉴클레오티드 내지 약 40개 뉴클레오티드를 갖는 다이서 기재일 수 있다.
특정 실시양태에서, 핵산 화합물은 하나 이상의 5-메틸우리딘 (리보티미딘), 하나 이상의 2-티오리보티미딘, 또는 하나 이상의 보편-결합 뉴클레오티드, 또는 하나 이상의 G 클램프를 함유할 수 있다. 보편-결합 뉴클레오티드의 예는 C-페닐, C-나프틸, 이노신, 아졸 카르복스아미드, 1-β-D-리보푸라노실-4-니트로인돌, 1-β-D-리보푸라노실-5-니트로인돌, 1-β-D-리보푸라노실-6-니트로인돌, 및 1-β-D-리보푸라노실-3-니트로피롤을 포함한다.
추가 실시양태에서, 핵산 화합물은 제1 가닥, 제2 가닥, 또는 제3 가닥 중 하나 이상의 하나 또는 양 말단 상의 말단 캡 치환기를 추가로 함유할 수 있다. 말단 캡의 예는 알킬, 무염기성, 데옥시 무염기성, 글리세릴, 디뉴클레오티드, 비-시클릭 뉴클레오티드, 또는 도립 데옥시뉴클레오티드 모이어티를 포함한다.
핵산 화합물은 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결, 예를 들면 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 알킬 포스포네이트, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트, 키랄 포스포네이트, 포스포노아세테이트, 티오포스포노아세테이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트, 또는 보라노포스페이트 연결을 추가로 함유할 수 있다.
핵산 화합물에서, 센스 가닥의 5'-말단, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두는 히드록실 또는 포스페이트일 수 있다.
핵산 화합물은 2개의 둔단을 갖는 두 기능의 핵산 화합물일 수 있다.
핵산 화합물은 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵산단량체 및 하나 이상의 형태적으로 제한된 핵산단량체를 함유할 수 있다.
핵산 화합물에서, 제1 및 제2 가닥은 핵산단량체의 비-쌍형성 영역에 의해 연결될 수 있다.
dsRNA 분자는 3개 이상의 가닥을 갖는 메로이중나선 RNA 또는 mdRNA일 수 있다. 예를 들어, mdRNA는 'A' (제1 또는 안티센스) 가닥, 'S1' (제2) 가닥, 및 'S2' (제3) 가닥을 가질 수 있으며, 여기서 'S1' 및 'S2' 가닥은 'A' 가닥의 비-중복 영역에 상보적이며, 이와 염기 쌍 (bp)을 이룬다 (예컨대, mdRNA는 A:S1S2의 형태를 가질 수 있음). S1, S2, 또는 더 많은 가닥은 함께 'A' 가닥에의 센스 가닥을 본질적으로 포함한다. 'S1' 및 'A' 가닥의 어닐링에 의해 형성된 이중-가닥 영역은 'S2' 및 'A' 가닥의 어닐링에 의해 형성된 이중-가닥 영역과 구분되며, 비-중복된다. mdRNA 분자는 "갭이 있는" 분자이며, 이는 0개 뉴클레오티드 내지 약 10개 뉴클레오티드 이하 범위인 "갭"을 의미한다. 일부 실시양태에서, A:S1 이중나선은 A:S2 이중나선으로부터, A:S1 이중나선 및 A:S2 이중나선 사이에 위치하며 'A', 'S1', 또는 'S2' 가닥 중 하나 이상의 3' 말단에서의 임의의 하나 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드로부터 구분되는, 'A' 가닥에서의 하나 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 (약 10개 이하의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드)로부터 야기된 갭에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, A:S1 이중나선은 A:B2 이중나선으로부터, A:S1 이중나선 및 A:S2 이중나선 사이에서 0개 뉴클레오티드의 갭 (즉, 폴리뉴클레오티드 분자에서 2개 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 결합 만이 깨지거나 또는 빠진 틈)에 의해 분리되며, 이는 또한 틈이 있는 dsRNA (ndsRNA)로 지칭될 수 있다. 예를 들어, A:S1S2는 총 약 14개 염기 쌍 내지 약 40 염기 쌍을 조합한 2개 이상의 이중-가닥 영역을 갖는 dsRNA로 이루어질 수 있으며, 이중-가닥 영역은 임의로 둔단을 갖는 약 0 내지 약 10개 뉴클레오티드의 갭에 의해 분리되거나, 또는 A:S1S2는 10개 이하의 뉴클레오티드의 갭에 의해 분리된 2개 이상의 이중-가닥 영역을 갖는 dsRNA를 포함할 수 있으며, 여기서 이중-가닥 영역 중 하나 이상은 약 5개 염기 쌍 내지 13개 염기 쌍을 포함한다.
핵산 분자의 합성
핵산 분자는 재조합적으로 생성되거나, 화학적으로 합성되거나, 또는 그의 조합일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 (예컨대, 특정 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드가 없는 올리고뉴클레오티드의 부분)는, 예를 들어 문헌 [Caruthers et al., Methods in Enzymol. 211:3-19, 1992]; [Thompson et al., PCT 공개 번호 WO 99/54459], [Wincott et al., Nucleic Acids Res. 23:2677-2684, 1995]; [Wincott et al., Methods Mol. Bio. 74:59, 1997]; [Brennan et al., Biotechnol Bioeng. 61:33 45, 1998]; 및 [Brennan, U.S. 특허 번호 6,001,311]에 기재된 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 합성될 수 있다. 본 개시내용의 특정 dsRNA 분자 및 그의 유사체를 포함하는 RNA의 합성은 문헌 [Usman et al., J. Am. Chem. Soc. 109:7845, 1987]; [Scaringe et al., Nucleic Acids Res. 18:5433, 1990]; 및 [Wincott et al., Nucleic Acids Res. 23:2677-2684, 1995]; [Wincott et al., Methods Mol. Bio. 74:59, 1997]에 기재된 절차를 사용하여 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 분자는 별도로 합성될 수 있으며, 예를 들어 라이게이션 (문헌 [Moore et al., Science 256:9923, 1992]; [Draper et al., PCT 공개 번호 WO 93/23569]; [Shabarova et al., Nucleic Acids Res. 19:4247, 1991]; [Bellon et al., Nucleosides & Nucleotides 16:951, 1997]; [Bellon et al., Bioconjugate Chem. 8:204, 1997]), 또는 합성 또는 탈보호 후 혼성화에 의해 합성 후 연결될 수 있다.
비-뉴클레오티드 링커는 무염기성 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질, 폴리탄화수소, 또는 다른 중합체 화합물 (예컨대, 2 내지 100개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 폴리에틸렌 글리콜)로 이루어질 수 있다. 구체적 예는 문헌 [Seela and Kaiser, Nucleic Acids Res. 18:6353, 1990, and Nucleic Acids Res. 15:3113, 1987]; [Cload and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 113:6324, 1991]; [Richardson and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 113:5109, 1991]; [Ma et al., Nucleic Acids Res. 21:2585, 1993, and Biochemistry 32:1751, 1993]; [Durand et al., Nucleic Acids Res. 18:6353, 1990]; [McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides 10:287, 1991]; [Jaschke et al., Tetrahedron Lett. 34:301, 1993]; [Ono et al., Biochemistry 30:9914, 1991]; [Arnold et al., PCT 공개 번호 WO 89/02439]; [Usman et al., PCT 공개 번호 WO 95/06731]; [Dudycz et al., PCT 공개 번호 WO 95/11910] 및 [Ferentz and Verdine, J. Am. Chem. Soc. 113:4000, 1991]에 의해 기재된 비-뉴클레오티드 링커를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 dsRNA 분자의 합성은 추가로 변형될 수 있으며, (a) 제1 (안티센스) 가닥의 합성 및 각각 제1 가닥의 비-중복 영역에 상보적인 제2 (센스) 가닥 및 제3 (센스) 가닥의 합성; 및 (b) 제1, 제2 및 제3 가닥을 함께 dsRNA 분자를 수득하기 위한 적합한 조건 하의 어닐링을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, dsRNA 분자의 제1, 제2 및 제3 가닥의 합성은 고체 상 올리고뉴클레오티드 합성에 의한 것이다. 또 다른 실시양태에서, dsRNA 분자의 제1, 제2, 및 제3 가닥의 합성은 고체 상 일렬 올리고뉴클레오티드 합성에 의한 것이다.
핵산 분자는 염기, 당, 포스페이트, 또는 그의 임의의 조합의 치환 또는 변형을 함유할 수 있다. 핵산 분자의 염기, 포스페이트, 또는 당 모이어티에의 치환 및 화학적 변형의 일부 예는 다음에 나타난다: 예컨대, 문헌 [Eckstein et al., PCT 공개 번호 WO 92/07065]; [Perrault et al., Nature 344:565, 1990]; [Pieken et al., Science 253:314, 1991]; [Usman and Cedergren, Trends in Biochem. Sci. 17:334, 1992]; [Usman et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 31:163, 1994]; [Beigelman et al., J. Biol. Chem. 270:25702, 1995]; [Burgin et al., Biochemistry 35:14090, 1996]; [Burlina et al., Bioorg. Med. Chem. 5:1999, 1997]; [Thompson et al., Karpeisky et al., Tetrahedron Lett. 39:1131, 1998]; [Earnshaw and Gait, Biopolymers (Nucleic Acid Sciences) 48:39-55, 1998]; [Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67:99-134, 1998]; [Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10:297, 2000]; [Kurreck, Eur. J. Biochem. 270:1628, 2003]; [Dorsett and Tuschl, Nature Rev. Drug Discov. 3:318, 2004]; [PCT 공개 번호 WO 91/03162; WO 93/15187; WO 97/26270; WO 98/13526]; [U.S. 특허 번호 5,334,711; 5,627,053; 5,716,824; 5,767, 264; 6,300,074]를 참조한다.
변형은 뉴클레오시드간 연결, 예를 들면 포스포로티오에이트, 또는 우리딘 대신 5-메틸우리딘을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 모르폴리노, 아미데이트 카르바메이트, 카르복시메틸, 아세트아미데이트, 폴리아미드, 술포네이트, 술폰아미드, 술파메이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 또는 알킬실릴 치환을 포함하는 치환된 또는 변형된 dsRNA 분자, 예를 들면 포스페이트 백본 변형을 특징으로 한다.
일부 올리고뉴클레오티드 백본 변형은 문헌 [Hunziker and Leumann, Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417, 1995]; 및 [Mesmaeker et al., ACS, 24 39, 1994]에 나타난다.
치료제
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 화합물을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 세포의 내인성 핵산 기반 조절 시스템의 기능을 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 여기서 핵산 화합물은 세포에서의 유전자의 발현을 감소시킨다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 화합물을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포의 내인성 핵산 기반 조절 시스템의 기능을 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 여기서 핵산 화합물은 세포에서의 내인성 핵산 기반 조절 시스템의 기능을 감소시킨다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 치료 또는 관리를 필요로하는 대상체에게 본원에 개시된 바와 같은 핵산 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 이상 핵산 발현과 연관되고/되거나, 연결되고/되거나, 이로부터 야기되는 질환 또는 상태를 치료하거나 또는 관리하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 핵산 화합물은 핵산의 발현 또는 기능을 감소시킴으로써 질환 또는 상태를 치료하거나 또는 관리한다.
