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WO1999043849A1 - Verfahren zum nachweis hochkonzentrierter nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren zum nachweis hochkonzentrierter nukleinsäuren Download PDF

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Publication number
WO1999043849A1
WO1999043849A1 PCT/EP1999/001258 EP9901258W WO9943849A1 WO 1999043849 A1 WO1999043849 A1 WO 1999043849A1 EP 9901258 W EP9901258 W EP 9901258W WO 9943849 A1 WO9943849 A1 WO 9943849A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
primers
nucleic acids
analyte
detection
Prior art date
Application number
PCT/EP1999/001258
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefanie KÖHLER
Peter Ebert
Volker SCHLÜTER
Original Assignee
Roche Diagnostics Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics Gmbh filed Critical Roche Diagnostics Gmbh
Publication of WO1999043849A1 publication Critical patent/WO1999043849A1/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of highly concentrated analyte nucleic acids in a sample by means of asymmetrical amplification and the use of asymmetrical nucleic acid amplification for reducing or avoiding false negative results, for the quantitative determination of nucleic acids and for increasing the dynamic measuring range in nucleic acid detection reactions.
  • the detection of nucleic acids is becoming increasingly popular for the detection of viral and bacterial pathogens.
  • the detection of a DNA / RNA section comprises 3 steps, namely sample preparation, amplification of the target sequence by means of the target amplification method and detection of the amplicon.
  • the sample preparation usually involves the release of the nucleic acids from compartments in which they are contained, eg. B. cell lysis, but also pre-cleaning, e.g. B. to remove PCR inhibitors of the sample.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Metric PCR is described in WO 91/13174.
  • the main advantage is an increased sensitivity in the detection of fluorescence.
  • the authors cite a decrease in competition with the complementary strand as the reason for this improved sensitivity.
  • the detection takes place here by means of gel shift analysis.
  • this method is insufficiently quantifiable and practically cannot be automated.
  • the detection can be carried out using various methods, e.g. B. Analysis by gel electrophoresis (+ Southern blot), dot blot analysis or ELISA techniques.
  • the object of the present invention was to provide a detection method for nucleic acids with an increased dynamic measuring range.
  • the signal dynamics in the detection can be massively improved and a "hook effect" at high amplification concentrations of the detection can be shifted to higher concentrations or even avoided.
  • the signal position can surprisingly be improved up to a Fal tor of 10.
  • the entire measuring range of the detection can be used. A drop in the signals at a high analyte concentration, which makes a quantitative assessment of the concentration of the analyte impossible, can thus be avoided.
  • the invention therefore relates to a method for the detection of a highly concentrated analyte nucleic acid in a sample, comprising the steps of adding at least two primers, of which the extension product of one primer can serve as a template for the extension of the other primer, to the sample and incubation of the formed mixture under conditions in which, depending on the presence of the analyte nucleic acid, extension products are formed for each of the primers, binding of a labeled single-stranded probe to one of the two extension products to form a binding product and immobilization of the extension products on a solid surface, the two types of Primers are used in a stoichiometric ratio of between 1.5: 1 and 10: 1.
  • the method according to the invention is a special embodiment of the so-called hybridization tests, the basic features of which are known to the person skilled in the art in the field of nucleic acid diagnostics. Insofar as experimental details are not given below, the full content of this is "Nucleic acid hybridization", publisher B.D. Harnes and S.J. Higgins, IRL Press, 1986, e.g. B. in Chapters 1 (Hybridization Strategy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridization) and 4 (Quantitative Filter Hybridization), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al., J. Wiley and Son, 1987, and Molecular Cloning, Ed. J.
  • nucleoside triphosphates as described in EP-B-0 324474, the chemical synthesis of modified and unmodified oligonucleotides, the cleavage of nucleic acids by means of restriction enzymes, the selection of hybridization conditions by which a Specificity can be achieved, which depends on the extent of the homology between the nucleic acids to be hybridized, their GC content and their length, and the formation of nucleic acids from nucleoside triphosphates with the aid of polymerases, optionally using so-called primers.
  • a label in the sense of the present invention consists of a directly or indirectly detectable group L.
  • Directly detectable groups are, for example, radioactive ( 32 P), colored or fluorescent groups or metal atoms.
  • Indirectly detectable groups are, for example, immunologically or enzymatically active compounds such as antibodies, antigens, haptens or enzymes or enzymatically active partial enzymes. These are detected in a subsequent reaction or reaction sequence. Haptens are particularly preferred, since nucleoside triphosphates labeled with them can generally be used particularly well as substrates for polymerases and a subsequent reaction with a labeled antibody against the hapten or the haptenized nucleoside can easily be carried out.
  • nucleoside triphosphates are, for example, bromine nucleoside triphosphates or digoxigenin, digoxin or fluorescein-coupled nucleoside triphosphates.
  • the steroids mentioned in EP-A-0 324 474 and their detection have proven to be particularly suitable.
  • Nucleoside triphosphates are ribo (rNTP) - or deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP).
  • An analyte nucleic acid is understood to mean a nucleic acid which is the aim of the detection.
  • a highly concentrated analyte nucleic acid is a nucleic acid that is or can be contained in the reaction mixture to more than 10 5 genome equivalents. The upper limit of the concentration is approx. 10 12 genome equivalents / ml.
  • the indication of the concentration in so far as it is referred to as highly concentrated analyte nucleic acids, refers to the concentration of the analyte nucleic acid in the PCR reaction mixture before the start of the amplification, which is available for carrying out the amplification without being diluted again.
  • Analyte nucleic acids are to be understood as meaning nucleic acids of any origin, for example nucleic acids of viroid, viral, bacterial or cellular origin. They can be present in solution, suspension, but also fixed to solids or in cell-containing media, cell swabs, fixed cells, tissue sections or fixed organisms. The nucleic acids are preferably in solution.
  • a template nucleic acid is a nucleic acid to which an essentially complementary nucleic acid strand is newly formed. With regard to the sequence information, the template nucleic acid serves as a template for the description.
  • Denaturation of nucleic acids means separation of nucleic acid double strands into single strands.
  • a multitude of possibilities are available to the person skilled in the art, e.g. B. Treatment by alkali hydroxides, by heat, or by chemicals.
  • a nucleic acid or nucleic acid sequence that is essentially complementary to a nucleic acid is understood to mean nucleic acids or sequences that can hybridize with the corresponding nucleic acid, the nucleotide sequence of which in the hybridizing region is in each case either exactly complementary to the other nucleic acid for directly successive bases or in a few bases is different from that distinguishes exactly complementary nucleic acid.
  • the specificity depends on both the degree of complementarity and the hybridization conditions.
  • the method according to the invention is a special embodiment of an amplification, in particular the polymerase chain reaction (PCR) according to US Pat. No. 4,683,202, but one of the two primers is used in excess.
  • this ratio is chosen to be far lower than is described, for example, in WO 91/13174 or WO 90/03442. It has been found that higher ratios result in a considerable loss of sensitivity and, in addition, a larger dynamic measuring range can be achieved with the ratio according to the invention.
  • the dynamic measuring range is understood to be the measuring range in which an unambiguous assignment of the measured signals to the concentrations of the analyte nucleic acid present in the sample is possible.
  • the dynamic measuring range is limited at the bottom by the measurement error, and at the top by the plateau formation.
  • FIG. 1 (1A and 1B) graphically shows for HBV which measured values for certain known concentrations are obtained with symmetrical PCR (both primers are present in the same concentration, dark) or asymmetrical PCR (lighter). The signal intensities are plotted against the concentration of HBV in geq / ml. It can be seen that the curve for the asymmetric PCR allows a clear assignment to a measurement signal even at higher concentrations.
  • FIG. 1A This comparison is shown in FIG. 1A for test conditions when no sodium chloride is present in the PCR mixture (low salt conditions).
  • Figure IB the case is shown that 625 mM sodium chloride is present (normal salt conditions). From the comparison between Figure 1A and Figure IB it is clear that it is preferred if relatively little salt is contained in the reaction mixture. At lower salt concentrations, the hook effect is surprisingly shifted to higher concentrations, ie the dynamic measuring range is increased compared to higher salt concentrations.
  • the two types of primers are used in a stoichiometric ratio of between 1.5: 1 and 10: 1, preferably between 2: 1 and 5: 1.
  • the narrower range has the advantage that the sensitivity of the detection is particularly high. Care is taken to ensure that the nucleic acid strand to be detected is formed in excess and is marked immobilized.
  • the concentration of the primers is usually selected from a range between 200 mM and 1 ⁇ M.
