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WO1998011208A1 - Procede de preparation d'adn plasmidique - Google Patents

Procede de preparation d'adn plasmidique Download PDF

Info

Publication number
WO1998011208A1
WO1998011208A1 PCT/FR1997/001594 FR9701594W WO9811208A1 WO 1998011208 A1 WO1998011208 A1 WO 1998011208A1 FR 9701594 W FR9701594 W FR 9701594W WO 9811208 A1 WO9811208 A1 WO 9811208A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
plasmid dna
carried out
precipitation
concentration
pharmaceutical composition
Prior art date
Application number
PCT/FR1997/001594
Other languages
English (en)
Inventor
Bruno Cavallini
Original Assignee
Transgene S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Transgene S.A. filed Critical Transgene S.A.
Priority to CA002266123A priority Critical patent/CA2266123A1/fr
Priority to JP51331498A priority patent/JP2001503971A/ja
Priority to EP97940209A priority patent/EP0958358A1/fr
Priority to AU42128/97A priority patent/AU733057B2/en
Publication of WO1998011208A1 publication Critical patent/WO1998011208A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4707—Muscular dystrophy
    • C07K14/4708—Duchenne dystrophy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the subject of the present invention is a new plasmid DNA purification protocol making it possible to produce a large quantity of DNA of pharmaceutical quality acceptable for use in humans. It also relates to a pharmaceutical composition comprising the DNA thus obtained and its use for the transfer of a nucleic acid into a host cell.
  • the invention is of particular interest for gene therapy perspectives.
  • genes into a given cell is the very basis of gene therapy.
  • This new technology makes it possible to envisage the treatment of serious illnesses for which conventional therapeutic alternatives are ineffective or even non-existent and also concerns genetic illnesses (hemophilia, cystic fibrosis, myopathy, etc.) that acquired (cancer, acquired immunodeficiency syndrome AIDS, ).
  • the most practiced approach consists in using a viral vehicle to introduce the therapeutic nucleic acid into the cell to be treated and, in particular, retroviral and adenoviral.
  • viruses have developed sophisticated mechanisms to cross cell membranes, escape degradation at the level of lysosomes and make their genome penetrate into the nuclei in order to ensure the expression of the therapeutic gene.
  • the viral approach has its limitations, in particular a limited cloning capacity, a potential production of viral particles competent for replication capable of dissemination in the host organism and the environment, a risk of insertional mutagenesis in the case of vectors. retrovirals and, in the case of adenoviral vectors, induction of immune and inflammatory responses in the host which hamper repeat therapy.
  • Non-viral vectors More and more gene transfer methods use non-viral vectors.
  • One of the most used is to deliver the therapeutic nucleic acid by means of synthetic vectors, such as cationic lipids which spontaneously interact with the nucleic acid to form positively charged complexes capable of fusing with the anionic cell membranes and causing the penetration of the nucleic acid they transport (see for example Behr, Bioconjugate Chemistry (1944 5: 382)).
  • a so-called biolistic method by bombardment of cells with metal microprojectiles covered with DNA has recently been used in the context of an anti-AIDS trial (Woftendin et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2889-2894).
  • an even simpler approach can also be envisaged by direct administration of naked DNA, in particular in the context of diseases affecting the muscles by intramuscular injection.
  • These non-viral methods generally use a plasmid vector carrying the therapeutic gene and the elements necessary for its expression.
  • the subject of the present invention is a process for preparing a plasmid DNA from a wet cellular biomass harvested after fermentation of a producer cell comprising said plasmid DNA, characterized in that it comprises the following steps: a ) alkaline lysis of the resuspended biomass, after resuspension of the wet cellular biomass b) acidification at high ionic strength, c) elimination of insolubles, d) reduction of endotoxins and ribonucleic acids (RNA), e) gel filtration chromatography, and f) conditioning.
  • Plasmid DNA denotes an extrachromosomal cellular element formed from a generally circular DNA molecule capable of autonomous replication in a producer cell (the cell in which it is amplified).
  • the choice of plasmids which can be used in the process of the present invention is vast. They can be of any origin (prokaryotic, eukaryotic) or be formed by the assembly of various elements. Generally, the plasmids are known to those skilled in the art. Many of them are commercially available, but it is also possible to construct them using genetic manipulation techniques (Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • It may be a cloning or expression vector derived for example from pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) or even p Poly (Lathe et al ., 1987, Gene 57, 193-201).
  • a plasmid used in the context of the present invention has the genetic elements which allow it to replicate autonomously in the producer cell and, optionally, in a host cell (cell in which the therapeutic effect is research).
  • Such elements can be constituted, inter alia, by an origin of replication ensuring the initiation of replication in a bacterium, yeast, fungus or mammalian cell. It can be isolated from a prokaryote (ColEl %), from a eukaryote (2 ⁇ or ARS for autonomous replication sequence), from a virus (SV40 ori from simian virus 40, oriP from Epstein Barr EBV virus.) or a bacteriophage (flora). Choosing the appropriate origin of replication is within the skill of the art.
  • the origin ColEl will be retained.
  • it will also include a functional origin in a eukaryote, for example oriP and may include the gene coding for the EBNA-1 protein of the EBV virus necessary for replication. from the latter (Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542, Yates et al., Nature 313, 812-815).
  • a plasmid used in the present invention may also comprise a selection gene making it possible to select or identify the transfected cells (producer cells and / or host cells). Selection methods based on the principle of deficient producer cells can be applied (by auxotrophic mutations or introduction of a lethal gene) incapable of growing in the absence of a plasmid carrying a gene complementing this deficiency (for example dap system described in application EP 0 258 1 18, complementation of an auxotrophy mutation, use of genes coding for a suppressor tRNA sup E, supF, etc.).
  • Another commonly used practice consists in integrating into the plasmid a gene coding for resistance to an antibiotic (ampicillin, anamycin, tetracycline, etc.). Of course, it can include additional elements improving its maintenance and / or its stability in a host or producer cell.
  • an antibiotic ampicillin, anamycin, tetracycline, etc.
  • it can include additional elements improving its maintenance and / or its stability in a host or producer cell.
  • sequence cer the presence of which promotes the monomeric maintenance of a plasmid (Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1 103) and certain sequences of viral origins (LTR of retrovirus, ITR d '' a virus associated with adenovirus ...) or cellular allowing integration into the chromosomes of the host cell.
  • a plasmid used in the present invention is intended to transport one or more gene (s) of therapeutic interest in a host cell.
  • the gene of interest can code for an antisense RNA, a messenger RNA which will then be translated into the polypeptide of interest, a ribozyme or even an RNA conferring a direct therapeutic benefit (VA RNA of an adenovirus capable to suppress the immune response, RNA activating the synthesis interferon) (Abbas et al. in Cellular and Molecular Immunology, WB, Saunders Company Harcourt Brace Jovanovich, Inc. p. 228).
  • the gene of interest can be isolated by any conventional technique such as cloning, PCR (Polymerase Chain Reaction) or even chemically synthesized. It can be of genomic type (provided with one or more introns) or complementary DNA (cDNA).
  • the polypeptide of interest can consist of a mature protein, a precursor and, in particular a precursor intended to be secreted and comprising a signal peptide, a truncated protein, a chimeric protein originating from the fusion of sequences of various origins or else a mutated protein with improved and / or modified biological properties.
  • a gene of interest selected from those encoding the following polypeptides:
  • cytokines or lymphokines interferons ⁇ , ⁇ and ⁇ , interleukins and in particular IL-2, IL-6, riL-10 or IL-12, tumor necrosis factors (TNF), colony stimulating factors (GM -CSF, C-CSF, M-CSF ...); cellular or nuclear receptors, in particular those recognized by pathogenic organisms (viruses, bacteria, or parasites) and, preferably, by the HIV virus (Immunodeficiency Virus Human) or their ligands; - proteins involved in a genetic disease (factor VII, factor VIII, factor
  • IX dystrophin or minidystrophin, insulin, CFTR protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), growth hormones (hGH), enzymes (urease, renin, thrombin ...); enzyme inhibitors ( ⁇ 1 -antitrypsin, antithrombin III, inhibitors of viral proteases ...); polypeptides with anti-tumor effect capable of at least partially inhibiting the initiation or progression of tumors or cancers (antisense RNA, antibodies, inhibitors acting at the level of cell division or transduction signals, expression products of tumor suppressor genes, for example p53 or Rb, proteins stimulating the immune system, etc.); proteins of the major histocompatibility complex of classes I or II or proteins regulators acting on the expression of the corresponding genes, polypeptides capable of inhibiting a viral, bacterial or parasitic infection or its development (antigenic polypeptides having immunogenic properties, antigenic epitopes, antibodies, trans-dominant variants capable of inhibiting the
  • the gene of interest can be placed under the control of the elements necessary for its expression in the host cell.
  • elements necessary for its expression is meant all of the elements allowing its transcription into RNA and the translation of a polypeptide mRNA
  • the promoter is of particular importance II can derive from any gene (eukaryotic, viral, natural promoter of the gene of interest in question) or can be artificial Furthermore, it can be constitutive or regulatable Alternatively, it can be modified so as to improve the promoter activity, to suppress a region inhibiting transcription, to modify its mode of regulation, to introduce a restriction site.
  • CMV viral promoters Cytomegalovirus
  • RSV Raster Sarcoma Virus
  • TK gene of the HSV-1 virus early of the SV40 virus
  • adenoviral MLP adenoviral MLP
  • eukaryotic promoters of the PG genes Murine or human K (Phospho Glycerate kinase), ⁇ l-antitrypsin (liver-specific), immunoglobulins (lymphocyte-specific)
  • Such elements may also include additional elements such as introns, signal sequence, nuclear localization sequence, termination sequence of transcription (polyA), site of initiation of IRES or other type translation, etc.
  • a plasmid used in the present invention is amplified in a producer cell before being purified according to the process of the present invention.
  • Very particularly preferred are gram negative bacteria and, in particular, E. coli.
  • the strains may be mentioned DH5 (Grant et al, 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87, 4645-4649), MC1061 (Wertman et al, 1986, Gene 49, 253-262) and its derivatives like DH10B (Grant et al, 1990, supra) Being gives that it is a widely known technology to date, only a brief description will be given of the procedure for introducing and amplifying a plasmid into a bacterium.
  • All conventional techniques can be used in the context of the present invention (treatment with calcium chlorides, rubidium, cobalt hexamine, by reducing agents, by DMSO, electroporation, transduction, liposomes, ...; Maniatis et al., 1 89, supra).
  • the producer cells thus transformed are then cultured according to general art practices (continuous fermentation "batch” or fed “fed batch”).
  • the culture conditions can be easily established by a person skilled in the art on the basis of general knowledge in this field and of the selection system carried by the plasmid.
  • the wet cell biomass is lysed after resuspension.
  • a slightly basic resuspension buffer is generally used to neutralize the acidic character of the cell paste and of weak ionic strength having little or no lyrical effects on the transformed cells. Its composition and pH can vary in particular depending on the producer cell, the culture medium used or any other parameter. The man of the year is able to develop an appropriate resuspension pad.
  • An example which may be mentioned is a buffer containing EDTA (concentration of 1 to 50 M, preferably 10 mM) and Tris-HCl
  • the alkaline lysis step makes it possible to release the cell content and to solubilize all the components. Proteins, RNA and DNA are denatured, including plasmid DNA, the two homologous strands of which remain tangled, unlike genomic DNA. It may be advantageous to carry out the alkaline lysis in the presence of a detergent and, preferably, an anionic surfactant. The choice of base and surfactant is not limited.
  • the combination of sodium hydroxide and SDS sodium dodecylsulfate is preferred, in particular at final concentrations around 0.1 M and 0.5% respectively.
  • the final pH of the lysis solution is preferably between 1 1 and 13 and, optimally, between 12.2 and 12.4. It is indicated that it is preferable to mix the resuspended transformed cells and the lysis solution in a gentle manner, for example by inversion, in order to minimize breaks in the genomic cellular DNA which would then be liable to contaminate the preparation of Plasmid DNA.
  • the second step of the process according to the invention results in acidification with high ionic strength of the lysate obtained previously.
  • the acidification is preferably carried out abruptly, c is to say in one go. Under these conditions, the plasmid DNA is rapidly renatured while the vast majority of proteins, denatured genomic DNA and insoluble RNA species under conditions of high ionic strength flocculate.
  • a solution comprising a buffer or a strong acid combined with a salt whose pH is between 4.5 and 6.5.
  • a solution of potassium acetate preferably at a final concentration close to 1 M, so as to obtain a final pH of about 5.1
  • a sodium acetate solution of pH and concentration as indicated above
  • the selected filter will have a porosity of between 1 and 100 ⁇ m, more advantageously 2 and 75 ⁇ m, preferably 5 and 75 ⁇ m, quite advantageously, 3 and 50 ⁇ m, and, quite preferably, 10 and 50 ⁇ m II can be made of synthetic material such as nylon.
  • successive filtrations are carried out using filters of decreasing porosity, for example a first filtration on sintered glass with a porosity of between 100 and 40 ⁇ m (sinter No. 2, Schott AG), the second on frit of porosity 16 to 40 ⁇ m (frit N ° 3, Schott AG) and the last on frit of porosity 10 to 16 ⁇ m (frit N ° 4, Schott AG)
  • filters of decreasing porosity for example a first filtration on sintered glass with a porosity of between 100 and 40 ⁇ m (sinter No. 2, Schott AG), the second on frit of porosity 16 to 40 ⁇ m (frit N ° 3, Schott AG) and the last on frit of porosity 10 to 16 ⁇ m (frit N ° 4, Schott AG)
  • the filtrate can be concentrated before the next step of reduction of endotoxins.
  • the means of concentrating DNA dissolved in an aqueous solution are known to those skilled in the art. We can cite ultrafiltration, alcoholic precipitation or a combination of these two techniques
  • membranes can be used as long as they do not or little adsorb the plasmid DNA under the conditions of use.
  • particularly suitable membranes are those of the YM type (and in particular, YM30-76, Diaflo and YM30-4208, Centricon), those equipping the Easy Flow units (reference 14669-OS-l V or 14669-OS-2V, Sarto ⁇ us) or else minipellicon 2 PL300 (Millipore in regenerated cellulose) Ultrafiltration constitutes at this stage a powerful means of reducing the contamination of the preparation of plasmid DNA by pigments of cellular origin or coming from the culture medium.
  • the filtrate is first concentrated by ultrafiltration on a polysulfone membrane having a cut-off threshold of approximately 100 kDa using a unit of the Easy Flow type (Sartorius) for single use or on a minipellicon membrane 2 PL300 (Millipore) with a cutoff threshold of around 300 kDa.
  • the nucleic acids are precipitated by adding 0.7 volume of isopropanol.
  • the precipitated material is recovered by centrifugation and can be subjected to one or more washes in ethanol at a concentration of 70 to 80% in order to reduce the contaminants soluble in alcohol such as the salts and, as already mentioned, the pigments residual.