정의
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "연결된"은 2개의 화학적 개체 사이의 직접 공유 연결 (예컨대, RNA 및 히드록시메틸 치환된 핵산단량체), 또는 2개의 화학적 개체 사이의, 예를 들어 링커를 통한, 간접 공유 연결 중 하나를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "핵염기 유사체"는 상보적 핵염기 또는 핵염기 유사체와 왓슨-크릭 수소 결합을 형성할 수 있는 치환되거나 또는 비치환된 질소-함유 모 헤테로방향족 고리를 지칭한다. 예시적인 핵염기 유사체는 7-데아자아데닌, 이노신, 네뷸라린, 니트로피롤, 니트로인돌, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 하이포크산틴, 슈도우리딘, 5-프로피닐시티딘, 이소시티딘, 이소구아닌, 7-데아자구아닌, 2-티오피리미딘, 6-티오구아닌, 4-티오티민, 4-티오우라실, O6-메틸 구아닌, N6-메틸 아데닌, O4-메틸 티민, 5,6-디히드로티민, 5,6-디히드로우라실, 4-메틸인돌, 에테노아데닌을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다. 추가의 예시적 핵염기 유사체는 문헌 [Fasman, 1989, Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, pp. 385-394, CRC Press, Boca Raton, Fla.] 및 이에 인용된 참조문헌에서 찾을 수 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "핵산단량체"는 (2) 제2 모이어티에 공유 연결된 (1) 염기를 포함하는 모이어티를 의미한다. 핵산단량체는 연결되어 핵산에서 서열 특이적 방식으로 표적 또는 상보적 염기 서열에 결합하는 올리고머를 형성할 수 있다. 핵산단량체는 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오시드 (예컨대, 히드록시메틸 치환된 핵산단량체)일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "형태적으로 제한된 핵산단량체", "형태적으로 제한된 뉴클레오티드"는 구별없이 사용될 수 있으며, 비시클릭 당 모이어티 (예컨대, 비시클릭 리보스)를 갖는 핵산단량체를 지칭하며, 여기서 당 모이어티의 C2' 및 C4'가 가교되거나 (예컨대, 단량체 R) 또는 C3' 및 C5'가 가교된다 (예컨대, 단량체 Q).
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "히드록시메틸 치환된 핵산단량체", "히드록시메틸 핵산단량체", "히드록시메틸 단량체", "비-시클릭 핵산단량체", "비-시클릭 단량체", "비-시클릭 히드록시메틸 치환된 핵산단량체"는 본원에 걸쳐 구별없이 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "RISC 길이" 또는 "RISC 길이 RNA 복합체"는 25개 미만의 염기 쌍을 갖는 핵산 분자를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "오버행" (예컨대, 3'-말단 오버행 또는 3' 오버행)은 모든 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드 (예컨대, 히드록시메틸 치환된 핵산단량체), 또는 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드의 조합을 함유할 수 있는 핵산 화합물의 쌍을 이루지 않은 영역을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "다이서 길이" 또는 "다이서 길이 RNA 복합체"는 25개 이상의 염기 쌍, 일반적으로, 25 내지 40개 염기 쌍을 갖는 핵산 분자를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "두 기능의 핵산 화합물" 또는 "두 기능의 RNA 복합체" 또는 "두 기능의 dsRNA"는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 핵산 화합물을 의미하며, 여기서 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 동일한 표적 RNA의 상이한 영역 (즉, 제1 영역 및 제2 영역)에 상보적이거나, 또는 각각 2개 이상의 상이한 표적 RNA의 영역에 상보적이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "시드 영역" 또는 "시드 서열"은 번역 및/또는 mRNA 분해의 억제에 의한 유전자 조절에 연루되는 마이크로RNA의 영역, 또는 마이크로RNA의 시드 영역에 유사한 siRNA에서의 가이드 가닥의 부분을 지칭한다.
"리보핵산" 또는 "RNA"는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같은, "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노스 모이어티의 2'-위치에 히드록실 기를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 RNA는 이중 가닥 (ds) RNA, 단일-가닥 (ss) RNA, 단리된 RNA (예를 들면, 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA), 변경된 RNA (자연 발생 RNA와 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 또는 변경에 의해 상이함), 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 이러한 변경된 RNA는 예를 들면, RNA 분자의 하나 또는 양 말단에서, 내부적으로 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서, 또는 그의 임의의 조합에서 비-뉴클레오티드 물질의 부가를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 RNA 분자 내의 뉴클레오티드는 또한 비-표준 뉴클레오티드, 예를 들면 자연 발생 뉴클레오티드, 비-자연 발생 뉴클레오티드, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 표준 뉴클레오티드 (즉, 본원에서 사용된 바와 같은 표준 뉴클레오티드는 아데닌, 시티딘, 구아니딘, 티미딘, 및 우리딘으로 고려됨)를 함유하는 RNA의 유사체 또는 유사체들로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "dsRNA" 및 "RNA 복합체"는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 분자를 포함하며, 예를 들어 RNA 간섭 ("RNAi") 또는 서열-특이적 방식으로 유전자 침묵을 촉진킴으로써 유전자 발현을 억제시키거나 또는 하향 조절시킬 수 있는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 본 개시내용의 dsRNA (mdRNA)는 RNAi에 의해 유전자 침묵을 매개하기 위한 RISC와의 회합 또는 다이서에 대한 적합한 기재일 수 있다. 본 개시내용의 dsRNA 분자의 예는 본원에 식별된 서열 목록에 제공된다. dsRNA의 하나 또는 양 가닥은 말단 포스페이트 기, 예를 들면 5'-포스페이트 또는 5', 3'-디포스페이트를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 dsRNA 분자는 하나 이상의 리보뉴클레오티드에 추가로, 치환, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 및 비-뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, dsRNA 분자는 뉴클레오티드 위치의 약 100% 이하의 리보뉴클레오티드를 포함한다.
추가로, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "RNAi"는 서열 특이적 RNA 간섭, 예를 들면 전사후 유전자 침묵, 번역적 억제, 또는 후생유전학(epigenetics)을 설명하기 위해 사용된 다른 용어에 동등할 의도가 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 dsRNA 분자는 유전자를 후생유전적으로 침묵시키기 위해 전사후 수준 또는 전사전 수준 또는 그의 임의의 조합에서 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "유전자"는 특히 RNAi에 대한 "표적 유전자" 또는 "유전자 표적"의 맥락에서, 메신저 RNA (mRNA, 또한 폴리펩티드를 코딩하기 위한 구조적 유전자로 지칭됨), 이러한 유전자의 mRNA 스플라이스 변이체, 기능적 RNA (fRNA), 또는 비-코딩 RNA (ncRNA), 예를 들면 소형 템포럴 RNA (stRNA), 마이크로RNA (miRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 인 RNA (snRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 전이 RNA (tRNA) 및 그의 전구체 RNA를 포함하는 상기 유전자의 RNA 또는 전사 생성물을 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 이러한 비-코딩 RNA는 기능적 또는 조절 세포 과정에 관여하는 표적 RNA의 활성을 변경하기 위해 dsRNA 매개된 RNAi에 대한 표적 핵산 분자로서의 역할을 할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "유전자 침묵"은 세포에서의 유전자 발현의 표적된 억제를 통한 부분적 또는 완전한 기능 상실을 지칭하며, 이는 또한 RNAi "넉다운(knockdown)", "억제", "하향-조절" 또는 표적 유전자의 발현의 "감소"로 지칭될 수 있다. 다루어지는 상황 및 생물학적 문제에 따라, 부분적으로 유전자 발현을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 유전자 발현을 되도록 많이 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 침묵의 정도는 본원에 기재되고 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다 (예컨대, PCT 공개 번호 WO 99/32619; 문헌 [Elbashir et al., EMBO J. 20:6877, 2001]을 참조함). 검정에 따라, 유전자 발현의 정량화는 mRNA 수준 또는 단백질 수준 또는 활성의 측면에서, 예를 들어 기준선 (즉, 정상)의 10%, 30%, 50%, 75% 90%, 95% 또는 99% 이상 또는 요법에 대해 표적된 특정 질환 상태 또는 다른 병태와 연관될 수 있는 상승된 발현 수준을 포함하는 다른 제어 수준으로 표적 유전자 발현을 넉다운할 수 있는, 예방적 및 치료적 방법을 포함하는 본 개시내용의 특정 실시양태에서 바람직할 수 있는 다양한 양의 억제의 검출을 가능하게 한다.