  • one of the primers preferably the one that is immobilized, preferably from the concentration range of between 150 to 400, particularly preferably between 150 to 200 mM
  • the other primer preferably one that is not (immobilizable) labeled, from a concentration range between 200 and 1000 , particularly preferably selected between 300 to 800 mM.
  • a concentration of approximately 400 mM has proven particularly useful for the second primer.
  • FIG. 2 shows that the dynamic measuring range for HGV ranges from approximately 10 3 to between 10 8 and 10 9 in the case of asymmetrical PCR, while for symmetrical PCR it is only between 10 3 and 10 6 .
  • an added internal control which in the present case is a competitive template (HGV with a modified nucleotide sequence in the intermediate primer range). It is therefore clearly recognizable that the dynamic measuring range with asymmetrical PCR (AI and B1) is much larger than with symmetrical PCR (A2 and B2).
  • the reaction sequence is usually started by making the analyte nucleic acid available with appropriate reagents. This can include changes in pH (alkaline), heat, repetition of extreme temperature changes - 7 -
  • the nucleic acids to be detected are in a sample to which the reagents required for the amplification are added. This is preferably done by adding a solution which contains all the reagents, such as the polymerase, the deoxyribonucleoside triphosphates, which contain a set of primers and buffers. After the reaction mixture has been prepared, the mixture formed is incubated under conditions in which, depending on the presence of the analyte nucleic acid, extension products are formed for each of the primers, in particular using thermocyclers. For denaturing double strands, hybridizing the primers to one or both of the strands of the Analyte nucleic acid or the extension products of the primers formed and enzymatic extension of the primers. The thermocycles are continued until sufficient amplification products have been formed, preferably between 20 and 40 cycles. The amplification products essentially represent copies of part of the analyte nucleic acid to be detected.
  • the analyte nucleic acid can be both DNA and RNA.
  • Preferred analyte nucleic acids are viral nucleic acids.
  • DNA viruses are e.g. HBV and Parvo B 19.
  • RNA viruses such as HGV, is advantageously carried out a so-called RT-PCR, d. H.
  • a cDNA is formed for the RNA, which is then available for amplification. This procedure is also known for symmetrical PCR and is modified according to the present invention by using the specific primer ratio.
  • a primer is understood to mean a compound which binds the analyte nucleic acid and which can be extended by at least one NTP by the enzymatic activity of a DNA polymerase, preferably at its 3 'end, the bound nucleic acid as template nucleic acid for the base sequence of the extension product of the primer serves.
  • Primers are preferably oligonucleotides. - 8th -
  • a set of primers for the PCR contains at least two primers which are complementary to different strands of the analyte nucleic acids. These are usually referred to as “forward" and “reverse” primers.
  • the PCR can use other primers, e.g. B. in a multiplex PCR, d. H. with simultaneous amplification of several sequences of an analyte nucleic acid or several analyte nucleic acids, or with simultaneous amplification of the analyte nucleic acid and a standard nucleic acid.
  • the primers of a set compete with the analyte nucleic acid and the standard nucleic acid.
  • Competitive (symmetrical) amplification is e.g. B. from WO 91/02817 and can be applied analogously to the invention (asymmetrical) format according to the invention. This allows the use of relatively high and therefore more precisely metered concentrations of standard nucleic acids, preferably between 100 and 10 million genome equivalents (geq).
  • a standard nucleic acid is a nucleic acid that is added to the sample in one or more known and defined concentrations, an aliquot of the sample or a reference liquid for the sample.
  • the standard nucleic acid behaves similarly to the analyte nucleic acid in terms of its separability and amplification, but differs from the analyte nucleic acid in a defined manner in its sequence and / or length.
  • a partial sequence in the standard nucleic acid is preferably exchanged for the analyte nucleic acid with the overall length of the amplificate produced remaining essentially the same, although the primer binding sites are essentially identical.
  • HCV the construction of such standard nucleic acids is described, for example, in J. Clin. Microb. 32/8: 1887-1893.
  • One or both of the primers can be modified by linking to a modifying group, for example a detectable or immobilizable group.
  • a modifying group for example a detectable or immobilizable group.
  • An immobilizable primer is understood to mean an oligonucleotide which is structurally modified compared to normal nucleic acid which is essentially complementary to the nucleic acid to be detected in such a way that it has one or more immobilizable groups I.
  • Groups I which can be used for immobilization are, for example, chemical groups which are normally not present in natural nucleic acids and which can be covalently bound to a solid phase, for example by means of a chemical or a photoreaction, or groups or parts of molecules which are different from one another via group-specific interactions Molecule or part of the molecule can be recognized and bound. Such groups are therefore z. B.
  • haptens antigens and antibodies, nucleotide sequences, receptors, regulatory sequences, glycoproteins, for example lectins, or also the binding partners of binding proteins, such as biotin or iminobiotin.
  • Vitamins and haptens are preferred, and biotin, fluorescein or steroids, such as digoxigenin or digoxin, are particularly preferred.
  • the liquid which contains the nucleic acid hybrid of the amplified product and the detector probe when the nucleic acid to be detected was present in the sample is brought into contact with a solid phase which can specifically bind the hybrid via the immobilizable group of the built-in primer.
  • the type of this solid phase depends on the group I capable of immobilization. It preferably has an immobilizing group R which can enter into a binding interaction with I. If the immobilizable group is, for example, a hapten, then a solid phase can be used which has antibodies against this hapten on its surface. Is the immobilizable group a vitamin, such as. B. biotin, then the solid phase can contain binding proteins such as avidin or streptavidin immobilized.
  • residues I and R are biotin and streptavidin. Immobilization via a group on the modified nucleic acid is particularly advantageous since it can take place under milder conditions than, for example, hybridization reactions.
  • the reaction mixture is preferably filled into a vessel before, during or after the formation of the nucleic acid hybrids, the surface of which can react with the immobilizable group.
  • the hybridization reaction with the probe preferably takes place essentially simultaneously with the immobilization. It is also possible to use a solid phase in the form of a porous material, - 10 - such as a membrane, a fabric or a nonwoven, to which the reaction mixture is applied.
  • beads, so-called beads, or latex particles is also possible.
  • the vessel for carrying out the immobilization on such porous materials is preferably a cuvette, a tube or a microtiter plate.
  • the solid phase should have at least as many binding sites for the immobilizable group of the probe as there are nucleic acid hybrids and thus nucleic acids to be detected.
  • the preparation of a preferred solid phase is described in EP-A-0 344 578, to which reference is made in full.
  • a labeled single-stranded probe is preferably used to detect one of the two extension products.
  • the probe is complementary to one of the two strands of the nucleic acid to be detected.
  • a detectable or immobilizable group is provided on the probe.
  • the variety of primer present in excess preferably has an immobilizable group, so that the extension product is labeled immobilizable.
  • the complementary labeled single-stranded probe is then preferably detectably mocked.
  • the labeled single-stranded probe is also preferably used in an excess compared to the expected amount of extension products.
  • the liquid phase from the vessel becomes porous Material or removed from the pelleted beads.
  • the solid phase can then be washed with a suitable buffer, since the binding of the hybrids to the solid phase is very efficient.
  • the amount of detectable label bound to the solid phase is then measured and determined as a measure of the amount of nucleic acid to be detected on the sample. In the case of directly detectable groups, for example fluorescent labels or electrochemiluminescent labels, such as bispyridine-ruthenium complexes, the amount is increased - 11 -
  • the modified nucleic acid is preferably reacted with a mock antibody against the hapten, as described in EP-A-0 324 474.
  • the label on the antibody can be, for example, a color or fluorescent label or, preferably, an enzyme label, such as ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase or peroxidase.
  • enzyme labeling the amount of nucleic acid is measured via the mostly photometric chemiluminometric or fluorometric monitoring of a reaction of the enzyme with a chromogenic, chemiluminogenic or fluorogenic substrate.
  • the measurement signal is a measure of the amount of originally present nucleic acid to be detected and thus possibly of organisms to be detected.
  • FIG. 3 A particularly preferred embodiment is shown in FIG. 3 when the immobilizable group I biotin and the detectable group D is a ruthenium bispyridyl complex.
  • the immobilizable labeled primer 2 is amplified with the aid of PCR (DNA) or RT-PCR (RNA).
  • RNA RT-PCR
  • nn extension products of primer 1 and extension products of primer 2 where m is greater than n.
  • a denaturation step with alkali preferably follows.
  • the detectably labeled probe which is complementary to a part of the extension product of the second primer, which was newly formed from mononucleotides, is added and hybridized with the immobilizable labeled extension product.
  • the probe and the unlabeled strand of the PCR product compete for the marked strand of the PCR product. Since more marked strand of the PCR product is formed in the asymmetric PCR, the competition reaction is reduced and a larger amount of the desired hybridization product is formed for the detection.