  • the nucleic acids are taken up in an appropriate buffer, for example 10 mM Tris-HCl pH 8 containing EDTA at a concentration of approximately 1 mM to inhibit nucleases and optionally sodium acetate. (at a final concentration of approximately 0.3 M allowing precipitation of the nucleic acids after the Triton extraction step). It is interesting to note here that the stages of ultrafiltration and precipitation with isopropanol are particularly advantageous for removing the majority of the pigments from the preparation.
  • the plasmid DNA preparation contains significant amounts of RNAs and endotoxins and the next steps are to reduce their levels.
  • reduction is meant a significant reduction in the level of endotoxins or RNA between the start and the end of the stage, by a factor of at least 100 and, preferably, at least 1000.
  • concentration in RNA and endotoxins can be assessed by tests similar to those described below or by any other methodology disclosed in the literature.
  • the stages can be interchanged, it is preferable first to act on the endotoxins and then on the RNAs. Endotoxins, because of their pyrogenic nature, must be considerably reduced or even eliminated before considering administration in humans. For common pharmaceutical products, the maximum tolerable amount has been set by health authorities at 5 units (EU) per dose.
  • EU 5 units
  • the compounds described above are amphiphilic compounds whose irascibility in the aqueous phase can be controlled by variation of the temperature around their cloud point.
  • the DNA preparation is cooled to a temperature below 10 ° C before adding said detergent.
  • the final concentration of detergent to be used can be between 0.5 and 6%, advantageously between 1 and 5% and, most preferably, around 1%. Under these conditions, said detergent is soluble in water and forms micelles complexing endotoxins. After incubation and centrifugation of the plasmid DNA / detergent mixture at a temperature much higher than the cloud point (for example> 37 ° C.
  • aqueous phase containing the DNA plasmid
  • a phase containing the detergent and endotoxins When the detergent chosen has a density greater than that of the DNA solution, after separation of the phases by centrifugation, the aqueous phase is located in the upper part of the tube and the phase containing the detergent and endotoxins in the lower part, and conversely when the detergent has a density lower than that of the DNA solution.
  • a detergent preferably having a density greater than that of the DNA solution will be chosen.
  • a person skilled in the art also has the necessary knowledge allowing him to adjust, if necessary, the density of the DNA solution, by modifying for example the salt concentration of said solution.
  • the method according to the invention can comprise one or more (preferably 3) successive extractions as described above.
  • the present invention also relates to a variant of the process of the invention according to which the nonionic detergent chosen has a cloud point situated outside the recommended range, and according to which said cloud temperature is adjusted by the addition of a small amount of 'anionic detergent (' Nonionic Surfactants', Chapter 'Surfactant and Detersive Systems' in Kirk-Othmer Encyclopaedia of Chemistry, John WLLEY & Sons, 1995).
  • 'anionic detergent ' Nonionic Surfactants', Chapter 'Surfactant and Detersive Systems' in Kirk-Othmer Encyclopaedia of Chemistry, John WLLEY & Sons, 1995.
  • the reduction of endotoxins is followed by a step of alcoholic precipitation of the plasmid DNA by incubation in the cold (4 ° C, -20 ° C or -80 ° C) in the presence 0.3 M sodium acetate and about 70% ethanol.
  • the nucleic acid precipitate is conventionally recovered by centrifugation. It can be washed with a solution of 80% ethanol in water before being dried and redissolved in an aqueous medium, for example 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA. This precipitation step, which is also optional, offers an effective means of eliminating traces of residual Triton TM Xl 14.
  • the reduction of RNA contamination can be carried out by any means known in the art, for example enzymatic hydrolysis using a ribonuclease of animal origin such as bovine pancreatic ribonuclease A.
  • RNAs under conditions of high ionic strength or in the presence of dehydrating agents.
  • Various salts can be used and mention will be made, for example, of lithium chloride (Ze'ev Lev, 1987, Analytical Biochemistry 160, 332-336), calcium chloride, ammonium acetate and ammonium sulphate .
  • ammonium sulfate constitutes a preferred embodiment, particularly at a final concentration of between 1 and 3.5 M, preferably between 1.5 and 3 M and, most preferably, between 2 and 2.5 M.
  • calcium chloride can be used at a final concentration of between 10 mM and 2 M, advantageously between 20 mM and 0.5 M, and preferably between 50 mM and 0.1 M.
  • the mixture is left under gentle stirring, optionally at low temperature, for a variable duration (1 to 120 min), centrifuged and the plasmid DNA recovered in the supernatant.
  • the process according to the invention comprises at this stage an exclusion chromatography step on gel filtration supports, which makes it possible to perfect the purification of the preparation of plasmid DNA (reduction of RNAs and residual proteins) and also to ensure the desalting.
  • the choice of support is wide and within the reach of those skilled in the art. More particularly, the supports approved for human or veterinary use by the competent American authorities (FDA for Food and Drug Administration) and / or European Union agencies and with a high exclusion limit and, in particular, greater than or equal to 20x10 Da (as measured on polymers such as dextrans).
  • the column is initially balanced under saline conditions limiting the hydrophobic interactions between the support and the DNA.
  • the TEN buffer (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA, and 100 mM NaCl).
  • the chromatography conditions can be adapted as a function of various parameters and in particular the volume of the column, the support chosen, the concentration of the preparation in plasmid DNA and the size of the latter. Plasmid DNA is excluded from the phase and is eluted before the lower molecular weight contaminants.
  • the fractions containing it can be analyzed by the usual techniques (absorbance at 254 nm, visual analysis after separation by agarose gel electrophoresis, etc.).
  • the column it is also possible to connect the column to a detector fitted with a filter (at 254 nm for example) for the online detection of positive fractions. It will be noted that an advantage of the method according to the invention consists in the elimination during this step, of the residual salt from the previous step. According to an optional embodiment, the fractions obtained after the chromatographic step can be combined and concentrated according to the methodology indicated above (ultrafiltration and / or alcoholic precipitation).
  • the method according to the invention comprises a step of conditioning the preparation of plasmid DNA.
  • the packaging pads which can be used in the context of the present invention are varied. It can be a physiological saline solution (NaCl 0.9%), a Hepes-Ringer solution, Lactate-Ringer, TE (10 mM Tris-HCl pH7.5 to 8, 1 mM EDTA) or simply H 2 O.
  • the preparation can be subjected to sterilizing filtration.
  • 0.22 ⁇ m filters with a surface adapted to the volume to be treated will be used.
  • the concentration of plasmid DNA can be determined in a conventional manner, for example by spectrophotometry at a wavelength of 260 nm.
  • the relative proportion of the different topoisomers can be assessed visually by agarose gel electrophoresis and staining with ethidium bromide, optionally followed by a densitometric analysis.
  • the integrity of the plasmid can be verified by digestion with restriction enzymes having one or more cleavage sites.
  • RNA contamination can be assessed visually by agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining or by spectrophotometry after reaction with hydrochloric orcinol (Bial reagent) (Moulé, 1953, Arch. Science Physiol. 7, 161 ; Mejbaum, 1939, Hope Seyler Z. 258, 11-17).
  • a plasmid DNA purified according to the method of the invention preferably has a residual RNA contamination of less than 5% (mass / mass), advantageously less than 3%, preferably less than 2% and, most preferably, less than 1%.
  • Residual protein contamination can be measured by any protein assay technique showing little or no DNA interference.
  • a suitable technique is that of the technique of BCA (bicinchoninic acid) based on the spectrophotometric detection at a wavelength of 562 nm of the colored complex formed between BCA and the Cu + ions resulting from the reduction in alkaline medium of cuprous ions Cu-f + by proteins (Smith et al., 1985, Anal. Biochem. 150, 76-85).
  • a plasmid DNA purified according to the method of the invention preferably has a residual protein contamination of less than 3% (mass / mass), advantageously less than 2%, preferably less than 1% and, most preferably, less than 0.5%.
  • the endotoxin assay techniques are known to those skilled in the art.
  • the amount of entoxins of the plasmid DNA preparation is less than 50 EU, advantageously less than 20 EU, preferably less than 10 EU and, most preferably, less than 5 EU per mg of plasmid .
  • the contaminating chromosomal DNA can be assayed by the competitive quantitative PCR technique based on the amplification of specific sequences of the producer microorganism, by Southern or by "Slot-blot" using a specific probe.
  • a plasmid DNA purified according to the method of the invention preferably has a residual contamination in chromosomal DNA of less than 5% (mass / mass), advantageously less than 3%, preferably less than 2% and, most preferably , less than 1%.
  • a method according to the invention is particularly advantageous with regard to the preparation of plasmid DNA of size greater than 10 kb.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising a plasmid DNA purified by the process according to the invention as a therapeutic or prophylactic agent.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be used in various types of host cells. It is preferably a mammalian cell and in particular a human cell.
  • Said cell may be a primary or tumor cell of hematopoietic origin (totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte, macrophage, ...), hepatic, epithelial, fibroblast and, very particularly, a muscle cell (myobiasis, myocyte, satellite cell, cardiomyocyte, ...), a tracheal or pulmonary cell.
  • a composition according to the invention may comprise a targeting element towards a particular cell, for example a ligand to a cellular receptor or even an antibody. Such targeting elements are known.
  • a composition according to the invention can be administered by the systemic route or by aerosol, in particular by the intragastric, subcutaneous, intracardiac, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, intratumoral intrapulmonary, intranasal or intratracheal route.
  • the administration can take place in single dose or repeated one or more times after a certain interval of interval.
  • the appropriate route and dosage will vary depending on various parameters, for example, the individual or disease to be treated or the gene (s) of interest to be transferred.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be formulated in the form of doses comprising between 0.05 and 100 mg of plasmid DNA purified according to the method according to the invention, advantageously 0, 1 and 10 mg and, preferably, 0.5 and 5 mg.
  • the formulation may also include other compounds such as a pharmaceutically acceptable adjuvant or excipient.
  • a compound improving its diffusion in particular a polymer or a cationic lipid.
  • DOGS 5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide
  • DC-Chol [N- (N ', N'-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol
  • DOSPA (2,3-droleylocy [ -N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] N, N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate)
  • DOSPA 5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide
  • DOSPA 2,3-droleylocy [ -N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] N, N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate
  • compositions may also comprise an adjuvant capable of improving its transfecting power.
  • adjuvant capable of improving its transfecting power.
  • It will preferably be a neutral lipid such as phosphatidyl ethanolamine, phosphatidyl choline, phosphatidyl serine, phosphatidyl glycerol and, in particular, dioleyl phosphatidyl ethanolamine (DOPE).
  • DOPE dioleyl phosphatidyl ethanolamine
  • a composition according to the invention is in particular, intended for the preventive or curative treatment of diseases such as genetic diseases (hemophilia, cystic fibrosis, diabetes or myopathies of Duchenne and Becker, ...), cancers, viral diseases (hepatitis, AIDS, %), and recurrent diseases (infections caused by the herpes virus, the human papilloma virus, ).
  • diseases such as genetic diseases (hemophilia, cystic fibrosis, diabetes or myopathies of Duchenne and Becker, 7), cancers, viral diseases (hepatitis, AIDS, %), and recurrent diseases (infections caused by the herpes virus, the human papilloma virus, ).
  • the present invention relates to the therapeutic or prophylactic use of a pharmaceutical composition according to the invention for the preparation of a medicament intended for the treatment of the human or animal body and, preferably, by gene therapy.
  • the drug can be administered directly in vivo (for example by intravenous, intramuscular injection, in an accessible tumor, in the lungs by aerosol, ).
  • We can also adopt the ex vivo approach which consists in taking cells from the patient (bone marrow stem cells, peripheral blood lymphocytes, muscle cells, etc.), transfecting them in vitro according to the techniques of the art. and readminister them to the patient.
  • the invention also extends to a method of treatment using plasmid DNA obtained by a method according to the invention, according to which a therapeutically effective amount of the latter is administered to a patient in need of such treatment.
  • Figure 1 illustrates a chromatogram after gel filtration on Sephacryl S 500 (column of 70 ml, diameter 16 mm and length 350 mm) and loading of a 2 ml sample containing 5 mg of pCHl ION obtained after alkaline lysis, ultrafiltration and treatment with ammonium sulfate. The elution is carried out at 0.5 mi / min (15 cm / h) in a 10 mM Tris-HCl buffer, 1 mM EDTA, 100 mM Nacl, pH 8.0. The optical dentist is recorded at 254 nm.
  • FIG. 2 is a schematic representation of the vector pTGl 1025 comprising the gene conferring resistance to kanamycin (kana), the origin of replication of ColEl, the CMV promoter (pCMv) of cytomegalovirus, the intron of the gene coding for Hydroxy-Methylglutaryl-Coenzyme A Reductase (HMG), the cDNA coding for dystrophin and a polyadenylation sequence of transcribed RNAs (pA).
  • Figure 3 illustrates a chromatogram after gel filtration on Sephacryl S500
  • Figure 4 illustrates the progressive elimination of endotoxins from an alkaline lysate by 3 successive extractions with 1% or 3% of Triton TM X-1 H followed by ethanol precipitation.
  • Figure 5 illustrates the selective precipitation of contaminating RNAs from an alkaline lysate in the presence of increasing molarities of ammonium sulfate (0 to 3.2 M final).
  • Figure 6 illustrates the selective precipitation of contaminating RNAs from an alkaline lysate in the presence of increasing molarities of calcium chloride (10 to 100 mM). The final molarity in CaCl is indicated under the lines concerned.
  • S deposit of a fraction sample of soluble material obtained after treatment with CaCI 2 ;
  • I. deposition of a fraction of the sample of insoluble material obtained after treatment with CaCl 2 ;
  • the following examples illustrate only one embodiment of the present invention.
  • the solutions defined below were prepared from stock solutions or commercially obtained chemicals.
  • E. coli MC 1061 (Wertman et al., 1986, supra) and the plasmid pCHl ION are used. It is a 8.5 kb plasmid, the maintenance of which in E. coli is ensured by an origin of replication (ColEl) and a gene for resistance to ampicillin, both derived from pBR322.
  • the gene of interest consists of the reporter gene ⁇ -galactosidase from E. coli whose expression can be easily detected by X-Gal (4-chloro-5-bromo-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside) staining. It is provided in its 3 ′ part with a sequence coding for a eukaryotic nuclear localization signal.
  • the nuclear localization of the recombinant ⁇ -galactosidase makes it possible to overcome the problems of background noise generated by the cross-reaction with the endogenous ⁇ -galactosidase of the host cell also detectable by Xgal, and therefore to ensure specific detection of the enzymatic activity resulting from the transfected plasmid.
  • Expression of the reporter gene is directed by the SV40 early promoter.
  • MCI 061 cells are made competent by treatment with calcium chloride and transformed by the plasmid pCHUON.
  • the recombinant bacteria are selected in a selective medium. A clone is chosen by examining the restriction profiles from which a primary glycerol stock is constituted.
  • the content of the fermenter is distributed in clean and sterile centrifugation pots (Nalgene, ref 3122- 1000, 3122-1010, 3120-1000 or 3120-1010) and the transformed cells recovered by centrifugation at low speed (5000 rpm (revolutions per min) for 30 min) and at 4 ° C.
  • the cells thus collected constitute the wet cellular biomass.