화학적 정의
추가로, 본원에 기재된 구조 및 치환기의 다양한 조합으로부터 유도된 개별 화합물, 또는 화합물의 군은 각각의 화합물 또는 화합물의 군이 개별적으로 개시된 것과 동일한 정도로 본원에 의해 개시되었다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 특정 구조 또는 특정한 치환기의 선택은 본 개시내용의 범주 내에 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 모든 값 범위는 나타낸 범위 내에 포함된다. 따라서, C1-C4의 범위는 1, 2, 3, 및 4의 값을 포함하여, C1, C2, C3 및 C4가 포함되도록 이해될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "알킬"은 1-22개 탄소 원자 (1, 2, 3, 4, 5 ,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22 탄소 원자)를 함유하는 포화, 분지형 또는 비분지형, 치환되거나 또는 비치환된 지방족 기를 지칭한다. 이 정의는 다른 기, 예를 들면 알콕시, 알카노일, 아르알킬, 및 하기 정의된 다른 기의 알킬 부분에 적용된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "시클로알킬"은 3 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 포화, 치환되거나 또는 비치환된 시클릭 알킬 고리를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "알케닐"은 2 내지 22개 탄소 원자 및 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화, 분지형 또는 비분지형, 치환되거나 또는 비치환된 알킬 또는 시클로알킬을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "알키닐"은 2 내지 22개 탄소 원자 및 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화, 분지형 또는 비분지형, 치환되거나 또는 비치환된 알킬 또는 시클로알킬을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "알콕시"는 산소 원자에 공유 결합된 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 또는 알키닐 기를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "알카노일"은 대안적으로 "아실"로 지칭될 수 있는 -C(=O)-알킬을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "알카노일옥시"는 -O-C(=O)-알킬 기를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "알킬아미노"는 기 -NRR'를 지칭하며, 여기서 R 및 R'은 각각 수소 또는 알킬 중 하나이고, R 및 R' 중 하나 이상은 알킬이다. 알킬아미노는 기, 예를 들면 피페리디노를 포함하며, 여기서 R 및 R'은 고리를 형성한다. 용어 "알킬아미노알킬"은 -알킬-NRR'를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "아릴"은 각각의 고리에 4 내지 12개의 원자의 임의의 안정한 모노시클릭, 비시클릭, 또는 폴리시클릭 탄소 고리계를 지칭하며, 여기서 하나 이상의 고리는 방향족이다. 아릴의 일부 예는 페닐, 나프틸, 테트라히드로-나프틸, 인다닐, 및 비페닐을 포함한다. 아릴 치환기가 비시클릭이고, 1개의 고리가 비-방향족인 경우, 부착은 방향족 고리에의 부착으로 이해된다. 아릴은 치환되거나 또는 비치환될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "헤테로아릴"은 각각의 고리에 4 내지 12개의 원자의 임의의 안정한 모노시클릭, 비시클릭, 또는 폴리시클릭 탄소 고리계를 지칭하며, 여기서 하나 이상의 고리는 방향족이며, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유한다. 헤테로아릴의 일부 예는 아크리디닐, 퀴녹살리닐, 피라졸릴, 인돌릴, 벤조트리아졸릴, 푸라닐, 티에닐, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 피라지닐, 피리다지닐, 피리디닐, 피리미디닐, 피롤릴, 및 테트라히드로퀴놀리닐을 포함한다. 헤테로아릴은 질소-함유 헤테로아릴의 N-옥시드 유도체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로시클릴"은 5 내지 22개의 원자의 방향족 또는 비방향족 고리계를 지칭하며, 여기서 1 내지 4개의 고리 원자는 산소, 질소, 및 황으로부터 선택된 헤테로원자이다. 따라서, 헤테로사이클은 헤테로아릴 또는 그의 디히드로 또는 테트라히드로 버전일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "아로일"은 방향족 카르복실산, 예를 들면 치환된 벤조산으로부터 유도된 아릴 라디칼을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "아르알킬"은 알킬 기에 결합된 아릴 기, 예를 들어 벤질 기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "카르복실"은 화학식 -C(=O)OH 또는 -C(=O)O-의 기를 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "카르보닐" 및 "아실"은 산소 원자가 탄소 원자에 이중 결합된 기 >C=O를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "히드록실"은 -OH 또는 -O-를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "니트릴" 또는 "시아노"는 -CN를 지칭한다. 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 플루오로 (-F), 클로로 (-Cl), 브로모 (-Br), 및 아이오도 (-I)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "시클로알킬"은 임의로 치환될 수 있는 3 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 포화 시클릭 탄화수소 고리계를 지칭한다. 예시적 실시양태는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 시클로알킬 기는 시클로프로필이다. 또 다른 실시양태에서, (시클로알킬)알킬 기는 시클릭 부분에서 3 내지 12개의 탄소 원자 및 알킬 부분에서 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유한다. 특정 실시양태에서, (시클로알킬)알킬 기는 시클로프로필메틸이다. 알킬 기는 할로겐, 히드록시 및 아미노로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "알카노일" 및 "알카노일옥시"는 각각 임의로 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 -C(O)-알킬 기 및 -O-C(=O)- 알킬 기를 각각 지칭한다. 알카노일 및 알카노일옥시 기의 구체적 실시양태는 각각 아세틸 및 아세톡시이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "알키닐"은 2 내지 10개의 탄소 원자 및 모 알킨의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화 분지형, 직쇄, 또는 시클릭 알킬 기를 지칭한다. 예시적인 알키닐은 에티닐, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 3-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 4-펜티닐, 1-옥티닐, 6-메틸-1-헵티닐, 2-데시닐 등을 포함한다. 알키닐 기는 치환되거나 또는 비치환될 수 있다.
용어 "히드록시알킬"는 단독 또는 조합으로 상기 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭하며, 여기서 1개 또는 다수의 수소 원자, 바람직하게는 1개의 수소 원자가 히드록실 기에 의해 대체되었다. 예는 히드록시메틸, 히드록시에틸 및 2-히드록시에틸을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "아미노알킬"은 기 -NRR'을 지칭하며, 여기서 R 및 R'은 독립적으로 수소 또는 (C1-C4) 알킬일 수 있다.
용어 "알킬아미노알킬"은 알킬 기를 통해 연결된 알킬아미노 기 (즉, 일반 구조 -알킬-NH-알킬 또는 -알킬-N(알킬)(알킬)을 갖는 기)를 지칭한다. 이러한 기는 모노- 및 디-(C1-C8 알킬)아미노C1-C8 알킬을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 여기서 각각의 알킬은 동일하거나 상이할 수 있다.
용어 "디알킬아미노알킬"은 알킬 기에 부착된 알킬아미노 기를 지칭한다. 예로는 N,N-디메틸아미노메틸, N,N-디메틸아미노에틸, N,N-디메틸아미노프로필 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 용어 디알킬아미노알킬은 또한 가교 알킬 모이어티가 임의로 치환된 기를 포함한다.
용어 "할로알킬"은 1개 이상의 할로 기로 치환된 알킬 기, 예를 들어 클로로메틸, 2-브로모에틸, 3-아이오도프로필, 트리플루오로메틸, 퍼플루오로프로필, 8-클로로노닐 등을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "카르복시알킬"은 치환기 -R10-COOH (여기서, R10은 알킬렌임)를 지칭하고, "카르브알콕시알킬"은 -R10-C(=O)OR11 (여기서, R10 및 R11은 각각 알킬렌 및 알킬임)을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자의 포화 직쇄형- 또는 분지형-쇄 히드로카르빌 라디칼, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, n-펜틸, 2-메틸펜틸, n-헥실 등을 지칭한다. 알킬렌은 기가 2가인 것을 제외하고는 알킬과 동일하다.
용어 "알콕시"는 산소 원자에 공유결합으로 연결된 치환된 및 비치환된 알킬, 알케닐 및 알키닐 기를 포함한다. 한 실시양태에서, 알콕시 기는 1 내지 약 10개의 탄소 원자를 함유한다. 알콕시 기의 실시양태는 메톡시, 에톡시, 이소프로필옥시, 프로폭시, 부톡시 및 펜톡시 기를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 치환된 알콕시 기의 실시양태는 할로겐화 알콕시 기를 포함한다. 추가 실시양태에서, 알콕시 기는 알케닐, 알키닐, 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 시아노, 아미노 (알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노 (알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티와 같은 기로 치환될 수 있다. 예시적인 할로겐 치환된 알콕시 기는 플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 트리플루오로메톡시, 클로로메톡시, 디클로로메톡시 및 트리클로로메톡시를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
용어 "알콕시알킬"은 알콕시 기로 치환된 알킬렌 기를 지칭한다. 예를 들어, 메톡시에틸 (CH3OCH2CH2-) 및 에톡시메틸 (CH3CH2OCH2-)은 양자 모두 C3 알콕시알킬 기이다.
본원에서 단독으로 또는 조합되어 사용된 바와 같은 용어 "아로일"은 방향족 카르복실산, 예컨대 임의로 치환된 벤조산 또는 나프토산으로부터 유도된 아릴 라디칼을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "아르알킬"은 알킬 기 (바람직하게는, 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유함)를 통해 2-피리디닐 고리 또는 4-피리디닐 고리에 결합된 아릴 기를 지칭한다. 바람직한 아르알킬 기는 벤질이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "카르복시"는 화학식 -C(=O)OH 또는 -C(=O)O-의 기를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "카르보닐"은 산소 원자가 탄소 원자에 이중 결합된 기 -C=O를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "트리플루오로메틸"은 -CF3을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "트리플루오로메톡시"는 -OCF3을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "히드록실"은 -OH 또는 -O-를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "니트릴" 또는 "시아노"는 -CN 기를 지칭한다.
본원에서 단독으로 또는 조합되어 사용된 바와 같은 용어 "니트로"는 -NO2 기를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "아미노"는 기 -NR9R9를 지칭하며, 여기서 R9는 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 알콕시 또는 헤테로아릴일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "아미노알킬"은 "아미노"와 비교하여 보다 상세한 선택을 나타내고, 기 -NR'R'를 지칭하며, 여기서 R'는 독립적으로 수소 또는 (C1-C4) 알킬일 수 있다. 용어 "디알킬아미노"는 동일하거나 상이할 수 있는 2개의 부착된 알킬 기를 갖는 아미노 기를 지칭한다.
용어 "알카노일아미노"는 기 -C(=O)- 다음에 -N(H)-를 함유하는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기, 예를 들어 아세틸아미노, 프로파노일아미노 및 부타노일아미노 등을 지칭한다.
용어 "카르보닐아미노"는 기 -NR'-CO-CH2-R'를 지칭하며, 여기서 R'는 독립적으로 수소 또는 (C1-C4) 알킬로부터 선택될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "카르바모일"은 -O-C(O)NH2를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "카르바밀"은 질소 원자가 카르보닐에 직접 결합된 관능기, 즉 -NR"C(=O)R" 또는 -C(=O)NR"R"에서와 같은 관능기를 지칭하며, 여기서 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클로 또는 헤테로아릴일 수 있다.
용어 "알킬술포닐아미노"는 기 -NHS(O)2R12를 지칭하며, 여기서 R12는 알킬이다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "할로겐"은 브로민, 염소, 플루오린 또는 아이오딘을 지칭한다. 한 실시양태에서, 할로겐은 플루오린이다. 또 다른 실시양태에서, 할로겐은 염소이다.
용어 "헤테로시클로"는 1개 이상의 탄소 원자-함유 고리에 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 4 내지 7원 모노시클릭 또는 7 내지 11원 비시클릭 고리계인 임의로 치환된, 불포화, 부분 포화 또는 완전 포화, 방향족 또는 비방향족 시클릭 기를 지칭한다. 헤테로시클로 고리 상의 치환기는 아릴 기에 대해 상기 주어진 것들로부터 선택될 수 있다. 헤테로원자를 함유하는 헤테로시클로 기의 각각의 고리는 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자를 가질 수 있다. 주어진 헤테로시클로 고리에서의 복수개의 헤테로원자는 동일하거나 상이할 수 있다.
예시적인 모노시클릭 헤테로시클로 기는 피롤리디닐, 피롤릴, 인돌릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 푸릴, 테트라히드로푸릴, 티에닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 아제피닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 테트라히드로피라닐, 모르폴리닐, 디옥사닐, 트리아지닐 및 트리아졸릴을 포함한다. 바람직한 비시클릭 헤테로시클로 기는 벤조티아졸릴, 벤족사졸릴, 벤조티에닐, 퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸릴, 인다졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 이소인돌리닐 및 테트라히드로퀴놀리닐을 포함한다. 보다 상세한 실시양태에서, 헤테로시클로 기는 인돌릴, 이미다졸릴, 푸릴, 티에닐, 티아졸릴, 피롤리딜, 피리딜 및 피리미딜을 포함할 수 있다.
2개 이상의 핵산 서열 간의 "동일성 퍼센트"는 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 개수의 함수이며 (즉, 동일성 % = 동일한 위치의 개수 / 위치의 총 개수 x 100), 이는 2개 이상의 서열의 정렬을 최적화하기 위해 도입될 필요가 있는 각각의 갭의 길이 및 갭의 개수를 고려한다. 서열의 비교 및 2개 이상의 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘, 예컨대 BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 그의 디폴트 파라미터에서 이용하여 달성될 수 있다 (예를 들어, BLASTN, 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990] 참조).