  • the hybrid formed from the probe and the biotin-labeled extension product is bound to streptavidin-coated magnetic particles.
  • the buffer for the generation of electrochemiluminescence is added to the magnetic particles and the electrochemiluminescent signal is applied by applying a sp. generated.
  • the flash signal is measured and used for evaluation for the detection of the analyte nucleic acid.
  • the method according to the invention is excellently suitable for a qualitative determination (presence of the analyte nucleic acid in the sample) but also excellent for quantitative determination (determination of the amount of analyte nucleic acid in the sample).
  • the method according to the invention has the advantage that false negative analysis results are reduced or even avoided with highly concentrated analyte nucleic acids. This is probably due to the fact that the high-dose hook effect, which is common in liquid hybridization processes, is either avoided by the process according to the invention or is shifted to even higher concentrations.
  • a high dose high effect is understood to mean the phenomenon that the measured signal initially increases as expected with increasing analyte concentrations, but surprisingly decreases again with increasing analyte concentrations.
  • the method according to the invention can also be automated for routine work as is required in clinical diagnostics.
  • the dynamic measuring range is particularly high in the method according to the invention.
  • RNA transcripts were approximately 900 nucleotides in length, which contained sequences of the 5 'non-coding region of HGV.
  • Internal control RNA is a so-called homologous internal control, which differs from the wild-type (wt) RNA by only 23 nucleotides. This exchanged sequence is used to distinguish between two RNA molecules during the detection, which is done by using different detection probes (see below).
  • the following HGV-specific primers were used for the amplification of both the wt RNA and the internal control:
  • the labeling of the non-coding primer only served the detection method, which is described below.
  • the amplification was carried out with the following temperature profile on a Perkin Elmer Cycler 9600:
  • Perkin Elmer Thermal Cycler PE 9600 cDNA synthesis 30 min 50 ° C initial denaturation 2 mm 94 ° C cycling profile (lOcycles) denaturation 15 sec. At 94 ° C approx. 30 sec. At 55 ° C elongation 30 sec. At 68 ° C following cycling profile (25-30cycles) denaturation 15 sec. at 94 ° C approx. 30 sec. at 55 ° C elongation 30 sec. at 68 ° C + 5s elongation / cycle
  • the PCR products were then used directly in the detection reaction below.
  • the detection was carried out with the help of electrochemilinescence (ECL) on an Elecsys 1010 (Boehringer Mannheim GmbH).
  • ECL electrochemilinescence
  • the reaction temperature for all steps is 37 ° C.
  • 10 ⁇ l of sample are first mixed with 35 ⁇ l of denaturing reagent and incubated for 5 minutes.
  • 120 ⁇ l of the probe solution 50 ng / ml in hybridization buffer
  • 35 ⁇ l of streptavidin-coated magnetic microparticles are added to the reaction mixture and this is incubated again for 10 minutes.
  • the hybrids (bi-labeled HGV strand with Ru-labeled detection probe) are bound to the solid phase (microparticles).
  • the samples are transferred to the measuring cell and the microparticles are bound there by a magnet.
  • the chemiluminescence then takes place in the measuring cell.
  • the Ru complex Under catalysis by TPA, the Ru complex emits flashes of light, the number of which are determined in the measuring cell.
  • the chemistry for electrocheminoluminescence is in J. Electrochem. Soc. 137: 3127-3131.
  • a detection probe with a final concentration of 50 ng / ml is added to the hybridization buffer.
  • the following specific ruthenium bispyride complexes (for the detection of HGV wt or HGV internal control) were used as detection probes:
  • HGV wild type Ru- CCACTATAGGTGGGTCTT SEQ.ID.NO. 3
  • FIG. 2A shows the result using the HGV wild-type St.andard
  • 2B shows the result using the internal control RNA.
  • the key findings are:
  • the asymmetrical use of the primers leads to a significant signal increase.
  • the HGV-specific signal is amplified up to a factor of 7, the signal from the internal control is amplified up to 5.5 times.
  • the number of copies at which the maximum signal is reached is shifted to higher concentrations.
  • the signal maximum is only reached two powers of ten later. As a result, the hook effect only sets in later, false negative results with strongly positive samples can be avoided.
  • Example 1 The general implementation of the experiment is described in Example 1. The changes compared to Example 1 are given below.
  • HBV positive plasma was used as sample material.
  • the virus concentration in the material was determined on the "Eurohep HBV reference plasma sample 1 / genotype A" (Gerlich WH, Heermann KH, Thomssen R et al .: Quantitative assays for hepatitis B virus DNA: standardization and quality control. Virol. Hepatitis Rev. 1995; 1: 53-57). The rehearsal - 17 -
  • the amplification was carried out with the following temperature profile on a Perkin Elmer Cycler 9600:
  • the detection was carried out analogously to Example 1.
  • the symmetrical approach was compared directly with the asymmetrical approach.
  • the following specific ruthenium bispyride complex-labeled probe was used as the detection probe:
  • FIG. 3A shows the result using 625mM NaCl in the hybridization buffer.
  • the hybridization buffer contained no NaCl.
  • the number of copies at which the maximum signal is reached is shifted to higher concentrations.
  • the signal maximum is shifted by at least 3 powers of ten.
  • the hook effect does not occur if there is no salt in the hybridization buffer (Fig. 3B).
  • the avoidance or reduction of the hook effect can also be achieved by reducing the salt concentration during the hybridization.
  • it has often been described in the literature that nucleic acid hybridizations without salt proceed much more poorly and therefore sensitivity is lost (Bryan et al., Pp. 47ff in Nucleic acid hybridization, Editors BD Harnes, SJ. Higgins; IRL press, 1985) .

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Abstract

Die Verwendung eines bestimmten Überschusses von Primern in einer Nukleinsäureamplifikation und Nachweis der gebildeten Verlängerungsprodukte unter Verwendung einer einzelsträngigen markierten Sonde führt zu einem deutlich erhöhten dynamischen Messbereich, was auch den Nachweis hochkonzentrierter Analytnukleinsäuren möglich macht.

Description

1 -
Verfahren zum Nachweis hochkonzentrierter Nukleinsäuren
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis hochkonzentrierter Analyt- nukleinsäuren in einer Probe mittels asymmetrischer Amplifikation sowie die Verwendung der asymmetrischen Nukleinsäureamplifikation zur Reduzierung oder Vermeidung falsch- negativer Ergebnisse, zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren und zur Erhöhung des dynamischen Meßbereichs bei Nukleinsäurenachweisre.aktionen.
Zum Nachweis von viralen und bakteriellen Erregern setzt sich neben der immunologischen Detektion mit Hilfe von Antikörpern immer stärker der Nachweis von Nukleinsäuren (DNA oder RNA) durch. Im Allgemeinen beinhaltet die Detektion eines DNA/RNA- Abschnittes 3 Schritte, nämlich Probenvorbereitung, Amplifikation der Zielsequenz mittels Target.ampli- fikationsverfahren und Detektion des Amplicons.
Die Probenvorbereitung beinhaltet üblicherweise die Freisetzung der Nukleinsäuren aus Kom- partimenten, in denen sie enthalten sind, z. B. Zellyse, aber auch Vorreinigung, z. B. zur Entfernung von PCR-Inhibitoren der Probe.
Die .am weitesten verbreitete Methode zur Amplifikation von Nukleinsäuren ist die Poly- merase Chain Reaction (PCR), die von Saiki et al. (Science 230, 1350-1354, 1985, US-A-4,683,202) entwickelt wurde. Bei der ursprünglichen Anwendung wurden 2 Primer mit gleicher Konzentration eingesetzt. Die Anwendung einer asymmetrischen PCR wurde erstmals 1985 von Gyllensten et al, (PNAS (USA) 85, 7652-7656) beschrieben. Als Hauptanwendung für diesen experimentellen Ansatz sind Sequenzierreaktionen zu nennen, bei denen ein markierter Primer in einem Überschuß von 100:1 bis 1000:1 eingesetzt wird, um möglichst eine einzelsträngige Nukleinsäure zu generieren (WO 90/03444, US-A-5,066,584; WO 90/03442, US-A-5,075,216). In anderen Publikationen wird ein asymmetrischer PCR- Ansatz benutzt, um Sequenzvariationen nachzuweisen (JP-08298998). Eine Anwendung der asym-
ERSATZBI_ATT (REGEL 26) - 2 -
metrischen PCR wird in WO 91/13174 beschrieben. Als Hauptvorteil wird dabei eine erhöhte Sensitivität beim Nachweis der Fluoreszenz beschrieben. Als Grund für diese verbesserte Sensitivität nennen die Autoren eine Minderung der Kompetition mit dem komplementären Strang. Die Detektion erfolgt hier mittels Gelshift- Analyse. Dieses Verfahren ist jedoch ungenügend quantifizierbar und praktisch nicht automatisierbar.