  • the frozen pellet is fragmented and the quantity of biomass which it is desired to process is removed using a spatula. Thereafter, the volumes of the solutions used are given for 27 g of wet biomass.
  • the cells are taken up in 320 ml of resuspension buffer (10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8) previously equilibrated at 4 ° C and resuspended using a shear homogenizer (Ultra Turrax-25 provided with a probe 18 mm in diameter) before being lyzed in the presence of 320 ml of lysis buffer (1% SDS, 0.2 M NaOH) balanced at 20 ° C.
  • the lysis is allowed to continue for 5 min at room temperature with gentle stirring of the preparation by inversion, then 320 ml of acid solution (CH3COOK 3 M pH 5.5) equilibrated at 4 ° C.
  • the acidified cell lysate is left for 20 min at 0 ° C by regularly carrying out gentle agitation by inversion.
  • the final pH is 5.1.
  • the flocculate is first coarsely removed by low speed centrifugation
  • the supernatant is subjected to two successive filtrations on frits of controlled porosity (16 to 40 ⁇ m then 10 to 16 ⁇ m; frits No. 3 and 4, Schott AG) using a vacuum flask connected to a water pump. or an equivalent vacuum source.
  • the filtrate is subjected to a concentration step by ultrafiltration on a cartridge
  • the nucleic acids contained in the filtrate are precipitated by adding 0.7 volume of isopropanol maintained at 20 ° C.
  • the mixture is homogenized by successive inversion, incubated for 5 min at room temperature and the precipitate collected by centrifugation at 10,000 rpm for 30 min at 4 ° C (GSA rotor, Sorvall) After removal of the supernatant, the nucleic acid pellet is washed 2 times in a row with 50 ml of an 80% ethanol solution in water (equilibrated at around -20 ° C) and again recovered by centrifugation at 10,000 rpm for 15 min at 4 ° C Endotoxin extraction
  • the pellet is dried and dissolved in 18 ml of a sodium acetate solution (0.3 M CH 3 COONa in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) and stored for thirty minutes at 0 ° C. 2 ml of a 10% (weight / volume) Triton TM Xl 14 solution (Sigma; reference Xl 14 TM) are added in 0.3 M CH 3 COONa at pH 5.5 (final concentration of Triton 1%) and the mixture is homogenized by manual stirring. After incubation for 10 min on ice then 25 min at 52 ° C, the lower phase obtained after centrifugation (SLA 1500 rotor, Sorvall) at 10,000 rpm for 10 min at 35 ° C is removed and eliminated.
  • SLA 1500 rotor, Sorvall the lower phase obtained after centrifugation at 10,000 rpm for 10 min at 35 ° C is removed and eliminated.
  • the centrifugation pellet is dried under vacuum and taken up in 9.4 ml of 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8 at room temperature. Solid ammonium sulphate (NH4) SO 4 is added so as to have a final concentration of approximately 2 M. After mixing by inversion and incubation 20 min on ice, centrifuging for 30 min at 7,000 rpm (rotor SLA 1500, Sorvall) and at 4 ° C. A second centrifugation under identical conditions is carried out on the supernatant recovered from the first in order to complete the elimination of the insolubles.
  • NH4 SO 4 Solid ammonium sulphate
  • the column is balanced in 2 volumes of TEN before applying a volume of sample of nucleic acids representing 4 to 5% of the volume thereof.
  • the collection and detection of fractions is automated (LKB 2212 fraction collector and LKB 2158 Uvicord SD detector fitted with a 254 nm filter).
  • the 3 min fractions are removed and frozen before being analyzed.
  • Figure 1 illustrates a chromatogram obtained on a smaller scale but representative of the process. Plasmid DNA leaves the exclusion volume while RNA and proteins are retained and only appear later. Note the clear separation, with a return to practically the baseline, obtained between the peak of plasmid DNA elected first and the peak of RNAs elected second.
  • the fractions containing the plasmid DNA are combined and concentrated approximately 8 ⁇ using a Sartocon-Micro type ultrafiltration unit with a polysulfone membrane having a cutoff threshold of 100 kDa (Sartorius, reference 15669-00- 1 Alternatively, and when a larger quantity of sample has to be processed, an EasyFlow ultrafiltration unit with a cellulose acetate membrane can be used (20 kDa cut-off threshold, Sartorius, reference 14549-0S-1 V) .
  • the purified plasmid DNA sample is precipitated by adding a solution of Na acetate (3M, pH 5.5) to the final concentration of 0.3 M and addition of 2.5 volumes of pure ethanol (99.95%) at -20 ° C. After incubation at -20 ° C (30 min), the plasmid DNA is recovered by centrifugation at 10,000 rpm for 30 min at 4 ° C (SLA 1500 rotor, Sorvall). The pellet is washed with 80% ethanol at approximately -20 ° C., then dried and taken up in the appropriate conditioning buffer (TE, 0.9% NaCl, Hepes Ringer, Lactate Ringer, H 2 O; approximately 20 ml per aliquot of 27 g of treated cells).
  • TE 0.9% NaCl
  • Hepes Ringer Lactate Ringer
  • H 2 O approximately 20 ml per aliquot of 27 g of treated cells
  • the DNA concentration is calculated using an OD 2o o corresponding to 50 ⁇ g ml as a basis. It can then be adjusted to 1.0 mg / ml by dilution with the conditioning buffer, and approximately 20 mg of plasmid DNA are typically obtained per aliquot of 27 g of initial biomass.
  • the E. Coli DH10B Electro Max strain is supplied by Gibco BRL (Reference
  • the 18.7 kb plasmid pTG1 1025 (FIG. 2) carries a marker gene which confers on bacteria the ability to resist kanamycin (gene coding for an aminoglycoside 3 ′ phosphotransferase transforming the antibiotic into an inactive derivative) and the origin of the ColEl replication, these two elements ensuring the maintenance of the plasmid in the producing strain. It also comprises an expression cassette for the cDNA coding for dystrophin under the control of the CMV promoter associated with the HMG intron.
  • the competent DH10B cells are transformed by the plasmid under the conditions recommended by the supplier and a primary glycerol stock is stored at -80 ° C. after selection of a recombinant clone.
  • a batch of primary seed is used to constitute a preculture in a vial on LB2x medium in the presence of kanamycin 50 ⁇ g / ml.
  • the culture is incubated at 30 ° C in a thermostatically controlled shaker (180 rpm) for 14 to 16 hours.
  • the transformed strain is propagated in a 20 liter fermenter. Growth is carried out at 30 ° C. in a complex culture medium (Hycase SF 37.5 g / l, Yeast Extract 9 g / l supplemented with growth factors and mineral salts) using glycerol as carbon substrate (20 g / 1 ) and in the presence of kanamycin (50 ⁇ g / ml) for the selection pressure.
  • the pH 7.0 is regulated by automatic addition of sodium hydroxide (NaOH, 30%) and sulfuric acid (H 2 SO, 2 M).
  • the dissolved oxygen is maintained at a saturation greater than or equal to 25% (aeration rate of lv.vm (10 1 min * 1 ) and a variable stirring speed. It may be advantageous to add kanamycin in culture course.
  • the culture is stopped by cooling to 4 ° C when the bacteria reach the stationary growth phase
  • the culture is withdrawn and the biomass harvested by centrifugation (Sorvall RC3B centrifuge, 15 mm, 4 ° C, 5000 rpm)
  • the cell pellet is preserved at -20 ° C. until application of the process for the purification of the plasmid pTG 1 1025
  • the purification is carried out from 360 g of wet biomass taken up in 3840 ml of resuspension buffer and lysee with an equivalent volume of lysis buffer then of acid solution
  • the filtrate is separated into 6 aliquots
  • the precipitation with isopropanol, the washes with ethanol 80%, the stages of extraction of the endotoxins with Triton TM Xl 14, the precipitation with ethanol and the washes with ethanol 80% subsequent are carried out on each of the aliquots as described in Example 1
  • the samples are pooled for precipitation with ammonium sulphate at a final mol of 2 M
  • the centrifugation supernatant harvested after the ammonium sulfate precipitation step is loaded onto a column of Sephacryl S500 gel filtration with a volume of 5 liters (length 82 cm, diameter 8.9 cm) developed at a flow rate of 15 ml / mm (14.5 cm / h)
  • the chromatogram obtained ( Figure 3) shows that the plasmid DNA is eluted in the exclusion volume, while the contaminating RNAs and other compounds of small molecular weights are retained on the column
  • the fractions containing the purified plasmid DNA are pooled and concentrated by ultrafiltration (factor 10.9)
  • the plasmid DNA is then precipitated by adding sodium acetate to a final concentration of 0.3 M and 2.5 volumes of 99.95% ethanol at -20 ° C -
  • the precipitate is collected by centrifugation (10,000 rpm at 4 ° C, SLA 1500 rotor Sorvall, 30 min) and washed with 200 ml of 80% ethanol.
  • the DNA is taken up in the TE conditioning buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), its concentration measured by UV spectrometry and adjusted to 1 mg / ml in the same buffer. . Typically 145 mg of purified plasmid DNA is obtained.
  • the integrity of the plasmid is evaluated by restriction enzyme mapping and the profiles obtained correspond to what is expected. Furthermore, the presence of contaminants is also determined in the final preparation and the results presented below.
  • the functionality of the purified plasmid pTG 1 1025 is verified by transfection of cell lines and demonstration of the recombinant dystrophin by immunofluorescence.
  • plasmid DNA Ten ⁇ g of purified plasmid DNA are combined with 40 ⁇ g of Lipofectin (a mixture of compounds facilitating the transfection of eukaryotic cells) according to the supplier's instructions (Life Technologies, Bethesda, USA, reference 18292-001 1), then are added, in 2 ml of DMEM medium (Life Technologies, Bethesda, USA, reference 1 1963), at 2.5 ⁇ 10 6 A549 cells (human pulmonary adenocarcinoma) seeded in the day before in a 35 mm diameter dish, cultured 24 hours in the presence of DMEM medium supplemented with 10% (vol / vol) of fetal calf serum (Life Technologies.
  • a mouse monoclonal antibody of anti-dystrophin Novocastra, Newcastle / Tyme, UK, reference NCL-DYS2
  • an anti-mouse rabbit antibody ICN, Costa Mesa, USA, reference 651713
  • FITC fluorescein thiosisocyanate
  • Triton TM Xl 14 extraction tests were carried out on an alkaline lysate as obtained in Example 1 in order to determine the optimal concentrations of Triton TM Xl 14 to be used and the number of extracts to be carried out for reduce the level of endotoxins below the tolerated threshold ( ⁇ 2 EU / dose).
  • the initial alkaline lysate is divided into 2 batches subjected to 3 consecutive extractions in the presence of Triton TM Xl 14 at a final concentration of 1 and 3% respectively.
  • the mixture is homogenized, incubated on ice (0 ° C) for a few minutes, centrifuged for 5 minutes (12,000 rpm, Eppendorf centrifuge, reference 5414) at room temperature.
  • the lower phase Triton TM Xl 14 and extracted endotoxins
  • the upper aqueous phase (Extr 1; remaining nucleic acids and endotoxins) treated again as described with 1% or 3% of Triton , M X-14 after removal of an aliquot used for the determination of endotoxins (Extr. 2 and 3)
  • the upper phase is precipitated by adding 2.5 volumes of absolute ethanol. The precipitate is taken up in 10 mM Tris-HCl, I mM EDTA, pH 8 (Final)
  • the level of endotoxins is measured by a colorimetric test derived from the LAL method, using the Biogenic COATEST kit (reference 822387) and the results presented in Figure 4 There is a significant reduction in the level of endotoxins after two extractions in the presence of Triton 1% A similar result is obtained when 3% of Triton TM Xl 14 is used. In both cases, the endotoxin level measured in the final product is compatible with pharmaceutical use for an average dose of 1 mg of plasmid DNA.
  • the precipitated material recovered by centrifugation and the soluble material are analyzed by electrophoresis on 0.4% agarose gel. After staining with ethidium bromide and revelation by UV fluorescence, the plasmid DNA appears in the form of clear bands corresponding to the different topoisomers. On the contrary, the RNAs form a very diffuse band migrating in the lower part of the gel.
  • RNAs were also tested in the presence of calcium chloride (CaCl 2 ).
  • the soluble and insoluble fractions are separated by centrifugation, and the insoluble pellet is resuspended in a buffer of low ionic strength in the absence of CaCl 2 .
  • the soluble and insoluble samples are analyzed by agarose gel electrophoresis and staining with ethidium bromide of a sample fraction in order to separate the plasmid DNA (open circular and overwound forms) and the contaminating RNAs.
  • the removal efficiency of the colored pigments present after the alkaline lysis step was evaluated during the steps of concentration by ultrafiltration, precipitation with isopropanol and washing with l 80% ethanol
  • the presence of these pigments results in a yellow coloration of the crude alkaline lysate before its concentration by ultrafiltration which can be analyzed by measuring the optical density at 340 nm. This absorbance was therefore measured on the samples obtained after the initial ultrafiltration, precipitation and washing steps with isopropanol and 80% ethanol.
  • Two series of experiments were carried out, one involving the filtration of the alkaline lysate on glass frit, the other on a Sartopure PP polypropylene cartridge.
  • the initial lysates are obtained from 150 g of a cellular biomass resulting from two fermentations of the pair £. coli strain DH5 x plasmid pTGl 1025 (-19 kbp).
  • the E. coli DH5 Library Efficiency strain (Life Technologies; ref. 18262-014) is transformed with the plasmid pTG1 1025 (see example 2 and FIG. 2).
  • the stages of processing, preparation and harvesting of the biomass are identical to those described in Example 2.
  • the crude lysate is filtered on a Sartopure PP2 filter cartridge (Sartorius, ref. 5591302P9-0) at a flow rate of 700 ml / min using a peristaltic pump.
  • the filtrate is then concentrated by ultrafiltration on a Millipore Minipellicon II membrane in regenerated cellulose type PL300 with a surface area of 0.1 m 2 (ref. P2C300C01) (recirculation flow -400 ml / min., Draw-off flow between 60 and 30 ml / min so as to maintain an average transmembrane pressure less than or equal to 0.5.10 5 Pa).
  • the nucleic acids thus concentrated (815 ml) are treated with isopropanol and ethanol as previously described in Example 2.
  • the endotoxins are eliminated by three successive extractions with Triton TM X-1 14.
  • the nucleic acids are precipitated.
  • the residual salts and nonionic detergent are rinsed with aqueous ethanol.
  • the nucleic acids are taken up in a 10 mM Tris, 1 mM EDTA buffer, pH 7.5 and the RNAs are specifically precipitated in the presence of final 100 mM CaCl 2 . These RNAs are removed by centrifugation (10,000 rpm, Sorvall rotor, SLA1500, temperature 20 ° C, 40 min.).