본원에서 사용된 바와 같은 "압타머" 또는 "핵산 압타머"는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 의미하며, 여기서 핵산 분자는 그의 천연 세팅으로 표적 분자에 의해 인식되는 서열을 포함하는 서열을 갖는다. 대안적으로, 압타머는 표적 분자에 결합하는 핵산 분자일 수 있으며, 여기서 표적 분자는 핵산에 자연적으로 결합하지 않는다. 표적 분자는 임의의 관심있는 분자일 수 있다. 예를 들어, 압타머는 단백질의 리간드-결합 도메인에 결합하는데 사용될 수 있으며, 이에 의해 단백질과 자연 발생 리간드의 상호작용을 방지한다. 이는 비제한적 예이고, 당업계에 일반적으로 공지된 기술을 이용하여 다른 실시양태를 용이하게 생성할 수 있다는 것을 당업자는 인식할 것이다 (예를 들어, [Gold et al., Annu. Rev. Biochem. 64:763, 1995]; [Brody and Gold, J. Biotechnol. 74:5, 2000]; [Sun, Curr. Opin. Mol. Ther. 2:100, 2000]; [Kusser, J. Biotechnol. 74:27, 2000]; [Hermann and Patel, Science 287:820, 2000]; 및 [Jayasena, Clinical Chem. 45:1628, 1999] 참조).
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치환된"은 동일하거나 상이할 수 있고 수소 치환기를 포함할 수 있는 하나 이상의 치환 또는 치환기를 갖는 원자를 지칭한다. 그러므로, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알카노일옥시, 알킬아미노, 알킬아미노알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 아로일 및 아르알킬은 치환된 변형을 포함하는 기를 지칭한다. 치환된 변형은 선형, 분지형 및 시클릭 변형, 및 기의 임의의 탄소 원자에 부착된 1개 이상의 수소를 대체하는 치환기 또는 치환기들을 갖는 기를 포함한다. 기의 탄소 원자에 부착될 수 있는 치환기는 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알카노일, 알카노일옥시, 알킬아미노, 알킬아미노알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클, 아로일, 아르알킬, 아실, 히드록실, 시아노, 할로, 할로알킬, 아미노, 아미노아실, 알킬아미노아실, 아실옥시, 아릴옥시, 아릴옥시알킬, 메르캅토, 니트로, 카르바밀, 카르바모일 및 헤테로사이클을 포함한다. 예를 들어, 용어 에틸은 제한없이 -CH2CH3, -CHFCH3, -CF2CH3, -CHFCH2F, -CHFCHF2, -CHFCF3, -CF2CH2F, -CF2CHF2, -CF2CF3, 및 상기 기재된 바와 같은 다른 변형을 포함한다. 대표적인 치환기는 -X, -R6, -O-, =O, -OR, -SR6, -S-, =S, -NR6R6, =NR6, -CX3, -CF3, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(=O)2O-, -S(=O)2OH, -S(=O)2R6, -OS(=O)2O-, -OS(=O)2OH, -OS(=O)2R6, -P(=O)(O-)2, -P(=O)(OH)(O-), -OP(=O)2(O-), -C(-O)R6, -C(=S)R6, -C(=O)OR6, -C(=O)O-, -C(=S)OR6, -NR6-C(=O)-N(R6)2, -NR6-C(=S)-N(R6)2 및 -C(=NR6)NR6R6을 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 할로겐이고; 각각의 R6은 독립적으로 수소, 할로겐, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 아릴아릴, 아릴헤테로알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, NR7R7, -C(=O)R7 및 -S(=O)2R7이고; 각각의 R7은 독립적으로 수소, 알킬, 알카닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 아릴헤테로알킬, 아릴아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이다. 치환기를 함유하는 아릴은, 하나 이상의 치환을 갖든 갖지 않든, 파라 (p-), 메타 (m-) 또는 오르토 (o-) 입체형태, 또는 그의 임의의 조합으로 부착될 수 있다. 일반적으로, 치환기는 임의의 원자 또는 원자들의 기로 추가로 치환될 수 있다.
오직 예시 목적으로, 가닥에서의 핵산단량체의 위치는 아래와 같이 기재될 수 있으며, 여기서 X는 임의의 유형의 핵산단량체 (예를 들어, 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오티드, RNA, DNA, 히드록시메틸 치환된 핵산단량체 또는 형태적으로 제한된 핵산단량체)를 나타내고, 숫자는 가닥에서의 상기 핵산단량체의 위치를 나타낸다. 예를 들어, X1은 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 하기 가닥의 위치 1을 나타내고, X7은 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 하기 가닥의 위치 7을 나타낸다. 대안적으로, X1, X2 및 X3은 하기 가닥의 5'-말단에서의 마지막 3개의 위치를 나타내고, X1 내지 X10은 가닥의 5'-말단에서의 마지막 10개의 위치를 나타낸다. Xn은 위치 11 내지 60 (또는 n = 1 내지 60)을 나타낼 수 있으며, 그러므로 n이 20 (또는 X20)인 경우, 이는 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 가닥의 위치 20을 나타낸다.
Figure pct00021
가닥에서의 핵산단량체의 위치를 확인하기 위해 가닥의 3'-말단으로부터 계수함으로써 동일한 접근법을 취할 수 있다 (하기 나타낸 예시 가닥). 하기 가닥의 경우, 가닥에서의 핵산단량체의 위치는 아래와 같이 기재될 수 있으며, 여기서 X는 임의의 유형의 핵산단량체 (예를 들어, 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오티드, RNA, DNA, 히드록시메틸 치환된 핵산단량체 또는 형태적으로 제한된 핵산단량체)를 나타내고, 숫자는 가닥에서의 상기 핵산단량체의 위치를 나타낸다. 예를 들어, X1은 가닥의 3'-말단으로부터 계수하여 하기 가닥의 위치 1을 나타내고, X7은 가닥의 3'-말단으로부터 계수하여 하기 가닥의 위치 7을 나타낸다. 대안적으로, X1, X2 및 X3은 하기 가닥의 3'-말단에서의 마지막 3개의 위치를 나타내고, X1 내지 X10은 가닥의 3'-말단에서의 마지막 10개의 위치를 나타낸다. Xn은 위치 11 내지 60 (또는 n = 1 내지 60)을 나타낼 수 있으며, 그러므로 n이 20 (또는 X20)인 경우, 이는 가닥의 3'-말단으로부터 계수하여 가닥의 위치 20을 나타낸다.
Figure pct00022
대안적 실시양태
본원에서 인용된 모든 간행물, 비특허 간행물, 참고문헌, 특허, 특허 공보, 특허 출원 및 기타 문헌은 각각 그 전문이 구체적으로 본원에 참고로 포함된다.
본 개시내용이 특정 실시양태에 관하여 기재되고 많은 세부사항이 예시 목적으로 제시되어 있으나, 본 개시내용이 추가 실시양태를 포함하고 본원에 기재된 세부사항 중 일부는 본 개시내용으로부터 벗어나지 않으면서 상당히 변형될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 개시내용은 이러한 추가 실시양태, 변형물 및 등가물을 포함한다. 특히, 본 개시내용은 다양한 예시적 성분 및 예의 특징, 용어 또는 요소의 임의의 조합을 포함한다.
대안물, 예를 들어 "또는"의 사용은 하나의 대안물, 양자 모두, 또는 그의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "a" 및 "an"은 "하나 이상"의 나열된 성분을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 개시내용의 기술에서 및 청구항에서 용어 "a", "an", "the" 및 유사한 용어를 본원에서 사용하는 것은 단수 및 복수 양자 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
용어 "포함하는", "갖는", "보유하는" 및 "함유하는"은 예를 들어 "포함하나 이에 제한되지 않는"을 의미하는 확장 가능(open-ended) 용어로서 해석되어야 한다. 그러므로, "포함하는", "갖는", "보유하는" 및 "함유하는"과 같은 용어는 배타적이 아닌 포괄적인 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "보유하다" 및 "포함하다"는 확장 가능하고 동의어로 사용된다.
본원에서 값의 범위의 인용은, 범위 내의 값의 일부가 분명히 인용되든 인용되지 않든 값이 개별적으로 본원에 인용된 것처럼, 범위 내에 포함되는 각각의 및 임의의 별개의 값을 개별적으로 지칭한다. 예를 들어, 범위 "4 내지 12"는 제한없이 값 5, 5.1, 5.35, 및 4 또는 4 초과 및 12 또는 12 미만의 임의의 다른 범자연수, 정수, 분수 또는 유리수 값을 포함한다. 본원에서 사용된 특정한 값은 예시로서 이해되고 개시내용의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 탄소 원자의 개수의 범위의 인용은, 범위 내의 값의 일부가 분명히 인용되든 인용되지 않든 값이 개별적으로 본원에 인용된 것처럼, 범위 내에 포함되는 각각의 및 임의의 별개의 값을 개별적으로 지칭한다. 예를 들어, 용어 "C1-24"는 제한없이 종 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23 및 C24를 포함한다.
본원에서 제공된 전문 용어의 정의는 당업자에게 공지된 이들 용어와 관련된 의미를 인용없이 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 개시내용의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 본원에서 제공된 전문 용어의 정의는 당업계에서의 대안적 정의, 또는 대안적 정의가 본원에서 제공된 정의와 충돌하는 정도로 본원에 참고로 도입된 정의보다 우위를 차지하는 것으로 해석될 수 있다.
본원에서 제공된 실시예, 및 본원에서 사용된 예시적인 표현은 단지 예시 목적을 위한 것이고, 개시내용의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
예시의 목록, 에컨대 본 개시내용에 적합한 화합물 또는 분자의 목록이 제공된 경우, 나열된 화합물 또는 분자의 혼합물이 또한 적합하다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
실시예 1
2,2'- 안히드로 -5- 메틸우라실의 합성
5-메틸 우리딘 (56.0 g, 217 mmol) 및 디페닐 카르보네이트 (69.7 g, 325 mmol)를 DMF (250 mL)에 용해시킨 후, 중탄산나트륨 (1.82 g, 22 mmol)을 용액에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 오일조에 침지시키고, CO2 발생의 정지가 관찰될 때까지 2.5-3시간 동안 110℃에서 교반하면서 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 절반 부피로 농축시킨 후, 급속히 교반하는 디에틸 에테르 (800 mL)에 천천히 부어, 백색 고체를 생성시켰다. 에테르를 기울여 따라낸 후, 백색 고체를 추가의 신선한 에테르 (3 x 500 mL)로 세척하였다. 생성된 고체를 여과하고, 에테르로 세척하였다. 단리된 백색 고체를 고온의 메탄올 (250 mL)에 용해시키고 용액을 실온으로 냉각시킴으로써 최종 침전을 수행하였다. 에테르 (250 mL)를 첨가하여 생성물을 침전시킨 후, 0℃에서 밤새 냉각시켰다. 백색 고체를 여과에 의해 단리하고, 고진공 상에서 건조시켜, 2,2'-안히드로-5-메틸우라실 (39.2 g, 75%)을 백색 분말로서 생성시켰다.