Die Detektion kann mittels verschiedener Verfaliren erfolgen, z. B. Analyse nach Gelelektrophorese (+ Southernblot), Dot-Blot- Analyse oder ELISA-Techniken.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung eines Nachweisverfahrens für Nukleinsäuren mit erhöhtem dynamischen Meßbereich.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß bei Durchführung einer asymmetrischen PCR die Signaldynamik in der Detektion massiv verbessert werden kann und ein "Hook-Effekt" bei hohen Amplifikationskonzentrationen der Detektion zu höheren Konzentrationen hin verschoben oder sogar vermieden werden kann. Die Signallage kann überraschenderweise bis zu einem Fal tor von 10 verbessert werden. Darüber hinaus kann der gesamte Meßbereich der Detektion ausgeschöpft werden. Ein Abfallen der Signale bei hoher Analytkonzentration, durch die eine quantitative Bewertung der Konzentration des Analyten unmöglich wird, kann so vermieden werden.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis einer hochkonzentrierten Analytnukleinsäure in einer Probe, enthaltend die Schritte Zugabe von mindestens zwei Primern, von denen das Verlängerungsprodukt des einen Primers als Templat für die Verlängerung des .anderen Primers dienen kann, zu der Probe und Inkubation des gebildeten Gemisches unter Bedingungen, bei denen in Abhängigkeit von der Anwesenheit der Analytnukleinsäure zu jedem der Primer Verlängerungsprodukte gebildet werden, Bindung einer markierten einzelsträngigen Sonde an eines der beiden Verlängerungsprodukte unter Bildung eines Bindeproduktes und Immobilisierung der Verlängerungsprodukte an einer festen Oberfläche, wobei die beiden Sorten von Primern in einem stöchiometrischen Verhältnis von zwischen 1,5 : 1 und 10 : 1 eingesetzt werden.
In Figur 1 ist eine bevorzugte Ausführungsform des erfmdungsgemäßen Verfahrens gezeigt. - 3 -
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine spezielle Ausführungsform der sogenannten Hybridisierungstests, die in ihren Grundzügen dem Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik bekannt sind. Soweit experimentelle Details im Folgenden nicht ausgeführt sind, wird dazu vollinhaltlich auf "Nucleic acid hybridisation", Herausgeber B.D. Harnes und S.J. Higgins, IRL Press, 1986, z. B. in den Kapiteln 1 (Hybridisation Strate- gy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridisation) und 4 (Quantitative Filter Hybridisation), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al., J. Wiley and Son, 1987, und Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al., CSH, 1989, Bezug genommen. Zu den bekannten Methoden gehört auch die Herstellung von markierten Nukleosidtriphosphaten, wie sie in EP-B-0 324474 beschrieben sind, die chemische Synthese von modifizierten und un- modifizierten Oligonukleotiden, die Spaltung von Nukleinsäuren mittels Restriktionsenzymen, die Auswahl von Hybridisierungsbedingungen, durch welche eine Spezifität erreicht werden kann, die vom Ausmaß der Homologie zwischen den zu hybridisierenden Nukleinsäuren, deren GC-Gehalt und deren Länge abhängt sowie die Bildung von Nukleinsäuren aus Nukleosidtriphosphaten mit Hilfe von Polymerasen, gegebenenfalls unter Verwendung von sogenannten Primern.
Eine Markierung im Sinne der vorliegenden Erfindung besteht aus einer direkt oder indirekt nachweisbaren Gruppe L. Direkt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise radioaktive (32P), farbige, oder fluoreszierende Gruppen oder Metallatome. Indirekt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise immunologisch oder enzymatisch wirksame Verbindungen, wie Antikörper, Antigene, Haptene oder Enzyme oder enzymatisch aktive Teilenzyme. Diese werden in einer nachfolgenden Reaktion oder Reaktionssequenz detektiert. Besonders bevorzugt sind Haptene, da an mit ihnen markierte Nukleosidtriphosphate im allgemeinen besonders gut als Substrate von Polymerasen einsetzbar sind und eine anschließende Reaktion mit einem markierten Antikörper gegen das Hapten oder das haptenisierte Nukleosid leicht vorgenommen werden kann. Solche Nukleosidtriphosphate sind beispielsweise Brom-Nukleosidtriphosphate oder Digoxigenin-, Digoxin- oder Fluorescein-gekoppelte Nukleosidtriphosphate. Als besonders geeignet haben sich die in EP-A-0 324 474 genannten Steroide und deren Detektion erwiesen. Für deren Inkorporation in Nukleinsäuren wird hiermit auf die EP-A-0 324 474 verwiesen. - 4 -
Nukleosidtriphosphate (NTP) sind Ribo (rNTP)- oder Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP).Unter einer Analytnukleinsäure wird eine Nukleinsäure verstanden, die Ziel des Nachweises ist. Unter einer hochkonzentrierten Analytnukleinsäure wird eine Nukleinsäure verst-anden, die in der Re.aktionsmischung zu mehr als 105 Genomäquivalente enthalten ist oder sein kann. Die Obergrenze der Konzentration liegt bei ca. 1012 Genomäquivalenten/ml. Die Angabe der Konzentration, insofern von hochkonzentrierten Analytnukleinsäuren gesprochen wird, bezieht sich auf die Konzentration der Analytnukleinsäure in der PCR-Real tions- mischung vor Start der Amplifikation, die für die Durchführung der Amplifikation bereitsteht, ohne daß diese nochmals verdünnt wird.
Unter Analytnukleinsäuren sind Nukleinsäuren jeglichen Ursprungs zu verstehen, beispielsweise Nukleinsäuren viroiden, viralen, bakteriellen oder zellulären Ursprungs. Sie können in Lösung, Suspension, aber auch an Festkörpern fixiert oder in zellhaltigen Medien, Zellabstrichen, fixierten Zellen, Gewebsschnitten oder fixierten Organismen vorliegen. Bevorzugt liegen die Nukleinsäuren in Lösung vor.
Eine Templatnukleinsäure ist eine Nukleinsäure, zu der ein im wesentlichen komplementärer Nukleinsäurestr.ang neu gebildet wird. In Bezug auf die Sequenzinformation dient die Templatnukleinsäure als Matrize für die Umschreibung.
Denaturierung von Nukleinsäuren bedeutet Auftrennung von Nukleinsäuredoppelsträngen in Einzelstränge. Dem Fachmann stehen prinzipiell eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Verfügung, z. B. Behandlung durch Alkalihydroxide, durch Hitze, oder durch Chemikalien.
Unter einer zu einer Nukleinsäure im wesentlichen komplementären Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenz werden Nukleinsäuren oder Sequenzen verstanden, die mit der entsprechenden Nukleinsäure hybridisieren können, deren Nukleotidsequenz im hybridisierenden Bereich jeweils für direkt aufeinanderfolgende Basen entweder genau komplementär zu der anderen Nukleinsäure ist oder sich in wenigen Basen von der genau komplementären Nukleinsäure unterscheidet. Die Spezifität richtet sich dabei sowohl nach dem Grad der Komplementarität als auch nach den Hybridisierungsbedingungen. - 5 -
Das erfindungsgem.äße Verfahren ist eine spezielle Ausführungsform einer Amplifikation, insbesondere der Polymerase Kettenreaktion (PCR) nach US-A-4,683,202, wobei aber einer der beiden Primer im Überschuß eingesetzt wird. Dieses Verhältnis wird jedoch weit geringer gewählt, als dies beispielsweise in WO 91/13174 oder WO 90/03442 beschrieben wird. Es wurde nämlich gefunden, daß höhere Verhältnisse einen erheblichen Sensitivitätsverlust mit sich bringen und darüber hinaus bei dem erfindungsgemäßen Verhältnis ein größerer dynamischer Meßbereich erzielt werden kann. Als dynamischer Meßbereich wird der Meßbereich verstanden, in welchem eine eindeutige Zuordnung der gemessenen Signale zu den in der Probe vorhandenen Konzentrationen der Analytnukleinsäure möglich ist. Der dynamische Meßbereich ist nach unten hin durch den Meßfehler begrenzt, und nach oben hin durch die Plateaubildung. Es wurde sogar gefunden, daß bei normaler (symmetrischer) PCR bei steigernder Konzentration von Analytnukleinsäuren (z. B. virale Parameter wie HBV, HGV und CMV, oder bakterielle Parameter, wie Chlamydien) in der Probe das Meßsignal sogar wieder abnimmt, so daß Meßsignale aus den oberen Signalbereichen prinzipiell mindestens 2 Konzentrationswerten zugeordnet werden könnten und somit keine eindeutige Zuordnung des Meßsignals zu einer Konzentration möglich ist. Dies wird oft als Hook-Effekt bezeichnet.