  • the plasmid DNA present in the soluble phase is precipitated by the addition of isopropanol and resolubilized in a 10 mM Tris buffer, 1 mM EDTA, 250 mM NaCl, pH ⁇
  • the plasmid DNA is concentrated by ultrafiltration on an EasyFlow unit with a cellulose triacetate membrane with a cutoff threshold of 20 kDa (Sartorius, ref. 14549-OS-1 V). After precipitation with ethanol in the presence of sodium acetate, the plasmid DNA is washed with 80% ethanol and dried under vacuum then taken up in a 10 mM Tris conditioning buffer, 1 mM EDTA, pH 7.5 and stored frozen at -20 ° C not a word

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un ADN plasmidique à partir d'une biomasse cellulaire humide comprenant après la resuspension de ladite biomasse, une étape de lyse alcaline, une étape d'acidification à force ionique élevée, une étape d'élimination des insolubles, une étape de réduction des endotoxines et des ARN contaminants, une étape de chromatographie de gel de filtration et une étape de conditionnement. Elle a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un ADN plasmidique ainsi préparé et son utilisation à des fins de thérapie génique.

Description

PROCEDE DE PREPARATION D'ADN PLASMIDIQUE
La présente invention a pour objet un nouveau protocole de purification d'ADN plasmidique permettant de produire en grande quantité un ADN d'une qualité pharmaceutique acceptable pour une utilisation chez l'homme. Elle concerne également une composition pharmaceutique comprenant l'ADN ainsi obtenu et son utilisation pour le transfert d'un acide nucléique dans une cellule hôte. L'invention présente un intérêt tout particulier pour des perspectives de thérapie génique.
Le transfert de gènes dans une cellule donnée est à la base même de la thérapie génique. Cette nouvelle technologie dont le champ d'application est vaste, permet d'envisager le traitement de maladies graves pour lesquelles les alternatives thérapeutiques classiques sont peu efficaces voire inexistantes et concerne aussi bien les maladies génétiques (hémophilie, mucoviscidose, myopathie....) qu'acquises (cancer, syndrome d'immunodéficience acquise SIDA, ...). L'approche la plus pratiquée consiste à utiliser un véhicule viral pour introduire l'acide nucléique thérapeutique dans la cellule à traiter et, en particulier, rétroviral et adénoviral. En effet, les virus ont développé des mécanismes sophistiqués pour traverser les membranes cellulaires, échapper à la dégradation au niveau des lysosomes et faire pénétrer leur génome dans les noyaux afin d'assurer l'expression du gène thérapeutique. Cependant, l'approche virale a ses limitations, notamment une capacité de clonage restreinte, une production potentielle de particules virales compétentes pour la replication susceptibles de dissémination dans l'organisme hôte et l'environnement, un risque de mutagénèse insertionnelle dans le cas des vecteurs rétroviraux et, pour ce qui est des vecteurs adénoviraux, une induction de réponses immunitaires et inflammatoires chez l'hôte qui entravent les répétitions de traitement. Ces inconvénients importants dans le cadre d'un usage humain justifient la recherche de systèmes alternatifs de transfert d'acides nucléiques.
De plus en plus de méthodes de transfert de gènes font appel à des vecteurs non viraux. Une des plus employées consiste à délivrer l'acide nucléique thérapeutique au moyen de vecteurs synthétiques, tels que les lipides cationiques qui interagissent spontanément avec l'acide nucléique pour former des complexes chargés positivement capables de fusionner avec les membranes cellulaires anioniques et faire pénétrer l'acide nucléique qu'ils transportent (voir par exemple Behr, Bioconjugate Chemistry ( 1 94) 5 : 382). Une méthode dite biolistique ("gène gun") par bombardement des cellules par des microprojectiles métalliques recouverts d'ADN a été récemment employée dans le cadre d'un essai anti-SIDA (Woftendin et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2889-2894). Enfin, une approche encore plus simple peut également être envisagée par administration directe de l'ADN nu, notamment dans le cadre des maladies touchant les muscles par injection intramusculaire. Ces méthodes non virales mettent généralement en oeuvre un vecteur plasmidique portant le gène thérapeutique et les éléments nécessaires à son expression.
La réalisation d'essais cliniques reposant sur des méthodes non virales nécessite de pouvoir produire des quantités importantes d'ADN plasmidique de qualité pharmaceutique. Les méthodes classiquement utilisées ne sont pas optimales puisqu'elles utilisent des enzymes d'origine animale (lysozyme, protéinase, ribonucléase...), des solvants organiques connus pour leur toxicité (phénol, chlorophorme) et des composés mutagènes (bromure d'éthidium) susceptibles de contaminer le produit final. De plus, leur mise en oeuvre à l'échelle industrielle est difficilement réalisable.
Les demandes internationales WO95/21250 et WO96/02658 décrivent des procédés de préparation d'ADN plasmidique sous forme purifiée utilisables pour des essais humains. Cependant, il est connu que diverses variables peuvent influencer l'efficacité de méthodes préparatives, notamment le plasmide à purifier, sa taille, le microorganisme qui le produit, les conditions et le milieu de fermentation. Dans ce contexte, il est avantageux de pouvoir disposer d'une nouvelle méthode pour la production de grandes quantités d'ADN plasmidique de qualité pharmaceutique.
On a maintenant trouvé une nouvelle méthode de préparation d'ADN plasmidique comprenant une succession d'étapes simples à mettre en oeuvre, évitant l'usage de produits d'origine animale, toxiques et mutagènes tels que ceux cités ci-avant et adaptables à l'échelle industrielle. L'ADN est produit avec un rendement élevé, sous forme substantiellement pure et d'une qualité compatible avec un usage humain. Les contaminations résiduelles par les protéines, endotoxines, ARN et ADN génomique du microorganisme producteur sont particulièrement faibles voire non détectables par les techniques standards de détection. Les exemples qui suivent montrent également que ce procédé permet la purification de manière efficace d'un plasmide de grande taille incorporant l'ADNc de la dystrophine destiné au traitement de la myopathie de Duchenne.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé pour préparer un ADN plasmidique à partir d'une biomasse cellulaire humide récoltée après fermentation d'une cellule productrice comprenant ledit ADN plasmidique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) lyse alcaline de la biomasse resuspendue, après resuspension de la biomasse cellulaire humide b) acidification à force ionique élevée, c) élimination des insolubles, d) réduction des endotoxines et des acides ribonucléiques (ARN), e) chromatographie de gel filtration, et f) conditionnement.
Au sens de la présente invention "ADN plasmidique" désigne un élément cellulaire extrachromosomique formé d'une molécule d'ADN généralement circulaire capable de replication autonome dans une cellule productrice (la cellule dans laquelle il est amplifié). Le choix des plasmides utilisables dans le procédé de la présente invention est vaste. Ils peuvent être d'une origine quelconque (procaryote, eucaryote) ou être formés par l'assemblage d'éléments variés. D'une manière générale, les plasmides sont connus de l'homme de l'art. Un grand nombre d'entre eux sont disponibles commercialement mais, il est également possible de les construire par les techniques de manipulation génétique (Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Il peut s'agir d'un vecteur de clonage ou d'expression dérivé par exemple de pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagéne), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) ou encore p Poly (Lathe et al., 1987, Gène 57, 193-201).
Avantageusement, un plasmide mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention possède les éléments génétiques qui lui permettent de se répliquer de manière autonome dans la cellule productrice et, de manière optionnelle, dans une cellule hôte (cellule dans laquelle l'effet thérapeutique est recherché). De tels éléments peuvent être constitués entre autre par une origine de replication assurant l'initiation de la replication dans une bactérie, une levure, un champignon ou une cellule mammifère. Elle peut être isolée d'un procaryote (ColEl ...), d'un eucaryote (2μ ou ARS pour séquence à replication autonome), d'un virus (SV40 ori du virus simien 40, oriP du virus Epstein Barr EBV . ) ou d'un bactériophage (flori..). Le choix de l'origine de replication appropriée est à la portée de l'homme de l'art. Par exemple, pour un plasmide destiné à être produit dans le microorganisme Escherichia coli (E. coli), on retiendra l'origine ColEl . De plus, si l'on désire qu'il soit autoreplicatif dans une cellule hôte mammifère, il comprendra également une origine fonctionnelle chez un eucaryote par exemple oriP et pourra inclure le gène codant pour la protéine EBNA- 1 du virus EBV nécessaire à la replication à partir de cette dernière (Lupton et Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542 , Yates et al., Nature 313, 812-815).
Par ailleurs, un plasmide en usage dans la présente invention peut en outre comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées (cellules productrices et/ou cellules hôtes). On peut appliquer les méthodes de sélection reposant sur le principe de cellules productrices déficientes (par mutations auxotrophes ou introduction d'un gène léthal) incapables de pousser en l'absence d'un plasmide portant un gène complémentant cette déficience (par exemple système dap décrit dans la demande EP 0 258 1 18, complémentation d'une mutation d'auxotrophie, usage de gènes codant pour un tARN suppresseur sup E, supF...). Une autre pratique couramment employée consiste à intégrer dans le plasmide un gène codant pour la résistance à un antibiotique (ampicilline, anamycine, tétracycline....). Bien entendu, il peut comprendre des éléments supplémentaires améliorant son maintien et/ou sa stabilité dans une cellule hôte ou productrice. A cet égard, on peut citer la séquence cer dont la présence favorise le maintien monomérique d'un plasmide (Summers et Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1 103) et certaines séquences d'origines virales (LTR de rétrovirus, ITR d'un virus associé à l'adénovirus ...) ou cellulaires permettant l'intégration dans les chromosomes de la cellule hôte.
Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, un plasmide en usage dans la présente invention est destiné à transporter un ou plusieurs gène(s) d'intérêt thérapeutique dans une cellule hôte. D'une manière générale, le gène d'intérêt peut coder pour un ARN antisens, un ARN messager qui sera ensuite traduit en polypeptide d'intérêt, un ribozyme ou encore un ARN conférant un bénéfice thérapeutique direct (ARN VA d'un adénovirus capable de réprimer la réponse immunitaire, ARN activant la synthèse d'interféron) (Abbas et al. in Cellular and Molecular Immunology , W.B., Saunders Company Harcourt Brace Jovanovich, Inc. p. 228).
Le gène d'intérêt peut être isolé par toute technique conventionnelle telle que clonage, PCR (Polymerase Chain Reaction) ou encore synthétisé chimiquement. Il peut être de type genomique (muni d'un ou plusieurs introns) ou ADN complémentaire (ADNc). Le polypeptide d'intérêt peut être constitué par une protéine mature, un précurseur et, notamment un précurseur destiné à être sécrété et comprenant un peptide signal, une protéine tronquée, une protéine chimère provenant de la fusion de séquences d'origines diverses ou encore une protéine mutée présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées.
A titre d'exemples, on peut avoir recours à un gène d'intérêt sélectionné parmi ceux codant pour les polypeptides suivants :
cytokines ou lymphokines (interférons α, β et γ, interleukines et notamment l'IL-2, l'IL-6, riL-10 ou l'IL- 12, facteurs nécrosant des tumeurs (TNF), facteurs stimulateurs de colonies (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...) ; récepteurs cellulaires ou nucléaires, notamment ceux reconnus par des organismes pathogènes (virus, bactéries, ou parasites) et, de préférence, par le virus VIH (Virus de l'Immunodéficience Humain) ou leurs ligands ; - protéines impliquées dans une maladie génétique (facteur VII, facteur VIII, facteur
IX, dystrophine ou minidystrophine, insuline, protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), hormones de croissance (hGH) , enzymes (uréase, rénine, thrombine....) ; inhibiteurs d'enzymes (α 1 -antitrypsine, antithrombine III, inhibiteurs de protéases virales...) ; polypeptides à effet anti-tumoral capables d'inhiber au moins partiellement l'initiation ou la progression de tumeurs ou cancers (ARN anti-sens, anticorps, inhibiteurs agissant au niveau de la division cellulaire ou des signaux de transduction, produits d'expression des gènes suppresseurs de tumeurs, par exemple p53 ou Rb, protéines stimulant le système immunitaire....) ; protéines du complexe majeur d'histocompatibilité des classes I ou II ou protéines régulatrices agissant sur l'expression des gènes correspondants , polypeptides capables d'inhiber une infection virale, bactérienne ou parasitaire ou son développement (polypeptides antigéniques ayant des propriétés immunogènes, épitopes antigéniques, anticorps, variants trans-dominants susceptibles d'inhiber l'action d'une protéine native par compétition ) , toxines ( thymidine kinase de virus simplex de l'herpès 1 (TK-HSV-1), ricine, toxine cholérique, diphtérique ) ou immunotoxines , et marqueurs (β-galactosidase, luciférase . )
Bien entendu, le gène d'intérêt peut être place sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans la cellule hôte Par "éléments nécessaires a son expression", on désigne l'ensemble des éléments permettant sa transcription en ARN et la traduction d'un ARNm en polypeptide Parmi ceux-ci le promoteur revêt une importance particulière II peut dériver d'un gène quelconque (eucaryote, viral, promoteur naturel du gène d'intérêt en question ) ou peut être artificiel Par ailleurs, il peut être constitutif ou réguiable Alternativement, il peut être modifié de manière à améliorer l'activité promotrice, supprimer une région inhibitπce de la transcription, modifier son mode de régulation, introduire un site de restriction, On peut mentionner, a titre d'exemples, les promoteurs viraux CMV (Cytomegalovirus), RSV (Rous Sarcoma Virus), du gène TK du virus HSV- 1, précoce du virus SV40, adénoviral MLP, , ou encore les promoteurs eucaryotes des gènes PGK (Phospho Glycerate kinase) murin ou humain, αl-antitrypsine (foie-specifique), immunoglobulines (lymphocyte-spécifique)
De tels éléments peuvent également comprendre des éléments additionnels tels que introns, séquence signal, séquence de localisation nucléaire, séquence terminatπce de la transcription (polyA), site d'initiation de la traduction de type IRES ou autre, etc
Un plasmide en usage dans la présente invention est amplifié dans une cellule productrice avant d'être purifie selon le procédé de la présente invention On préfère tout particulièrement les bactéries gram négatif et, notamment, E. coli A titre indicatif, on peut citer les souches DH5 (Grant et al , 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87, 4645-4649), MC1061 (Wertman et al , 1986, Gène 49, 253-262) et ses dérivées comme DH10B (Grant et al , 1990, supra) Etant donne qu'il s'agit d'une technologie largement connue a ce jour, il ne sera procédé qu'à une description brève de la manière d'opérer pour introduire un plasmide dans une bactérie et l'amplifier. Toutes les techniques conventionnelles peuvent être employées dans le cadre de la présente invention (traitement par les chlorures de calcium, de rubidium, d'hexamine cobalt, par des agents réducteurs, par le DMSO, électroporation, transduction, liposomes, ... ; Maniatis et al., 1 89, supra). Les cellules productrices ainsi transformées sont ensuite cultivées selon les pratiques générales de l'art (fermentation en continue "batch" ou alimentée "fed batch"). Les conditions de culture peuvent être facilement établies par l'homme du métier sur la base des connaissances générales dans ce domaine et du système de sélection porté par le plasmide. Leur récolte est effectuée selon les techniques habituelles, comme la filtration ou encore la centrifugation à faible vitesse, pour générer la biomasse cellulaire humide laquelle peut, à ce stade, être congelée ou stockée à 4°C avant d'être soumise au procédé selon l'invention.