실시예 2
1-[5-O-(4- 메톡시트리틸 )-2- 데옥시 -2-비닐-β-D-리보- 펜토푸라노실 ]-티민의 합성
아세톤 (700 mL) 중 2,2'-안히드로-5-메틸우라실 (41.0 g, 171 mmol), p-토스산 일수화물 (32.5 g, 171 mmol) 및 NaI (25.6 g, 171 mmol)의 현탁액을 55℃에서 4시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 생성된 침전물을 여과하고, 아세톤으로 세척하였다. 수집된 여과물을 대략 20% 부피로 농축시켰다. 그 후, 포화 Na2S2O3 (50 mL)을 대략 5 mL씩 나누어 첨가하고, 혼합물을 진탕하고, 갈색빛 용액이 연황색 용액으로 흐릿해질 때까지 초음파처리하였다. 생성된 침전물을 여과하고, 단리된 여과물을 진공에서 농축시켜, 황색 고무질 발포체를 얻었다. 그 후, 잔류물을 아세토니트릴 (350 mL)에 용해시킨 후, 여과에 의해 추가의 백색 침전물을 제거하였다. 단리된 여과물을 진공에서 농축시켜, 조질 1-(2-데옥시-2-아이오도-β-D-리보푸라노실)-5-메틸우라실을 황색 발포체 (62.2 g, 조질)로서 얻었다. 조질 1-(2-데옥시-2-아이오도-β-D-리보푸라노실)-5-메틸우라실 (62.2 g, 169 mmol)을 무수 피리딘 (800 mL)에 용해시키고, 4-메톡시트리틸클로라이드 (57.4 g, 186 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 질소하에 교반하였다. 용액을 진공에서 농축시킨 후, EtOAc (400 mL) 및 물 (400 mL) 사이에 분배하였다. 분리 후, 수성 층을 추가의 EtOAc (400 mL)로 세척하였다. 합한 유기 상을 염수 (400 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 증발시켜 건조시켰다. 생성된 포말성 갈색 잔류물을 고진공하에 밤새 건조시켜, 115.9 g의 조질 중간체 1-[5-O-(4-메톡시트리틸)-2-데옥시-2-아이오도-β-D-리보푸라노실] 5-메틸우라실을 제공하였다. 이러한 조질 물질 (115.9 g, 181 mmol)을 톨루엔 (1.5 L)에 용해시킨 후, DMAP (6.63 g, 54 mmol) 및 TEA (75 mL, 543 mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 질소하에 10분 동안 교반한 후, 첨가 깔때기를 통해 클로로디메틸비닐실란 (75 mL, 543 mmol)을 적가하였다.
반응물을 질소하에 실온에서 1시간 동안 교반한 후, MeOH (20 mL)를 첨가하여 켄칭하였다. 용액을 추가 10분 동안 교반한 후, 혼합물을 반고체 잔류물로 증발시킨 후, 이를 EtOAc (1600 mL) 및 냉 염수 (1800 mL) 사이에 분배하였다. 분리 후, 유기 층을 추가의 냉 염수 (1800 mL)로 세척하였다. 그 후, 합한 수성 층을 EtOAc (500 mL)로 역추출하였다. 합한 유기 상을 냉 염수 (1 L)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켜, 조질 중간체 1-[5-O-(4-메톡시트리틸)-2-데옥시-2-아이오도-3-(디메틸)비닐실릴-β-D-리보-펜토푸라노실]-티민 3 (112 g)을 갈색 발포체로서 얻었다. 비닐 전이 반응을 위해 이 물질을 그 상태 그대로 사용하여, 1-[5-O-(4-메톡시트리틸)-2-데옥시-2-비닐-β-D-리보-펜토푸라노실]-티민 4 를 생성시켰다.
벤젠 (1.7 L) 중 조질 화합물 3 (125.7 g, 173.4 mmol)의 용액에 2,2'-아조비스(2-메틸프로프리오니트릴) (17.09 g, 104 mmol) 및 헥사메틸이주석 (25.18 mL, 121.42 mmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 오일조에 침지시키고, 2.5시간 동안 환류하에 교반하면서 가열한 후, 가열로부터 혼합물을 제거하고, 실온으로 냉각시켰다. 그 후, 추가의 2,2'-아조비스(2-메틸프로프리오니트릴) (8.55 g, 52.04 mmol) 및 헥사메틸이주석 (12.59 mL, 60.71 mmol)을 첨가하고, 반응물을 환류로 다시 가열하였다. 추가 2.5시간 동안 교반한 후, 가열로부터 혼합물을 제거하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 그 후, 반응물을 진공에서 농축시키고, THF (1.7 L)에 용해시켰다. THF 중 테트라부틸암모늄플루오라이드 (1 M, 260.19 mL, 260.19 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 후, THF를 증발시켜, 260.31 g의 조질 반응 혼합물을 생성시켰다. 조질 물질을 SiO2 크로마토그래피 (50/50 EtOAc/Et2O)에 의해 정제하여, 화합물 4 (23.4 g, 25%)를 수득하였다. ES/MS (M-H) m/z: 539.
실시예 3
1-[3-O-벤질-2- 데옥시 -2-비닐-β-D-리보- 펜토푸라노실 ] 티민의 합성
화합물 4 (22.5 g, 42 mmol)를 THF (140 mL)에 질소하에 용해시키고, 빙조에서 -10℃로 냉각시킨 후, 수소화나트륨 (미네랄 오일 중 60% 분산액) (5.0 g, 125 mmol)을 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 교반한 후, 벤질 브로마이드 (4.95 mL, 42 mmol)를 천천히 적가하였다. -10℃에서 1시간 동안 계속 교반한 후, 반응 용기를 18시간 동안 4℃에서 계속 교반하였다. 반응의 진행을 LCMS로 모니터링하였다 (하기 스펙트럼 참조). 그 후, 반응 혼합물을 여전히 냉각 상태 동안 물 (5 mL 적가)로 켄칭한 후, EtOAc (150 mL) 및 물 (150 mL)을 첨가하였다. 상 분리시, 수성 층을 EtOAc (100 mL)로 역추출하였다. 합한 유기 상을 포화 NaHCO3 (200 mL), 물 (200 mL), 염수 (200 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜, 27.6 g의 조질 생성물 1-[5-O-(4-메톡시트리틸)-3-O-벤질-2-데옥시-2-비닐-β-D-리보-펜토푸라노실] 티민을 제공하였다. 이 물질을 직접 EtOAc (70 mL)에 용해시키고, 빙조에서 0℃로 냉각시킨 후, EtOAc (200 mL) 중 1 M HCl을 첨가하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 210 mL의 2 M NaOH로 천천히 중화시키고, 상 분리 후 유기 층을 염수 (200 mL)로 세척하고, 건조시키고 농축시켰다. 조질 생성물을 SiO2 크로마토그래피 (10%-60% ACN/DCM v/v)에 의해 정제하여, 1-[3-O-벤질-2-데옥시-2-비닐-β-D-리보-펜토푸라노실] 티민 5 를 백색 발포체 (7.75g, 53%)로서 얻었다. ES/MS (M-H) m/z: 357.
실시예 4
1-[3-O-벤질-4-C- 히드록시메틸 -2- 데옥시 -2-비닐-β-D-리보- 펜토푸라노실 ] 티민의 합성
DCM (145 mL) 중 데스-마르틴 퍼아이오디난 (11.0 g, 26 mmol)의 용액을 0℃에서 DCM (145 mL) 중 알콜 5 의 용액에 첨가하고, 혼합물을 2.5시간 동안 강력 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 DCM (100 mL) 및 4% aq. Na2S2O3 (400 mL)로 희석시킨 후, 15분 동안 교반하였다. 분리 후, 수성 층을 DCM (200 mL)으로 역추출하고, 합한 유기 상을 포화 NaHCO3 (400 mL), 염수 (400 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 건조시켰다. 생성된 백색 발포체를 1,4-디옥산 (145 mL)에 용해시켰다. 포름알데히드 (37% aq. 용액) (25 mL, 325 mmol) 및 수산화나트륨 용액 (65 mL, 2 M)을 첨가하고, 혼합물을 15시간 동안 강력 교반하였다. 포화 NaHCO3 (20 mL/1.5 g의 알콜 5 )을 첨가하고, 5분 동안 교반한 후 현탁액을 증발시켜 건조시키고, 현탁시키고 (초음파처리에 의해), 아세토니트릴 (150 mL)과 공증발시키고, 메탄올 (100 mL)에 현탁시키고, 실리카 겔 상에서 증발시켰다. 잔류물을 얇은 셀라이트 패드 상에 로딩하고, 생성물을 1 L의 DCM:MeOH=7:3으로 여과시켜 예비-정제하였다. 생성물을 SiO2 겔 크로마토그래피 (0-15% MeOH/DCM)에 의해 정제하여, 1-[3-O-벤질-4-C-히드록시메틸-2-데옥시-2-비닐-β-D-리보-펜토푸라노실] 티민 6 을 백색 발포체 (5.5 g, 67%)로서 수득하였다. ES/MS (M-H) m/z: 387.
실시예 5
1-[4',5'-(1,1,3,3- 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-3-O-벤질-2- 데옥시 -2-비닐-β-D-리보- 펜토푸라노실 ] 티민의 합성
디올 6 (5.5 g, 14 mmol)을 무수 피리딘 (50 mL)에 용해시키고, 1,3-디클로로-1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산 (6.33 mL, 20.0 mmol)을 실온에서 N2 분위기하에 적가하였다. 3시간 동안 계속 교반한 후, 용매를 감압하에 제거하고, 잔류물을 EtOAc 및 포화 NaHCO3 사이에 분배하였다. 수성 층을 EtOAc로 역추출하고, 합한 유기 층을 물, 염수로 세척하고, 건조시키고, 증발시켜 건조시켰다. 조질 생성물을 SiO2 겔 크로마토그래피 (0-60% EtOAc/헥산 v/v)에 의해 정제하여, 1-[4',5'-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-3-O-벤질-2-데옥시-2-비닐-β-D-리보-펜토푸라노실] 티민 7 을 백색 발포체 (7.7 g, 86%)로서 생성시켰다. ES/MS (M-H) m/z: 630.