In Figur 1 (1 A und IB) ist für HBV graphisch dargestellt, welche Meßwerte für bestimmte bekannte Konzentrationen bei symmetrischer PCR (beide Primer sind in gleicher Konzentration vorhanden, dunkel) bzw. asymmetrischer PCR (heller) erhalten werden. Aufgetragen sind die Signalintensitäten gegen die Konzentration von HBV in geq/ml. Es ist erkennbar, daß die Kurve für die asymmetrische PCR auch bei höheren Konzentrationen eine eindeutige Zuordnung zu einem Meßsignal erlaubt.
In Figur 1 A ist dieser Vergleich für Versuchsbedingungen gezeigt, wenn kein Natriumchlorid in der PCR-Mischung enthalten ist (Niedrigsalzbedingungen). In Figur IB hingegen ist der Fall gezeigt, daß 625 mM Natriumchlorid .anwesend ist (Normalsalzbedingungen). Aus dem Vergleich zwischen Figur 1 A und Figur IB wird klar, daß es bevorzugt ist, wenn relativ wenig Salz in der Reaktionsmischung enthalten ist. Bei geringeren Salzkonzentrationen ist erstaunlicherweise auch der Hook-Effekt zu höheren Konzentrationen verschoben, d. h. der dynamische Meßbereich ist gegenüber höheren Salzkonzentrationen erhöht. Eine Konzen- - 6 -
tration von zwischen 150 mM und 600 mM Natriumchlorid ist bevorzugt, da eine geringere Konzentration einen Sensitivitätsverlust zur Folge hat.
Erfindungsgemäß werden die beiden Sorten von Primern in einem stöchiometrischen Verhältnis von zwischen 1,5:1 und 10:1, bevorzugt zwischen 2:1 und 5:1 eingesetzt. Der engere Bereich hat den Vorteil, daß die Sensitivität des Nachweises besonders hoch ist. Dabei wird darauf geachtet, daß der nachzuweisende Nukleinsäurestrang im Überschuß entsteht und immobilisiert markiert ist.
Bei symmetrischer PCR wird die Konzentration der Primer üblicherweise aus einem Bereich zwischen 200 mM und 1 μM ausgewählt. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird einer der Primer, bevorzugt der immobilisierbar markierte, bevorzugt aus dem Konzentrationsbereich von zwischen 150 bis 400, besonders bevorzugt zwischen 150 bis 200 mM und der andere Primer, bevorzugt ein nicht (immobilisierbar) markierter, aus einem Konzentrationsbereich zwischen 200 und 1000, besonders bevorzugt zwischen 300 bis 800 mM gewählt. Für den zweiten Primer hat sich besonders eine Konzentration von ca. 400 mM bewährt. Diese Bedingungen führen dazu, daß nach der Amplifikation ein Überschuß .an immobilisierbarem Verlängerungsprodukt vorliegt. Dieses wird dann zum Gegenstand des weiteren Nachweises gemacht.
In Figur 2 ist gezeigt, daß sich der dynamische Meßbereich für HGV von ca. 103 bis zwischen 108 und 109 erstreckt bei asymmetrischer PCR, während er für symmetrische PCR nur bei zwischen 103 und 106 liegt. Dasselbe gilt auch für eine zugegebene interne Kontrolle, bei der es sich im vorliegenden Fall um ein kompetetives Templat (HGV mit im Zwischenprimerbe- reich veränderter Nukleotidsequenz) handelt. Es ist daher klar erkennbar, daß der dynamische Messbereich bei asymmetrischer PCR (AI und Bl) weitaus größer ist als bei symmetrischer PCR (A2 und B2).
Wenngleich die Durchführung der PCR aus US-A-4,683,202 bekannt ist und diesbezüglich auf die dort befindliche Offenbarung verwiesen wird, soll doch das erfindungsgemäße Verfahren kurz beschrieben werden. Die Reaktionssequenz wird meist gestartet durch Verfüg- barmachung der Analytnukleinsäure mit entsprechenden Reagenzien. Hierbei können sowohl Veränderungen des pHs (alkalisch), Hitze, Wiederholung extremer Temperaturveränderungen - 7 -
(Einfrieren/ Auftauen), Veränderung der physiologischen Wachstumsbedingungen (Osmotischer Druck), Einwirkung von Detergenzien, chaotropen Salzen oder Enzymen (z. B. Proteasen, Lipasen), alleine oder in Kombination zur Freisetzung der Nukleinsäuren beitragen.
Nach Probenvorbereitung befinden sich die nachzuweisenden Nukleinsäuren in einer Probe, zu der die für die Amplifikation erforderlichen Reagenzien zugegeben werden. Dies geschieht bevorzugt durch Zugabe einer Lösung, die alle Reagenzien, wie die Polymerase, die Deoxyribonukleosidtriphosphate, die ein Set von Primern und Puffer, enthält. Nach Herstellung der Reaktionsmischung wird das gebildete Gemisch unter Bedingungen inkubiert, bei denen in Abhängigkeit von der Anwesenheit der Analytnukleinsäure zu jedem der Primer Verlängerungsprodukte gebildet werden, insbesondere unter Anwendung von Thermocyclern .zur Denaturierung von Doppelsträngen, Hybridisierung der Primer an einen oder beide der Stränge der Analytnukleinsäure bzw. die gebildeten Verlängerungsprodukte der Primer und enzymatische Verlängerung der Primer. Die Thermocyclen werden solange fortgeführt, bis ausreichend Amplifikationsprodukte gebildet wurden, bevorzugt zwischen 20 und 40 Zyklen. Die Amplifikationsprodukte stellen im wesentlichen Kopien eines Teils der nachzuweisenden Analytnukleinsäure dar.
Bei der Analytnukleinsäure kann es sich sowohl um DNA als auch um RNA handeln. Bevorzugte Analytnukleinsäuren sind virale Nukleinsäuren. DNA- Viren sind z.B. HBV und Parvo B 19. Für den Fall RNA, wie z. B. RNA- Viren, wie HGV, führt man zweckmäßigerweise eine sogenannte RT-PCR durch, d. h. in einem ersten Schritt wird zu der RNA eine cDNA gebildet, welche dann der Amplifikation zur Verfügung steht. Diese Vorgehensweise ist ebenfalls für symmetrische PCR bekannt und wird nach der vorliegenden Erfindung durch Einsatz des bestimmten Primerverhältnisses modifiziert.
Unter einem Primer wird eine die .Analytnukleinsäure bindende Verbindung verstanden, die durch die enzymatische Aktivität einer DNA-Polymerase, vorzugsweise an seinem 3 '-Ende um mindestens ein NTP verlängert werden kann, wobei die gebundene Nukleinsäure als Templatnukleinsäure für die Basensequenz des Verlängerungsproduktes des Primers dient. Primer sind bevorzugt Oligonukleotide. - 8 -
Ein Set von Primern für die PCR enthält mindestens zwei Primer, die zu unterschiedlichen Strängen der Analytnukleinsäuren komplementär sind. Diese werden üblicherweise als "forward" und "reverse" Primer bezeichnet. Die PCR kann jedoch noch weitere Primer benutzen, z. B. bei einer multiplex-PCR, d. h. bei simultaner Amplifikation mehrerer Sequenzen einer Analytnukleinsäure oder mehreren Analytnukleinsäuren, oder aber bei simultaner Amplifikation der Analytnukleinsäure und einer Standardnukleinsäure. Es ist bei dem erfindungsgemäßen Verfal ren aber auch besonders vorteilhaft, die simultane Amplifikation der Analytnukleinsäure und einer Standardnukleinsäure mit Primern derselben Sequenz durchzuführen. Hierbei kompetieren die Primer eines Sets mit der Analytnukleinsäure und der Standardnukleinsäure. Kompetitive (symmetrische) Amplifikation ist z. B. aus WO 91/02817 bekannt und k.ann erfindungs-analog auf das erfindungsgemäß (asymetrische) Format angewendet werden. Dies erlaubt den Einsatz relativ hoher und somit genauer dosierbarer Konzentrationen an Standardnukleinsäuren, vorzugsweise von zwischen 100 und 10 Mio Genomäquivalente (geq).