Selon le procédé de l'invention, on effectue la lyse de la biomasse cellulaire humide après avoir procédé à sa resuspension. On emploie généralement un tampon de resuspension légèrement basique pour neutraliser le caractère acide de la pâte cellulaire et de force ionique faible ne présentant pas ou peu d'effets lyriques sur les cellules transformées. Sa composition et son pH peuvent varier en particulier en fonction de la cellule productrice, du milieu de culture employé ou tout autre paramètre. L'homme de l'an est en mesure d'élaborer un tampon de resuspension approprié. On peut citer à titre d'exemple un tampon contenant de l'EDTA (concentration de 1 à 50 M, de préférence 10 mM) et du Tris-HCl
(concentration de 10 à 100 mM, de préférence 50 mM) tamponné à un pH d'environ 8. Les cellules peuvent être resuspendues par tout moyen technique habituel tel que agitation rectilineaire, pipetage répété et/ou homogénéisateur (vortex, homogénéisateur par cisaillement...). L'étape de lyse alcaline permet de libérer le contenu cellulaire et en solubiliser tous les composants. Protéines, ARN et ADN sont dénaturés y compris l'ADN plasmidique dont les deux brins homologues restent enchevêtrés, à la différence de l'ADN genomique. Il peut être avantageux d'effectuer la lyse alcaline en présence d'un détergent et, de préférence, d'un tensioactif anionique. Le choix de la base et du tensioactif n'est pas limité. A cet égard, la combinaison soude et SDS (sodium dodécylsulfate) est préférée, notamment à des concentrations finales aux environs de 0, 1 M et 0,5 % respectivement. Le pH final de la solution de lyse est, de préférence, compris entre 1 1 et 13 et, de manière optimale, entre 12,2 et 12,4. On indique qu'il est préférable de mélanger les cellules transformées resuspendues et la solution de lyse d'une manière douce, par exemple par inversion, afin de minimiser les cassures de l'ADN cellulaire genomique qui serait alors susceptible de contaminer la préparation d'ADN plasmidique. Bien qu'il ne s'agisse pas d'un mode préféré, il est néanmoins possible dans le cadre de la présente invention de faciliter la lyse cellulaire par chauffage à température élevée (voir par exemple la demande internationale WO96/02658) ou l'emploi d'enzymes animales dégradant les membranes cellulaires (lysozyme...) La seconde étape du procédé selon l'invention résulte en une acidification à haute force ionique du lysat obtenu précédemment L'acidification se fait de préférence d'une manière brutale, c'est à dire en une seule fois. Dans ces conditions, l'ADN plasmidique est renaturé rapidement alors que la grande majorité des protéines, de l'ADN genomique dénaturé et des espèces d'ARN insolubles en condition de force ionique élevée floculent. Dans le cadre de la présente invention, on met en oeuvre une solution comprenant un tampon ou un acide fort combiné à un sel dont le pH est compris entre 4,5 et 6,5 Selon un mode de réalisation avantageux, on utilise une solution d'acétate de potassium de préférence, à une concentration finale proche de 1 M, de manière à obtenir un pH final d'environ 5, 1 Mais, on aurait également pu avoir recours à une solution d'acétate de sodium de pH et de concentration tels qu'indiqués ci-dessus
On procède ensuite à l'élimination des insolubles constitués par les débris cellulaires et les floculats de macromolécules. Ceci peut être réalisé par toute technique conventionnelle de filtration ou centrifugation. Il peut être judicieux d'éliminer la majorité des insolubles d'abord par centrifugation puis de poursuivre la clarification par filtration De nombreux filtres peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention à la condition qu'ils retiennent les insolubles et laissent passer l'ADN plasmidique. Avantageusement, le filtre choisi aura une porosité comprise entre 1 et 100 μm, plus avantageusement 2 et 75 μm, de préférence 5 et 75 μm, de manière tout à fait avantageuse, 3 et 50 μm,et, de manière tout à fait préférée, 10 et 50 μm II peut être en matière synthétique comme le nylon. organique comme la cellulose ou non organique comme le verre Selon un mode de réalisation avantageux, on procède à des filtrations successives à l'aide de filtres de porosités décroissantes, par exemple une première filtration sur verre fritte d'une porosité comprise entre 100 et 40 μm (fritte N° 2, Schott AG), la seconde sur fritte de porosité 16 à 40 μm (fritte N° 3, Schott AG) et la dernière sur fritte de porosité 10 à 16 μm (fritte N° 4, Schott AG)
Selon une autre variante, il est possible de procéder à une seule filtration en utilisant une cartouche en polypropylène Sartopure PP de porosité 8 μm (Réf 552 1302 P9-00-A) ou Sartopure PP2 de porosité 3 μm (Réf 559 1302 P9-00-A)
Selon un mode de réalisation optionnel mais particulièrement avantageux, le filtrat peut être concentré avant l'étape suivante de réduction des endotoxines Les moyens de concentrer un ADN dissous dans une solution aqueuse sont connus de l'homme de l'art. On peut citer l'ultrafiltration, la précipitation alcoolique ou encore une combinaison de ces deux techniques
En ce qui concerne l'ultrafiltration, diverses membranes peuvent être employées du moment qu'elles n'adsorbent pas ou peu l'ADN plasmidique dans les conditions d'utilisation. On aura avantageusement recours à des membranes dont le seuil de coupure est compris entre 20 et 300 kDa, de préférence entre 30 et 100 kDa Elles peuvent être de compositions variées, organiques ou non (poly(ether)sulfone, acétate de cellulose, ) Les membranes particulièrement adaptées sont celles de type YM (et notamment, YM30-76, Diaflo et YM30-4208, Centricon), celles équipant les unités Easy Flow (référence 14669-OS-l V ou 14669-OS-2V, Sartoπus) ou encore minipellicon 2 PL300 (Millipore en cellulose régénérée) L'ultrafiltration constitue à cette étape un moyen puissant de réduire la contamination de la préparation d'ADN plasmidique par des pigments d'origine cellulaire ou provenant du milieu de culture II est également possible de concentrer les acides nucléiques par précipitation alcoolique en présence d'éthanol ou d'isopropanol Les paramètres de précipitation tels que volume d'alcool à ajouter, température, présence de cations monovalents ainsi que la récupération du matériel précipité sont détaillés dans de nombreux ouvrages accessibles à l'homme du métier En particulier, la précipitation par l'isopropanol présente l'avantage de réduire encore la teneur en pigments, certains d'entre eux étant solubles dans la phase alcoolique Selon un mode préféré, le filtrat est en premier lieu concentré par ultrafiltration sur membrane polysulfone ayant un seuil de coupure d'environ 100 kDa à l'aide d'une unité de type Easy Flow (Sartorius) à usage unique ou sur membrane minipellicon 2 PL300 (Millipore) présentant un seuil de coupure d'environ 300 kDa. Une fois le volume réduit d'un facteur 5 à 20, les acides nucléiques sont précipités par addition de 0,7 volume d'isopropanol. Le matériel précipité est récupéré par centrifugation et peut être soumis à un ou plusieurs lavages dans l'éthanol à une concentration de 70 à 80 % afin de réduire les contaminants solubles dans l'alcool tels que les sels et, comme déjà mentionné, les pigments résiduels. Après séchage, les acides nucléiques sont repris dans un tampon approprié, par exemple du Tris-HCl 10 mM pH 8 contenant de l'EDTA à une concentration d'environ 1 mM pour inhiber les nucléases et de manière optionnelle de l'acétate de sodium (à une concentration finale d'environ 0,3 M permettant la précipitation des acides nucléiques après l'étape d'extraction au Triton). Il est intéressant de noter ici que les étapes d 'ultrafiltration et de précipitation à l'isopropanol sont particulièrement avantageuses pour éliminer la majorité des pigments de la préparation.
A ce stade, la préparation d'ADN plasmidique contient des quantités importantes d'ARNs et d'endotoxines et les étapes suivantes consistent en une réduction de leurs taux. Par réduction, on entend une diminution notable du taux d'endotoxines ou d'ARN entre le début et la fin de l'étape, d'un facteur d'au moins 100 et, de préférence, d'au moins 1000. La concentration en ARN et endotoxines peut être appréciée par des essais semblables à ceux décrits ci-après ou par tout autre méthodologie divulguée dans la littérature. Bien que les étapes puissent être permutées, on préfère en premier lieu agir sur les endotoxines puis sur les ARNs. Les endotoxines du fait de leur caractère pyrogène, doivent être considérablement réduites voire éliminées avant d'envisager une administration chez l'homme. En ce qui concerne les produits pharmaceutiques courants, la quantité maximale tolérable a été fixée par les autorités sanitaires à 5 unités (EU) par dose. Or, il a été montré que les procédés courants de préparation d'ADN plasmidique (ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium, chromatographie échangeuse d'anions, ...) laissent subsister de grandes quantités d'endotoxines (Cotten et al., 1994, Gène Therapy I, 239-246). Aux fins de la présente invention, on préférera avoir recours à une extraction en présence d'un détergent non ionique ayant un point nuage compris entre 15°C et 35°C, avantageusement 18°C et 30°C et, de préférence, 20°C et 25°C. Un détergent préféré est choisi parmi les polyoxyéthylènes. Des exemples de détergents utilisables selon la présente invention sont décrits dans le tableau suivant :
Figure imgf000013_0001
Les composés décrits précédemment sont des composés amphiphiles dont la irascibilité dans la phase aqueuse peut être contrôlée par variation de la température autour de leur point nuage. Avantageusement, selon le procédé de l'invention, la préparation d'ADN est refroidie à une température inférieure à 10°C avant d'ajouter ledit détergent. La concentration finale en détergent à utiliser peut être comprise entre 0,5 et 6%, avantageusement entre 1 et 5% et, de manière tout à fait préférée, aux environs de 1%. Dans ces conditions, ledit détergent est soluble dans l'eau et forme des micelles complexant les endotoxines. Après incubation et centrifugation du mélange ADN plasmidique / détergent à une température nettement supérieure au point nuage (par exemple >37°C dans le cas du Triton™ X-l 14), il y a séparation de deux phases : une phase aqueuse contenant l'ADN plasmidique et une phase contenant le détergent et les endotoxines. Lorsque le détergent choisi possède une densité supérieure à celle de la solution d'ADN, après séparation des phases par centrifugation, la phase aqueuse est localisée dans la partie supérieure du tube et la phase contenant le détergent et les endotoxines dans la partie inférieure, et inversement lorsque le détergent possède une densité inférieure à celle de la solution d'ADN. Pour des raisons techniques évidentes, on choisira de préférence un détergent ayant une densité supérieure à celle de la solution d'ADN. L'homme du métier dispose en outre des connaissances nécessaires lui permettant d'ajuster, si nécessaire, la densité de la solution d'ADN, en modifiant par exemple la concentration saline de ladite solution. Le procédé selon l'invention peut comprendre une ou plusieurs (de préférence 3) extractions successives telles que décrites ci-dessus.
Selon la présente invention, un détergent préféré est constitué par le Triton™ X-l 14 (octoxynol ou octylphenoxy-poly(éthylèneglycoéther)n avec n=7 ou 8) dont le point nuage est environ 20°C et la densité environ 1,06.
La présente invention concerne également une variante du procédé de l'invention selon laquelle le détergent non ionique choisi présente un point nuage situé en dehors de la gamme préconisée, et selon laquelle ladite température nuage est ajustée par l'addition d'une faible quantité d'un détergent anionique («Nonionic Surfactants», Chapter «Surfactant and Detersive Systems» in Kirk-Othmer Encyclopaedia of Chemistry, John WLLEY & Sons, 1995). Selon une variante intéressante du procédé selon l'invention, la réduction des endotoxines est suivie d'une étape de précipitation alcoolique de l'ADN plasmidique par incubation au froid (4°C, -20°C ou -80°C) en présence de 0,3 M d'acétate de sodium et environ 70 % d'éthanol. Le précipitât d'acide nucléique est récupéré classiquement par centrifugation. Il peut être lavé par une solution d'éthanol à 80 % dans l'eau avant d'être séché et redissous en milieu aqueux comme par exemple du Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM. Cette étape de précipitation, par ailleurs optionnelle, offre un moyen efficace d'éliminer les traces de Triton™ X-l 14résiduel. La réduction de la contamination par les ARN peut être réalisée par tout moyen connu de l'art, par exemple l'hydrolyse enzymatique au moyen d'une ribonucléase d'origine animale telle que la ribonucléase A pancréatique bovine. Mais, dans le cadre de la présente invention, on préfère avoir recours à une précipitation sélective des ARN dans des conditions de haute force ionique ou en présence d'agents déshydratants. Divers sels peuvent être utilisés et on mentionnera à titre indicatif, le chlorure de lithium (Ze'ev Lev, 1987, Analytical Biochemistry 160, 332-336), le chlorure de calcium, l'acétate d'ammonium et le sulfate d'ammonium. A ce titre, le sulfate d'ammonium constitue un mode de réalisation préféré, particulièrement à une concentration finale comprise entre 1 et 3,5 M, de préférence, entre 1,5 et 3 M et, de manière tout à fait préférée, entre 2 et 2,5 M. Selon une autre variante de l'invention, on peut utiliser du chlorure de calcium à une concentration finale comprise entre 10 mM et 2 M, avantageusement entre 20 mM et 0,5 M, et de manière préférée entre 50 mM et 0, 1 M. D'une manière optimale, après l'ajout du sel ou de la solution saline, le mélange est laissé sous agitation faible, éventuellement à température basse, pendant une durée variable (1 à 120 min), centrifugé et l'ADN plasmidique récupéré dans le surnageant.
Le procédé selon l'invention comprend à ce stade une étape de chromatographie d'exclusion sur supports de gel filtration, qui permet de parfaire la purification de la préparation d'ADN plasmidique (réduction des ARNs et protéines résiduels) et également d'assurer le dessalage. Le choix du support est large et à la portée de l'homme de l'art. On retiendra plus particulièrement, les supports agréés pour un usage humain ou vétérinaire par les autorités compétentes américaines (FDA pour Food and Drug Administration) et/ou les agences de l'Union Européenne et présentant une limite d'exclusion élevée et, notamment, supérieure ou égale à 20x10 Da (telle que mesurée sur des polymères comme les dextrans). On peut citer par exemple les supports Séphacryl S500 HR (Pharmacia, référence 17-0613- 01), S 1000 SF (Pharmacia, référence 17-0476-01) et GF2000 (Biosepra, référence 260651). Le support Séphacryl S500 est préféré dans le cadre de l'invention.