실시예 6
1-[4',5'-(1,1,3,3- 테트라이소프로필디실록산 -1,3- 디일 )-3-O-벤질-2- 데옥시 -2-히 드록시메 틸-β-D-리보- 펜토푸라노실 ] 티민의 합성
건조 CH2Cl2 (63 mL) 중 화합물 7 (2 g, 3.17 mmol)의 용액을 드라이아이스/아세톤조에서 -78℃로 냉각시켰다. 냉각된 용액을 통해 오존 함유 공기를 60분 동안 버블링시켰다 (5 SCFH의 압축 공기 유량 및 12.5 mmol/h 또는 0.6 g/h의 O3 생산율). 그 후, 용액을 MeOH (63 mL) 중 수소화붕소나트륨 (0.959 g, 25.4 mmol)의 냉각된 혼합물 (0℃)에 첨가하고, 20분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응물을 시트르산 (2.4 g, 12.7 mmol)으로 켄칭하고, 진공에서 증발시켜 건조시켰다. 조질 잔류물을 EtOAc (60 mL)에 용해시키고, 물 (2 x 60 mL)로 세척하였다. 합한 수성 상을 EtOAc (40 mL)로 역추출한 후, 합한 유기 층을 염수 (60 mL)로 세척하고, 후속적으로 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 백색 필름으로 증발시켰다. 조질 물질을 실리카 겔 크로마토그래피 (20%-80% EtOAc/헥산 v/v)에 의해 정제하여, 화합물 1-[4',5'-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일)-3-O-벤질-2-데옥시-2-히드록시메틸-β-D-리보-펜토푸라노실] 티민 8 (1.01 g, 50%)을 수득하였다. ES/MS (M-H) m/z: 633. 또한 화합물 8 의 합성에 대해 60%의 수율을 얻었다.
실시예 7
1-[3-O-벤질-4-C- 히드록시메틸 -2- 데옥시 -2- 아세톡시메틸 -β-D-리보- 펜토푸라노실 ] 티민의 합성
건조 피리딘 (30 mL) 중 화합물 8 (1.72 g, 2.72 mmol)의 용액에 아세트산 무수물 (0.31 mL, 3.26 mmol)을 질소 분위기하에 적가하였다. 밤새 실온에서 계속 교반하였다. 용매를 진공에서 제거하고, 잔류물을 EtOAc (150 mL) 및 포화 NaHCO3 (150 mL) 사이에 분배하였다. 수성 층을 추가의 EtOAc (100 mL)로 역추출하고, 합한 유기 층을 물 (100 mL), 염수 (100 mL)로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 증발시켜 건조시켰다. 조질 생성물을 SiO2 칼럼 크로마토그래피 (10%-60% EtOAc/헥산 v/v)에 의해 정제하여, 중간체 아세테이트 (1.28 g, 70%)를 백색 발포체로서 얻었다. 정제된 아세틸화 화합물 8 (1.28 g, 1.9 mmol)을 실온에서 완충된 TBAF (THF 중 1 M AcOH (50 mL)를 THF 중 1 M TBAF (50 mL)에 첨가함으로써 제조함)에 용해시켰다. 1시간 교반 후, 용매를 감압하에 제거하고, 잔류물을 SiO2 칼럼 크로마토그래피 (0-5% MeOH/DCM) 상에서 정제하여, 1-[3-O-벤질-4-C-히드록시메틸-2-데옥시-2-아세톡시메틸-β-D-리보-펜토푸라노실] 티민 9 (0.63 g, 77%)를 회백색 발포체로서 수득하였다. ES/MS (M-H) m/z: 433.
실시예 8
(1R,3R,4R,8S)-1- 벤조일옥시메틸 -8- 벤질옥시 -3-(티민-1-일)-2,6- 디옥사비시 클로[3,2,1] 옥탄의 합성
무수 피리딘 (15 mL) 중 화합물 9 (0.64 g, 1.46 mmol)의 용액에 메탄술포닐 클로라이드 (0.25 mL, 3.22 mmol)를 질소 분위기하에 실온에서 적가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 잔류물을 EtOAc (100 mL) 및 포화 NaHCO3 (80 mL) 사이에 분배하였다. 수성 층을 EtOAc (60 mL)로 역추출하고, 합한 유기 상을 물 (100 mL) 및 염수 (100 mL)로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 검으로 농축시켰다. 조질 생성물을 아세토니트릴 (2 x 50 mL)로부터 공증발시켰고, 다음 단계를 위한 추가의 정제 없이 사용하였다. 조질 비스메실레이트를 디옥산/물 혼합물 (15 mL)에 용해시키고, 2 M 수산화나트륨 (15 mL)을 첨가하였다. 실온에서 20분 교반한 후에, 반응 용기를 오일조로 이동시키고 60℃에서 1시간 동안 가열하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 잔류물을 EtOAc (100 mL) 및 포화 NaHCO3 (80 mL) 사이에 두었다. 수성 층을 추가의 EtOAc (2 x 40 mL)로 역추출한 후, 합한 유기 상을 염수 (100 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시켜 건조시켰다. 조질 생성물을 SiO2 크로마토그래피 (0-10% DCM 중 MeOH v/v)로 정제하여 폐환 비시클릭 중간체 (0.59 g, 89%)를 백색 발포체로서 수득하였다. 비시클릭 중간체 (0.715 g, 1.6 mmol)를 DMF (60 mL)에 용해시키고, 벤조산나트륨을 첨가하였다 (0.68 g, 4.7 mmol). 용액을 5시간 동안 130℃까지 가열시킨 후, 밤새 실온까지 냉각되도록 하였다. 고체 물질을 여과에 의해 제거하고 DMF로 철저히 세척하였다. 합한 세척액을 진공에서 갈색빛 고체로 농축시켰다. 고체 물질을 DCM (100 mL)에 용해시키고 추가의 침전물을 여과로 제거하였다. 분리된 물질을 실리카 겔 크로마토그래피 (2%-5% DCM 중 MeOH v/v)로 정제하여 (1R,3R,4R,8S)-1-벤조일옥시메틸-8-벤질옥시-3-(티민-1-일)-2,6-디옥사비시클로[3,2,1] 옥탄 10 (0.70 g, 93%)을 백색 발포체로서 얻었다. ES/MS (M-H) m/z: 477.
실시예 9
(1S,3R,4R,8S)-8-히드록시-1-(4,4'- 디메톡시트리틸옥시메틸 )-3-(티민-일)-2,6-디 옥사비시 클로[3,2,1] 옥탄의 합성
1:1 THF/물 (12 mL) 중 화합물 10 (0.43 g, 0.9 mmol)의 용액에 2 M NaOH (3 mL)를 첨가하였다. 탁한 용액을 실온에서 90분 동안 교반한 후, AcOH (0.5 mL)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 진공에서 고체로 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피 (5%-10% MeOH/DCM v/v)로 정제하여 중간체 (1S,3R,4R,8S)-8-벤질옥시옥시-1-히드록시메틸-3-(티민-일)-2,6-디옥사비시클로[3,2,1] 옥탄 (0.29 g, 77%)을 백색 발포체로서 수득하였다. 상기 물질을 MeOH (8 mL)에 용해시킨 후, 포름산암모늄 (0.14 g, 2.3 mmol) 및 Pd(OH)2/C (0.125 g)를 첨가하였다. 현탁액을 3시간 동안 환류로 가열한 후, 실온까지 냉각되도록 하였다. 냉각된 용액을 셀라이트의 베드를 통해 여과시킨 후, 추가의 MeOH (100 mL)로 철저히 세척하였다. 여과물을 발포체 (0.22g)로 농축시키고 건조시켰다. 그 후, 조질 뉴클레오시드를 무수 피리딘 (15 mL)에 용해시키고, DMTrCl (0.34 g, 1.0 mmol)을 첨가하였다. 용액을 질소 분위기하에 밤새 교반한 후, 진공에서 점성 물질로 농축시켰고, 이를 EtOAc (60 mL) 및 염수 (100 mL) 사이에 분배하였다. 유기 층을 추가의 염수 (100 mL)로 세척한 다음, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 조질 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피 (5%-10% 구배의 MeOH/DCM v/v)로 정제하여 (1S,3R,4R,8S)-8-히드록시-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(티민-일)-2,6-디옥사비시클로[3,2,1] 옥탄 11 (0.4g, 88%)을 백색 발포체로서 얻었다. ES/MS (M-H) m/z: 585.
실시예 10
(1S,3R,4R,8S)-8-히드록시-1-(4,4'- 디메톡시트리틸옥시메틸 )-3-(티민-일)-2,6-디 옥사비시 클로[3,2,1] 옥탄의 합성
대안적 실시양태에서, (1S,3R,4R,8S)-8-히드록시-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(티민-일)-2,6-디옥사비시클로[3,2,1] 옥탄 11 은 다음과 같이 제조될 수 있다:
Figure pct00023
(1S,3R,4R,8S)-8-히드록시-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(티민-일)-2,6-디옥사비시클로[3,2,1] 옥탄 11 로의 상기 경로는 역방향 폐환을 수행하여 이로써 이동된 메실레이트가 상기 기재된 바와 같이 4'-위치가 아니라 2'-위치에 자리잡게 함으로써 달성될 수 있다. 화합물 8 을 표준 조건을 사용하여 2'-히드록시메틸에서 메실화시킨다. 그 후, TIPS 기를 완충된 TBAF를 사용하여 제거한 후, 수산화나트륨을 반응 혼합물에 바로 첨가한다. 가열시, 2' 메실레이트는 4' 히드록시메틸 기로 순조롭게 대체되어 화합물 16 을 높은 수율로 제공한다. 상기 물질은 이제 수소화에 이어서 트리틸화에 의해 화합물 11 로 바로 용이하게 전환될 수 있다. 상기 경로는 화합물 11 의 수율을 대폭 증가시킨다.
실시예 11
(1S,3R,4R,8S)-8- 벤질옥시옥시 -1- 히드록시메틸 -3-(티민-일)-2,6- 디옥사비시 클로[3,2,1] 옥탄
무수 피리딘 (30 mL) 중 화합물 8 (1.0 g, 1.58 mmol)의 용액에 메실클로라이드 (0.16 mL, 2.05 mmol)를 적가하였다. 반응물을 3시간 동안 질소 베드하에 실온에서 교반하였다. 반응물을 MeOH (2 mL)의 첨가에 의해 켄칭한 후, 농축시켜 건조시켰다. 생성된 조질 물질을 EtOAc (80 mL) 및 포화 NaHCO3 (80 mL) 사이에 분배하였다. 수성 상을 추가의 EtOAc (60 mL)로 추출하고, 합한 유기 상을 물 (80 mL), 염수 (80 mL)로 세척한 후, 건조시키고 (Na2SO4), 진공에서 농축시켰다. SiO2 (20%-80% EtOAc/헥산)에 의한 정제로 0.94 g의 중간체 메실레이트 84%를 수득하였다. 상기 물질을 19 mL의 0.5 M 완충된 TBAF (1 M HOAc)에 용해시키고, 30분 동안 실온에서 교반하였다. 그 후, 2 M 수산화나트륨 (9 mL)을 반응물에 첨가한 후, 이를 60℃로 90분 동안 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시킨 후, 건조시까지 농축시켰다. 잔류물을 MeOH (20 mL)에 현탁시키고, SiO2 (12 g) 상에서 건조시켰다. 정제 (0-10% MeOH/DCM)로 (1S,3R,4R,8S)-8-벤질옥시옥시-1-히드록시메틸-3-(티민-일)-2,6-디옥사비시클로[3,2,1] 옥탄 16 (0.35 g, 71%)을 백색 발포체로서 얻었다.