Eine Standardnukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die in einer oder mehreren bekannten und definierten Konzentrationen der Probe, einem Aliquot der Probe oder eine Vergleichsflüssigkeit für die Probe zugesetzt wird. Die Standardnukleinsäure verhält sich ähnlich wie die Analytnukleinsäure bezüglich ihrer Abtrennbarkeit und Amplifikation, unterscheidet sich jedoch von der Analytnukleinsäure in definierter Weise in ihrer Sequenz und/oder Länge. Bevorzugt ist in der Standardnukleinsäure eine Teilsequenz gegenüber der Analytnukleinsäure bei im wesentlichen gleichbleibender Gesamtlänge des erzeugten Amplifikats ausgetauscht, wobei jedoch die Primerbindungsstellen im wesentlichen identisch sind. Für HCV ist die Konstruktion solcher Standardnukleinsäuren beispielsweise in J. Clin. Microb. 32/8:1887-1893 beschrieben.
Einer oder beide der Primer können durch Verknüpfung mit einer modifizierenden Gruppe, beispielsweise einer detektierbaren oder immobilisierbaren Gruppe, modifiziert sein. Hierdurch wird in die Verlängerungsprodukte jeweils eine solch modifizierende Gruppe eingebaut. Solche Verfahren sind allgemein in DE-3807994 bzw. US-5,476,769 beschrieben. - 9 -
Unter einem immobilisierbaren Primer wird ein Oligonukleotid verstanden, welches strukturell gegenüber normalen, zu der nachzuweisenden Nukleinsäure im wesentlichen komplementären Nukleinsäure d.ahingehend verändert ist, daß es eine oder mehrere immobilisierbare Gruppen I aufweist. Zur Immobilisierung befäliigende Gruppen I sind beispielsweise chemische Gruppen, die normalerweise in natürlichen Nukleinsäuren nicht vorhanden sind und die kovalent, beispielsweise über eine chemische oder eine Photoreaktion an eine feste Phase gebunden werden können, oder Gruppen bzw. Molekülteile, die über gruppenspezifische Wechselwirkungen von einem anderen Molekül oder Molekülteil erkannt und gebunden werden können. Solche Gruppen sind daher z. B. Haptene, Antigene und Antikörper, Nukleotidse- quenzen, Rezeptoren, Regulationssequenzen, Glykoproteine, beispielsweise Lectine, oder auch die Bindungspartner von Bindeproteinen, wie Biotin oder Iminobiotin. Bevorzugt sind Vit.amine und Haptene, besonders bevorzugt sind Biotin, Fluorescein oder Steroide, wie Digo- xigenin oder Digoxin.
Die Flüssigkeit, welche das Nukleinsäurehybrid aus Amplifikat und Detektorsonde gelöst enthält, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure in der Probe vorhanden war, wird mit einer festen Phase in Kontakt gebracht, welche das Hybrid über die immobilisierbare Gruppe des eingebauten Primers spezifisch binden kann. Die .Art dieser Festphase richtet sich nach der zur Immobilisierung befähigenden Gruppe I. Bevorzugt weist sie eine immobilisierende Gruppe R auf, die eine bindende Wechselwirkung mit I eingehen kann. Ist die immobilisierbare Gruppe beispielsweise ein Hapten, dann kann eine Festphase verwendet werden, die an ihrer Oberfläche Antikörper gegen dieses Hapten aufweist. Ist die immobilisierbare Gruppe ein Vitamin, wie z. B. Biotin, dann kann die Festphase bindende Proteine, wie Avidin oder Strep- tavidin immobilisiert enthalten. Besonders bevorzugte Reste I und R sind Biotin und Strepta- vidin. Die Immobilisierung über eine Gruppe an der modifizierten Nukleinsäure ist besonders vorteilhaft, da sie unter milderen Bedingungen stattfinden kann als beispielsweise Hybridi- sierungsreaktionen. Bevorzugt wird zur Immobilisierung der gebildeten Nukleinsäuren die Reaktionsmischung vor, während oder nach Bildung der Nukleinsäurehybride in ein Gefäß gefüllt, welches an seiner Oberfläche mit der immobilisierbaren Gruppe reagieren kann. Bevorzugt findet die Hybridisierungsreaktion mit der Sonde im wesentlichen gleichzeitig mit der Immobilisierung statt. Es ist auch möglich, eine Festphase in Form eines porösen Materials, - 10 - wie einer Membran, eines Gewebes oder eines Vlieses, zu verwenden, aufweiche die Reaktionsmischung aufgegeben wird. Ebenso ist die Verwendung von Perlen, sogenannten beads, oder Latex-Partikeln möglich. Das Gefäß für die Durchführung der Immobilisierung an solchen porösen Materialien ist bevorzugt eine Küvette, ein Röhrchen oder eine Mikrotiterplatte. Die feste Phase sollte mindestens so viele Bindungsstellen für die immobilisierb.are Gruppe der Sonde haben, wie Nukleinsäurehybride und damit nachzuweisende Nukleinsäuren vorhanden sind. Die Herstellung einer bevorzugten festen Phase ist in der EP-A- 0 344 578 beschrieben, aufweiche vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Bei der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt eine markierte einzelsträngige Sonde eingesetzt, um eines der beiden Verlängerungsprodukte nachzuweisen. Hierzu ist die Sonde komplementär zu einem der beiden Stränge der nachzuweisenden Nukleinsäure. Abhängig von dem eventuellen Einbau einer immobilisierbaren oder detektierbaren Gruppe in dieses Verlängerungsprodukt wird entweder eine detektierbare oder immobilisierbare Gruppe an der Sonde vorgesehen. Bevorzugt weist die im Überschuß vorhandene Sorte von Primem eine immobilisierbare Gruppe auf, so daß das Verlängerungsprodukt immobilisierbar markiert wird. Die hierzu komplementäre markierte einzelsträngige Sonde ist dann bevorzugt detektierbar mokiert. Es kann sich sowohl um ein Oligonukleotid (vorteilhafterweise chemisch-synthetisiert) oder eine Peptidnukleinsäure (PNA gemäß WO 92/20702) handeln. Auch die markierte einzelsträngige Sonde wird bevorzugt in einem Überschuß gegenüber der erwarteten Menge an Verlängerungsprodukten eingesetzt.
Nach einer Inkubationszeit, während der die Hybridisierung der Sonde mit dem Verlängerungsprodukt des Primers und (bei Anwesenheit einer zur Bindung des immobilisierbaren Primers bzw. des daraus gebildeten Verlängerungsproduktes geeigneten Festphase) auch die Immobilisierungsreaktion stattfindet, wird die flüssige Phase aus dem Gefäß, von dem porösen Material oder von den pelletierten beads entfernt. Die Festphase kann anschließend mit einem geeigneten Puffer gewaschen werden, da die Bindung der Hybride an der Festphase sehr effizient ist. Dann wird die an die Festphase gebundene Menge an nachweisbarer Markierung als Maß für die Menge der nachzuweisenden Nukleinsäure an der Probe gemessen und bestimmt. Bei direkt nachweisbaren Gruppen, beispielsweise Fluoreszenslabeln oder Elektrochemilumineszenzlabeln, wie Bispyridin-ruthenium-komplexen, wird die Menge an - 11 -
M.arkierung fluorometrisch bzw. elektrisch angeregt und photometrisch bestimmt. Ist die nachweisbare Gruppe indirekt nachweisbar z. B. ein Hapten, so wird die modifizierte Nukleinsäure bevorzugt mit einem mokierten .Antikörper gegen das Hapten umgesetzt, wie in der EP-A-0 324 474 beschrieben. Die Markierung am Antikörper kann beispielsweise eine Färb- oder Fluoreszenzmarkierung oder bevorzugt eine Enzymmarkierung, wie ß-Galactosi- dase, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, sein. Im Falle der Enzymmarkierung wird die Menge an Nukleinsäure über die meist photometrische chemoluminometrische oder fluorome- trische Verfolgung einer Rektion des Enzyms mit einem chromogenen, chemoluminogenen oder fluorogenen Substrat gemessen. Das Meßsignal ist ein Maß für die Menge ursprünglich vorhandener nachzuweisender Nukleinsäure und somit ggf. an nachzuweisenden Organismen.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist in Figur 3 gezeigt, wenn die immobilisierbare Gruppe I Biotin und die detektierbare Gruppe D ein Rutheniumbispyridylkomplex ist. Unter Verwendung eines Überschusses des immobilisierbar markierten Primers 2 wird die Analytnukleinsäure mit Hilfe der PCR (DNA) bzw. RT-PCR (RNA) amplifiziert. Es entstehen nn Verlängerungsprodukte des Primers 1 und rnnVerl-ängerungsprodukte des Primers 2, wobei m größer ist als n. Sobald eine ausreichende Menge an Amplifikat gebildet worden ist, folgt bevorzugt ein Denaturierungsschritt mit Alkali. Anschließend wird die detektierbar markierte Sonde, die komplementär zu einem Teil des Verlängerungsproduktes des zweiten Primers ist, der neu aus Mononukleotiden gebildet wurde, zugegeben und mit dem immobilisierbar markierten Verlängerungsprodukt hybridisiert. Dabei konkurrieren die Sonde und der un- markierte Strang des PCR-Produktes um den markierten Strang des PCR-Produktes. Da bei der asymmetrischen PCR mehr markierter Strang des PCR-Produktes gebildet wird, ist die Konkurrenzreaktion vermindert und es wird eine größere Menge gewünschtes Hybridisie- rungsprodukt für den Nachweis gebildet. Das gebildete Hybrid aus Sonde und biotin-markier- tem Verlängerungsprodukt wird an Streptavidin beschichtete Magnetp-artikel gebunden. Nach Abtrennung überschüssiger Sonde (durch Entfernung der Flüssigkeit, Zurückhalten der Ma- gnetp.artikel mit den Hybriden an einem Magneten und einem Waschschritt) wird den Ma- gnetp.artikeln der Puffer für die Erzeugung der Elektrochemilumineszenz zugegeben und das Elektrochemilumineszenzsignal durch Anlegen einer Sp.annung erzeugt. Das Blitzsignal wird gemessen und zur Auswertung für den Nachweis der Analytnukleinsäure verwendet.