La colonne est initialement équilibrée dans des conditions salines limitant les interactions hydrophobes entre le support et l'ADN. Avantageusement, on utilise le tampon TEN (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM, et NaCl 100 mM). Les conditions de chromatographie peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres et notamment du volume de la colonne, du support choisi, de la concentration de la préparation en ADN plasmidique et de la taille de ce dernier. L'ADN plasmidique est exclu de la phase et est élue avant les contaminants de poids moléculaire inférieur. Les fractions le contenant peuvent être analysées par les techniques usuelles (absorbance à 254 nm, analyse visuelle après séparation par électrophorèse en gel d'agarose ...). Il est également possible de connecter la colonne à un détecteur muni d'un filtre (à 254 nm par exemple) pour la détection en ligne des fractions positives. On notera qu'un avantage du procédé selon l'invention consiste en l'élimination au cours de cette étape, du sel résiduel issu de l'étape précédente. Selon un mode de réalisation optionnel, les fractions obtenues après l'étape chromatographique peuvent être rassemblées et concentrées selon la méthodologie indiquée ci-avant (ultrafiltration et/ou précipitation alcoolique).
Enfin, le procédé selon l'invention comprend une étape de conditionnement de la préparation d'ADN plasmidique. Les tampons de conditionnement utilisables dans le cadre de la présente invention sont variés. 11 peut s'agir d'une solution saline physiologique (NaCl 0,9 %), d'une solution Hepes-Ringer, de Lactate-Ringer, de TE (Tris-HCl 10 mM pH7,5 à 8, EDTA 1 mM) ou simplement d'H2O. De manière optionnelle, la préparation peut être soumise à une filtration stérilisante. On aura avantageusement recours à des filtres de 0,22 μm d'une surface adaptée au volume à traiter. On peut citer, par exemple, les unités de filtration de type Minisart (Sartorius, référence SM 16534), Sartolab P20 (Sartorius, référence 18053D), Millex GF (Millipore, référence SLGS025BS), Millex GV (Millipore, référence SLGV025BS), Millex GP (Millipore, référence SLGPR25LS), Anotop 25 (Whatman, référence 20025H-68092122), Anotop 25 Plus (Whatman, référence 2002 AP- 68094122), Sartobran 300 (référence 5231307H5p00V) ou Easy Flow 0,2 μm en acétate de cellulose (référence 12307-05- 1-V). Puis, le filtrat est conditionné en doses ajustées à une concentration donnée. La concentration en ADN plasmidique peut être déterminée de manière conventionnelle, par exemple par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 260 nm. La proportion relative des différents topoisomères peut être évaluée visuellement par électrophorèse sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium éventuellement suivies d'une analyse densitométrique. L'intégrité du plasmide peut être vérifiée par digestion par des enzymes de restriction ayant un ou plusieurs sites de coupure.
La qualité de l'ADN plasmidique préparé par le procédé selon l'invention peut être appréciée par des essais standards tels que ceux qui sont décrits dans les exemples qui suivent. La contamination en ARN peut être évaluée visuellement par électrophorèse en gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium ou par spectrophotométrie après réaction à l'orcinol chlorhydrique (réactif de Bial) (Moulé, 1953, Arch. Science Physiol. 7, 161 ; Mejbaum, 1939, Hope Seyler Z. 258, 1 17). Un ADN plasmidique purifié selon le procédé de l'invention présente de préférence une contamination résiduelle en ARN inférieure à 5 % (masse/masse), avantageusement inférieure à 3 %, de préférence inférieure à 2 % et, de manière tout à fait préférée, inférieure à 1 %. La contamination résiduelle par les protéines peut être mesurée par toute technique de dosage des protéines ne montrant pas ou peu d'interférences dues à l'ADN . Une technique adéquate est celle de la technique du BCA (acide bicinchoninique) basée sur la détection spectrophotométrique à une longueur d'onde de 562 nm du complexe coloré formé entre le BCA et les ions Cu+ issus de la réduction en milieu alcalin d'ions cuivreux Cu-f+ par les protéines (Smith et al., 1985, Anal. Biochem. 150, 76-85). Un ADN plasmidique purifié selon le procédé de l'invention présente de préférence une contamination résiduelle en protéines inférieure à 3 % (masse/masse), avantageusement inférieure à 2 %, de préférence inférieure à 1 % et, de manière tout à fait préférée, inférieure à 0,5 %.
Les techniques de dosage des endotoxines sont connues de l'homme du métier. On peut par exemple procéder par un essai colorimétrique dérivé de la méthode du LAL (Limulus Amebocyte Lysate) recommandée par les pharmacopées de l'Union Européenne et des Etats Unis, tel qu'il est mis en oeuvre dans les kits commerciaux (Bio-Whittaker, QCL-1000, référence L50-647-U ; Biogenic, COATEST, référence 82 2387). De préférence, la quantité d'entoxines de la préparation d'ADN plasmidique est inférieure à 50 EU, avantageusement inférieure à 20 EU, de préférence inférieure à 10 EU et, de manière tout à fait préférée, inférieure à 5 EU par mg de plasmide.
L'ADN chromosomique contaminant peut être dosé par la technique de PCR quantitative compétitive basée sur l'amplification de séquences spécifiques du microorganisme producteur, par Southern ou encore par "Slot-blot" à l'aide d'une sonde spécifique. Un ADN plasmidique purifié selon le procédé de l'invention présente de préférence une contamination résiduelle en ADN chromosomique inférieure à 5 % (masse/masse), avantageusement inférieure à 3 %, de préférence inférieure à 2 % et, de manière tout à fait préférée, inférieure à 1 %.
Un procédé selon l'invention est particulièrement avantageux pour ce qui est de la préparation d'ADN plasmidique de taille supérieure à 10 kb. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un ADN plasmidique purifié par le procédé selon l'invention à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique. Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être utilisée dans divers types de cellules hôtes. Il s'agit de préférence d'une cellule de mammifère et, en particulier d'une cellule humaine. Ladite cellule peut être une cellule primaire ou tumorale d'une origine hématopoiétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte, macrophage, ...), hépatique, épithéliale, fibroblaste et, tout particulièrement, une cellule musculaire (myobiaste, myocyte, cellule satellite, cardiomyocyte, ...), une cellule trachéale ou pulmonaire. Par ailleurs, une composition selon l'invention peut comprendre un élément de ciblage vers une cellule particulière, par exemple un ligand à un récepteur cellulaire ou encore un anticorps. De tels éléments de ciblage sont connus.
Une composition selon l'invention peut être administrée par voie systémique ou par aérosol, en particulier par voie intragastrique, sous-cutanée, intracardiaque, intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, intratumorale intrapulmonaire, intranasale ou intratrachéale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu ou de la maladie à traiter ou encore du ou des gène(s) d'intérêt à transférer. En particulier, une composition pharmaceutique selon l'invention peut être formulée sous forme de doses comprenant entre 0,05 et 100 mg d'ADN plasmidique purifié selon le procédé selon l'invention, avantageusement 0, 1 et 10 mg et, de préférence, 0,5 et 5 mg. La formulation peut également inclure d'autres composés tels qu'un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Dans ce contexte, il peut être particulièrement avantageux d'associer l'ADN plasmidique à un composé améliorant sa diffusion, notamment un polymère ou un lipide cationique. A titre d'exemples, on mentionnera le 5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide (DOGS), le 3β ([N-(N',N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyl] cholestérol (DC-Chol), le (2,3- droleylocy[-N-[2(sperminecarboxamido) éthyl] N, N-diméthyl-l-propanaminium trifluoroacétate) (DOSPA), la spermine cholestérol et la spermidine cholestérol (décrits dans la demande française 96 01347).
Par ailleurs, une telle composition peut en outre comprendre un adjuvant capable d'améliorer son pouvoir transfectant. Il s'agira de préférence d'un lipide neutre tel que les phosphatidyl éthanolamine, phosphatidyl choline, phosphatidyl serine, phosphatidyl glycérol et, en particulier, la dioleyl phosphatidyl éthanolamine (DOPE). Il est également possible de combiner au complexe ADN plasmidique/lipide d'autres substances pour améliorer encore l'efficacité transfectionnelle ou la stabilité des complexes.
Une composition selon l'invention est en particulier, destinée au traitement préventif ou curatif de maladies telles que maladies génétiques (hémophilie, mucoviscidose, diabète ou myopathies de Duchenne et de Becker, ...), cancers, maladies virales (hépatites, SIDA, ...), et maladies récurrentes (infections provoquées par le virus de l'herpès, le virus du papilloma humain, ...).
Enfin, la présente invention est relative à l'utilisation thérapeutique ou prophylactique d'une composition pharmaceutique selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal et, préférentiellement, par thérapie génique. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple par injection intraveineuse, intramusculaire, dans une tumeur accessible, dans les poumons par aérosol, ...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moelle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires, ...), de les transfecter in vitro selon les techniques de l'art et de les réadminister au patient.
L'invention s'étend également à une méthode de traitement mettant en oeuvre un ADN plasmidique obtenu par un procédé selon l'invention, selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement efficace de ce dernier à un patient ayant besoin d'un tel traitement.
La présente invention est plus complètement décrite en référence aux figures suivantes :
La Figure 1 illustre un chromatogramme après gel filtration sur Séphacryl S 500 (colonne de 70 ml de diamètre 16 mm et longueur 350 mm) et chargement d'un échantillon de 2 ml contenant 5 mg de pCHl ION obtenu après lyse alcaline, ultrafiltration et traitement au sulfate d'ammonium. L'élution est effectuée à 0,5 mi/min (15 cm/h) dans un tampon Tris- HCl 10 mM, EDTA 1 mM, Nacl 100 mM, pH 8,0. La dentiste optique est enregistrée à 254 nm. La Figure 2 est une représentation schématique du vecteur pTGl 1025 comportant le gène conférant la résistance à la kanamycine (kana), l'origine de replication de ColEl, le promoteur CMV (pCMv) du cytomégalovirus, l'intron du gène codant pour l'Hydroxy- Méthylglutaryl-Coenzyme A Reductase (HMG), l'ADNc codant pour la dystrophine et une séquence de polyadénylation des ARNs transcrits (pA). La Figure 3 illustre un chromatogramme après gel filtration sur Séphacryl S500
(colonne de 5 litres de diamètre 8,9 cm et de longueur 82 cm) et chargement de 125 ml d'échantillon contenant 85 mg de pTGl 1025. L'élution est effectuée à environ 15 ml/min (14,5 cm/h) dans un tampon Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0.
La Figure 4 illustre l'élimination progressive des endotoxines d'un lysat alcalin par 3 extractions successives avec 1 % ou 3 % de Triton™ X-l Hsuivies d'une précipitation à l'éthanol.
La Figure 5 illustre la précipitation sélective des ARNs contaminants d'un lysat alcalin en présence de molarités croissantes de sulfate d'ammonium (0 à 3,2 M final).
La Figure 6 illustre la précipitation sélective des ARNs contaminants d'un lysat alcalin en présence de molarités croissantes de chlorure de calcium ( 10 à 100 mM). La molarité finale en CaCl est indiquée sous les lignes concernées. S = dépôt d'une fraction de l'échantillon de matériel soluble obtenu après traitement par le CaCI2 ; I. = dépôt d'une fraction de l'échantillon de matériel insoluble obtenu après traitement par le CaCl2 ; oc = ADN plasmidique de forme circulaire (open circle) ; se = ADN plasmidique de forme surenroulée (super coiled) ; a = ARNs. Les exemples qui suivent n'illustrent qu'un mode de réalisation de la présente invention.
EXEMPLES
Les solutions définies ci-après ont été préparées à partir de solutions mères ou produits chimiques obtenus commercialement.
EXEMPLE 1 : Purification du plasmide pCHl ION à partir de la souche E. coli
MCI 061 transformée.
/. Préparation et amplification des cellules recombinantes
On a recours à la souche E. coli MC 1061 (Wertman et al., 1986, supra) et au plasmide pCHl ION. Il s'agit d'un plasmide de 8,5 kb dont ie maintien dans E. coli est assuré par une origine de replication (ColEl) et un gène de résistance à l'ampicilline, tous deux issus de pBR322. Le gène d'intérêt est constitué par le gène reporter β-galactosidase d'E. coli dont l'expression peut être facilement détectée par coloration au X-Gal (4-chloro-5- bromo-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Il est muni dans sa partie 3' d'une séquence codant pour un signal de localisation nucléaire eucaryote. La localisation nucléaire de la β- galactosidase recombinante permet de s'affranchir des problèmes de bruits de fond engendrés par la réaction croisée avec la β-galactosidase endogène de la cellule hôte également détectable par le Xgal, et donc d'assurer une détection spécifique de l'activité enzymatique résultant du plasmide transfectée. L'expression du gène reporter est dirigée par le promoteur précoce de SV40. Les cellules MCI 061 sont rendues compétentes par traitement au chlorure de calcium et transformées par le plasmide pCHUON. Les bactéries recombinantes sont sélectionnées en milieu sélectif. On choisit un clone par examen des profils de restriction à partir duquel on constitue un stock gycérol primaire. Après inoculation d'une préculture en fiole, celle-ci est utilisée pour ensemencer un fermenteur. La fermentation a été conduite en continu (batch) dans 18 litres d'un milieu LB 2 fois concentré (LB2x) sans ajout de substrat carbonné, à 37°C et en présence d'ampicilline (100 μg/ml). La culture est recueillie après 2 heures en phase stationnaire. Dans ces conditions et pour une densité optique finale DO6oo de 7,5, on obtient 180 g de biomasse totale.
2. Récolte de la biomasse cellulaire humide
Le contenu du fermenteur est réparti dans des pots de centrifugation propres et stériles (Nalgène, ref 3122- 1000, 3122- 1010, 3120- 1000 ou 3120- 1010) et les cellules transformées récupérées par centrifugation à faible vitesse (5000 rpm (tours par min) pendant 30 min) et à 4°C. On peut employer une centrifugeuse Sorvall RC3 munie d'un rotor H6000-A ayant une capacité de 6x1 litre et procéder à trois centrifugations successives dans les mêmes pots afin de récolter la totalité de la culture. Après élimination du milieu, le poids des culots cellulaires est estimé par pesée et ceux-ci peuvent être congelés à -20°C avant d'être traités par le procédé détaillé ci-dessous. Les cellules ainsi récoltées constituent la biomasse cellulaire humide.
3. Préparation du lysat acidifié
Le culot congelé est fragmenté et on prélève à l'aide d'une spatule la quantité de biomasse que l'on désire traiter. Par la suite, les volumes des solutions utilisées sont données pour 27 g de biomasse humide. Les cellules sont reprises dans 320 ml de tampon de resuspension (10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8) préalablement équilibré à 4°C et remises en suspension à l'aide d'un homogénéisateur par cisaillement (Ultra Turrax-25 muni d'une sonde de diamètre 18 mm) avant d'être iysées en présence de 320 ml de tampon de lyse (1 % SDS, 0,2 M NaOH) équilibré à 20°C. On laisse la lyse se poursuivre 5 min à température ambiante en agitant doucement la préparation par inversion puis on ajoute 320 ml de solution acide (CH3COOK 3 M pH 5,5) équilibrée à 4°C Le lysat cellulaire acidifié est laissé 20 min à 0°C en procédant régulièrement à des agitations douces par inversion. Le pH final est de 5, 1.