실시예 12
(1S,3R,4R,8S)-1-(4,4'- 디메톡시트리틸옥시메틸 )-3-(티민-일)-2,6 디옥사비시클로 [3,2,1] 옥탄 8-O-(2- 시아노에틸 -N,N- 디이소프로필포스포로아미다이트의 합성
무수 DCM (40 mL)에 화합물 11 (0.48 g, 0.82 mmol)을 질소하에 실온에서 용해시키고, 디이소프로필에틸 아민 (0.86 mL, 4.91 mmol)을 첨가한 후, 2-시아노에틸-N,N'-디이소프로필클로로포스포르아미다이트 (0.55 mL, 2.46 mmol)를 적가하였다. 6시간 동안 교반한 후에, 반응 혼합물 EtOAc (100 mL)로 희석시키고, 포화 NaHCO3 (80 mL)로 세척하였다. 수성 상을 EtOAc (100 mL)로 역추출하고, 합한 유기 상을 염수 (150 mL)로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4) 농축시켰다. 조질 생성물을 SiO2 칼럼 크로마토그래피 (0.5%의 TEA를 갖는 66% Hex/EtOAc v/v 내지 0.5%의 TEA를 갖는 66% EtOAc/헥산 v/v의 구배)를 사용하여 정제하여 (1S,3R,4R,8S)-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(티민-일)-2,6-디옥사비시클로[3,2,1] 옥탄 8-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포로아미다이트 12 (0.496g ,77%)를 백색 발포체로서 얻었다. ES/MS (M-H) m/z: 785.
실시예 13
(1S,3R,4R,8S)-8- 트리에틸실릴옥시 -1-(4,4'- 디메톡시트리틸옥시메틸 )-3-( N 4 -티민-일)-2,6- 디옥사비시클로 [3,2,1] 옥탄의 합성
DMF (5 mL)에 화합물 11 을 용해시키고, 이미다졸 (0.24 g, 3.4 mmol)을 첨가한 후, TESCl (0.29 g, 1.7 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 질소하에 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 그 후, 혼합물을 EtOAc (50 mL)로 희석시키고, 포화 NaHCO3 (40 mL)로 세척하였다. 수성 상을 EtOAc (50 mL)로 역추출하고, 합한 유기 상을 염수 (100 mL)로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 농축시켰다. 조질 생성물을 SiO2 칼럼 크로마토그래피 (0-60% EtOAC/헥산 v/v)를 사용하여 정제하여 (1S,3R,4R,8S)-8-트리에틸실릴옥시-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(N4-티민-일)-2,6-디옥사비시클로[3,2,1] 옥탄 13 (0.535, 90%)을 무색 오일로서 얻었다. ES/MS (M-H) m/z: 699.
실시예 14
(1S,3R,4R,8S)-8- 트리에틸실릴옥시 -1-(4,4'- 디메톡시트리틸옥시메틸 )-3-( N 4 -벤조일-5- 메틸 시토신-일)-2,6- 디옥사비시클로 [3,2,1] 옥탄의 합성
오븐 건조된 질소 플러싱한 플라스크를 1,2,4-트리아졸 (1.77g, 25.6 mmol) 및 무수 아세토니트릴 (50 mL)로 충전하였다. 1,2,4-트리아졸을 용해시킨 후, 반응 혼합물을 빙조에서 0℃까지 냉각시켰다 (트리아졸이 침전됨). POCl3 (0.53 mL, 5.73 mmol)를 적가하고, 0℃에서 10분 동안 교반을 계속하였다. 그 후, 조 온도를 0℃에서 유지하면서 트리에틸아민 (4.1 mL, 30 mmol)을 적가하고, 반응 혼합물을 추가의 30분 동안 교반하였다. 그 후, 아세토니트릴 (15 mL) 중 화합물 13 (0.53, 0.76 mmol)을 천천히 적가하고, 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙조로부터 제거하고, 질소 분위기하에 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 그 후, 혼합물을 그 부피가 대략 50%가 될 때까지 농축시키고, 포화 NaHCO3 (50 mL) 및 EtOAc (60 mL) 사이에 분배하였다. 분리 후에, 수성 상을 EtOAc (40 mL)로 역추출하고, 합한 유기 상을 물 (100 mL), 염수 (100 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 유성 잔류물로 농축시켰다. 잔류물을 디옥산 (12.5 mL)에 용해시키고, 농축 수성 암모니아 (5 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반한 후, 용매를 감압하에 제거하였다. 그 후, 잔류물을 아세토니트릴 (2 x 65 mL)에 재용해시키고, 공증발시켜 건조시켰다. 건조된 물질을 DMF (5 mL)에 용해시키고, 벤조산 무수물 (0.26, 1.15 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 21시간 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 EtOAc (80 mL)로 희석시키고, 포화 NaHCO3 (2 x 60 mL) 및 염수 (60 mL)로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4) 농축시켰다. 조질 생성물을 THF (7.6 mL)에 용해시키고, TBAF (THF 중 1 M) (1.15 mL, 1.15 mmol) 용액을 첨가하였다. 15분 후에 반응 혼합물을 염수 (60 mL)로 희석시키고, 생성물을 EtOAc (2 x 50 mL)로 추출하였다. 조질 생성물을 SiO2 칼럼 크로마토그래피 (0-80% EtOAc/헥산 v/v)로 정제하여 (1S,3R,4R,8S)-8-트리에틸실릴옥시-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(N4-벤조일-5-메틸 시토신-일)-2,6-디옥사비시클로[3,2,1] 옥탄 14 (0.5 g, 94%)를 백색 발포체로서 얻었다. ES/MS (M-H) m/z: 688.
실시예 15
(1S,3R,4R,8S)-1-(4,4'- 디메톡시트리틸옥시메틸 )-3-( N 4 - 벤조일 -5- 메틸시토신 -일)-2,6- 디옥사비시클로 [3,2,1] 옥탄 8-O-(2- 시아노에틸 -N,N- 디이소프로필포스포 로아미다이트의 합성
무수 DCM (36 mL)에 화합물 14 (0.5 g, 0.72 mmol)를 실온에서 질소하에 용해시키고, 디이소프로필에틸 아민 (0.75 mL, 4.33 mmol)을 첨가한 후, 2-시아노에틸-N,N'-디이소프로필클로로포스포르아미다이트 (0.75 mL, 4.33 mmol)를 적가하였다. 6시간 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석시키고 포화 NaHCO3 (80 mL)로 세척하였다. 수성 상을 EtOAc (100 mL)로 역추출하고, 합한 유기 상을 염수 (150 mL)로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4) 농축시켰다. 조질 생성물을 SiO2 칼럼 크로마토그래피 (0.5%의 TEA를 갖는 66% Hex/EtOAc v/v 내지 0.5%의 TEA를 갖는 66% EtOAc/헥산 v/v의 구배)를 사용하여 정제하여 (1S,3R,4R,8S)-1-(4,4'-디메톡시트리틸옥시메틸)-3-(N4-벤조일-5-메틸시토신-일)-2,6-디옥사비시클로[3,2,1] 옥탄 8-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포로아미다이트 15 (0.48g, 75%)를 백색 발포체로서 얻었다. ES/MS (M-H) m/z: 889.
실시예 16
수르비빈 ( BIRC5 )을 표적화하는 RNA
수르비빈 (BIRC5)을 표적화하는 서열 특이적인 RNA를 표 1 및 2에 나타내었다. 표 1 및 2의 서열에서 CRN 단량체는 "crnX"로서 식별되고, 여기서 X는 뉴클레오티드: A, U, C 또는 G에 대한 하나의 문자 코드이다. 예를 들어, "crnC"는 시티딘 CRN을 나타낸다. 표 1 및 2의 CRN은 단량체 R에 기초한다. 센스 서열인 서열:1-10의 각각은 안티센스 서열인 서열:11-20 중 하나와 각각 결합할 것인데, 다르게 말하면, 서열:1은 서열:11과 결합할 것, 서열:2는 서열:12와 결합할 것 등이다.
<표 1> 수르비빈을 표적화하는 RNA
Figure pct00024
<표 2> 수르비빈을 표적화하는 RNA
Figure pct00025
실시예 17
PLK 를 표적화하는 RNA
PLK1을 표적화하는 서열 특이적인 RNA를 표 3 및 4에 나타내었다. 표 3 및 4의 서열에서 CRN 단량체는 "crnX"로서 식별되고, 여기서 X는 핵염기: A, U, C 또는 G에 대한 하나의 문자 코드이다. 예를 들어, "crnC"는 시토신 CRN을 나타낸다. 표 3 및 4의 CRN은 단량체 R에 기초한다. 센스 서열인 서열:21-30의 각각은 안티센스 서열인 서열:31-40 중 하나와 각각 결합할 것인데, 다르게 말하면, 서열:21은 서열:31과 결합할 것, 서열:22는 서열:32와 결합할 것 등이다. "d"는 "데옥시"를 지칭한다.
<표 3> PLK1를 표적화하는 RNA
Figure pct00026
<표 4> PLK1를 표적화하는 RNA
Figure pct00027
실시예 18
인자 VII 를 표적화하는 RNA
인자 VII를 표적화하는 서열 특이적인 RNA를 표 5 및 6에 나타내었다. 표 5 및 6의 CRN은 단량체 R에 기초한다. 센스 서열인 서열:41-50의 각각은 안티센스 서열인 서열:51-60 중 하나와 각각 결합할 것인데, 다르게 말하면, 서열:41은 서열:51과 결합할 것, 서열:42는 서열:52와 결합할 것 등이다. 명칭 "unaU"는 U 핵염기를 갖는 히드록시메틸 치환된 핵산단량체 (해제된 핵산단량체, UNA)를 지칭한다. 명칭 "mU"는 변형된 뉴클레오티드 "um", 즉 2'-O-메틸우리딘을 지칭한다.
<표 5> 인자 VII를 표적화하는 RNA
Figure pct00028
<표 6>
인자 VII를 표적화하는 RNA
Figure pct00029
실시예 19
RNA 표적화 ApoB
서열 특이적인 ApoB를 표적화하는 RNA를 표 7 및 8에 나타내었다. 표 7 및 8의 CRN은 단량체 R에 기초한다. 센스 서열인 서열:61-66의 각각은 안티센스 서열인 서열:67-72 중 하나와 각각 결합할 것인데, 다르게 말하면, 서열:61은 서열:67과 결합할 것, 서열:62는 서열:68과 결합할 것 등이다.