ERSATZB.LATT (REGEL 26) - 12 -
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich hervorragend für eine qualitative Bestimmung (Anwesenheit der Analytnukleinsäure in der Probe) aber auch ausgezeichnet für quantitative Bestimmung (Bestimmung der Menge an Analytnukleinsäure in der Probe). Darüber hinaus hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß falschnegative Analysenergebnisse bei hochkonzentrierten Analytnukleinsäuren reduziert oder gar vermieden werden. Dies wird wohl darauf zurückzuführen sein, daß der high-dose Hook-Effekt, der bei flüssigen Hybridi- sierungsverfahren üblich ist, durch das erfindungsgemäße Verfahren entweder vermieden oder zu noch höheren Konzentrationen verschoben wird. Unter einem High Dose Hoch Effekt wird das Phänomen verstanden, daß bei zunehmenden Analytkonzentrationen zunächst wie erwartet auch das gemessene Signal größer wird, bei weiter zunehmenden Analytkonzentrationen erstaunlicherweise aber wieder abnimmt. Dies kann bei hohen Analytkonzentrationen zu falsch-niedrigen bis falsch-negativen Ergebnissen führe. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, daß in der Detektionsreaktion die Detektionssonde mit dem unm.arkierten Str.ang des PCR-Produktes um den markierten Strang des PCR-Produktes konkurriert. Aufgrund dieser Konkurrenzreaktion wird die Anzahl der gewünschten Hybride für die Detektion reduziert, was zu dem beobachteten Effekt führt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch für Routinearbeiten, wie sie in der klinischen Diagnostik erforderlich werden, automatisierbar. Der dynamische Meßbereich ist beim erfindungsgemäßen Verfahren besonders hoch. Umgekehrt gesehen ist es möglich, auch Proben, bei denen der Verdacht auf Anwesenheit hoher Analytkonzentrationen, einer eindeutigen Auswertung zuzuführen, ohne eine Verdünnung vorzunehmen. Dasselbe gilt für in einer Probenvorbereitung aufkonzentrierte Nuleinsäuren.
Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren weiter.
- 13 -
Beispiel 1
Nachweis von HGV
Die Reduktion des Hook-Effektes durch eine asymetrische RT-PCR konnte am Beispiel Hepatitis G Virus gezeigt werden. Als Proben dienten dabei zwei mit Hilfe des Bakteriophagen- promotors T7 in vitro transkribierte RNA-Standards, die Herstellung erfolgte nach bereits beschriebenen Standardmethoden (vergl. Sambrock et al.: Molecular cloning, S. 10.27 ff). Beide RNA-Transkripte hatten eine Länge von ca. 900 Nukleotiden, die Sequenzen der 5 '-nicht kodierenden Region von HGV enthielten. Interne Kontroll-RNA ist eine sogenannte homologe interne Kontrolle, die sich im Vergleich zur wildtyp (wt) RNA nur um 23 Nukleotide unterscheidet. Diese ausgetauschte Sequenz dient zur Unterscheidung von beiden RNA Molekülen während der Detektion, die durch Verwendung von unterschiedlichen Detektionssonden erfolgt (siehe unten). Für die Amplifikation sowohl der wt RNA als auch der internen Kontrolle wurden folgende HGV spezifischen Primer verwendet:
HGV Primer Sequenzen:
coding-strand 5 '-CGG CCA AAA GGT GGT GGA TG-3 ' 20-mer
SEQ.ID.NO. 1
non-coding Strand 5 '-Bi-CGA CGA GCC TGA CGT CGG G-3 ' 19-mer
SEQ.ID.NO. 2
Die Markierung des nicht kodierenden Primers diente nur dem Detektionsverfahren, welches weiter unten beschrieben ist.
Für die PCR wurde der folgende Reaktionsansatz gewählt (1 -Schritt RT-PCR; durchgeführt mit BM Titan RT-PCR System, Enzymmix ohne Pwo Polymerase; Id. Nr. 1 855 476):
4 U AMV Reverse Transkriptase
2,5 U Taq Polymerase
50 mM Tricine/HCl, pH 9,0 14 -
15 mM (NH2)S04
2,5 mM MgCl2
0,l % Tween 20
2 % DMSO
5 mM Dithiothreiol
200 nM dCTP, dATP, dGTP, 600 mM dUTP
200 nM coding-strand primer
200 nM non-coding Strand primer, Biotin-markiert bei symetrischen Ansätzen
400 nM non-coding Strand primer, Biotin-markiert bei asymetrischen Ansätzen variable Kopienzahl der in vitro tr.anskribierten RNA-Standards (s. Abbildung)
Angegeben sind die Endkonzentration/RT-PCR.
Die Amplifikation wurde mit folgendem Temperaturprofil auf einem Perkin Eimer Cycler 9600 durchgeführt:
Perkin Eimer Thermal Cycler PE 9600 cDNA synthesis 30 min 50°C initial denaturation 2 mm 94°C cycling profile (lOcycles) denaturation 15 sec. at 94°C anneahng 30 sec. at 55°C elongation 30 sec. at 68°C following cycling profile (25-30cycles) denaturation 15 sec. at 94°C anneahng 30 sec. at 55°C elongation 30 sec. at 68°C + 5s Elongation/Zyklus
Extension 7 min 68°C
Final Hold 4°C
Figure imgf000016_0001
Die PCR-Produkte wurden .anschließend direkt in die unten stehende Detektionsre-aktion eingesetzt.
ERSATZB.LATT (REGEL 26) - 15 -
Detektionsverfahreπ :
Die Detektion erfolgte mit Hilfe von Elektrocheminumileszenz (ECL) auf einem Elecsys 1010 (Boehringer Mannheim GmbH). Reaktionstemperatur für alle Schritte ist 37°C. 10 μl Probe werden zunächst mit 35 μl Denaturierungsreagenz versetzt und für 5 Minuten inkubiert. Anschließend werden 120 μl der Sondenlösung (50 ng/ml in Hybridisierungspuffer) zugegeben und 20 min inkubiert. Nach Beendigung der Hybridisierung werden dem Reaktions.ansatz 35 μl Streptavidin-beschichtete magnetische Mikropartikel beigemischt und dieser erneut 10 Minuten inkubiert. Die Hybride (Bi-markierter HGV Strang mit Ru-markierter Detektionssonde) werden dabei an die Festphase (Mikropartikel) gebunden. Nach Beendigung der Inkubation werden die Proben in die Meßzelle transferiert und dort die Mikropartikel über einen Magneten gebunden. Anschließend erfolgt in der Meßzelle die Chemilumineszenz. Unter Katalyse von TPA gibt der Ru-Komplex Lichtblitze ab, deren Anzahl in der Meßzelle bestimmt werden. Die Chemie zur Elektrocheminolumineszenz ist in J. Electrochem. Soc. 137: 3127-3131 beschrieben.
1. Denaturierungsreagenz, pH > 12
Natriumhydroxid 0004464 0,05 N
Natriumchlorid 0004324 154 mM (0,9 %)
Dodecyl-di-Me-Ammoniopropylsulf 1112899 0,1 %
VE-Wasser 0030163
2. Hybridisierungslösung, pH 6,5
Stoff?