- . Elimination des insolubles et concentration du filtrat
Le floculat est tout d'abord éliminé grossièrement par centrifugation à faible vitesse
(5000 rpm pendant 30 min à 4°C dans un rotor GSA, Sorvall). Le surnageant est soumis à deux filtrations successives sur frittes de porosité contrôlée (16 à 40 μm puis 10 à 16 μm; frittes N° 3 et 4 , Schott AG) à l'aide d'une fiole à vide connectée à une trompe à eau ou une source de vide équivalente. Le filtrat est soumis à une étape de concentration par ultrafiltration sur cartouche
Easy Flow (Sartorius) munie d'une membrane de polysulfone d'un seuil de coupure de 100 kDa (Sartorius, 0, 1 m2 référence 14669-OS- l-V ou 0,2 m2 référence 14669-OS-2-V selon le volume à traiter) La cartouche est reliée à une pompe péristatique et le débit de recirculation appliqué est d'environ 400 ml/min L'ultrafiltration est effectuée jusqu'à ce que le volume final soit réduit d'un facteur 8 à 16. On travaille à température ambiante afin de réduire la durée de l'opération
Les acides nucléiques contenus dans le filtrat sont précipités par ajout de 0,7 volume d'isopropanol maintenu à 20°C. Le mélange est homogénéisé par retournements successifs, incubé 5 min à température ambiante et le précipité collecté par centrifugation à 10 000 rpm pendant 30 min à 4°C (rotor GSA, Sorvall) Après élimination du surnageant, le culot d'acides nucléiques est lavé 2 fois de suite par 50 ml d'une solution d'éthanol à 80 % dans l'eau (équilibrée à environ -20°C) et à nouveau récupéré par centrifugation à 10 000 rpm pendant 15 min à 4°C Extraction des endotoxines
Le culot est séché et dissous dans 18 ml d'une solution d'acétate de sodium (CH3COONa 0,3 M dans du Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM) et conservé une trentaine de minutes à 0°C. On ajoute 2 ml d'une solution de Triton™ X-l 14(Sigma ; référence X-l 14™) à 10 % (poids/volume) dans CH3COONa 0,3 M à pH 5,5 (concentration finale en Triton 1%) et le mélange est homogénéisé par agitation manuelle. Après incubation 10 min sur glace puis 25 min à 52°C, la phase inférieure obtenue après centrifugation (rotor SLA 1500, Sorvall) à 10 000 rpm pendant 10 min à 35°C est prélevée et éliminée. On procède à deux extractions supplémentaires dans les mêmes conditions en présence de 2,2 ml et 2,4 ml de Triton ™X- 1 14 respectivement. La phase supérieure est précipitée par ajout de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -20°C. Après incubation au moins 45 min à -20°C, le précipitât est récupéré par centrifugation à 10 000 rpm (rotor SLA 1500, Sorvall) pendant 30 min et à 4°C et soumis à 1 ou 2 lavages successifs par une solution d'éthanol à 80 % dans l'eau conservée à -20°C. Le culot de centrifugation peut être congelé avant de procéder à la prochaine étape.
Elimination des ARNs
Le culot de centrifugation est séché sous vide et repris dans 9,4 ml de Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8 à température ambiante. On ajoute du sulfate d'ammonium (NH4) SO4 solide de manière à avoir une concentration finale d'environ 2 M. Après mélange par inversion et incubation 20 min sur glace, on centrifuge 30 min à 7 000 rpm (rotor SLA 1500, Sorvall) et à 4°C. Une deuxième centifugation dans des conditions identiques est effectuée sur le surnageant récupéré de la première afin de parfaire l'élimination des insolubles.
Chromatographie sur Séphacryl S500
Le surnageant de centrifugation est soigneusement prélevé et soumis à une J
chromatographie de gel filtration sur matrice Séphacryl S 500 (Pharmacia ; référence 17- 0613-01 ). Dans les conditions précitées, on utilise une colonne ayant une capacité de 1 litre (longueur 622 mm, diamètre 44 mm) développée à 3,8 ml/min (15cm/h) mais, bien entendu l'homme du métier est capable d'adapter la capacité de la colonne en fonction du volume à traiter.
La colonne est équilibrée dans 2 volumes de TEN avant d'appliquer un volume d'échantillon d'acides nucléiques représentant 4 à 5 % du volume de celle-ci. La collecte et la détection des fractions sont automatisées (collecteur de fractions LKB 2212 et détecteur LKB 2158 Uvicord SD muni d'un filtre à 254 nm). Les fractions de 3 min sont prélevées et congelées avant d'être analysées. La Figure 1 illustre un chromatogramme obtenu à plus petite échelle mais représentatif du procédé. L'ADN plasmidique sort dans le volume d'exclusion alors que ARN et protéines sont retenus et n'apparaissent que plus tardivement. On notera la nette séparation, avec un retour pratiquement à la ligne de base, obtenue entre le pic d'ADN plasmidique élue en premier et le pic d'ARNs élue en second.
Conditionnement
Les fractions contenant l'ADN plasmidique sont regroupées et concentrées environ 8 x à l'aide d'une unité d'ultrafiltration de type Sartocon-Micro à membrane de polysulfone ayant un seuil de coupure de 100 kDa (Sartorius, référence 15669-00-1 Alternativement, et lorsque une plus grande quantité d'échantillon doit être traitée, on peut employer une unité d'ultrafiltration EasyFlow à membrane d'acétate de cellulose (20 kDa de seuil de coupure, Sartorius, référence 14549-0S-1 V).
Après concentration, l'échantillon d'ADN plasmidique purifié est précipité par ajout d'une solution d'acétate de Na (3 M, pH 5,5) jusqu'à la concentration finale de 0,3 M et addition de 2,5 volumes d'éthanol pur (99,95 %) à -20°C. Après incubation à -20°C (30 min), l'ADN plasmidique est récupéré par centrifugation à 10 000 rpm pendant 30 min à 4°C (rotor SLA 1500, Sorvall). Le culot est lavé par l'éthanol à 80 % à environ -20°C, puis séché et repris dans le tampon de conditionnement adéquat (TE, 0,9 % NaCl, Hepes Ringer, Lactate Ringer, H2O ; environ 20 ml par aliquote de 27 g de cellules traitées). Après mesure de la densité optique à 260 nm, la concentration en ADN est calculée en prenant pour base une DO2oo correspondant à 50 μg ml. Elle peut alors être ajustée à l,0 mg/ml par dilution avec le tampon de conditionnement, et on obtient typiquement environ 20 mg d'ADN plasmidique par aliquote de 27 g de biomasse initiale.
EXEMPLE 2 : Purification du plasmide pTGl 1025 à partir de la souche E. coli
DH10B transformée
La souche E. Coli DH10B Electro Max est fournie par Gibco BRL (Référence
18290-015). Le plasmide pTG1 1025 (Figure 2) de 18,7 kb porte un gène marqueur qui confère aux bactéries la capacité de résistance à la kanamycine (gène codant pour une aminoglycoside 3' phosphotransférase transformant l'antibiotique en dérivé inactif) et l'origine de replication ColEl, ces deux éléments assurant le maintien du plasmide dans la souche productrice. Il comporte en outre une cassette d'expression de l'ADNc codant pour la dystrophine sous le contrôle du promoteur CMV associé à l'intron HMG.
Les cellules DH10B compétentes sont transformées par le plasmide dans les conditions préconisées par le fournisseur et on constitue un stock glycerol primaire conservé à -80°C après sélection d'un clone recombinant. Un lot de semence primaire est utilisé pour constituer une préculture en fiole sur milieu LB2x en présence de kanamycine 50μg/ml. La culture est incubée à 30°C dans un agitateur thermostaté (180 rpm) pendant 14 à 16 heures.
Après transfert de la préculture en fiole d'ensemencement, la souche transformée est propagée dans un fermenteur de 20 litres. La croissance est effectuée à 30°C dans un milieu de culture complexe (Hycase SF 37,5g/l, Yeast Extract 9g/l supplémenté en facteurs de croissance et sels minéraux) utilisant le glycerol à titre de substrat carboné (20 g/1) et en présence de kanamycine (50 μg/ml) pour la pression de sélection. Le pH = 7,0 est réguié par addition automatique de soude (NaOH, 30%) et d'acide sulfurique (H2SO , 2 M). L'oxygène dissous est maintenu à une saturation supérieure ou égale à 25 % (taux d'aération de lv.v.m (10 1 mn*1) et une vitesse d'agitation variable. Il peut être avantageux d'ajouter de la kanamycine en cours de culture. La culture est stoppée par refroidissement a 4°C lorsque les bactéries atteignent la phase stationnaire de croissance La culture est soutirée et la biomasse récoltée par centrifugation (centrifugeuse Sorvall RC3B, 15 mm, 4°C, 5000 rpm) Le culot de cellules est conserve a -20°C jusqu'à la mise en application du procédé de purification du plasmide pTG 1 1025
Celui-ci est similaire au procède décrit a l'exemple 1, a l'exception des modifications suivantes
La purification est effectuée a partir de 360 g de biomasse humide reprise dans 3840 ml de tampon de resuspension et lysee par un volume équivalent de tampon de lyse puis de solution acide
Les insolubles sont élimines par filtration sur Fπtté N° 4 (16-10 μm, Schott AG) avant concentration 15 fois sur Easy Flow
Le filtrat est sépare en 6 aliquotes La précipitation a l'isopropanol, les lavages à l'éthanol 80 %, les étapes d'extractions des endotoxines par le Triton™ X-l 14, la précipitation a l'éthanol et les lavages à l'éthanol 80 % subséquents sont réalises sur chacune des aliquotes comme décrit à l'exemple 1 Les échantillons sont regroupes pour la précipitation au sulfate d'ammonium a une molaπte finale de 2 M
Le surnageant de centrifugation récolte après l'étape de précipitation au sulfate d'ammonium est charge sur une colonne de gel filtration de Séphacryl S500 d'un volume de 5 litres (longueur 82 cm, diamètre 8,9 cm) développée a un débit de 15 ml/mm (14,5 cm/h) Le chromatogramme obtenu (Figure 3) montre que l'ADN plasmidique est elué dans le volume d'exclusion, alors que les ARNs contaminants et autres composés de petits poids moléculaires sont retenus sur la colonne
Les fractions contenant l'ADN plasmidique purifié sont regroupées et concentrées par ultrafiltration (facteur 10,9) L'ADN plasmidique est alors précipite par ajout d'acétate de sodium a une concentration finale de 0,3 M et de 2,5 volumes d'éthanol 99,95 % a -20°C - Le précipite est collecte par centrifugation (10 000 rpm a 4°C, rotor SLA 1500 Sorvall, 30 min) et lavé par 200 ml d'éthanol à 80 %.
Après séchage sous vide, l'ADN est repris dans le tampon de conditionnement TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5), sa concentration mesurée par spectrométrie UV et ajustée à 1 mg/ml dans le même tampon. On obtient typiquement 145 mg d'ADN plasmidique purifié.
L'intégrité du plasmide est évaluée par cartographie par enzymes de restriction et les profils obtenus correspondent à ce qui est attendu. Par ailleurs, la présence de contaminants est également déterminée dans la préparation finale et les résultats présentés ci-dessous.
Figure imgf000028_0001
Par ailleurs, la fonctionnalité du plasmide pTG 1 1025 purifié est vérifiée par transfection de lignées cellulaires et mise en évidence de la dystrophine recombinante par immunofluorescence.
Dix μg d'ADN plasmidique purifiés sont combinés à 40 μg de Lipofectine (un mélange de composés facilitant la transfection de cellules eucaryotes) suivant les instructions du fournisseur (Life Technologies, Bethesda, USA, référence 18292-001 1), puis sont ajoutés, dans 2 ml de milieu DMEM (Life Technologies, Bethesda, USA, référence 1 1963), à 2,5 x 106 cellules A549 (adénocarcinome pulmonaire humain) ensemencées ia veille dans une boîte de diamètre 35 mm, cultivées 24 heures en présence de milieu DMEM supplémenté par 10 % (vol/vol) de sérum de veau foetal (Life Technologies. Bethesda, USA, référence 10101-061) et préalablement rincées par un tampon physiologique (PBS lx). Quatre heures après ajout de l'ADN, le milieu est complémenté par 10 % (vol/vol) de sérum de veau foetal, puis la culture est poursuivie 48 heures. Les cellules sont ensuite fixées par traitement à -20°C dans un mélange méthanol/acétone (1/1) (vol/vol), séchées à l'air, et incubées en présence d'abord d'un anticorps monoclonal de souris antidystrophine (Novocastra, Newcastle/Tyme, UK, référence NCL-DYS2) puis d'un anticorps de lapin antisouris (ICN, Costa Mesa, USA, référence 651713) couplé au FITC (fluorescéine thio- isocyanate) ; les conditions détaillées de ces opérations sont connues de l'homme de l'art. La dystrophine produite lors de l'expression du gène codé par le vecteur pTGl 1025 est détectée par examen en microscopie de fluorescence des complexes immuns. L'examen simultané de cellules transfectées en présence d'un plasmide pTGl 1025 contrôle de fonctionnalité déjà démontrée purifié selon un protocole standard (Maniatis et al., 1989, supra) (témoin positif) ou en absence d'ADN (témoin négatif) permet d'évaluer le caractère fonctionnel de la préparation d'ADN plasmidique pTGl 1025. Le taux de cellules fluorescentes exprimant la dystrophine recombinante est comparable après transfection par le pTGl 1025 contrôle et par le plasmide purifié par le procédé selon l'invention. Bien entendu, les cellules non transfectées ne montrent aucune fluorescence.
EXEMPLE 3 : Elimination des endotoxines par le Triton™ X-l 14.
Des essais d'extractions au Triton ™ X-l 14 ont été menés sur un lysat alcalin tel qu'obtenu à l'exemple 1 afin de déterminer les concentrations optimales de Triton™ X-l 14 à mettre en oeuvre et le nombre d'extractions à réaliser pour réduire le taux d'endotoxines en dessous du seuil toléré (< 2 UE / dose).
Pour ce faire, le lysat alcalin initial est réparti en 2 lots soumis à 3 extractions consécutives en présence de Triton™ X-l 14 à une concentration finale de 1 et 3 % respectivement. Le mélange est homogénéisé, incubé sur glace (0°C) quelques minutes, centrifugé 5 minutes (12000 rpm, centrifugeuse Eppendorf, référence 5414) à température ambiante. Après centrifugation, la phase inférieure (Triton™ X-l 14 et endotoxines extraites) de chaque lot est éliminée, et la phase aqueuse supérieure (Extr 1 ; acides nucléiques et endotoxines restantes) traitée à nouveau comme décrit par 1 % ou 3 % de Triton , M X- l 14 après prélèvement d'une aliquote servant au dosage des endotoxines (Extr.2 et 3) Après la troisième extraction, la phase supérieure est précipitée par ajout de 2,5 volumes d'éthanol absolu. Le précipitât est repris dans du Tris-HCl 10 mM, EDTA I mM, pH 8 (Final)
Le taux d'endotoxines est dosé par un essai colorimétrique dérivé de la méthode LAL, à l'aide du kit Biogenic COATEST (référence 822387) et les résultats présentés dans la Figure 4 On observe une réduction notable du taux d'endotoxines après deux extractions en présence de Triton 1 % Un résultat similaire est obtenu lorsque 3 % de Triton™ X-l 14 sont utilisés. Dans les 2 cas, le taux d'endotoxines mesuré dans le produit final est compatible avec une utilisation pharmaceutique pour une dose moyenne de 1 mg d'ADN plasmidique.