<표 7> ApoB를 표적화하는 RNA
Figure pct00030
<표 8> ApoB를 표적화하는 RNA
Figure pct00031
실시예 20
CRN - 안티미어 -122-8a
본 발명의 방법에 의해 CRN-함유 안티미어인 CRN-안티미어-122-8a를 합성하였다. 마이크로RNA-122는 간-특이적이고 지질 대사에 관련되며 C형 간염 바이러스 복제와 관련될 수 있는 miRNA이다. 마이크로RNA-122는 다양한 하류 mRNA를 조절한다. CRN-안티미어-122-8a는 마이크로RNA-122를 침묵시키고 그의 하류 표적을 탈억제할 수 있는 마이크로RNA-122의 5' 말단에 상보적인 16량체 올리고뉴클레오티드이다.
CRN-안티미어-122-8a의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00032
여기서 뉴클레오티드 코드 앞의 "crn"은 X가 O인 단량체 R에 기초하는 CRN을 지칭하고, "s"는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고, 명칭 crnm5C는 X가 O인 단량체 R 및 염기 5-메틸시티딘 (m5C)에 기초한 CRN을 의미하고, 뉴클레오티드 코드 앞의 "d"는 데옥시 뉴클레오티드를 지칭한다.
실시예 21
마우스 mRNA 의 탈억제에서 CRN -함유 안티미어인 CRN - 안티미어 -122-8a의 효능
CRN 치환된 안티미어-122는 마우스 모델에서 하류 유전자 ALDOA, SLC7A, P4H4의 탈억제를 입증하였다.
CRN-함유 안티미어인 CRN-안티미어-122-8a를 8-주령 BALB/c 마우스에서 시험하였다. 치료군 (n = 5)을 Q1dx3 (3일 연속으로 매일)의 투여 스케줄로 10 mg/kg 용량으로 정맥내 주사하였다. 부검은 최종 투여 후 24시간 시 수행하였다. 연구 과정 동안 체중 및 임상 징후를 모니터링하였다. 간 및 비장을 수거하였다. CRN 치환된 안티미어-122는 내성이 좋았다. CRN-안티미어-122-8a 처리된 동물의 비장 중량은, CRN 치환된 안티미어에 대해 비-특이적 면역 반응을 나타내지 않는 완충제 대조군에 비해 변동이 없는 것으로 밝혀졌다.
측정된 종점은 하류 유전자 AldoA (알돌라제 A), P4H4 (프롤릴 4-히드록실라제 유전자), 및 SLC7A1 (용질 담체 패밀리 7)의 발현이었다. 음성 대조군은 미스매치 안티미어-122 서열이었다.
완충제 대조군에 비해 CRN 치환된 안티미어-122에 대해서는, 2.5-배에 이르는 간 AldoA mRNA에서의 탈억제가 관찰되었다. 동일한 조건하에서, 완충제에 비해 음성 대조군에 대해서는 효과가 관찰되지 않았다.
완충제 대조군에 비해 CRN 치환된 안티미어-122에 대해서는, 1.5-배에 이르는 간 P4H4 mRNA에서의 탈억제가 관찰되었다. 동일한 조건하에서, 완충제에 비해 음성 대조군에 대해서는 효과가 관찰되지 않았다.
완충제 대조군에 비해 CRN 치환된 안티미어-122에 대해서는, 1.3-배에 이르는 간 SLC7A1 mRNA에서의 탈억제가 관찰되었다. 동일한 조건하에서, 완충제에 비해 음성 대조군에 대해서는 효과가 관찰되지 않았다.
CRN 치환된 안티미어-122를 투여한 뒤 체중 감소는 관찰되지 않았다. CRN 처리된 마우스에서 간 및 신장 효소의 변화는 관찰되지 않았다. 다른 혈청 화학 파라미터는 예상되는 정상 수준에 속하였다.
<110> Marina Biotech, Inc. <120> SYNTHESIS AND USES OF NUCLEIC ACID COMPOUNDS WITH CONFORMATIONALLY RESTRICTED MONOMERS <130> PC141994 <150> 61/532,056 <151> 2011-09-07 <160> 73 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <220> <221> modified_base <222> (19) <223> u is crnU <400> 1 cugccuggca gcccuuucu 19 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <220> <221> modified_base <222> (2) <223> u is crnU <220> <221> modified_base <222> (21) <223> u is crnU <400> 2 cugccuggca gcccuuucuu u 21 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <220> <221> modified_base <222> (1) <223> u is crnU <220> <221> modified_base <222> (2) <223> c is crnC <220> <221> modified_base <222> (22) <223> u is crnU <400> 3 ucugccuggc agcccuuucu uu 22 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <220> <221> modified_base <222> (2) 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65 acagaguccc ucaaacagac augac 25 <210> 66 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <220> <221> modified_base <222> (2) <223> u is crnU <220> <221> modified_base <222> (25) <223> g is crnG <400> 66 gucucaaaag guuuacuaau auucg 25 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 67 uuucuuguuc ugaauguccu u 21 <210> 68 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 68 ucuguuugag ggacucuguu u 21 <210> 69 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 69 auugguauuc agugugaugu u 21 <210> 70 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 70 uuuggaucaa auauaagauu cccuucu 27 <210> 71 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 71 gucaugucug uuugagggac ucuguga 27 <210> 72 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 72 cgaauauuag uaaaccuuuu gagacug 27 <210> 73 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence containing a phosphorothioate linkage between each base <220> <221> modified_base <222> (1) <223> c is crn 5-methylcytidine <220> <221> modified_base <222> (2) <223> c is deoxyC <220> <221> modified_base <222> (3) <223> a is deoxyA <220> <221> modified_base <222> (4)..(5) <223> t is crnT <220> <221> modified_base <222> (6) <223> g is deoxyG <220> <221> modified_base <222> (7) <223> t is crnT <220> <221> modified_base <222> (8) <223> c is crn 5-methylcytidine <220> <221> modified_base <222> (9) <223> a is deoxyA <220> <221> modified_base <222> (10) <223> c is crn 5-methylcytidine <220> <221> modified_base <222> (11) <223> a is deoxyA <220> <221> modified_base <222> (12) <223> c is deoxyC <220> <221> modified_base <222> (13) <223> t is deoxyT <220> <221> modified_base <222> (14)..(15) <223> c is crn 5-methylcytidine <220> <221> modified_base <222> (16) <223> a is deoxyA <400> 73 ccattgtcac actcca 16

Claims (30)

  1. 하기 화학식 II를 갖는 화합물을 제공하고, 오존분해 또는 산화에 의해 화학식 II를 갖는 화합물을 변형시키고, 화학식 V를 갖는 화합물을 단리하는 것을 포함하는, 하기 화학식 V를 갖는 화합물을 제조하는 방법.
    <화학식 II>
    Figure pct00033

    <화학식 V>
    Figure pct00034

    상기 식에서, R1은 치환기 보호기이고, R2는 치환기 보호기이고, R1 및 R2 중 하나 또는 둘 다는 부피가 큰(bulky) 치환기 보호기이고, R1 및 R2는 임의로 연결되고, R3은 보호기이고, B는 핵염기 또는 핵염기 유사체이다.
  2. 제1항에 있어서, B가 우리딘 또는 5-메틸우리딘인 방법.
  3. 제1항에 있어서, R1 및 R2가 1,1,3,3-테트라알킬디실록산-1,3-디일 기인 방법.
  4. 제1항에 있어서, R1 및 R2가 1,1,3,3-테트라이소프로필디실록산-1,3-디일 기인 방법.
  5. 제1항에 있어서, R3이 벤질인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 오존분해에 의한 화학식 V를 갖는 화합물의 수율이 화학식 V를 갖는 화합물의 5 그램 이상의 규모에서 적어도 50%인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 오존분해에 의한 화학식 V를 갖는 화합물의 수율이 화학식 V를 갖는 화합물의 10 그램 이상의 규모에서 적어도 50%인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 오존분해에 의한 화학식 V를 갖는 화합물의 수율이 화학식 V를 갖는 화합물의 10 그램 이상의 규모에서 적어도 70%인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 오존분해에 의한 화학식 V를 갖는 화합물의 수율이 화학식 V를 갖는 화합물의 10 그램 이상의 규모에서 적어도 80%인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 5'-히드록실 기를 보호하고, R3을 포스포르아미다이트로 치환시킴으로써, 화학식 V를 갖는 화합물을 하기 화학식 VI을 갖는 형태적으로 제한된 핵산단량체 CRN으로 변형시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
    <화학식 VI>
    Figure pct00035
  11. 제10항에 있어서, 5'-히드록실 기가 DMTr 기로 보호되는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, B가 시티디닐, 우리디닐, 또는 티미디닐 기로 변형되는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 형태적으로 제한된 핵산단량체가 피리미딘 CRN인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 피리미딘 CRN의 글리코시드 전이반응에 의해, 피리미딘 CRN을 퓨린 CRN으로 변형시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제10항에 있어서, 핵산 화합물을 제조하기 위하여 CRN을 사용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 핵산 화합물이 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 핵산 화합물이 마이크로RNA, 안티미어(antimir), 안타고미어(antagomir), 마이크로RNA 모방체, 마이크로RNA 전구체, RNA, siRNA, DNA, RNA 및 DNA, usiRNA, mdRNA, 소형 헤어핀 RNA 또는 shRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
  18. 비시클릭 당을 합성하고, 상기 비시클릭 당을 실릴화 퓨린과 반응시키는 것을 포함하는, 퓨린 CRN을 제조하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 비시클릭 당이 B가 알콕시 기로 치환된 화학식 VI를 갖는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 핵산 화합물을 제조하기 위하여 CRN을 사용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 핵산 화합물이 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 핵산 화합물이 마이크로RNA, 안티미어, 안타고미어, 마이크로RNA 모방체, 마이크로RNA 전구체, RNA, siRNA, DNA, RNA 및 DNA, usiRNA, mdRNA, 소형 헤어핀 RNA 또는 shRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
  23. 구조
    Figure pct00036
    를 갖고, 여기서 R은 메틸이고, R1은 독립적으로 H, 알킬, 또는 보호기이고, R2는 독립적으로 H, 알킬, 보호기, 또는 포스포르아미다이트 기인 CRN.
  24. 구조
    Figure pct00037
    를 갖는 CRN.
  25. 제23항의 CRN을 포함하는 핵산 화합물.
  26. 제24항의 CRN을 포함하는 핵산 화합물.
  27. 제25항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드인 핵산 화합물.
  28. 제25항에 있어서, 마이크로RNA, 안티미어, 안타고미어, 마이크로RNA 모방체, 마이크로RNA 전구체, RNA, siRNA, DNA, RNA 및 DNA, usiRNA, mdRNA, 소형 헤어핀 RNA 또는 shRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 핵산 화합물.
  29. 제26항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드인 핵산 화합물.
  30. 제26항에 있어서, 마이크로RNA, 안티미어, 안타고미어, 마이크로RNA 모방체, 마이크로RNA 전구체, RNA, siRNA, DNA, RNA 및 DNA, usiRNA, mdRNA, 소형 헤어핀 RNA 또는 shRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 핵산 화합물.
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