Figure imgf000017_0001
Na-Dihydrogenphosphat x 1 W.asser 0013978 62,5 mM
Na-Monohydrogenphosphat x 2 Wasser 0004537
Natriumchlorid (NaCl) 0004324 0 oder 625 mM
Dodecyl-di-Me-Ammoniopropylsulf 1112899 0,125 % 16
MIT 1085905 0,01 %
Oxypyrion 0,1 %
RPLA I 1726536 0,0625 %
Figure imgf000018_0001
Zu dem Hybridisierungspuffer wird eine Detektionssonde mit einer Endkonzentration von 50 ng/ml zugegeben. Als Detektionssonden wurden die folgenden spezifischen Rutheniumbis- pyridkomplexe (zum Nachweis von HGV wt bzw. HGV interne Kontrolle) verwendet:
HGV wildtyp: Ru- CCACTATAGGTGGGTCTT SEQ.ID.NO. 3
HGV interne Kontrolle Ru-ATGCTGTCAGCACTC TGAG SEQ.ID.NO. 4
Das Ergebnis ist in Fig. 2 wiedergegeben. Fig. 2A zeigt das Ergebnis unter Verwendung des HGV Wildtyp-St.and.ards, 2B das Ergebnis unter Verwendung der internen Kontroll-RNA. Die wichtigsten Erkenntnisse sind:
Der asymetrische Einsatz der Primer führt zu einer deutlichen Signalerhöhung. Das HGV spezifische Signal ist bis zu einem Faktor 7 verstärkt, das Signal der internen Kontrolle verstärkt sich bis zu 5,5-fach. Die Kopienzahl, bei der das maximale Signal erreicht wird, wird zu höheren Konzentrationen hin verschoben. Insgesamt wird das Signalmaximum erst 2 Zehnerpotenzen später erreicht. Dadurch setzt auch der Hook-effekt erst später ein, falsch negative Ergebnisse bei stark positiven Proben können vermieden werden.
Beispiel 2
Nachweis von HBV
Die generelle Durchführung des Experimentes ist unter Beispiel 1 beschrieben. Im Folgenden sind die Veränderungen im Vergleich zum Beispiel 1 angegeben.
1. Probenmaterial.
Als Probenmaterial wurde ein HBV positives Plasma eingesetzt. Die Virus-Konzentration im Material wurde am "Eurohep HBV reference plasma sample 1/Genotyp A" (Gerlich WH, Heermann KH, Thomssen R et al.: Quantitative assays for hepatitis B virus DNA: standardi- zation and quality control. Virol. Hepatitis Rev. 1995; 1: 53-57) abgeglichen. Die Probenprä- - 17 -
p.aration erfolgte mit dem High Pure viral nucleic acid kit (Boehringer Mannheim GmbH) analog derPackungsbeilage.
2. HBV spezifische Primer
coding-strand 5'-GGA GTG TGG ATT CGC ACT-3' 18-merSEQ.ID.NO. 5 non-coding Strand 5 '-TGA GAT CTT CTG CGA CGC-3 ' 18-mer SEQ.ID.NO. 6
3. PCR-Ansatz
Für die PCR wurde der folgende Reaktionsansatz gewählt:
2,5 U Taq polymerase
10 mM Tris/HCl, pH 8,3
50 mM KCL l,5 mM MgCl2
0,1 mg/ml gelantine
200 nM dCTP, dATP, dGTP, 600 mM dUTP
200 nM coding-strand primer/200 nM non-coding Strand primer, Biotin-markiert bei symetri- scher PCR
200 nM coding-strand primer/400 nM non-coding Strand primer, Biotin-markiert bei asyme- trischer PCR präparierte, HBV enthaltene Nukleinsäure
Die Amplifikation wurde mit folgendem Temperaturprofil auf einem Perkin Eimer Cycler 9600 durchgeführt:
35 Zyklen:
15 sec 94°C
30 sec 55°C
30 sec 72°C
3. dann: hold 4°C
ERSATZB.LATT (REGEL 26) - 18 -
Detektion
Die Detektion wurde analog zu Beispiel 1 durchgeführt. In einem Experiment wurde der sy- metrische Ansatz direkt mit dem asymmetrischen Ansatz verglichen. Als Detektionssonde wurde die folgende spezifische Rutheniumbispyrid-komplex-markierte Sonde verwendet:
Ru-AGACCACCAAAT GCC CCT SEQ.ID.NO.7
Das Ergebnis ist in Fig. 3 wiedergegeben. Fig. 3A zeigt das Ergebnis unter Verwendung von 625 mM NaCl im Hybridisierungspuffer, im Experiment, d.as in 3B dargestellt ist, enthielt der Hybridisierungspuffer kein NaCl. Die wichtigsten Erkenntnisse sind:
• Wie schon in Beispiel 1 beschrieben bewirkt der asymetrische Einsatz der Primer zu einer deutlichen Signalerhöhung im Vergleich zum Experiment mit symetrischen Primerkonzen- trationen. Das HBV spezifische Signal ist bis zu einem Faktor von 18,8 verstärkt.
• Die Kopienzahl, bei der das maximale Signal erreicht wird, wird zu höheren Konzentrationen hin verschoben. Im Beispiel 3A ist das Signalmaximum mindestens um 3 Zehnerpotenzen verschoben.
• In der Literatur sind HB V-Konzentrationen in Seren bis zu 1010 Genomäquivalenten ml (geq/ml) beschrieben worden (W.H. Gehrlich, Hepatitis B Virus-structure .and molecular virology, S. 83-113; in Viral Hepatitis, Editors A.G Zuckermann, H.C. Thomas; Churchill Livingstone, Edinburgh, London, Madrid, Melbourne, New York, Tokyo, 1993). Legt man diese Angaben zugrunde, erscheint es möglich, das eine sehr hohe Viruskonzentration im Serum beim Einsatz einer symetrischen PCR zu falsch negativen Ergebnissen führen kann. Der asymetrische Ansatz kann daher das Auftreten von falsch negativen Ergebnissen vermeiden.
Der Hook-Effekt tritt nicht auf, wenn kein Salz im Hybridisierungspuffer vorhanden ist (Abb. 3B). Die Vermeidung bzw. Verminderung des Hook-Effektes kann also auch durch Reduktion der Salzkonzentration während der Hybridisierung erreicht werden. Allerdings ist in der Literatur häufig beschrieben worden, das Nuklemsäurehybridisierungen ohne Salz sehr viel schlechter ablaufen und darum die Sensitivität verloren geht (Bryan et al., S. 47ff in Nucleic acid hybridisation, Editors B.D. Harnes, SJ. Higgins; IRL press, 1985).

Claims

19Patentansprüche
1. Verfiahren zum Nachweis einer hochkonzentrierten Analytnukleinsäure in einer Probe, enthaltend die Schritte
- Zugabe von zwei Sorten von Primern, von denen das Verlängerungsprodukt des einen Primers als Templat für die Verlängerung des anderen Primers dienen kann, zu der Probe und Inkubation des gebildeten Gemisches unter Bedingungen, bei denen in Abhängigkeit von der Anwesenheit der Analytnukleinsäure zu jedem der Primer Verlängerungsprodukte gebildet werden,
- Bindung einer mokierten einzelsträngigen Sonde an eines der beiden Verlängerungsprodukte unter Bildung eines Bindeproduktes und Immobilisierung der Verlängerungsprodukte an einer festen Oberfläche,
dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Sorten von Primern in einem stöchiometrischen Verhältnis von zwischen 1,5 : 1 und 10 : 1 eingesetzt werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die im Überschuß vorhandene Sorte von Primern zu einem Verlängerungsprodukt führt, welches die markierte Sonde binden kann.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese Sorte von Primern eine immobilisierbare Gruppe gebunden hat, die das gebildete Verlängerungsprodukt aufgrund spezifischer Wechselwirkungen an die feste Oberfläche binden kann.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Analytnukleinsäure in der Probe größer sein kann als 105 Genomäquivalente/ml. 20
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis die Bestimmung der Menge an Analytnukleinsäuren in der Probe einschließt.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Überschuß zwischen 2 : 1 und 5 : 1 liegt.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, d.aß die Analytnukleinsäure eine virale Nukleinsäure ist.
8. Verwendung einer asymmetrischen Nukleinsäure-amplifikation zur Reduzierung oder Vermeidung falschnegativer Analyseergebnisse bei potentiell hochkonzentrierten Analytnukleinsäuren.
9. Verwendung einer asymmetrischen Nukleinsäure-amplifikation zur quantitativen Bestimmung von hochkonzentrierten Nukleinsäuretargets.
10. Verwendung einer asymmetrischen Nuklemsäureamplifikation zur Erhöhung des dynamischen Meßbereiches bei Nukleinsäurenachweisverfahren.
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