EXEMPLE 4 : Précipitation sélective des ARNs contaminants.
Des essais de précipitation sélective ont été menés sur un lysat alcalin tel qu'obtenu à l'exemple 1 afin de déterminer les concentrations optimales en sulfate d'ammonium pour précipiter les ARNs contaminants. Pour ce faire, le lysat alcalin est réparti en 7 aliquotes soumises à une précipitation en présence de quantité croissante de sulfate d'ammonium (0,5 M, 1 M, 1,5 M, 2 M, 2,5 M, 3 M et 3,2 M final)
Le matériel précipité récupéré par centrifugation et le matériel soluble sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 0,4 % Après coloration au bromure d'éthidium et révélation par fluorescence UV, l'ADN plasmidique apparaît sous forme de bandes nettes correspondant aux différents topoisomères Au contraire, les ARNs forment une bande très diffuse migrant dans la partie inférieure du gel.
Les résultats illustrés dans la Figure 5 montrent qu'au-delà d'une concentration finale de 1,5 M en sulfate d'ammonium, la très grande majorité des ARNs se trouve sélectivement précipitée alors que l'ADN plasmidique reste soluble. On notera également l'élimination dans le précipité d'espèces d'acides nucléiques de grande taille retenues dans les poches du gel d'analyse.
EXEMPLE 5 ' Précipitation sélective des ARNs contaminants au chlorure de calcium.
La précipitation sélective des ARNs a également été testée en présence de chlorure de calcium (CaCl2). Un lysat alcalin préparé selon la méthode décrite dans l'exemple 1, incluant l'étape de traitement au Triton™ X-l 14, a été aliquote en échantillons identiques auxquels différents volumes d'une solution de CaCl2 concentrée ( IM dans ce cas précis, mais une solution moins concentrée, 0.5M par exemple, peut être utilisée) sont ajoutés afin d'obtenir une concentration finale en chlorure de calcium de 10, 20, 30, 50, 75 ou 100 mM, respectivement. Les fractions solubles et insolubles sont séparées par centrifugation, et le culot d'insoluble est resuspendu dans un tampon de faible force ionique en absence de CaCl2. Les échantillons solubles et insolubles sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium d'une fraction d'échantillon afin de séparer l'ADN plasmidique (formes circulaire ouverte et surenroulée) et les ARNs contaminants
Les résultats (Figure 6) montrent qu'au-delà d'une concentration de 30 mM en CaCl2 une précipitation détectable des ARNs est observée Cette précipitation devient importante puis massive au delà de 50 et 75 mM respectivement, puis quasi totale à 100 mM. L'ADN plasmidique sous ses formes circulaire ouverte (Open-Circle, migrant le moins rapidement) et surenroulée (Super-Coiled, migrant le plus rapidement) demeure pour sa part majoritairement soluble dans chacun des cas.
EXEMPLE 6 Elimination des pigments colorés.
L'efficacité d"élimination des pigments colorés présents après l'étape de lyse alcaline (cf. Exemples 1, 2 et 5) a été évaluée au cours des étapes de concentration par ultrafiltration , de précipitation par l'isopropanol et de lavage par l'éthanol à 80 % La présence de ces pigments se traduit par une coloration jaune du lysat alcalin brut avant sa concentration par ultrafiltration qui peut être analysée par mesure de la densité optique à 340 nm. Cette absorbance a donc été mesurée sur les échantillons obtenus après les étapes d'ultrafiltration initiale, de précipitation et de lavage par l'isopropanol et par l'éthanol à 80%. Deux séries d'expériences ont été réalisées, l'une mettant enjeu la filtration du lysat alcalin sur fritte de verre, l'autre sur cartouche de polypropylène Sartopure PP. Les lysats initiaux sont obtenus à partir de 150 g d'une biomasse cellulaire issue de deux fermentations du couple £. coli souche DH5 x plasmide pTGl 1025 (-19 kbp).
Expérience N° 1 : Macrofiltration réalisée sur fritte de verre N° 3 ( 16 à 40 μm de porosité - Schott AG
Figure imgf000032_0001
Expérience N°2 : Macrofiltration réalisée sur cartouche SartopurePP2 ( 8 mm de porosité - Sartorius)
Figure imgf000033_0001
Ces résultats montrent que les étapes d'ultrafiltration et de précipitation à l'isopropanol contribuent à l'élimination des pigments d'un facteur 4 à 5 x et 1 ,5 à 2 x, respectivement. Combinées, ces deux étapes permettent d'atteindre un facteur d'élimination de 6 à 10 X, soit une élimination totale de 80 à 90% des pigments colorés.
EXEMPLE 7 : Purification du plasmide pTGl 1025 à partir de la souche E. coli DH5 Library Efficiency.
La souche E. coli DH5 Library Efficiency ( Life Technologies ; réf. 18262-014) est transformée avec le plasmide pTG1 1025 (voir exemple 2 et figure 2). Les étapes de transformation, de préparation et de récolte de la biomasse sont identiques à celles décrites dans l'exemple 2.
Le lysat brut est filtré sur une cartouche de filtration Sartopure PP2 (Sartorius, réf. 5591302P9— 0) sous un débit de 700 ml/min à l'aide d'une pompe péristaltique. Le filtrat est ensuite concentré par ultrafiltration sur une membrane Millipore Minipellicon II en cellulose régénérée de type PL300 de surface 0, 1 m2 (réf. P2C300C01 ) (débit de recirculation -400 ml/min., débit de soutirage compris entre 60 et 30 ml/min. de façon à maintenir une pression transmembranaire moyenne inférieure ou égale à 0,5.105 Pa).
Les acides nucléiques ainsi concentrés (815 ml) sont traités à l'isopropanol et à l'éthanol comme précédemment décrit dans l'exemple 2. Les endotoxines sont éliminées par trois extractions successives au Triton™ X-l 14. Les acides nucléiques sont précipités. Les sels et le détergent non ionique résiduels sont rincés à l'aide d'éthanol aqueux.
Les acides nucléiques sont repris dans un tampon Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5 et les ARNs sont spécifiquement précipités en présence de CaCl2 100 mM final. Ces ARNs sont éliminés par centrifugation (10000 r.p.m., rotor Sorvall, SLA1500, température 20°C, 40 min.). L'ADN plasmidique présent dans la phase soluble est précipité par addition d'isopropanol et resolubilisé dans un tampon Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 250 mM, pH δ
Un aliquote de l'échantillon correspondant à 180 g de la biomasse initiale est déposé sur une colonne de Séphacryl S500 ( volume de 6 I , longueur 92 cm, diamètre 8,9 cm, débit de 5 ml/min soit -5 cm/heure). L'absorbance de l'éluat est suivie à 254 nm. Les fractions contenant l'ADN plasmidique sont récoltées juste après élution du volume mort de la colonne (-2100 ml), alors que celles contenant les ARNs sont récoltées après environ 2 volumes morts (-4100 ml). Les fractions contenant l'ADN sont ensuite regroupées (volume 1480 ml). L'ADN plasmidique est concentré par ultrafiltration sur une unité EasyFlow à membrane en triacétate de cellulose de seuil de coupure 20 kDa (Sartorius, réf.14549-OS-1 V). Après précipitation par l'éthanol en présence d'acétate de sodium, l'ADN plasmidique est lavé par l'éthanol 80% et séché sous vide puis repris dans un tampon de conditionnement Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5 et stocké congelé à -20°C J J
Afin d'analyser la qualité de cet ADN, les paramètres suivants ont ete mesures
Biomasse initiale 360 g (poids humide) de pTGl 1025 / DH5LE approximativement 1 , 1 mg d'ADN / DOGOO ml )
Quantité finale 120 mg (post Ultrafiltration finale) Conditionnement 1 mg/ml dans Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5 Protéines contaminantes < 0 20 % (n=1 ) (*) ARNs contaminants < 1 0 % (n=l) (*) Endotoxines 3,7 UE/mg d'ADN Fonctionahte Actif en transfection /// vitro Structure Conforme par analyse de restriction Rendement - 30 %
(*) valeurs < aux limites de quantification des dosages

Claims

REVENDICATIONS
Procédé pour préparer un ADN plasmidique à partir d'une biomasse cellulaire humide récoltée après fermentation d'une cellule productrice comprenant ledit ADN plasmidique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) lyse alcaline de la biomasse resuspendue, après resuspension de la biomasse cellulaire humide, b) acidification à force ionique élevée, c) élimination des insolubles, d) réduction des endotoxines et des acides ribonucléiques (ARN), e) chromatographie de gel filtration, et f) conditionnement.
Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape de lyse alcaline est effectuée en présence de soude et de sodium dodécyl sulfate (SDS)
Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape d'acidification est effectuée en présence d'acétate de potassium a un pH final d'environ 5, 1
Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape d'élimination des insolubles comprend au moins une étape de macrofiltration
Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend deux à trois étapes successives de macrofiltration sur filtres de porosités décroissantes inférieures à 100 μm, 40 μm et/ou 16 μm
Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend une seule étape de macrofiltration réalisée sur cartouche de porosité égale à 8 μm ou à 3 μm Procédé selon l'une des revendications 1 a 6, caracteπse en ce que l'étape de réduction des endotoxines comprend au moins une étape d'extraction en présence d'un détergent ayant un point nuage compπs entre 15°C et 35°C, avantageusement 18°C et 30°C et, de préférence 20°C et 25°C
Procède selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape de réduction des endotoxines comprend 1 à 3 extractions successives réalisées en présence de 1 à 3 % final dudit détergent
Procède selon la revendication 7 ou 8, caracteπse en ce que le détergent est choisi parmi les polyoxyéthylènes
Procédé selon la revendication 9, caractéπse en ce que le détergent est le Tπton™ X- 114
Procède selon l'une des revendications 7 à 10, caractérise en ce que l'étape de réduction des endotoxines est suivie d'une étape de précipitation alcoolique
Procède selon l'une des revendications 1 a 1 1, caracteπse en ce que l'étape de réduction des ARNs comprend une précipitation sélective des ARNs dans des conditions de haute force ionique
Procédé selon la revendication 12, caractérise en ce que la précipitation sélective est effectuée en présence de sulfate d'ammonium a une concentration finale comprise entre 2 et 2,5 M
Procédé selon la revendication 12, caracteπse en ce que la précipitation sélective est effectuée en présence de chlorure de calcium a une concentration finale comprise en 10 mM et 2M, avantageusement entre 20 mM et 0,5 M, et de manière préférée entre 50 mM et 0, 1 M
15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'étape de chromatographie de gel filtration est effectuée sur un support ayant une limite d'exclusion supérieure ou égale à 20x10 Da.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le support est sélectionné parmi les supports Séphacryl S500, Séphacryl S 1000 et GF2000.
17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le conditionnement comprend une étape de filtration stérilisante.
18. Procédé selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce qu'il comprend en outre entre les étapes c) et d), d) et e) et/ou e) et f), une étape de concentration suivie, de manière optionnelle, par une étape de précipitation alcoolique et resuspension en phase aqueuse.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'étape de concentration est effectuée par ultrafiltration sur membrane ayant un seuil de coupure compris entre 20 et 300 kDa.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'étape de concentration est effectuée par ultrafiltration sur membrane ayant un seuil de coupure compris entre 30 et 100 kDa.
21. Procédé selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que l' ADN plasmidique compris dans ladite cellule productrice est un ADN plasmidique recombinant comprenant un gène sélectionné parmi les gènes codant pour une cytokine, un récepteur cellulaire ou nucléaire, un ligand, un facteur de coagulation, la protéine CFTR, l'insuline, la dystrophine, une hormone de croissance, une enzyme, un inhibiteur d'enzyme, un polypeptide à effet antitumoral, un polypeptide capable d'inhiber une infection bactérienne, parasitaire ou virale et, notamment a VIH, un anticorps, une toxine, une îmmunotoxine et un marqueur
Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 pour la préparation d'un ADN plasmidique de taille supérieure a 10 kb
Procédé selon l'une des revendications 1 à 22, caractérisé en ce que la biomasse cellulaire humide est récoltée après fermentation d'une souche dEschertchia coli comprenant un ADN plasmidique recombinant
Procède selon la revendication 23, caractérisé en ce que la souche d'Eschenchia coli est sélectionnée parmi les souches DH5, DH10B et MCI 061
Procédé selon l'une des revendications 1 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) resuspension de la biomasse cellulaire humide, b) lyse alcaline de la biomasse resuspendue obtenue à l'étape a) en présence de soude et de SDS, c) acidification du lysat alcalin obtenu à l'étape b) en présence d'acétate de potassium a un pH final d'environ 5, 1 , d) élimination des insolubles par macrofiltration du lysat acidifié obtenu a l'étape c), e) concentration du filtrat obtenu à l'étape d) par ultrafiltration sur membrane ayant un seuil de coupure compris entre 20 et 300 kDa, de préférence entre 30 et 100 kDa, et précipitation alcoolique suivie d'une resuspension du précipité en milieu aqueux, f) réduction des endotoxines du précipité resuspendu à l'étape e) par extraction en présence de Triton™ X-l 14 suivi d'une précipitation alcoolique et d'une resuspension du précipité en milieu aqueux, g) réduction des ARNs du précipité resuspendu obtenu à l'étape f) par précipitation sélective en présence de sulfate d'ammonium ou de chlorure de calcium, h) chromatographie de gel filtration du surnageant obtenu a l'étape g) sur un support Séphacryl S500, i) concentration des fractions contenant ledit ADN plasmidique obtenues à l'étape h) par ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de coupure compris entre 20 et 300 kDa, de préférence entre 30 et 100 kDa, et précipitation alcoolique, et j) conditionnement par resuspension du précipité obtenu à l'étape i) dans un tampon acceptable d'un point de vue pharmaceutique suivie d'une filtration stérilisante et d'une répartition en doses.
26. Composition pharmaceutique comprenant un ADN plasmidique purifié par le procédé selon l'une des revendication 1 à 25.
27. Composition pharmaceutique selon la revendication 26, comprenant en outre un composé lipidique.
28. Composition pharmaceutique selon la revendication 27, caractérisée en ce que le composé lipidique est choisi parmi le 5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide (DOGS), le 3β ([N-(N',N'-diméthylaminoéthane)-carbamoyl] cholestérol (DC-Chol), le (2,3-droleylocyl-N-[2(sperminecarboxamido) éthyl] N, N-diméthyl-1-propanaminium trifluoroacétate) (DOSPA), la spermine cholestérol et la spermidine cholestérol.
29. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 26 à 28, comprenant en outre un adjuvant capable d'améliorer le pouvoir transfectant de ladite composition pharmaceutique.
30. Composition pharmaceutique selon la revendication 29, caractérisée en ce que ledit adjuvant est un lipide neutre et, notamment la dioleyl phosphatidyl éthanolamine (DOPE).
31. Utilisation d'une composition pharmaceutique selon l'une des revendications 26 à 30, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal par thérapie génique.
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